KR101029306B1 - 대마 대사체 분석방법 - Google Patents

Abstract

대마 대사체 분석방법으로써, 모발 시료를 밀리미터 수준의 입자 크기로 세절하는 단계; 상기 세절단계에서 얻은 시료를 강염기성 용액으로 가수분해하는 단계; 상기 가수분해단계에서 얻은 시료를 비드를 이용하여 액체상 추출 후 원심분리 하는 단계; 및 상기 원심분리 단계 후 추출액을 유도체 화합물을 이용하여 유도체화를 거쳐 기체크로마토그래프로 분리하는 단계를 포함하는 대마 대사체 분석방법이 개시된다.
본 발명에 의하면 모발 중 대마 대사체 분석에 비드를 이용하여 액체상추출을 수행함으로써, 추출에 사용되는 유기용매의 양을 절감하고 전처리 과정을 신속, 간편하게 처리할 수 있어 경제적이다. 또한 고속 원심분리 방법으로 추출물을 깨끗하게 정제할 수 있어 검출한계를 높일 수 있다.

Description

대마 대사체 분석방법{Method for determination of 11-nor-delta 9-tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid}

본 발명은 모발 중 대마 대사체를 분석하는 방법으로, 보다 상세하게는 비드를 이용한 액체상 추출, 원심 분리 및 유도체화 단계를 거쳐 기체크로마토그래프를 포함하는 분석방법이다.

대마(cannabis)는 세계적으로 가장 남용이 많이 되는 약물로 국내에서는 암페타민계 마약류에 이어 두 번째로 남용빈도가 높은 마약이다. 대마 성분 중 활성물질은 테트라하이드로칸나비놀(delta 9-tetrahydrocannabinol, THC)로 대마를 흡연하게 되면 체내 대사과정을 거쳐 테트라하이드로칸나비놀 카복실산(11-nor-delta 9-tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid, THC-COOH)이 생성되는 것으로 보고되어 있다.

일반적으로 마약류 복용여부 확인을 위해서는 모약물(parent drug)과 대사체 또는 대사체 한 성분을 분석하기도 한다. 따라서 대마의 흡연 여부를 판별하기 위해서는 체내 대사과정에서의 생성되는 대사체인 THC-COOH를 분석해야 한다.

일반적으로 마약분석에 사용되는 시료는 소변과 모발이다. 대마는 소변감정으로 흡연 후 1~2주 정도까지 확인이 가능한 반면, 모발감정은 수개월 전 흡연 사실 뿐만 아니라 시기나 빈도 등 남용이력까지도 추정이 가능한 장점이 있다.

그러나 대마의 불법적인 복용여부 확인은 최근까지 소변을 이용한 분석법만을 이용하여 복용 여부를 확인할 수 있었다. 이는 다른 마약과 달리 대마 대사체 성분이 모발로 전이되는 비율이 현저히 낮아 결과적으로 모발에 잔류하게 되는 농도가 매우 낮게 되어 분석이 쉽지 않았기 때문이다.

따라서 효과적인 대마 모발 분석을 수행하기 위해서는 극미량분석이 가능한 고감도 분석법의 도입이 필수적이며 이러한 어려움으로 최근까지 대마 대사체 성분에 대한 모발감정 기법을 실제 감정에 적용한 국가는 미국, 독일 등 극히 일부에서만 분석법을 자체 개발하여 분석을 수행하고 있는 상황이다.

현재 우리나라의 마약 시장은 수입처가 다변화될 뿐만 아니라 외국인 노동자, 해외교포 및 유학생 등을 통한 마약의 국제적 유통이 과거에 비해 빈번해져 마약의 국내 반입이 손쉽게 이루어지는 상황이다. 대마의 유입도 기존의 대마초 보다 환각효과가 훨씬 강한 해쉬쉬, 보관 및 복용이 간편한 대마 쿠키 등 대마 성분을 포함한 다양한 형태의 마약류가 유통되고 매년 대마사범의 구성비가 크게 증가하고 있고 국내의 대마의 남용 빈도가 더욱 빈번해짐에 따라 장기간의 복용여부 확인이 가능한 대마 모발 분석법 개발 및 적용에 대한 요구와 관심이 집중되고 있는 실정이다.

앞서 기술하였듯이 모발 분석은 약물은 모근으로부터 모발에 축적되어 성장하게 되므로 모발의 길이에 해당하는 기간 동안 약물 복용 여부를 확인할 수 있으며, 모발 시기추정 분석(hair sectional analysis)을 통해 상습 복용 여부도 확인할 수 있는 장점이 있다. 반면 분석과정이 소변 분석법에 비해 복잡하고 사람의 노동력이 많이 소요되며 극미량 분석을 수행하여야 하는 단점이 있다.

일반적인 대마 대사체 모발 분석 과정은 여섯 단계로 구분할 수 있다. 모발의 세척(decontamination), 세절(pulverization), 가수분해(incubation), 추출(extraction), 정제(purification) 그리고 기기분석(instrumental analysis)으로 구성된다. 일련의 모발 분석 과정은 대체로 처리 시간이 많이 소요되고 상당한 노동력이 투여되는 분석 방법으로 여겨지고 있다.

통상적인 모발 중 대마 대사체 분석과정은 노동 집약적이고 처리기간이 길게 소요되는 문제가 있다. 따라서 모발 세절 단계에서의 시간단축이 요구되며, 추출단계에서 소요되는 시간과 단계를 줄이려는 노력들이 있어왔다.

종래의 세절시료로부터 유기 용매를 이용하여, 대마 대사체를 추출하는 액체상추출법은 시험관에 시료와 용매를 넣고 진탕하여 분석물질을 추출하는 과정으로 진탕 속도를 빠르게 할 경우 에멀젼(emulsion) 현상이 발생하여 분석물질의 추출률을 저하시키는 문제가 있었다.

따라서 대마 대사체의 추출률을 높이기 위해서는 에멀젼에 영향을 받지 않고 추출이 이루어질 수 있는 새로운 방법이 요구되고 있다.

상기 추출단계 후, 통상 정제과정은 가수분해 과정 시 발생되는 다량의 모발 단백질의 분해 물질을 효과적으로 제거하기 위한 단계이다. 이러한 방해물질은 액체상추출 후 원심분리 과정을 통해 추출물의 정제가 이루어진다.

종래의 액체상추출 방법에 따르면 추출과정을 거친 시료가 담긴 시험관은 통상 3200 g 이상에서 원심분리를 하는 경우 시험관이 손상되어 깨지는 경향이 있어 고속에서 충분한 층 분리를 이룰 수 없어서, 추출물의 깨끗한 정제가 되지 않을 수 있다. 고속에서도 원심분리가 가능하여 바람직한 정제 과정을 거칠 수 있는 방법이 고속원심분리법(high speed centrifugation)이다. 이 방법은 자동세절방법에서 사용된 분쇄용기를 동일하게 사용할 수 있어 시료의 손실을 최소화할 수 있으며, 짧은 시간 내에 효과적인 정제가 이루어질 수 있도록 진행된다.

생체시료에서 마약 분석에 기준이 되는 분석기기는 기체크로마토그래프-질량분석기(gas chromatograph-mass spectrometer, GC-MS)로 우선 크로마토그래피법으로 분석 물질을 분리하고 질량분석법을 이용하여 분리된 물질의 확인이 가능한 장점이 있다. 따라서 모발 중 마약류 복용 여부 확인에 사용되는 방법 역시 크로마토그래피법과 질량분석법이 접목된 분석법이 많이 사용되고 있다.

최근 기체크로마토그래프로 분리가 어려운 물질이나 열적 안정성이 낮은 물질의 경우 액체크로마토그래프-질량분석기(liquid chromatograph-mass spectrometer)를 다양한 마약류 분석에 이용하는 사례가 보고되고 있다. 그러나 기체크로마토그래피-질량분석법을 이용하여 극성물질을 분석하는 경우 분석물질의 극성작용기를 비극성으로 전환시키는 다양한 유도체화 기법(derivatization)이 상용화되어 있어 기체크로마토그래프를 이용한 극성물질의 분석이 가능하다.

종래 기술로써 THC-COOH 분석에 사용된 유도체화 방법은 N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(MSTFA) 유도체화 시약을 이용한 trimethylsilylation 방법과 전자충격(electron impact) 이온화 방식을 적용하여 다양한 암페타민계 흥분제 성분과 동시분석에 응용한 사례가 있으나, 이 방법은 플로린과 같이 전자를 많이 함유하고 있는 원자를 포함하고 있지 않아 화학적 이온화 과정을 이용한 극미량분석에 적합하지 않다.

종래의 방법 중에는 모발의 기질로부터 과도하게 추출된 분석방해 물질의 제거를 위해 추가적인 정제 단계를 접목시킨 방법이 있다(Sachs and Dressler, Forensic Sci Int., 107 (2000) 239). 이러한 방법에는 부가적인 단계가 포함되어 결국 전처리과정이 복잡해지고 일상적인 분석에 이용하기 어렵게 된다.

따라서 모발 중 대마 대사체 분석을 신속하고 비용측면에서 경제적이고 고감도 분석을 수행하기 위한 분석법을 정립하기 위해서는 전처리 단계를 자동화하고 단순화하여 신속한 분석에 적합하게 하며, 소량의 용매를 사용하여 분석물질 추출을 용이하게 하고 방해물질을 효과적으로 제거할 수 있는 정제 단계를 포함하며, 유도체화 화학반응과 적절한 이온화 방식을 적용하여 충분한 분석 감도를 확보할 수 있으며 일상적으로 쉽게 분석이 가능한 마약 분석법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

추출과정 시 회수율을 저하시키는 주요 요인인 에멀젼 현상을 극복하고 추출에 사용되는 용매의 양을 절감할 수 있고, 방해물질 제거 및 시료 정제에 효과적인 고속원심분리법과 화학적 이온화에 적합한 유도체화 방법 등의 사용을 통하여 대마 대사체의 고감도 분석이 가능하고 정확, 정밀하게 정량할 수 있는 방법 제공을 목적으로 한다.

다만, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 평균적 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 구체예에서, 모발 시료를 밀리미터 수준의 입자 크기로 세절하는 단계; 상기 세절단계에서 얻은 시료를 강염기성 용액으로 가수분해하는 단계; 상기 가수분해단계에서 얻은 시료를 비드를 이용하여 액체상 추출 후 원심분리 하는 단계; 및 상기 원심분리 단계 후 추출액을 유도체 화합물을 이용하여 유도체화를 거쳐 기체크로마토그래프로 분리하는 단계를 포함하는 대마 대사체 분석방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 상기 기체크로마토그래프로 분리된 화합물을 음이온 화학적 이온화(negative ion chemical ionization)과정을 거쳐 질량분석기(mass spectrometer)로 더 분석하는 대마 대사체 분석방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 상기 대마 대사체는 테트라하이드로칸나비놀 카복실산(THC-COOH)이다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 상기 세절하는 단계는 시료를 직경 2.8~3.0 mm 스테인리스 스틸 비드(stainless steel bead)가 담긴 1.5~2 mL 용량의 튜브에 넣고 30±5 Hz에서 8~10분 동안 자동 세절한다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 상기 비드를 이용하여 액체상 추출을 하는 단계는 상기 가수분해단계에서 얻은 시료에 혼합용매 n-hexane:ethyl acetate(9:1, v/v)를 첨가한 후 10±2 Hz에서 추출한다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 상기 액체상 추출 후 원심분리 하는 단계에서 원심 분리는 10000~30000 g에서, 3~5분간 수행한다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 상기 유도체 화합물은 pentafluoropropionic anhydride(PFPA)/pentafluoropropanol(PFPOH)이다.

본 발명의 다른 일 구체예에서, 상기 질량분석기는 이중질량분석기(tandem mass spectrometer)를 사용한다.

기타 본 발명의 구체예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.

본 발명에 따른 본 발명에 의하면 한 번의 세절로 수십개의 모발 시료를 동시에 자동세절 할 수 있어 전처리 시간을 단축하였으며, 비드를 이용한 액체상추출을 신규 고안하여 대마 대사체 추출률 저하의 주요 요인인 에멀젼 현상을 제거함으로써 추출 효율 향상과 사용되는 용매의 양을 현저히 절감하였다.

또한 비드를 이용하여 액체상 추출을 함으로써, 고속원심분리 방법을 정제과정에 도입하여 분리의 효율을 높일 수 있으며, 화학적 이온화 방식과 이에 적합한 유도체화 과정을 도입함으로써 고감도 분석이 가능하다.

도 1은 실제 대마 흡연자의 모발을 이용하여 음이온 화학적 이온화 방식을 적용한 기체크로마토그래프-이중질량분석기로 분석한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 2는 본 발명에 따른 실제 대마 흡연자(224명)의 모발에서 측정된 대마 대사체의 농도 분포를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명의 구체예를 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며, 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명의 일 측면에 따라, 모발 시료를 밀리미터 수준의 입자 크기로 세절하는 단계; 상기 세절단계에서 얻은 시료를 강염기성 용액으로 가수분해하는 단계; 상기 가수분해단계에서 얻은 시료를 비드를 이용하여 액체상 추출 후 원심분리 하는 단계; 및 상기 원심분리 단계 후 추출액을 유도체 화합물을 이용하여 유도체화를 거쳐 기체크로마토그래프로 분리하는 단계를 포함하는 대마 대사체 분석방법을 제공한다.

상기 대마 대사체는 테트라하이드로칸나비놀 카복실산(THC-COOH)이며, 다음의 화학식 1로 표시된다.

[화학식 1]

상기 대마 대사체는 테트라하이드로칸나비놀(THC)의 생체 대사체이며, THC는 다음의 화학식 2로 표시된다.

[화학식 2]

대마 대사체 테트라하이드로칸나비놀 카복실산은 대마에 포함되어 있는 칸나비노이드 성분 중 환각작용과 관련이 있는 주요 활성성분으로 알려진 테트라하이드로칸나비놀(THC)이 체내 대사과정을 거쳐 생성된 것이다. 현재 THC-COOH는 소변 및 모발 분석에서 대마 흡연 여부를 판정하는 기준 물질로 활용되고 있으며 통상 소변 중 THC-COOH는 대마 흡연 후 4~8 시간부터 최대 4주 정도까지 확인이 가능한 것으로 알려져 있고 모발의 경우 모발 길이에 따라 다르지만 수개월에서 1년 이내의 흡연 여부 확인이 가능하다.

본 발명의 분석 방법에서, 모발 시료 세절 단계는 모발을 구성하는 단백질이 염기성 용액에서 쉽게 가수분해 되도록 시료를 밀리미터 수준 이하의 크기로 세절한다.

모발 세절 방법은 특별히 한정되지 않으나, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 다량의 시료를 신속하게 처리할 수 있으며 인건비 절감이 가능한 자동분쇄장치를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 바람직하게는 시료를 직경 2.8~3.0 mm 스테인리스 스틸 비드(stainless steel bead)가 담긴 1.5~2 mL 용량의 튜브에 넣고 30±5 Hz에서 8~10분 동안 자동 세절한다.

모발 단백질과 결합된 대마 대사체 성분을 효과적으로 해리시키기 위해 가수분해 과정을 수행할 수 있으며 가수분해를 위해 적용할 수 있는 방법은 효소를 이용한 방법, 강염기성 용액(1~2 M 수산화나트륨 수용액)을 이용하는 방법, 초음파를 이용하는 방법 등이 사용가능하나, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 바람직하게는 수산화나트륨 수용액을 이용하여 가수분해한다.

본 발명에서는 가수분해 단계에서 얻은 시료를 비드를 이용하여 액체상 추출 후 원심분리하는 단계를 포함한다.

통상 이후 가수분해 단계에서 얻은 시료를 추출하는 단계에서, 추출방법으로, 액체상추출법과 고체상추출법 그리고 초음파 하에서 용매에 의한 직접추출법을 이용한다.

종래 수층에 존재하는 분석 대상물질을 유기층으로 추출하기 위해 통상 사용되는 액체상추출법은 시험관에 시료와 용매를 넣고 진탕하여 분석물질을 추출하는 과정으로 진탕 속도를 빠르게 할 경우 에멀젼(emulsion) 현상이 발생하여 분석물질의 추출 효율을 저하시키는 문제가 있다. 따라서 추출률을 높이기 위해서는 진탕 속도를 낮게 하고 진탕 시간을 늘림으로써 추출률을 향상시킬 수 있으나 전체적인 추출시간이 증가하는 단점이 있다.

또한 통상 액체상추출법은 시험관에 담긴 시료를 유기용매를 넣어 진탕기로 추출하는 과정을 거치게 되는데, 추출에 사용되는 유기용매의 양은 3~5 mL 정도로 많은 용매를 사용한다.

추출에 사용되는 시험관의 경우, 시료 및 용매의 부피가 커서 고속원심분리가 가능한 시험관을 사용하지 못하여, 통상 초자로 만들어진 시험관을 사용하게 되므로, 수층과 유기층을 분리하기 위해 통상 3200 g 이상에서 원심분리를 하는 경우 시험관이 손상되어 깨지는 경향이 있다. 따라서, 고속에서 충분한 층 분리를 이룰 수 없고 결국 추출물의 깨끗한 정제가 되지 않을 수 있다.

본 발명의 비드를 이용한 액체상 추출은 에멀젼 현상에 영향을 받지 않고 추출효율을 높일 수 있으며, 이후 원심분리시 고속 원심분리가 가능하며, 통상의 원심분리 시간보다 10배 이상 단축할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 20분 정도의 추출시간을 10분의 1 수준인 2분으로 단축가능하며, 특히 고강도 용기를 채택하여 원심분리시 30000 g에 이르는 고속 회전력도 견딜 수 있다.

본 발명의 비드를 이용한 액체상추출은 세절시 사용한 스텐인리스 스틸 비드(직경 2.8 mm-3.0 mm)가 폴리프로필렌 재질의 2 mL 튜브에 첨가된 상태에서 소량의 시료에 소량의 유기 용매를 첨가하여 추출이 진행된다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 0.7 mL의 시료에 0.8 mL의 유기용매를 첨가하여 추출이 가능하다. 이때 비드의 역할은 시료인 수층과 첨가된 유기용매를 5-20 Hz의 속도로 강제적으로 shaking 하여 휘저어 섞어 주게 되므로 짧은 시간 안에 충분한 추출 효율을 얻을 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 액체상 추출은 바람직하게는 10±2 Hz에서 추출되며, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 추출시간은 바람직하게는 2분이상이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 액체상 추출에 사용되는 용매는 바람직하게는 노르말 핵산과 에틸아세테이트의 혼합물이며, 가장 바람직하게는 상기 핵산:에틸아세테이트의 비율이 9:1(v/v)이다.

비드를 이용한 액체상추출은 종래의 방법보다 사용되는 용매의 양을 1/3로 절감 효과를 얻을 수 있으며 다량의 시료를 한 번에 추출하는 시간이 통상의 방법보다 전처리 시간을 상당히 단축하는 효과를 얻을 수 있다.

또한 초자로 만들어진 시험관과 달리, 시료 및 추출용매가 소량으로 사용되므로, 유리 초자이외에 고속원심분리가 가능한 고강도 시험관을 사용할 수 있어 고속원심분리가 가능하므로 수층과 유기층이 깨끗이 분리되는 장점이 있다.

가수분해 과정에서 발생한 모발의 기질 효과(matrix effect; 정량하고자 하는 이온이 모발 자체의 기질의 영향으로 실제보다 적게 검출되거나 그 반대로 실제보다 많은 양이 있는 것처럼 나타나는 현상)에 의한 방해물질의 영향이 커지게 되므로 추출물의 정재과정을 통해 기질의 영향을 감소시키고 추출물로부터 분석 대상물질과 함께 추출되는 방해물질을 효과적으로 제거하는 과정이 필요하다.

상기 비드를 이용하여 액체상 추출 후, 원심분리하는 단계에서, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 바람직하게는 10000-30000 g에서 3-5분간 고속원심분리하여 추출물을 정제할 수 있다.

상기 과정을 거침으로써 시료의 기질 효과가 감소하여 정제 상태가 바람직하며, 재현성이 높고, 일정한 머무름 시간을 가지고 정량분석을 할 수 있다.

상기 원심분리 단계 후 추출액을 유도체 화합물을 이용하여 유도체화한다. 유도체 화합물은 TFAA(Trifluoroacetic anhydride), PFPA(pentafluoropropionic anhydride), HFBA(heptaflourobutyric anhydride), PFPOH(pentafluoropropanol)과 HFIP(hexafluropropanol)이며, 바람직하게는 pentafluoropropionic anhydride(PFPA) 및 pentafluoropropanol(PFPOH)를 이용한다.

상기 유도체화 기법을 사용함으로써, 유도체화 기법을 사용하지 않았을 경우 모세분리관(capillary column)에 분석 대상물질의 흡착으로 분석이 어려운 화합물을 효과적으로 검출할 수 있다. 유도체화 기법을 사용하여 대마 대사체를 PFPOH와 PFPA로 유도체화 반응을 수행하는 경우, 피이크(peak) 모양과 인텐서티(intensity)의 증가를 이룰 수 있어 정량범위내의 직선성이 향상되어 분석 감도의 개선을 제공한다. 이때 유도체화의 조건은 50~80 ℃의 온도 범위에서 설정이 가능하지만 바람직하게는 70 ℃에서 30분간의 반응조건을 선정할 수 있다.

유도체 반응이 완결된 추출물에 대한 기기분석에 앞서 재 용해된 추출물에 대한 정제 과정을 거친다. 이때 바람직한 정제 방법으로는 방해물질을 효과적으로 걸러낼 수 있는 시린지 필터(syringe filter)를 사용할 수 있다. 필터의 재질은 테플론(polyvinylidene fluoride, PVDF)으로 통과가능한 입자의 크기는 0.2 μm가 바람직하다.

한편, 기체크로마토그래프와 질량분석기를 이용하여 시료를 분석하는 경우, 먼저 기체크로마토그래프에 장착된 모세분리관의 고정상과 이동상 사이에서 흡착성 또는 분배계수의 차를 이용하여 분리된 성분은 머무름 시간의 차이를 두고 질량분석기로 주입된다. 도입된 시료는 이온화 장치에 의하여 분석물질이 이온화된다.

본 발명에서는 상기 기기분석 단계에서 모세분리관을 사용함으로써, 분석물질을 바람직하게 검출할 수 있다. 이때 모세분리관은 5% phenyl-과 95% methyl-polysiloxane으로 정지상이 구성되어 있고 모세관의 길이가 30 m, 직경이 0.25 mm, 정지상의 두께가 0.25 μm인 모세분리관을 사용하는 것이 바람직하며, 이를 사용하는 경우, 분리능(resolution)과 인텐서티의 증가를 이룰 수 있어 검출감도 개선을 제공한다.

분리조건 설정단계에서는 기체크로마토그래프의 오븐 온도를 단계별 조절하여 각각의 분석물질의 머무름 시간과 분리 조건을 조정할 수 있다. 이때 적용되는 온도 조건은 기질로부터 유래한 방해물질의 영향을 최소화하며 분석물질이 빠른 시간 내에 모두 분석될 수 있도록 설정한다.

기체크로마토그래프의 분리관 온도 조절 단계에서 분석 대상물질 분석시 등온과 가온을 가함으로써 분석물질과 방해물질을 구분하고 각 성분에 해당되는 크로마토그램의 분리능을 향상시키기 위해 100-300 ℃의 온도 범위로 선정할 수 있다.

기체크로마토그래프 분석시 분자량이 큰 분석물질은 피이크 꼬리끌림(peak tailing) 현상 제거와 감도 향상을 위해 모세분리관의 유량을 0.7~1.4 mL/min으로 선정할 수 있으며, 바람직하게는 1.0 mL/min의 유량을 사용할 수 있다. 시료 주입방식은 split과 splitless 방식이 있으나 고감도 분석에 바람직하게는 splitless 방식으로 사용할 수 있다.

기체크로마토그래프용 모세분리관은 직경 0.1-0.53 mm인 분리관을 사용할 수 있다. 분리관의 고정상으로는 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane과 100% dimethylpolysiloxane을 사용할 수 있다. 이동상으로는 질소, 수소, 헬륨 기체를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 고순도 헬륨기체를 사용할 수 있다.

상기 기체크로마토그래프의 모세분리관을 통과하여 분리된 시료는 이중질량분석기(MS/MS)로 분석하기에 앞서 화학적 이온화 방식(NCI)을 이용하여 이온화시킬 수 있다. 이온화 방식으로는 음이온과 양이온 화학적 이온화 방식을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 음이온 화학적 이온화 방식을 사용할 수 있다.

이온화된 검출이온은 분석물질의 첫 번째 사중극자에서 얻은 질량스펙트럼에서 특성이온을 선정하고 선정된 특성이온은 세 번째 사중극자를 통과해서 얻은 질량스펙트럼에서 특성이온을 선정하여 이온쌍(transition pair)을 선정하고 정량 이온쌍과 정성 이온쌍으로 구분하여 분석한다.

상기 이중질량분석기로 분석하는 단계에서 정성 및 정량 분석 시 질량분석기의 MRM(multiple reaction monitoring) 방식에서 정량하는 것은 신호대잡음비(signal to noise ratio)를 개선하기 위한 것이다. 즉, 분석 대상물질의 특성 이온쌍을 선정하여 MS/MS에서 검출하는 MRM 방식으로 분석하는 것이 바람직하다.

MRM 방식을 이용하는 경우에는 분석 대상 물질에 대해 서로 다른 2개의 특성 이온쌍을 선정하고 중수소가 치환된 내부표준물질의 특성 이온쌍을 함께 검출하는 경우 선택성(selectivity)이 높아지고 분석 감도(sensitivity)가 개선되며 높은 정밀도와 정확도로 분석 대상물질을 분석할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예 및 비교예를 기재한다. 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 수십개의 모발 시료를 동시에 밀리미터 수준 이하의 입자 크기로 자동 세절하는 제 1 단계

이소프로필알코올로 세척한 모발을 2 cm 이하의 크기로 절단한 후, 시료 중 25 mg을 취하여 직경이 2.8 mm의 스테인리스 스틸 비드 3개가 담긴 2 mL 용량의 튜브에 담아 1회 최대 처리량이 48개인 독일 레취사의 자동분쇄장치(Qiagen TissuLyserⅡ)로 30 Hz에서 8분간 세절하였다.

세절된 모발 입자의 크기는 1 밀리미터 이하의 크기를 유지하여, 가수분해 반응에 적합하도록 하였다. 가수분해에 앞서 세절된 모발 시료에 내부표준용액(1.0 ng/mL for THC-COOH-d ₉ ) 50 μL를 첨가하였다.

2. 세절 시료를 강염기성 용액으로 가수분해 한 후 혼합 유기용매를 첨가하여 비드를 이용한 액체상추출법으로 추출하고, 이어 고속원심분리법으로 정제하는 단계 및 상기 추출물을 PFPA / PFPOH 유도체화 반응을 거쳐 기체크로마토그래프로 분리하는 제 2 단계

모발과 분석 대상물질의 결합이 끊어지게 하는 가수분해 반응을 강염기성 용액에서 진행한다. 상기 내부표준물질이 첨가된 시료에 1 M 수산화나트륨 수용액 0.7 mL를 첨가한 후 95 ℃에서 30분간 가열하였다. 완전히 가수분해된 시료에 아세트산 120 μL를 첨가하여 산성화 시킨 후 n-hexane:ethyl acetate(9:1, v/v) 0.8 mL를 첨가한 후 10 Hz에서 2분간 비드를 이용하여 shaking 하여, 액체상추출을 수행하였다.

상기 추출액을 30000 g에서 3분간 고속원심분리하여 정제하였다. 정제된 추출액을 증발시킨 잔사에 PFPOH 30 μL와 PFPA 50 μL를 첨가한 후, 70 ℃로 유지된 반응기에서 30분간 반응시키는 유도체화 실험을 수행하였다. 이때 분석 대상물질인 THC-COOH의 특징적인 작용기인 카르복실산기는 PFPOH로 alkylation 유도체화 반응을 시켰으며 알코올기를 PFPA로 acylation 유도체화 반응을 수행하였다. 혼합물을 질소기류 하에서 증발시킨 후 잔사에 에틸아세테이트 100 μL 첨가하여 잘 혼합한 용액을 시린지 필터로 정제하였다. 시린지 필터로는 0.2 μm 이하의 입자를 통과시킬 수 있는 영국 Whatman사 테플론 재질의 필터를 사용하였다.

3. 음이온 화학적 이온화( NCI ) 방식과 이중 질량분석기( MS / MS )를 이용하여 모발 중 대마 대사체를 정성, 정량 분석하는 제 3 단계

상기 단계의 시린지 필터링 후 여액 중 일부(1 μL)를 취해 기체크로마토그래프-이중질량분석기에 주입하였다. 사용된 기체크로마토그래프는 자동주입기가 장착된 미국 에질런트사의 기체크로마토그래프(6890N GC)를 사용하였다.

이때 모세분리관의 온도는 초기 온도를 100 ℃로 설정하여 1분간 유지시킨 다음 35 ℃/min으로 275 ℃까지 승온하여 3분간 유지시킨 후 25 ℃/min으로 300 ℃까지 승온하여 3.5분간 유지시킨다. 이때 기체크로마토그래프의 주입구와 질량분석기의 연결부위의 온도는 260과 280 ℃로 설정하였고 비분할방식(splitless mode)으로 시료를 주입하였고 1분이 경과한 후 분할 방식으로 전환하였다.

도 1에서 나타난 것처럼, 본 발명의 기체크로마토그래프와 이중질량분석기를 이용한 모발 중 대마 대사체 고감도 분석법을 이용할 경우 모세분리관을 통과시키는 단계에서 화학적 물성이 서로 다른 분석 물질을 분리해 낼 수 있었다.

검출기로 사용한 이중질량분석장치(MS/MS)는 미국 워터스사의 Quattro micro GC 검출기로 음이온 화학적 이온화 방식으로 분석 대상물질을 이온화시켰으며 이때 반응기체로 메탄을 사용하였다. MS/MS 분석을 위해 사용된 충돌기체(collision gas)는 아르곤을 사용하였고 이때 압력은 3.0±0.3 mTorr이다. 이온화장치와 사중극자의 온도는 230과 150 ℃로 설정하였다.

또한 신호대잡음비(signal to noise ratio)를 개선하고 검출감도를 향상하기 위하여 분석 대상물질이 이온화장치에 의해 발생된 특징적인 이온들을 검출하는 MRM 방식으로 분석을 수행하였다.

정성 및 정량분석을 위한 분석 대상물질의 특성 이온쌍들을 표 1에 나타내었다. 분석물질과 내부표준물질에 해당되는 이온쌍을 적용하여 이중질량분석기로 검출한 실제 대마 흡연자의 모발 분석 크로마토그램(MRM chromatogram)을 도 1에 나타내었다.

그 결과 본 발명의 기체크로마토그래프와 검출기로 이중질량분석기를 이용한 대마 대사체 고감도 분석방법을 이용하여 검출한계 0.015 pg/mg 까지 정성정량 분석할 수 있었다. 또한 노동력과 시간이 많이 소요되는 모발 세절 과정을 자동화함으로써 분석시간을 앞당길 수 있었고 신규 고안된 비드를 이용한 액체상추출법으로 사용되는 용매의 양을 절감하고 추출 효율을 향상시켰으며, 모발 내 기질로부터 유래한 방해물질을 고속원심분리법으로 보다 효과적으로 추출물을 정제하였으며 실제 대마 흡연자의 모발에 본 발명의 고감도 분석법을 적용했을 때 산업이용가능성이 크다는 것을 보여주고 있다 (표 3).

정량분석은 MRM 크로마토그램에서 나타난 피이크의 면적을 합한 후, 내부표준법을 적용하여 검량선을 그려 함량을 결정하였다. 분석법의 정밀도와 정확도는 저, 중, 고 농도의 quality control 시료(n=6)로 측정하였고 그 결과를 표 2에 나타내었다. 또한 실제 대마 흡연자의 모발 시료의 정량분석 결과를 도 2에 나타내었다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

4. 본 발명 및 종래 기술의 추출용매 및 세절 방법 비교

본 발명의 비드를 이용한 액체상추출법과 기체크로마토그래피 및 화학적 이온화 방식을 이용한 모발 중 대마 대사체 분석방법에 대한 세절방법 및 처리용량, 추출방법, 용매 사용량, 유도체화 방법, 이온화 방법, 검출한계(limit of detection), 정량범위 값을 종래의 대마 대사체 분석법과 비교하였다.

종래 기술로써, 화학적 이온화 장치가 장착된 기체크로마토그래프-이중질량분석기를 이용하는 방법(비교예 1: Marsili et al., Rapid Commun Mass Spectrom., 19 (2005) 1566), 액체크로마토그래프를 이용한 정제과정과 이용한 화학적 이온화 장치가 장착된 기체크로마토그래프-질량분석기를 이용하는 방법(비교예 2: Sachs and Dressler, Forensic Sci Int., 107 (2000) 239)을 본 발명과 비교하였으며, 그 결과를 표 4에서 보여주고 있다.

실시예 1

상기 제 1 단계 내지 3 단계에 의해 대마 대사체 분석을 수행하였다.

비교예 1

화학적 이온화 장치가 장착된 기체크로마토그래프-이중질량분석기를 이용하는 방법으로 가위를 이용하여 모발을 세절한 후 강염기성 용액으로 가수분해한 후 heptane:ethyl acetate 혼합 용매를 이용하여 액체상추출법을 수행한 다음 PFPA/PFPOH로 유도체화한 시료를 모세분리관으로 분리한 후 대마 대사체 분석을 수행하였다.

비교예 2

액체크로마토그래프에 의한 정제과정과 음이온 화학적 이온화 장치가 장착된 기체크로마토그래프-질량분석기를 이용하는 방법으로 가위를 이용하여 모발을 세절한 후 강염기성 용액으로 가수분해한 후 n-hexane:ethyl acetate 혼합 용매를 이용하여 액체상추출법을 수행한 다음 액체크로마토그래프로 정제과정을 거친 후 시료를 다시 n-hexane:ethyl acetate 혼합 용매로 액체상추출법으로 재추출한 다음 PFPA/HFIP(hexafluoropropanol)로 유도체화한 시료를 모세분리관에 통과시켜 대마 대사체 분석을 수행하였다.

[표 4]

실시예 및 비교예를 비교했을 때, 본 발명의 분석방법이 대마 대사체 분석에 상당히 효과적임을 나타내고 있다. 이는 시료의 자동세절 단계, 비드를 이용한 액체상추출법을 수행하는 단계, 정제 단계, 마지막 과정으로 음이온 화학적 이온화 방식(NCI)에 적합한 유도체화 과정, 검출기로 이중질량분석기(MS/MS)를 이용한 기기분석 단계를 포함하는 상기 분석 방법을 이용할 경우 높은 분석의 신속성 및 간편성, 자동화를 통한 비용 절감, 바람직한 분석 감도의 확보, 분석결과의 정확성, 재현성의 장점이 있다.

Claims (8)

1. 20-25 mg의 모발 시료를 직경 2.8~3.0 mm 스테인리스 스틸 비드(stainless steel bead)가 담긴 1.5~2 mL 용량의 폴리프로필렌 튜브에 넣고 30±5 Hz에서 8~10분 동안 밀리미터 수준의 입자 크기로 자동 세절하는 단계;
   상기 자동 세절단계에서 얻은 시료를 강염기성 용액으로 가수분해하는 단계;
   상기 가수분해단계에서 얻은 시료에 0.5-2.0mL 용매를 첨가한 후 비드를 이용하여 1-5분간 액체상 추출 후 10,000-30,000 g에서 3~5분간 초고속 원심분리 하는 단계; 및
   상기 원심분리 단계 후 추출액을 유도체 화합물을 이용하여 유도체화를 거쳐 기체크로마토그래프로 분리하는 단계를 포함하며,
   상기 자동 세절하는 단계, 가수분해하는 단계 및 액체상 추출 후 초고속 원심분리 단계는 상기 자동 세절하는 단계에서 사용된 1.5-2 mL 용량의 폴리프로필렌 튜브내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 대마 대사체 분석방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 분석방법은 상기 기체크로마토그래프로 분리된 화합물을 음이온 화학적 이온화(negative ion chemical ionization)과정을 거쳐 질량분석기(mass spectrometer)로 더 분석하는 것을 특징으로 하는 대마대사체 분석방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 대마 대사체는 테트라하이드로칸나비놀 카복실산(THC-COOH)인 것을 특징으로 하는 대마 대사체 분석방법.
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 비드를 이용하여 액체상 추출을 하는 단계는 상기 가수분해단계에서 얻은 시료에 혼합용매 노르말 핵산:에틸 아세테이트(9:1, v/v)를 첨가한 후 10±2 Hz에서 추출하는 것을 특징으로 하는 대마 대사체 분석방법.
6. 삭제
7. 제 1항에 있어서, 상기 유도체 화합물은 pentafluoropropionic anhydride(PFPA)/pentafluoropropanol(PFPOH)인 것을 특징으로 하는 대마 대사체 분석방법.
8. 제 2항에 있어서, 상기 질량분석기는 이중질량분석기(tandem mass spectrometer)를 사용하는 것을 특징으로 하는 대마 대사체 분석방법.
   

Images