KR100927463B1

KR100927463B1 - 기체크로마토그래피를 이용한 모발 중 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 다성분 동시 분석법

Info

Publication number: KR100927463B1
Application number: KR1020090036627A
Authority: KR
Inventors: 김진영; 인문교; 이재일
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2009-04-27
Filing date: 2009-04-27
Publication date: 2009-11-19

Abstract

본 발명은 모발 시료를 마이크로미터(μm) 수준의 입자 크기로 세절하는 단계; 상기 세절 시료를 메탄올로 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 perfluoroacetyl 유도체화 반응을 거쳐 기체크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 다성분 동시 신속 분석법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면 모발 중 암페타민, 메스암페타민, 엠디엠에이, 엠디에이 및 노르케타민의 총 5 성분을 메탄올 직접추출법을 이용하여 간편한 전처리과정을 거쳐 신속하게 동시 분석할 수 있어 경제적이며, 유도체화 반응을 이용하여 바람직한 분석 감도를 확보할 수 있으며, 동위원소가 치환된 내부표준물질을 사용하여 종래기술에 비해 정확도와 정밀도가 향상된 정량분석을 수행할 수 있다.

암페타민 유도체, 노르케타민, 다성분 동시 분석, 기체크로마토그래피

Description

기체크로마토그래피를 이용한 모발 중 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 다성분 동시 분석법{Simultaneous determination of methamphetamine, amphetamine, 3,4-methylenedioxymethylamphetamine, 3,4-methylenedioxyamphetamine, and norketamine in hair}

본 발명은 자동세절기와 기체크로마토그래피를 이용한 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 다성분 동시 분석법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 모발 시료의 입자를 마이크로미터 크기로 세절하고, 메탄올 직접추출법으로 추출 및 정제를 한 후, 분석 대상물질의 극성작용기인 아민기를 플로린이 포함된 heptaflourobutyric anhydride로 유도체화하여 기체크로마토그래피를 통해 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 총 5 종의 성분을 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다.

암페타민계 유도체 범주에 포함되며 국내에서 남용빈도가 높은 마약류는 암페타민(AP, amphetamine), 메스암페타민(MA, methamphetamine), 엠디엠에이(MDMA, 3,4-methylenedioxymethamphetamine), 엠디이에이 (MDA, 3,4- methylenedioxyamphetamine) 등이다. 이러한 합성마약류는 제조가 용이하고 구입비용이 저렴하고 환각효과가 오랜 기간 지속되는 것으로 알려져 있으며 복용 방법은 코로 흡입하거나 주사 또는 경구투여 등이 이용된다. 이들 약물을 복용함으로써 사람들은 사회적 단절감의 해소, 명석함, 능력 그리고 힘 등을 갖는 듯 한 느낌을 쫓아 남용을 하게 된다. 국내에서 가장 많이 남용되는 마약인 메스암페타민은 강력한 중추신경 흥분 작용을 일으키며 체내 대사과정을 거쳐 대사체로 암페타민이 형성되어 체외로 배설되는 것으로 보고되어 있다. 다음으로 남용 빈도가 높은 엠디엠에이는 메스암페타민과 더불어 1990년대 말 크게 유행하여 심각한 사회적 문제를 일으킨 약물로 주요 대사체는 엠디에이(MDA, 3,4-methylenedioxyamphetamine)이다. 엠디엠에이는 순수한 엠디엠에이 단일 성분으로 유통되는 경우가 드물고 케타민(ketamine), 엠디에이, 카페인(caffeine) 등과 혼합되어 유통된다. 특히 케타민은 대사과정을 통해 노르케타민(norketamine)으로 변형되고 이러한 대사체는 모약물의 복용여부를 확인하는 물질로 분석 대상물질이 되기도 한다. 이러한 케타민은 메스암페타민이나 엠디엠에이 만큼 남용되지는 않으나 신종 마약으로 우리나라와 동아시아 지역에서 남용이 증가하는 경향을 보여주고 있다. 따라서 국내에서 남용 빈도가 높고 향후 남용 가능성이 큰 이들 약물의 위험성이 커짐에 따라 복용여부 확인이 신속하고 간편한 분석법에 대한 요구와 관심이 집중되고 있는 상황이다.

법과학 분야 중 마약류 분석에 널리 쓰이는 시료는 소변, 혈액, 모발 등이다. 소변이나 혈액 분석과 같이 기존에 널리 사용되는 방법의 상호 보완을 이루는 분석시료인 모발은 여러 장점이 있다. 기존의 소변 및 혈액이 현재 또는 최근의 복 용여부에 대한 정보를 주는 반면, 모발 분석은 수개월에서 1년 이내의 복용 여부확인에 이용될 수 있다. 약물은 모근으로부터 모발에 축적되어 성장하게 되므로 모발의 길이에 해당하는 기간 동안 약물 복용 여부를 확인할 수 있으며, 모발 분할 분석(sectional analysis)을 통해 상습 복용 여부도 확인할 수 있다. 반면 모발 분석은 소변이나 혈액 분석과정에 비해 복잡하고 사람의 노동력이 많이 소요되는 단점이 있다.

일반적으로 모발 분석 과정은 5 단계로 구분할 수 있다. 모발의 세척(decontamination), 세절(pulverization), 배양(incubation), 추출(extraction) 그리고 기기분석(instrumental analysis)으로 구성된다. 5 단계 중 모발의 세절 단계가 시간 소요가 많고 노동력이 많이 투여되는 것으로 여겨지고 있다. 현재까지 메스암페타민 및 암페타민 분석에 이용된 세절 방법은 가위를 이용하여 모발을 밀리미터 크기의 입자로 세절하는 방법(Kim et al., Yakhak Hoeji., 47 (2003) 142), 쇠구슬(ball)을 이용하는 방법(Frison et al., Rapid Commun Mass Spectrom., 19 (2005) 919), 탄환모양의 비드(bead)를 이용하는 방법(Miyaguchi et al., J Chromatogr A., 1216 (2009) 4063) 등이 보고되어 있다.

쇠구슬이나 비드를 이용한 모발 분쇄방법은 가위로 세절한 모발의 크기에 비해 10배 이상 작은 모발 입자로 세절되므로 분석시 모발 자체에 포함되어 있는 기질(matrix)의 영향을 많이 받게 된다. 이러한 기질 내에 포함되어 있는 분석 방해물질을 효과적으로 제거하기 위한 방법으로 고체상 추출법(solid-phase extraction) 또는 액체상 추출법(liquid-liquid extraction)이 있으나 추가적인 전 처리과정 도입에 따른 처리비용과 소요 시간이 발생되는 문제점이 있었다. 최근 발표된 탄환모양의 비드를 이용한 종래의 방법(Miyaguchi et al., J Chromatogr A., 1216 (2009) 4063)의 경우 모발을 자동세절한 후 수용액상에서 아세틸화 반응을 시키고 다시 MEPS(microextraction by packed sorbent)를 이용하여 재 추출하고 다량의 시료를 기체크로마토그래프(gas chromatograph)에 주입하여 분석을 한다. 이와 같이 시료의 정제과정을 추가함으로써 크로마토그램상의 노이즈(noise) 제거에 효과적이지만 시간적 경제적인 측면에서는 효율적이지 못하다. 또한 통상 기체크로마토그래프에 주입되는 시료의 양인 1~2 μL의 25배에서 50배에 이르는 많은 양인 50 μL의 시료를 분석기기에 주입하도록 분석방법이 설정되어 있어 다량의 시료 주입으로 인해 질량분석기의 진공도가 낮아져 노이즈가 증가할 뿐만 아니라 다음 분석에 영향을 미치게 될 가능성이 커지게 된다.

모발분석의 노동집약적이고 처리기간이 오래 걸리는 단점을 보완하기 위해 전처리 과정을 단순화하고 신속한 모발 분석을 위해 도입 가능한 방법이 추출용매에 의한 직접추출법이다. 직접추출법은 배양과 추출과정을 한번에 처리함으로써 시료 전처리시간 절감에 유리하며, 짧은 시간 안에 효과적인 추출이 이루어질 수 있도록 항온수조 내에서 초음파로 추출이 진행된다. 모발 중 메스암페타민 분석에 사용된 추출용매로는 5 M hydrochloric acid/methanol(1:20 v/v)(Nakahara, Forensic Sci Int., 70 (1995) 135), 0.25 M methanolic hydrochloric acid solution(Kim et al., Rapid Commun Mass Spectrom., 21 (2007) 1705), acetone(Goodpaster et al., J Forensic Sci., 48 (2003) 1), methanol(Kikura et al., Forensic Sci Int., 84 (1997) 165) 등이 사용되었다. 다만 모발의 세절 방법에 따라 기질로부터 발생되는 방해물질이 분석에 미치는 영향이 다르므로 각각의 용매에 대한 비교 시험이 반드시 필요하다. 이는 세절된 모발의 입자 크기에 따라 용매에 따른 추출효율과 방해물질의 영향이 다르게 나타날 수 있기 때문이다.

법과학 분야의 마약류 분석에 기준이 되는 분석기기는 기체크로마토그래피-질량분석기(gas chromatography-mass spectrometry)로 여러 분석 대상물질을 크로마토그래피법을 이용하여 분리하고 질량분석법을 이용하여 물질의 확인이 가능한 장점이 있다. 따라서 모발 중 마약류 복용 여부 확인에 사용되는 방법 역시 크로마토그래피와 질량분석법이 접목된 방법이 많이 사용되고 있다. 주입된 시료가 분리관의 고정상과 헬륨기체인 이동상 사이에서 흡착성 또는 분배계수의 차를 이용하여 성분별로 시간의 차이에 따라 분리되어 질량분석기로 검출하여 분석하는 방법인 기체크로마토그래피-질량분석법(Kim et al., Rapid Commun Mass Spectrom., 21 (2007) 1705; Wu et al., Rapid Commun Mass Spectrom., 22 (2008) 887; Kim et al., J Anal Toxicol., 29 (2005) 370)을 이용하는 방법, 분리관의 고정상과 액체상태인 이동상으로 구성된 액체크로마토그래피와 대기압하에서 이온화하여 분석물질을 검출하는 질량분석기의 액체크로마토그래피-질량분석법(liquid chromatography-mass spectrometry)를 이용하는 방법(Kronstrand et al., Forensic Sci Int., 145 (2004) 183; Stanaszek and Piekoszewski, J Anal Toxicol., 28 (2004) 77; Miyaguchi et al., J Chromatogr A., 1163 (2007) 43) 그리고 항온항체 반응을 이용하여 분석하는 면역반응측정법(Han et al., J Anal Toxicol., 30 (2006) 380) 등이 보고되어 있다.

현재까지 기체크로마토그래피-질량분석기가 마약류 분석의 표준장비(gold standard)로서의 위치를 차지하고 있는 이유로는 액체크로마토그래피-질량분석기에 비해 분석기기 도입 비용이 2~5배 정도 저렴하고 기체크로마토그래피의 특성상 한 번 분석으로 많은 성분의 분석물질을 분리·분석할 수 있는 장점이 있기 때문이다. 다만 극성물질 또는 열적 안정성이 낮은 물질을 분석하는 경우 액체크로마토그래피-질량분석기를 사용하는 것이 유리하다. 그러나 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용하여 극성물질을 분석하는 경우 분석물질의 극성작용기를 비극성으로 전환시키는 다양한 유도체화 기법(derivatization)이 상용화되어 있다.

일반적으로 마약류 복용여부 확인을 위해서는 모약물(parent drug)과 대사체 또는 대사체를 분석한다. 따라서 메스암페타민, 엠디엠에이, 케타민의 복용 여부를 판별하기 위해서는 모 약물 뿐만 아니라 체내 대사과정에서의 생성되는 대사체인 암페타민, 엠디에이, 노르케타민를 포함한 5종 모두를 분석해야 할 필요성이 있다. 이들 약물 중 암페타민과 엠디에이는 대사체로 분석되기도 하고 경우에 따라서는 단일 성분으로 남용되는 사례가 있다.

앞서 언급한 종래의 분석방법 중에는 가위를 이용하여 모발을 세절하는 단계를 포함하는 방법이 있다. 이러한 방법은 노동력이 많이 소요되고 전처리 시간도 증가하는 단점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 자동세절장치를 도입한 종래의 방법 중에는 모발의 기질로부터 과도하게 추출된 분석방해 물질의 제거를 위해 정제 단계를 추가시킨 방법이 있다. 이러한 방법에는 부가적인 전처리 단계가 포함되어 전처리과정이 복잡해지고 결국 일상적인 분석에 이용하기 어렵게 된다.

따라서 모발 중 여러 종류의 마약류를 동시에 분석할 수 있는 방법의 개발과 전처리 단계를 자동화하고 단순화하여 신속한 분석에 적합하며, 소량의 시료에서도 충분한 분석 감도를 확보할 수 있으며 국내에서 많이 남용되고 있는 마약류 분석에 적용이 가능한 분석법의 개발이 요구되고 있는 상황이다.

상기와 같은 문제점을 극복하기 위하여 본 발명은 기체크로마토그래피와 검출기로써 질량분석기를 이용한 분석방법을 연구한 결과, 모발 세절과정의 자동화, 모발 기질내의 내재하는 방해물질을 효과적으로 제거하고 분석 대상물질의 추출효율이 높은 추출용매의 선정, 기체크로마토그래피와 질량분석기를 이용한 분석에 적합하도록 극성 물질을 비극성물질로 전환하는 유도체화 기법을 도입함으로써 소량의 시료로도 바람직한 분석감도를 확보하며, 또한 추출조작을 자동화하여 절차를 간편하게 하여 운전을 용이하게 하는 것을 목적으로 하고 종래와 다른 시료의 자동세절장치의 도입, 최적화된 추출용매의 선정, 유도체화 기법 등의 사용을 통하여 화학적 물성이 다른 다수의 마약류 성분을 검출 및 정량할 수 있는 방법 제공을 목적으로 한다.

다만, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 평균적 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 구현예는 모발 시료를 마이크로미터(μm) 수준의 입자 크기로 세절하는 단계;

상기 세절 시료를 메탄올로 추출하는 단계; 및

상기 추출물을 HFBA(heptaflourobutyric anhydride) 화합물을 이용한 heptaflourobutyric acylation 유도체화 반응을 거쳐 기체크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 다성분 동시 신속 분석법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 구현예는 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 다성분은 메스암페타민(MA, methamphetamine), 엠디엠에이(MDMA, 3,4-methylenedioxymethamphetamine), 암페타민(AP, amphetamine), 엠디에이(MDA, 3,4-methylenedioxyamphetamine), 노르케타민(NKT, norketamine)이다.

본 발명의 다른 일 구현예는 제 1단계에서 세절은 시료를 직경 2.8 mm 스테인리스 스틸 비드(stainless steel bead)가 담긴 2 mL 용량의 튜브에 넣고 3000-8000 rpm에서 30초 내지 2분 동안 자동 세절하는 것이다.

본 발명의 다른 일 구현예는 상기 제 3 단계의 기체크로마토그래피는 질량분석기(mass spectrometry)를 더 추가한다.

본 발명의 다른 일 구현예는 상기 질량분석기로 분석시 분석물질에 대해 동 위원소가 치환된 내부표준물질을 이용하여 정량한다.

기타 본 발명의 구현예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.

본 발명에 따른 본 발명에 의하면 한번의 분석으로 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 총 5 성분을 동시에 분석할 수 있으며 자동 세절 과정을 도입하여 분석을 신속하게 할 수 있으며, 좀 더 정밀도와 정확도 높은 분석을 할 수 있다.

이하, 본 발명의 구현예를 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며, 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명은 일 구현예는 모발 시료를 마이크로미터(μm) 수준의 입자 크기로 세절하는 단계;

상기 세절 시료를 메탄올로 추출하는 단계; 및

상기 추출물을 heptaflourobutyric acylation 유도체화 반응을 거쳐 기체크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 다성분 동시 신속 분석법을 제공한다.

본 발명의 분석대상인 암페타민 유도체 및 케타민 대사체는 총 5 종으로 메 스암페타민(MA, methamphetamine), 엠디엠에이(MDMA, 3,4-methylenedioxymethamphetamine), 뿐만 아니라 체내 대사과정에서의 생성되는 대사체인 암페타민(AP, amphetamine), 엠디에이(MDA, 3,4-methylenedioxyamphetamine), 노르케타민(NKT, norketamine)이며, 다음의 화학식 1 내지 5로 표시된다.

본 발명의 분석대상인 암페타민 유도체 (화학식 1-4) 및 노르케타민 (화학식 5)의 구조적 차이점은 벤젠고리로부터 2번 위치의 탄소에 질소(N)원자의 위치한 경 우 암페타민 유도체로 분류되며 약리작용은 흥분제의 기능을 한다. 반면 1번 위치의 탄소에 질소 원자의 위치한 점이 노르케타민의 구조적 특징을 이루며 모 약물인 케타민은 각성제로서 약리작용을 갖는다.

본 발명의 상기 분석 방법에서, 모발 세절 단계를 수행하는 것은 시료로부터 분석 대상 마약류 성분을 효과적으로 추출하기위해 모발 시료를 마이크로미터 수준의 크기로 세절하는 것이다. 이때 모발 시료의 입자 크기가 작아질수록 입자의 표면적이 증가하게 되어 추출 효율이 높아지는 장점이 있다.

입자가 작아질수록 분석 대상 성분의 추출이 용이한 반면 모발의 기질 효과(matrix effect; 정량하고자 하는 이온이 모발 자체의 기질의 영향으로 실제보다 적게 검출되거나 그 반대로 실제보다 많은 양이 있는 것처럼 나타나는 현상)에 의한 방해물질의 영향이 커지게 되므로 모발 입자의 크기를 조절하여 분석 대상물질의 회수율을 높이기 위하여 일정한 범위의 입자 크기(50-200 μm)로 세절하는 것이며 바람직하게는 평균 120 마이크로미터 정도의 크기로 세절한다.

이때 모발을 세절하는 방법으로는 다량의 시료를 신속하게 처리할 수 있는 자동 세절장치를 사용하는 것이 바람직하며 세절 조건 3000-8000rpm으로 30초 내지 2분간 세절이 가능하나 바람직하게는 5000 rpm(rotation per minute), 1분 30초 세절한다.

또한, 상기 메탄올로 추출하는 단계에서 용매에 의한 직접추출법을 이용할 수 있는데, 추출용매의 바람직한 정제과정을 거쳐 기질 효과를 줄이고, 배양과 추출조작을 단일화하여 절차를 간편하게 하여 운전을 용이하도록 하는 것이다.

이때 추출 용매로는 크로마토그램(chromatogram) 상의 분석 대상 물질의 피이크(peak) 모양이 대칭을 이루고 높은 회수율을 얻을 수 있는 용매를 선택하여 사용하는 것이 바람직하다.

이 과정을 거침으로써 시료의 매트릭스 효과가 감소하여 정제 상태가 바람직하며, 재현성이 높고, 일정한 머무름 시간을 가지고 정량분석을 할 수 있다.

이때 추출용매를 정제하는 방법으로는 방행해물질을 효과적으로 걸러낼 수 있는 시린지 필터(syringe filter)를 사용하는 것이 바람직하며 필터의 재질은 테플론(polyvinylidene fluoride, PVDF), 통과가능한 입자의 크기는 0.2 μm가 바람직하다.

상기 유도체화 단계에서 암페타민 유도체 및 케타민 대사체 분석에 perfluoroacetyl derivatization을 사용할 수 있다. 유도체화 단계에서 적용할 수 있는 과정은 MBTFA(N-methyl-bis(Trifluoroacetamide)), TFAA(Trifluoroacetic anhydride), PFPA(pentafluoropropionic anhydride), HFBA(heptaflourobutyric anhydride)를 이용한 유도체화 기법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 HFBA 시약을 이용한 유도체화 기법을 사용할 수 있다.

또한, 상기 유도체화 기법을 사용함으로써, 유도체화 기법을 사용하지 않았을 경우 모세분리관에 분석 대상물질의 흡착으로 분석이 어려운 마약류 성분을 효과적으로 검출할 수 있다. 유도체화 기법을 사용하여 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 특징적인 작용기인 아민기를 heptaflourobutyric acylation하는 경우, 피이크(peak) 모양과 인텐서티(intensity)의 증가를 이룰 수 있어 정량범위내의 직선 성이 향상되어 분석감도의 개선을 제공한다. 이때 유도체화 조건은 50℃에서 30분간 반응하는 것이 바람직하다.

한편, 기체크로마토그래피와 질량분석기를 이용하여 시료를 분석하는 경우, 먼저 기체크로마토그래피에 장착된 모세분리관의 고정상과 이동상 사이에서 흡착성 또는 분배계수의 차를 이용하여 분리된 성분들은 머무름 시간의 차이를 두고 질량분석기로 도입된다. 도입된 시료는 이온화 장치에 의하여 분석물질들이 이온화된다.

본 발명에서는 상기 기기분석 단계에서 모세분리관을 사용함으로써, 분석물질을 바람직하게 검출할 수 있다. 이때 모세분리관은 5% phenyl-과 95% methyl-polysiloxane으로 정지상이 구성되어 있고 모세관의 길이가 30 m, 직경이 0.25 mm, 정지상의 두께가 0.25 μm인 모세분리관을 사용하는 것이 바람직하며, 이를 사용하는 경우, 분리능(resolution)과 인텐서티의 증가를 이룰 수 있어 검출감도 개선을 제공한다.

분리조건 설정단계에서는 기체크로마토그래피의 오븐 온도를 단계별 조절하여 각각의 분석물질의 머무름 시간과 분리 조건을 조정할 수 있다. 이때 적용되는 온도 조건은 기질의 영향을 최소화하며 분석물질이 빠른 시간 내에 모두 분석될 수 있도록 설정한다.

가스크로마토그래피 분리관 온도 조절 단계에서 다성분 물질에 대한 동시분석시 등온과 가온을 가함으로서 크로마토그램 상의 분석물질의 분리능을 향상시키기 위해 90-300℃의 온도 범위로 선정 될 수 있다.

다성분 동시분석시 머무름 시간(retention time)이 길고 분자량이 큰 분석물질은 피이크 꼬리끌림(peak tailing) 현상 제거와 감도 향상을 위해 1.1 mL/min의 유량과 시료 주입방식을 splitless로 선정 할 수 있다.

기체크로마토그래피용 모세분리관은 직경 0.1-0.53 mm인 분리관을 사용할 수 있다.

모세분리관의 고정상으로는 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane, 100% dimethylpolysiloxane을 사용할 수 있다. 이동상으로는 질소, 수소, 헬륨 기체를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 고순도 헬륨기체를 사용할 수 있다.

상기 기체크로마토그래피의 분석컬럼을 통과하여 분리된 시료는 질량분석기로 도입하여 전자충격(electron impact) 이온화장치를 이용하여 이온화시킬 수 있다. 이때 이온화된 검출이온은 암페타민 유도체 및 노르케타민의 총 5종의 분석물질의 질량스펙트럼에서 특성이온을 선정하여 정량이온과 정성이온으로 구분하여 분석한다.

상기 질량분석기로 분석하는 단계에서 정량분석시 질량분석기의 SIM(selected ion monitoring) 방식에서 정량하는 것은 신호대잡음비(signal to noise ratio)을 개선하기 위한 것이다. 즉, 분석 대상물질의 특성 이온을 선정하여 사중극자에서 검출하는 SIM 방식에서 분석을 시행하는 것이 바람직하다.

SIM 방식을 이용하는 경우에는 분석 대상 물질에 대해 서로 다른 3개의 특성이온을 선정하고 중수소가 치환된 내부표준물질의 특성이온을 함께 검출하는 경우 선택성(selectivity)이 높아지고 분석감도(sensitivity)가 개선되어 높은 정밀도와 정확도로 다양한 종류의 마약류 성분들을 동시에 분석할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예 및 비교예를 기재한다. 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 시료인 모발을 마이크로미터(μm) 수준의 입자 크기로 자동 세절하는 제 1 단계

증류수와 아세톤으로 세척한 사람의 모발을 2 cm 이하의 크기로 절단한 후, 시료 중 10 mg을 취하여 직경이 2.8 mm의 스테인리스 스틸 비드 6개가 담긴 2 mL 용량의 튜브에 담아 프랑스 베르틴 테크놀러지사의 자동세절기(Precellys 24)로 5000 rpm에서 1분 30초간 세절하였다.

세절된 모발 입자의 크기는 방해물질의 추출이 최소화되고 분석 대상물질의 회수율이 극대화될 수 있도록 결정하였으며, 이때 입자의 크기는 평균 123 μm이었으며 그 결과는 도 1에 나타내었다.

추출에 앞서 세절된 모발 시료에 50 μL의 내부표준용액(0.3 μg/mL for AP-d ₈ , MA-d ₁₁ , MDA-d _5, MDMA-d ₅ , NKT-d ₄ )을 첨가하였다.

2. 시료에 메탄올 직접추출법을 수행하는 제 2 단계

사람의 모발로부터 암페타민 유도체 및 케타민 대사체 검출시 얻어지는 추출액은 모발 내 기질의 영향에 의해 검출량의 가감이 생길 수 있다.

따라서 제 2 단계에서는 이러한 기질의 영향을 감소시키고 분석물질의 회수율을 높이기 위하여, 추출용매로 메탄올을 이용하는 직접추출법을 수행하였다. 세절된 모발 시료에 메탄올 1 mL를 첨가한 후 50 ℃의 항온수조에서 초음파를 이용하여 1시간 추출하였다.

추출용매로 메탄올을 사용하는 것은 도 2에 나타난 것처럼 실제 메스암페타민 복용자의 모발 양성시료에서 메탄올, 아세톤, 0.25 M hydrochloride 용액의 추출효율을 비교한 결과 가장 추출효율이 우수하기 때문이다. 또한 메탄올은 팽윤성(swelling property)이 튀어나 모발과 약물의 결합 위치(binding site)에서 약물의 확산을 개선하는 것으로 보고되어있다 (Eser et al., Forensic Sci Int., 84 (1997) 271). 제 1 단계에서 메스암페타민의 주요 대사체인 암페타민의 추출효율을 함께 비교하였으나 메탄올에서만 검출이 되어 다른 두 용매와 상대적인 추출효율의 비교를 수행하지 못했다.

분석 대상물질과 함께 추출되는 방해물질의 영향을 감소시켜 분석감도를 증가시키기 위해 10000 g로 5분간 고속 원심분리 후, 메탄올 추출액 상층을 시린지 필터로 정제하였다. 시린지 필터로는 0.2μm 이하의 입자를 통과시킬 수 있는 영국 Whatman사 테플론 재질의 필터를 사용하였다.

3. 기체크로마토그래피와 검출기로써 질량분석기를 이용하여 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 농도를 정량분석하는 제 3 단계

상기 제 2 단계에서 얻은 추출액을 증발시킨 잔사를 아세톤 50 μL와 HFBA(heptaflourobutyric anhydride) 50μL를 첨가한 후, 50℃로 유지된 반응기에서 30분간 반응시키는 유도체화 실험을 수행하였다.

이때 분석 대상물질인 암페타민 유도체 및 노르케타민의 특징적인 작용기인 아민기를 heptaflourobutyric acylation하였다. 혼합물을 질소기류하에서 증발시킨 후 잔사에 에틸아세테이트 50 μL 첨가하여 잘 혼합한 용액 중 일부(1μL)를 가스크로마토그래피-질량분석기에 주입하였다.

기체크로마토그래피는 자동주입기가 장착된 미국 에질런트사의 가스크로마토그래피(7890 GC)를 사용하였다.

이때 분리관의 온도는 하기와 같이 초기 온도를 90℃로 설정하여 0.5분간 유지시킨 다음 25℃/min으로 150℃까지 승온하여 1.5분간 유지한 후 15℃/min으로 230℃까지 승온하여 1분간 유지하고 다시 40℃/min으로 300℃까지 승온하여 1.3분간 유지시킨다. 이때 가스크로마토그래피의 주입구와 질량분석기의 연결부위의 온도는 260과 280℃로 설정하였고 비 분할방식(splitless mode)으로 시료를 주입하였다.

상기와 같이 시간에 따라 모세분리관의 온도를 달리하여 분리하는 것은 분석시간을 단축하고 분석 후 남아 있을 수도 있는 방해물질을 효과적으로 제거할 수 있기 때문이다.

그 결과 도 3에서 나타난 것처럼, 본 발명의 기체크로마토그래피와 질량분석기를 이용한 모발 중 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 다성분 동시 신속 분석법을 이용할 경우 모세분리관을 통과시키는 단계에서 화학적 물성이 서로 다른 분 석 물질을 분리해 낼 수 있었다.

이때 검출기로 사용한 질량분석장치(MS, mass spectrometer)는 미국 에이질런트사의 5975C MS 검출기로 물질을 이온화시킬 때의 조건은 전자충격 이온화 방식으로 이때 이온화장치와 사중극자의 온도는 230과 150℃로 설정하였다.

또한 신호대잡음비(signal to noise ratio)를 개선하고 검출감도를 향상하기 위하여 분석 대상물질이 이온화장치에서 전자 충돌에 의해 충돌에 의해 발생된 특징적인 이온들을 검출하는 SIM 방식으로 분석을 수행하였다.

정성 및 정량분석을 위한 분석 대상물질의 특성 이온들을 표 1에 나타내었고, SIM 방식으로 질량분석기로 검출한 바탕모발, 일정량의 표준물질이 첨가된 모발, 실제 메스암페타민 복용자의 모발 분석결과를 도 4에 나타내었다.

그 결과 본 발명의 기체크로마토그래피와 검출기로 질량분석기를 이용한 암페타민 유도체 및 노르케타민 다성분 동시 신속분석법을 이용하여 화학적 물성이 다른 5 종의 마약류를 모두 정성, 정량분석할 수 있었다. 이는 모발내 기질 효과를 개선하였으며, 노동력과 시간이 많이 소요되는 모발 세절 과정을 자동화함으로써 분석시간을 앞당길 수 있었고, 실제 마약 복용자의 모발에 본 발명의 분석법을 적용했을 때 산업이용가능성이 크다는 것을 나타내었다.

정량분석은 크로마토그램에서 나타난 피이크의 면적을 합한 후, 내부표준법을 적용하여 검량선을 그려 함량을 결정하였다. 분석법의 정밀도와 정확도는 저, 중, 고 농도의 QC 시료(n=6)로 측정하였고 그 결과를 표 2에 나타내었다. 또한 실제 메스암페타민 복용자의 모발 시료의 정량분석 결과를 표 3에 나타내었다.

4. 본 발명 및 종래 기술의 추출용매 및 세절 방법 비교

본 발명의 기체크로마토그래피와 검출기로 질량분석기를 이용한 암페타민 유도체 및 케타민 대사체 다성분 동시 신속 분석법에 대한 추출시간, 추출용매, 처리용량, 검출한계(LOD, limit of detection) 값을 종래의 메스암페타민을 포함한 마약류 분석법 중 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 분석법과 비교하였다.

종래 기술로써, 밀리미터 크기의 입자로 세절하는 방법(비교예 1: Kim et al., Yakhak Hoeji, 47 (2003) 142), 쇠구슬(ball)을 이용하는 방법(비교예 2: Frison et al., Rapid Commun Mass Spectrom., 19 (2005) 919), 탄환모양의 비드(bead)를 이용하는 방법(비교예 3: Miyaguchi et al., J Chromatogr A., 1216 (2009) 4063)을 본 발명과 비교하였으며, 그 결과를 표 4에서 보여주고 있다.

실시예 1

상기 제 1 단계 내지 3 단계에 의해 수행된 암페타민 유도체 및 노르케타민의 총 5 종의 화합물의 다성분 동시 신속 분석법을 나타내고 있다.

비교예 1

기체크로마토그래피-질량분석기를 이용하는 방법으로 가위를 이용하여 밀리미터 수준의 입자 크기로 모발을 세절한 후 5M 염산/메탄올(1:20, v/v) 혼합 용액을 이용하여 직접추출법을 수행한 다음 trifluoroacetic anhydride (TFAA)로 유도체화한 시료를 모세분리관을 통과시켜 암페타민계 흥분제 5 종의 물질을 검출하는 방법이다.

비교예 2

화학적이온화 장치가 장착된 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용하는 방법으로 쇠구슬(ball)을 이용하는 일정 수준의 입자 크기로 세절한 후 2% 염산/메탄올 혼합용액을 이용하여 직접추출한 다음 물에 녹인 시료의 pH를 염기성으로 조절한 후 다시 고체상추출법으로 재추출 후 건고된 잔사에 2,2,2-trichloroethylchloroformate로 유도체화한 시료를 모세분리관을 통과시켜 암페타민계 흥분제 및 에페드린류 14 종의 물질을 검출하는 방법이다.

비교예 3

기체크로마토그래피-질량분석기를 이용하는 방법으로 탄환모양의 비드를 이용하여 마이크로미터 수준의 입자 크기로 모발을 자동세절한 후 수용액상에서 아세틸화 반응을 시키고 다시 고체상추출법과 MEPS(microextraction by packed sorbent)를 이용하여 두 번 재 추출하고 다량의 시료를 기체크로마토그래프(gas chromatograph)에 주입하여 메스암페타민, 암페타민의 총 2 종의 분석물질을 분석하는 방법이다.

실험 결과 및 종래의 방법과 비교했을 때 본 발명의 분석방법이 암페타민 유도체 및 케타민 대사체 분석에 상당히 효과적임을 나타내고 있다. 이는 시료의 자동세절 단계, 메탄올 직접추출법을 수행하는 단계, 마지막 과정으로 유도체화 과정과 기체크로마토그래피와 검출기로 질량분석기를 이용한 기기분석 단계를 포함하는 상기 검출 방법을 이용할 경우 높은 분석 감도의 확보, 정확성, 재현성, 분석의 신속성 및 간편성의 장점이 있다.

본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

도 1은 모발 시료를 자동세절한 후 프랑스 Cilas사 입도분석기(1064 particle size analyzer)를 이용하여 측정한 모발 입자의 크기를 나타낸 분포도이다.

도 2는 실제 메스암페타민 복용자의 모발을 이용하여 메탄올, 아세톤, 0.25 M methanolic hydrochloride(HCl) 혼합 용액의 3 종의 추출용매에 대한 추출효율을 비교한 결과를 표시한 막대그래프이다.

도 3은 본 발명에 따른 암페타민 유도체 및 노르케타민 5 종의 화합물에 대해 기체크로마토그래피-질량분석기로 분석한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.

도 4는 본 발명에 따른 암페타민 유도체 및 노르케타민에 대한 바탕모발, 분석 표준물질이 첨가된 모발, 실제 메스암페타민 복용자의 모발을 기체크로마토그래피-질량분석기로 분석한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.

Claims

모발 시료를 비드(bead)가 담긴 튜브에 넣고 3000-8000 rpm에서 30초 내지 2분 동안 자동 세절장치를 이용하여 마이크로미터(μm) 수준의 입자 크기로 세절하는 단계;

상기 세절 단계에서 얻은 세절 시료를 메탄올로 추출하는 단계;

상기 추출 단계에서 얻은 추출물을 원심 분리 후 여과하는 단계; 및

상기 여과 단계에서 얻은 여과액을 HFBA(heptaflourobutyric anhydride) 화합물을 이용하여 heptaflourobutyric acylation 유도체화를 거쳐 기체크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 다성분 동시 신속 분석법.
제 1항에 있어서, 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 다성분은 메스암페타민(MA, methamphetamine), 엠디엠에이(MDMA, 3,4-methylenedioxymethamphetamine), 암페타민(AP, amphetamine), 엠디에이(MDA, 3,4-methylenedioxyamphetamine), 노르케타민(NKT, norketamine)인 것을 특징으로 하는 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 다성분 동시 신속 분석법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 기체크로마토그래피는 질량분석기(Mass spectrometry)를 더 추가하는 것을 특징으로 하는 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 다성분 동시 신속 분석법.
제 4 항에 있어서, 상기 질량분석기로 분석시 분석물질에 대해 동위원소가 치환된 내부표준물질을 이용하여 정량하는 것을 특징으로 하는 암페타민 유도체 및 케타민 대사체의 다성분 동시 신속 분석법.