KR101374193B1

KR101374193B1 - 면역 반응 측정법을 이용한 모발 중 마약 성분 신속 분석법

Info

Publication number: KR101374193B1
Application number: KR1020130111695A
Authority: KR
Inventors: 정재철; 인문교; 김진영; 이재일
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-09-17
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2014-03-14

Abstract

본 발명은 면역반응측정법을 이용한 모발 중 마약성분 신속분석법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (i) 모발 시료를 용매로 세척하는 단계; (ii) 상기 세척된 모발을 세절한 후, 모발 시료를 효소를 사용하여 액상화하는 단계; (iii) 상기 액상화된 모발 액체시료를 원심분리기로 분리하는 단계; 및 (iv) 상기 원심분리된 상층의 모발 액체시료를 면역반응측정법을 사용해서 모발 중 마약 성분을 정량화하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, 특정 마약성분을 빠른 시간 내에 확인할 수 있어 매우 실용적이며, 분석의 신속성 면에서 실제 활용도가 높다.

Description

면역 반응 측정법을 이용한 모발 중 마약 성분 신속 분석법{Rapid analysis of abused drugs using an immunoassay in hair}

본 발명은 면역 반응 측정법을 이용한 모발 중 마약 성분 신속 분석법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 모발 시료를 세척하는 단계, 액상화하는 단계, 원심분리 하는 단계 및 면역반응측정법을 이용하여 모발 중 마약 성분을 정량화하는 단계를 포함한다.

암페타민계 각성제 (amphetamine-type stimulants) 중 국내에서 가장 많이 남용되고 있는 마약성분은 메트암페타민(methamphetamine; MA)과 엠디엠에이( 3,4-methylenedioxymethamphetamine; MDMA)이다. 이들 마약성분에 대한 남용여부 확인은 주로 생체시료인 사람의 소변이나 모발을 통해 이뤄진다.

마약성분을 남용하게 되면 체내에서 일정 기간 동안 잔류 한 후 신체 외부로 빠져나가게 된다. 소변에서 마약성분을 검출 할 수 있는 기간은 일반적으로 수 일에서 몇 주 정도이지만, 모발의 경우는 모발을 자르지 않는 한 모발 자체에 마약성분이 그대로 잔류하고 있어 수개월 이상까지도 분석이 가능하다. 그래서 소변 보다는 모발시료를 이용한 마약성분 확인이 더 효과적인 결과를 얻을 수 있어, 국내에서는 모발분석을 통한 마약성분 남용여부 확인이 많이 이뤄지고 있다.

그러나 모발분석은 복잡한 전처리 실험과정을 거쳐야하며, 처리시간과 노동력이 많이 필요하고, 검출 농도 또한 모발 밀리그램(mg)당 나노그램(nanogram) 이하의 매우 낮은 상태의 고감도 분석으로 마약성분을 검출해야하기 때문에 소변분석 보다 쉽지 않다.

모발 전처리 실험과정(Kim et al., J. Anal. Toxicol., 29(2005) 370)은 모발의 세척, 건조, 길이 및 무게측정, 미세 세절, 마약성분 추출단계 등 여러 단계를 거치는 반면, 소변분석에서는 상기 전처리는 대부분 불필요한 단계들이다. 모발시료의 전처리 실험과정 최종단계가 끝난 후, 기체크로마토그래피-질량분석법(gas chromatography-mass spectrometry; GC-MS), 기체크로마토그래피-이중질량분석법(GC-MS/MS), 액체크로마토그래피-질량분석법(liquid chromatography-mass spectrometry; LC-MS), 액체크로마토그래피-이중질량분석법(LC-MS/MS)과 같은 정밀분석방법(confirmation method)을 이용하여 마약성분을 확인하게 된다.

일반적으로 고체 시료인 모발분석은 액체시료인 소변분석처럼 특정 마약성분에 대해 면역반응측정법(immunoassay; IA) 원리를 이용한 신속분석방법(Ruangyuttikarn et al., J. Anal. Toxicol., 12(1988) 229)을 적용하기가 쉽지 않다. 왜냐하면, 시료상태 자체가 고체 모발시료이거나, 모발 전처리 실험과정을 거쳐서 처리된 액체시료 상태가 수소이온농도(pH) 등과 같은 화학적 특성이 소변과 다르기 때문에 IA 방법과 같은 신속분석방법을 적용하기에는 어렵다.

예컨대, 소변 기질(matrix)의 경우 액체상 자체로 별도의 메트릭스 변형 없이 면역반응측정법으로 바로 분석 가능하지만, 모발 메트릭스의 경우는 소변과 같은 조건인 비슷한 수소이온농도(pH)의 액체상 상태로 물성을 변형시켜 주는 과정을 거쳐야만 소변처럼 바로 분석이 가능하다. 그러나, 소변에서는 장기간 마약성분이 잔류할 수 없기 때문에, 모발을 이용하는 장점이 있다.

소변의 경우 신속분석방법을 통해 음성시료(특정 마약성분이 없거나 검출 농도 미만인 시료)를 1차로 확인해 내고, 양성시료(특정 마약성분이 검출 농도 이상인 시료)만 다시 2차 정밀분석방법을 적용하여 최종분석결과를 재확인한다.

모발분석은 위의 소변분석처럼 신속분석방법을 적용할 수 없기 때문에 음성 또는 양성시료와 상관없이 모든 시료에 대해 복잡한 전처리 실험과정을 거친 후 정밀분석방법을 적용하여 결과를 얻어 내야 한다.

만일 모발시료의 복잡한 전처리 실험과정 중 일부 단계를 생략하거나 개선한 후 모발시료를 소변시료와 같은 액체시료로 만든 후, 모발 메트릭스의 정제과정을 거쳐 IA 방법과 같은 신속분석방법을 적용 할 수 있다면, 모든 모발시료에 대해 정밀분석방법을 적용할 필요가 없으므로 복잡한 전처리 실험과정, 처리시간과 노동력이 불필요하게 되어, 신속하고 효과적인 모발분석이 이뤄질 것이다.

일반적으로 IA 원리를 이용한 소변 또는 모발신속분석방법으로는 효소면역반응측정법(enzyme immunoassay; EIA), 효소연계면역반응측정법(enzyme-linked immune-sorbant assay; ELISA), 형광편광면역반응측정법(fluorescence polarization immunoassay; FPIA), 라디오면역반응측정법(radio immunoassay; RIA) 등이 있다.

현재 메트암페타민 성분이 양성으로 인정되는 기준 농도는 0.5 ng/mg이다.

IA 방법을 신속분석법으로 적용하기 위한 전제 조건으로, 정밀분석법 결과와 90% 이상 일치하는 신뢰성 있는 신속분석법 결과가 있어야 한다. 신뢰성 있는 신속분석법을 위해서는 정밀분석 결과 및 신속분석 결과 간의 상관관계로부터 계산된 민감도(sensitivity; SE)와 특이성(specificity; SP)이 각각 90% 이상이 되어야 한다.

모발에서 MA 또는 MDMA 성분 확인을 위해 IA 방법을 적용한 사례들이 보고되고 있다. 그러나 검출하고자하는 특정 기준 농도를 낮추기 위해 많은 양의 모발시료(50 mg 이상)를 사용하거나(Kintz et al., Forensic Sic. Int., 37(1992) 328), 고체 모발시료를 액체화시키는데 걸리는 시간이 너무 길거나(Cassani et al., Forensic Sic. Int., 63(1993) 175), 고체 모발시료를 복잡한 전처리 실험과정(세척, 건조, 무게측정, 미세 세절, 추출, 재건조)을 거쳐 액체화된 모발시료를 IA 방법에 적용하였다(Miki et al., J. Anal. Toxicol., 26(2002) 274).

현재까지는 MA 또는 MDMA성분에 대해 IA 방법을 통한 실용적인 모발신속분석법이 없어, 양성이든 음성이든 모든 모발을 복잡한 전처리 실험과정을 거쳐 확인되는 모발정밀분석방법만을 적용하고 있는 실정이다.

상기한 문제점을 극복하기 위해 본 발명은 (i) 모발 시료를 용매로 세척하는 단계; (ii) 상기 세척된 모발을 세절한 후, 모발 시료를 효소를 사용하여 액상화하는 단계; (iii) 상기 액상화된 모발 액체시료를 원심분리기로 분리하는 단계; 및(iv) 상기 원심분리된 상층의 모발 액체시료를 면역반응측정법을 사용해서 마약 성분을 정량화하는 단계를 포함하는 면역반응측정법을 이용한 모발 중 마약성분 신속분석법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

다만, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 또 다른 기타 기술적 문제점들은 아래의 기재로부터 보편적 기술자들에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

발명의 일 측면에 따라, 본 발명은 (i) 모발 시료를 용매로 세척하는 단계; (ii) 상기 세척된 모발을 세절한 후, 모발 시료를 효소를 사용하여 액상화하는 단계; (iii) 상기 액상화된 모발 액체시료를 원심분리기로 분리하는 단계; 및(iv) 상기 원심분리된 상층의 모발 액체시료를 면역반응측정법을 사용해서 마약 성분을 정량화하는 단계를 포함하는 면역반응측정법을 이용한 모발 중 마약성분 신속분석법을 제공한다.

본 발명의 일 측면 중 일 구체예에 따르면, 상기 마약성분은 메트암페타민(Methamphetamine; MA), 암페타민(Amphetamine; AP) 또는 이들의 혼합물이다.

본 발명의 일 측면 중 일 구체예에 따르면, 상기 제 (i) 단계에서 모발 시료는 길이 0 초과-20 cm 및 무게 1-50 mg 이다.

본 발명의 일 측면 중 일 구체예에 따르면, 상기 제 (ii) 단계에서 세절된 모발 길이는 0.3-1.5 cm, 효소를 포함하는 버퍼용매 양은 190-210 ㎕, 액상화 온도는 35-65 ℃, 액상화 시간은 1-24 시간이다.

본 발명의 일 측면 중 일 구체예에 따르면, 상기 (iii) 단계 효소는 프로티나아제 K(proteinas K)이다.

본 발명의 일 측면 중 일 구체예에 따르면, 상기 제 (iii) 단계에서 원심분리는 10,000-30,000 g, 60분 이하에서 수행된다.

본 발명의 일 측면 중 일 구체예에 따르면, 상기 제 (iv) 단계에서 면역반응측정법은 형광편광면역반응측정법이다.

본 발명의 일 측면 중 일 구체예에 따르면, 마약 성분 신속 분석법은 정밀 분석법과 비교하여, 민감도(sensitivity) 및 특이성(specificity)이 각각 90% 이상이다.

본 발명을 이용하면 최대 5-6일 이상 소요되는 모발 중 마약성분 분석을 최대 2일 이내에 신속하게 확인할 수 있다. 최종분석결과를 얻기 위해 소요되는 시료 전처리 실험과정의 물리적 시간과 노동력을 줄일 수 있어 실용성 및 신속성 면에서 가치가 높다. 또한 최소 및 최적화된 모발량과 마약성분들의 낮은 검출농도에 맞게 기술적으로 적용한 방법으로 그 효과가 높다.

도 1은 본 발명에 따른 메트암페타민 및 그 대사체성분 암페타민에 대한 기체크로마토그래피-질량분석법(GC-MS)으로 분석한 정밀분석결과와 형광평광(FP) 원리를 이용한 면역반응측정법(IA)으로 분석한 신속분석결과와의 상관 관계를 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 구체예를 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며, 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명의 일 측면은 면역반응측정법을 이용한 모발 중 마약성분 신속분석법에 관한 것으로,

(i) 모발 시료를 용매로 세척하는 단계;

(ii) 상기 세척된 모발을 세절한 후, 모발 시료를 효소를 사용하여 액상화하는 단계;

(iii) 상기 액상화된 모발 액체시료를 원심분리기로 분리하는 단계; 및

(iv) 상기 원심분리된 상층의 모발 액체시료를 면역반응측정법을 사용해서 모발 중 마약 성분을 정량화하는 단계를 포함한다.

본 발명의 분석대상 성분은 메트암페타민(MA), 암페타민(AP)이며, 다음과 같은 화학구조를 보여 준다.

본 발명의 제 (i) 단계에서 모발 시료는, 모발의 겉 표면을 용매로 닦아내어 세척한 후 분석에 필요한 모발 길이와 무게를 측정한다. 모발의 겉 표면에 부착될 수 있는 외부 오염원 즉, 분석하고자하는 마약성분이나 분석 방해물질 등을 제거할 목적으로 메탄올과 같은 세척용매가 흡착된 종이 타올을 사용하여, 한 올씩 필요 올수만 닦아낸다. 세척 용매는 특별한 제한이 없으나, 바람직하게는 메탄올을 사용한다.

일반적으로 모발시료를 세척할 때는 여러 종류의 세척용매 각각에 담근 후 수 초간 강하게 흔들어 세척한 후 몇 시간 동안 건조를 시킨다. 하지만 용매가 흡착된 종이 타올로 닦아내면 잠시 후 건조가 되어 빠르게 실험을 진행할 수 있어 긴급하게 분석해야하는 신속분석방법으로써는 큰 장점이다.

이렇게 세척된 모발시료를 분석에 적합한 모발 길이와 무게를 측정하게 된다. 바람직하게, 모발 길이는 10 cm이하, 모발량은 5 mg이다. 위 기준들은 모발 액상화에 사용되는 효소(proteinase K)가 포함된 버퍼용매 첨가량과 모발정밀분석에서 확인하고자 하는 양성 기준농도(0.5 ng/mg)와 밀접한 관계가 있다.

모발신속분석은 실제로 음성인 모발시료를 확인하여 모발정밀분석을 실시하지 않는 것이 목적이다. 지나치게 많은 모발량을 사용할 경우 버퍼용매 첨가량이 더 많아질 것이고, 모발을 액체화하는데 걸리는 시간 또한 증가하며, 이로 인하여 모발 중 특정 마약성분의 농도는 첨가된 버퍼 용매만큼 더 희석된다. 결과적으로, 정밀분석시에는 양성 기준농도 0.5 ng/mg 이상으로 확인되어 양성으로 결정되지만, 신속분석에서는 양성 기준농도 미만으로 나타나 결국 음성으로 결정되는 문제점이 발생할 수 있다.

모발 길이 또한 기준이상으로 모발시료를 준비하여 분석을 실시할 경우, 모발 무게 증가와 같은 문제가 발생한다. 예컨대, 비교하고자 하는 두 모발시료에는 동일한 농도의 특정 마약성분이 포함되어 있으며, 10 cm 길이에 5 mg 무게인 모발시료와 20 cm 길이에 5 mg 무게인 모발시료가 있다면, 무게는 동일하나 길이가 50% 차이가 나므로 확인하고자하는 농도에 영향을 준다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 모발 무게는 1-50 mg, 모발 길이는 0 초과-20 cm 이하가 가능하며, 가장 바람직한 모발 무게는 5 mg, 길이는 10 cm 이하이다.

본 발명의 제 (ii) 단계에서, 상기 세척된 모발을 세절한 후, 모발 시료를 효소를 사용하여 액상화한다.

(i) 단계에서, 용매로 세척된 모발 시료를 가위를 이용하여 바람직하게는 0.5 cm이하로 잘게 세절한다. 이때 너무 미세하게 세절하거나, 너무 길게 세절하면 액상화하는데 시간이 더 소요된다. 예컨대, 즉 모든 모발을 0.1 cm 이하로 너무 미세한 크기로 세절하는 경우 버퍼용매와 세절된 시료와의 접촉 공간이 협소하여 액상화가 더 오래 걸리며, 세절된 시료의 길이가 길 경우 1.5 mL 코니컬 튜브(conical tube) 속에 든 버퍼용매 안에 잠겨야 하나 그렇지 못할 경우 액상화가 진행되지 않는다.

상기에서 세절한 모발 시료는 효소를 사용하여 액상화한다.

액상화를 위해 사용되는 효소는 모발을 액상화할 수 있는 효소라면 모두 가능하나, 바람직하게는 프로티나아제 K(proteinase K)이다. 이때 사용되는 효소는 버퍼용액에 포함되는 데, 버퍼 용매의 사용량은 제한이 없으나, 바람직하게는 20㎕이하이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 프로티나아제 K(100 mg, specific activity: 30 units/mg)를 1M tris-hydroxymethyl aminomethane(pH=8.0) 용액 0.1 mL와 탈이온수 19.9 mL로 용해한다. 그 다음 1M Tris 용액 250 ㎕, 1M dithiothreitol 40 ㎕, 탈이온수 580 ㎕, 용해된 효소 130 ㎕를 혼합하여 최종 1 mL 기준으로 버퍼용매를 조제한다. 더 많은 양의 버퍼용매가 필요할 경우 전술한 비율로 조제가능하다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 조제된 버퍼용매를 고체 모발이 든 튜브 속에 200 ㎕를 첨가한 후 온도 56 ℃에서 최대 4시간 이내에, 모발 매트릭스를 액체화하여 효소 액상화(enzymatic digestion)를 수행한다. 효소에 첨가되는 버퍼용매의 양이 증가할 경우 GC-MS의 정밀분석결과는 0.5 ng/mg 이상으로 양성이지만, IA의 신속분석결과는 양성 기준농도 미만으로서 음성으로 확인되므로, 양성으로 결정되어야 할 모발시료가 신속분석에서 음성으로 결정될 가능성이 있으므로 주의를 기울여야 한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 세절된 모발 길이는 0.3-1.5 cm, 효소를 포함하는 버퍼용매 양은 190-210 ㎕, 액상화 온도는 35-65℃ , 액상화 시간은 1-24 시간이 바람직하고, 가장 바람직하게는 세절된 길이는 0.5 cm, 버퍼용매 양은 200 ㎕, 액상화 온도는 56℃ , 액상화 시간은 4 시간이다.

본 발명의 제 (iii) 단계에서, 상기 액상화된 모발 액체시료를 원심분리기로 분리한다.

상기 단계에서 처리된 모발 액체시료를 원심분리기를 이용하여 마약이 존재하는 버퍼용매층과 방해물질이 많이 포함되어 있는 잔류층을 분리하기 위해 고속원심분리에 의한 정제화 과정을 거친다. 원심분리는 바람직하게는 고속 원심분리기를 사용하며, 일 구체예에 따르면, 20,000 g로 5분 동안 실시한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 원심분리는 10,000-30,000 g, 시간은 60분 이하가 바람직하고, 가장 바람직하게는 원심분리는 20,000 g, 시간은 5분이다.

본 발명의 제 (iv) 단계에서, 상기 원심분리된 상층의 모발 액체시료를 면역반응측정법을 사용해서 모발 중 마약 성분을 정량화한다.

원심분리된 상층의 버퍼 용매층인 액체시료에서 면역반응측정법을 사용해서 모발의 특정 마약성분들을 선택적으로 확인한다. 바람직하게 상기 면역반응측정법은 형광편광(fluorescence polarization; FP)을 이용한다.

상기 형광편광 면역 반응측정방법은 항원항체반응을?이용하여 액체시료 속에서 특정약물들(항원I, drugs)과 형광물질이 결합되어 있는 임의약물(항원 II, tracer)이 경쟁적으로 반응하여 항체와 결합하게 한다.

두 항원이 경쟁적으로 결합된 이후 특정 파장의 광원을 조사(excitation)하면 항원 II에 결합된 형광물질이 빛을 일부 흡수하며, 몇 나노(nano) 초 이내에 흡수된 빛이 다시 방출(emission)하게 된다.

이 때 방출된 빛이 편광(polarization)하게 되는데 이 편광정도는 액체시료 속 항원II에 결합된 형광물질의 회전도에 의존하며, 그 회전도는 분자의 크기에 따라 달라지게 된다. 회전도가 빨라지면(형광물질이 결합된 항원 II가 빛을 흡수하여 그 빛을 방출하기 전에 빠르게 회전), 편광도는 감소하게 된다.

예컨대, 액체시료 속에 특정약물들(항원 I)의 농도가 높으면, 항체와 결합을 많이 하게 되며, 반면에 형광물질이 결합된 항원 II는 항체와 결합할 수 있는 기회가 적어지게 되며(항체 II는 항체와 결합할 수 있는 기회가 감소되어 액체시료 내에서 결합되지 않은 자체 항체 II로 남아 있게 되어, 분자 크기는 별로 변하지 않음), 항체와 결합하지 않은 항원 II 분자들의 회전도는 빨라지게 된다.

반대로 액체시료 속에 특정약물들(항원 I)의 농도가 낮으면 항체와 결합 할 수 있는 기회가 작아지고, 형광물질이 결합된 항원 II가 더 많이 결합할 수 있게 되어 분자의 크기는 커지게 되어 회전도는 감소하게 된다.

이렇게 형광물질이 결합된 항원 II의 편광정도를 측정하여 약물의 농도를 정량적으로 산출함으로써 액체시료 속에 특정약물들의 농도를 확인하게 된다. 그러므로 항원항체 반응원리를 이용하기 때문에 특정 약물에 포함되는 단일성분에 대해서는 정확하게 확인 할 수 없기 때문에 정밀분석(confirmation method) 결과가 아닌 신속분석(rapid method) 결과로써 사용한다.

따라서, 신속분석방법에서 메트암페타민, 암페타민등이 확인된다면 후속작업으로, 정밀분석방법으로 다시 확인해야한다.

즉, 신속분석방법은 단지 특정 계열의 약물들의 존재 유무만을 확인하면 되므로, 많은 소요시간 및 노동력, 복잡한 전처리 실험과정을 필요로 하는 정밀분석방법 적용을 미리 스크리닝하는 장점이 있다.

신속분석방법에서는 모발 액체시료 속에서 특정 마약성분의 존재 유무를 확인하는 것이다. 특정 마약성분들의 존재여부 확인을 위한 기준은 신속분석방법에 의한 분석결과와 정밀분석방법에 의한 분석결과가 거의 일치 확인되어야 신속분석방법으로써 적용가능하다.

이를 객관적으로 판단하는 근거는, 전술한 바와 같이 신속분석법 및 정밀 분석법의 상관관계를 나타내는 민감도(SE)와 특이성(SP)이다.

민감도 및 특이성을 구체적으로 살펴보면, 민감도(SE)는 메트암페타민 성분에 대한 정밀분석결과가 양성 기준농도 이상이면, 신속분석법에서도 양성 기준농도 이상으로 확인되는 참 양성(true positive) 비율을 의미하며, 신뢰성 있는 신속분석법이 되기 위해서는 민감도가 90% 이상이어야 한다. 또한, 특이성(SP)은 정밀분석결과가 양성 기준농도 미만이면, 신속분석법에서도 양성 기준농도 미만으로 확인되는 되는 참 음성(true negative) 비율을 의미하며, 신뢰성 있는 신속분석법이 되기 위해서는 특이성 또한, 90 % 이상되어야 한다.

SE와 SP를 수식으로 나타내면 다음과 같다.

- SE (%) = (TP/(TP+FN)) X 100

여기서 TP는 true positive(신속분석결과“양성”, 정밀분석결과“양성”)이며, FN은 false negative(신속분석결과“음성”, 정밀분석결과“양성”)이다.

- SP (%) = (TN/(TN+FP)) X 100

여기서 TN는 true negative(신속분석결과“음성”, 정밀분석결과“음성”)이며, FP는 false positive(신속분석결과“양성”, 정밀분석결과“음성”)이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 메트암페타민 성분에 대해 GC-MS에 의한 정밀분석방법의 양성 기준농도 0.5 ng/mg에서, 90% 이상의 민감도와 특이성을 감안할 때, 혼합된 메트암페타민과 암페타민 성분에 대해 IA에 의한 신속분석방법의 양성 기준농도 범위는 바람직하게는 55-85 ng/10³ mg이며, 가장 바람직하게는 65-75 ng/10³ mg 이다.

이하, 본 발명의 실시예 및 비교예를 기재한다. 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

1. 모발 겉면을 메탄올로 닦아내어 세척한 후 모발 길이와 무게를 측정하는 제 (i) 단계;

모발 시료 몇 올을 선택하여 메탄올이 흡착된 종이타올로 각각 닦아낸 후, 모발 길이를 측정하여 10 cm 이하의 경우는 모발 무게가 5 mg이 되게 시료를 준비하였고, 모발 길이가 10 cm 이상의 경우 10 cm 간격으로 각각 자른 후 각 간격별로 무게가 5 mg이 되게 측정하여 시료를 준비하였다.

2. 세척된 모발 시료를 잘게 세절하여, 모발 시료를 효소를 사용하여 액상화하는 제 (ii) 단계;

세절 가위를 이용하여 0.5 cm 정도로 잘게 세절하여 1.5 mL 마개가 있는 코니컬 튜브에 넣는다. 코니컬 튜브에 효소가 포함된 버퍼용매 200 ㎕를 첨가한 후 56 ℃에서 4시간 동안 인큐베이터에서 모발 매트릭스를 액체화하였다.

3. 액상화된 모발 액체시료를 원심분리기로 분리하는 제 (iii) 단계;

상기 제 (ii) 단계에서 액체화된 모발을 에펜도르프사의 고속원심분리기로 20,000 g, 5분 동안 원심분리하였다.

4. 상기 원심분리된 상층의 모발 액체시료를 면역반응측정법을 사용해서 모발 중 마약 성분을 정량화하는 제 (iv) 단계;

상기의 버퍼용매 상층 모두를 마이크로피펫을 이용하여 분석용 테스트 튜브에 옮긴 후 애보트사의 면역반응측정기를 사용하여 특정 마약성분의 농도를 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 효소 액상화법과 면역반응측정법을 이용한 신속분석방법으로써 모발 중 메트암페타민과 암페타민을 최소 2일 이내에 확인해 낼 수 있었다.

이때 사용되어진 모발 실제시료는 60개, 마약성분을 전혀 사용하지 않은 모발 시료(blank)는 2개로 정밀분석방법과 신속분석방법을 수행하여 본 기술을 검증하였다.

GC-MS의 정밀분석방법과 형광편광(FP) 원리를 이용한 면역반응측정(IA)의 신속분석방법에 의해 수행된 분석결과를 아래 표 1에 나타내었고, 두 분석결과에 대한 상관성을 도 1에 나타내었다.

표 1에서 정밀분석결과는 메트암페타민과 암페타민(메트암페타민의 대사체 성분) 각각에 대한 농도로 확인되지만, 분석원리가 다른 신속분석결과는 단일성분이 아닌 메트암페타민과 암페타민으로 혼합된 농도로 확인된다. IA에 의한 신속분석방법은 도 1처럼 정밀분석결과와 높은 상관관계가 있음을 확인할 수 있으며, 그 선형성(r)은 시료 No. 26-60까지의 범위에서 0.91로 나타냈다. 그러므로 정밀분석결과와 비교시 상관관계가 매우 높아 신속분석법으로써 신뢰성이 있음을 알 수 있다.

[표 1]

^a메트암페타민(MA)과 암페타민(AP, amphetamine) 각각의 단일성분 농도

^bMA와 AP성분이 혼합된 농도

^cBlank: 마약성분이 전혀 없는 모발시료

^d1 MA 농도

^d2 AP 농도

* MA 농도는 0.2 ng/mg 미만, AP 농도는 0.01 ng/mg 미만으로 검출된 GC-MS결과

** AP 농도가 0.01 - 0.1 ng/mg 미만으로 검출된 GC-MS결과

신속분석방법에 대한 신뢰성 검증 확인을 위해 민감도(SE)과 특이성(SP) 결과를 아래 표 2에 나타냈다. 신속분석방법으로 적용하기 위해서는 민감도와 특이성은 각각 90% 이상되어야 한다.

표 2는 표 1의 자료를 토대로 나타난 결과로, 정밀분석법의 양성 기준농도는 메트암페타민 0.5 ng/mg으로 모두 동일하며, 신속분석법에서 양성 기준농도별로 정밀 분석법과의 민감도 및 특이성 결과를 나타내었다.

신속분석법의 양성 기준농도를 혼합된 메트암페타민과 암페타민 50 ng/10³mg로 설정할 경우, 민감도는 100%, 특이성은 86.7%(13.3%가 참 음성인데 거짓 양성으로 확인된다는 의미)이며, 신속분석법의 양성 기준농도를 55-85 ng/10³mg으로 설정할 경우, 민감도와 특이성은 각각 90-100%이며, 90 ng/10³mg으로 설정할 경우, 민감도는 86.7%(13.3%가 참 양성인데 거짓 음성으로 확인된다는 의미), 특이성은 100%로 나타났다.

결과적으로, 신속분석법의 양성 기준농도는 참 양성(TP)과 참 음성(TN)률이 높아야, 민감도 및 특이성이 각각 90% 이상이 될 수 있다. 예컨대, 신속분석법의 양성 기준농도 범위가 55-85 ng/10³mg으로 설정할 경우에, 민감도와 특이성은 각각 90%이상이 되며, 단지 10% 이내의 거짓 양성 또는 거짓 음성으로 확인된다.

더 적합한 양성 기준농도 범위로는 65-75 ng/10³mg으로 설정할 경우 민감도와 특이성은 각각 96.7-100%로 확인되어, 거짓 양성률(3.3%) 또는 거짓 음성률(3.3%)이 낮아 더 신뢰성 있는 신속분석결과가 된다.

[표 2]

다음으로 표 3에서는 모발량에 따른 신속분석결과의 농도 변화를 확인하였다. 모발길이는 10 cm이하에서 모발량(2.0-3.6 mg)에 따른 농도 변화를 확인하기 위한 신속분석결과를 아래 표 3에 나타냈다.

모발량이 5 mg보다 작은 경우 메트암페타민의 정밀분석결과가 1.1-2.1 ng/mg 일때 신속분석결과는 27.0-79.6 ng/10³ mg으로 나타냈다. 표 1를 참조하면, 메트암페타민의 정밀분석결과가 1.1-1.8 ng/mg(sample No.: 36-40) 일 때 신속분석결과는 88.7-217.7 ng/10³ mg로 분석하고자하는 모발량이 기준량(5 mg) 보다 작을 경우, 신속분석결과의 양성 기준농도보다 낮게 나타나 결국 정밀분석결과는 양성이지만, 작은 량의 모발이 사용된 신속분석결과는 음성으로 확인되어 거짓 음성(FN)률이 높게 된다.

[표 3]

비교예 1

종래기술로써 P. Kintz 발명자의 방법으로 모발 시료의 마약성분을 신속분석해 보았다. 이들 방법은 Forensic Sic. Int., 37(1992) 328에 개시되어 있으며 다음과 같다. P. Kintz 발명은 메트암페타민류 등을 모발에서 액체상추출 후 면역반응측정법을 이용하여 농도를 측정하는 방법이다.

모발 50 mg을 세척, 건조, 세절 후 1M NaOH로 100, 1시간동안 액체화 한 후 시료 물성변경(pH 조절)을 위해 3M HCl로 중성화하였으며, 위의 시료를 원심분리하여 메트암페타민류 및 그 대사체성분들을 분석장비로 확인하였다.

비교예 2

종래기술로써 M. Cassani 발명자의 방법으로 모발 시료의 마약성분을 신속분석해 보았다. 이들 방법은 Forensic Sic. Int., 63(1993) 175에 개시되어 있으며 다음과 같다. M. Cassani 발명은 메트암페타민류 등을 모발에서 액체화한 후 면역반응측정법을 이용하여 농도를 측정하는 방법이다.

모발 50 mg 이상을 세척, 건조, 세절 후 0.1M HCl로 37, 16시간 동안 용매추출 한후 2M NaOH와 1M acetate 버퍼로 pH 조절한 시료에서 메트암페타민류 등 및 그 대사체성분들을 분석장비로 확인하였다.

비교예 3

종래기술로써 A. Miki 발명자의 방법으로 모발 시료의 마약성분을 분석해 보았다. 이들 방법은 J. Anal. Toxicol., 26(2002) 274에 개시되어 있으며 다음과 같다. A. Miki 발명은 메트암페타민을 모발에서 액체상추출 후 면역반응측정법을 이용하여 농도를 측정하는 방법이다.

모발 10 mg을 세척, 건조, 미세 세절 후 메탄올/5M HCl 추출용매로 50, 12 시간 이상 동안 추출하고 다시 건조 한 후 탈이온수로 희석한 시료에서 메트암페타민류를 분석장비로 확인하였다.

본 발명과 비교예 1-3의 전처리 조건(모발량, 액상화 시간 및 추출 시간, 처리 단계), 분석법 신뢰성 검토(민감도, 특이성)에 대해 비교한 결과를 표 4에서 보여주고 있다.

[표 4]

결과적으로 비교예 1-3을 비교했을 때 본 발명의 분석방법이 종래의 고체 모발시료의 액상화 뿐만 아니라 다른 전처리조건들(모발량, 추출 유무 등)에 있어서 매우 실용적으로 신속하게 분석할 수 있음을 알 수 있다.

특히 국내의 경우 마약남용 의심자들의 모발시료 채취가 쉽지 않아 모발량을 최소화해야하므로, 본 분석방법에 있어 최소의 모발량으로 검출하고자하는 GC-MS의 양성 기준농도(0.5 ng/mg)을 확인할 수 있는, IA의 의한 신속분석방법이 필요하게 되었다.

본 발명의 신속분석법에 따라 마약성분들(메트암페타민, 그 대사체성분 암페타민)이 함유되어 있는 고체 모발시료를 분석하는 경우, 소량의 모발 시료가 필요하며, 분석단계 및 분석시간을 줄일 수 있으며, 정밀분석법과의 상관관계(도 1)가 높으며, 또한 IA에 의한 신속분석법의 민감도 및 특이성이 높아 신뢰할 수 있는 분석 결과를 얻을 수 있다.

본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

면역반응측정법을 이용한 모발 중 마약성분 신속분석법으로서,
(i) 모발 시료를 용매로 세척하는 단계;
(ii) 상기 세척된 모발을 세절한 후, 모발 시료를 프로티나아제 K(proteinase K) 효소를 사용하여 액상화하는 단계;
(iii) 상기 액상화된 모발 액체시료를 원심분리기로 분리하는 단계; 및
(iv) 상기 원심분리된 상층의 모발 액체시료를 면역반응측정법을 사용해서 모발 중 마약 성분을 정량화하는 단계를 포함하며,
상기 마약 성분 신속 분석법은 정밀 분석법과 비교하여, 민감도(sensitivity) 및 특이성(specificity)이 각각 90% 이상인 것을 특징으로 하는 면역반응측정법을 이용한 모발 중 마약성분 신속분석법.
제 1항에 있어서, 상기 마약성분은 메트암페타민(methamphetamine: MA), 암페타민(amphetamine: AP) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 면역반응측정법을 이용한 모발 중 마약성분 신속분석법.
제 1항에 있어서, 상기 제 (i) 단계에서 모발 시료는 길이 0 초과-20 cm 이하 및 무게 1-50 mg인 것을 특징으로 하는 면역반응측정법을 이용한 모발 중 마약성분 신속분석법.
제 1항에 있어서, 상기 제 (ii) 단계에서 세절된 모발 길이는 0.3-1.5 cm, 효소를 포함하는 버퍼용매 양은 190-210 ㎕, 액상화 온도는 35-65℃, 액상화 시간은 1-24 시간인 것을 특징으로 하는 면역반응측정법을 이용한 모발 중 마약성분 신속분석법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 제 (iii) 단계에서 원심분리는 10,000-30,000 g, 60분 이하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 면역반응측정법을 이용한 모발 중 마약성분 신속분석법.
제 1 항에 있어서, 상기 제 (iv) 단계에서 면역반응측정법은 형광편광면역반응측정법인 것을 특징으로 하는 면역반응측정법을 이용한 모발 중 마약성분 신속분석법.
삭제