CN112213491A - 一种毛发中毒品快速检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种毛发中毒品快速检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种毛发中毒品快速检测的试剂盒及其检测方法。本发明通过免疫小鼠实验筛选得到甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮等毒品的高特异性单克隆抗体，并通过生物素标记得到相应的特异性抗体标记物，其能够与酶标板中包被的抗原反应，抗原又与毛发中的毒品产生竞争反应，利用亲和素‑辣根过氧化物酶级联放大反应，与四甲基联苯胺(TMB)显色，对甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮等毒品的含量进行检测，这大大提高了毛发检测试剂盒的灵敏度。同时，本发明还优化复配了一种毛发消化液，使毒品滥用者毛发中甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮能充分溶出，而不产生杂蛋白，避免交叉反应，降低检测结果的假阳性率，保证了本试剂盒检测结果的准确性。

Description

一种毛发中毒品快速检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及毒品检测领域，具体涉及一种毛发中毒品快速检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
毒品是一类人工合成的兴奋剂，对中枢神经和交感神经具有“致幻”性，常见的毒品有甲基苯丙胺、海洛因、吗啡、美沙酮、氯胺酮、可卡因等。甲基苯丙胺，俗称“冰毒”，在我国滥用最为广泛，它在体内主要是通过肝脏进行代谢作用，主要方式为羟基化或N-脱氧基化，最后大部分经肾脏以原药的形式排出体外，其余则进行N-脱氧基反应，产生甲基苯丙胺。吗啡，是从鸦片中提炼出的生物碱，具有镇痛及催眠作用，在医学上，可用作麻醉性镇痛药，其具有抑制中枢神经系统的功能，使用者易产生耐受和依赖，极易成瘾。氯胺酮，俗称“K粉”，也是近年来我国滥用较为严重的毒品之一，青少年亚文化群体是其主要的吸食人群，氯胺酮使用后会产生长时间的幻觉和精神错乱，持续使用海会使人产生心理依赖。目前，滥用毒品导致的精神依赖很难祛除，严重者甚至会出现幻觉、精神错乱、自杀、心脑血管意外和暴力行为，威胁人类的生命健康和社会安全。
目前，毒品检测中较常使用的生物样本主要包括血液、尿液、唾液和毛发等。其中，血液中毒品分析物含量较高，且使用的检测仪器要求不高，从而受到广泛的应用，但血液中存在的各种酶易导致待测物的降解，因此，血液的采集和储存较为困难。尿液是毒品常规的检测物，尿液采集过程中无创伤且样品预处理过程简单，但当吸毒三天甚至更长时间之后，尿液中的毒品就很难被检测或追溯。唾液采集过程更为方便，但毒品含量过低且易代谢不稳定，对检测技术及仪器具有较高的要求。相比于血液、尿液及唾液，毛发易获取、易保存、结果稳定、检测时限长，毒品在毛发中的代谢较慢，可长期存在，且有利于对取样过程进行监督，防止检材被掺假或调换，能够对单次给药后的痕量毛发样品进行检测，避免暂时性药物切断或掺假造成的假阳性或假阴性结果，并可提供个体吸毒者长期用药信息。
毒品进入毛发后，被包埋在毛发中的角蛋白中，不能直接进行检测，需先将其释放为游离状态方可进行检测。与尿液或血液毒品分子含量通常为μg/ml级相比，毛发中毒品及其代谢物的含量很低，仅为ng/mg级，因此，如何快速、高效、安全地从人体毛发中提取毒品小分子是当前首要的技术难题。毛发中待测物的释放方式有酸解、碱解、酶解、甲醇和乙腈等有机试剂消解等。酸性水解条件温和，释放效率高但水解时间较长。碱性水解剧烈，但生物基质干扰过大。甲醇、乙腈等有机溶剂超声水解存在环境污染、操作复杂、基层不易推广等问题。酶解条件温和，专一性强，专利CN110208072A即公开了一种用于痕量毒品检测的人体毛发快速裂解液，包括碱性蛋白酶、巯基乙醇、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、氯化钠-氢氧化钠缓冲液、Triton X-100、二硫苏糖醇(DTT)等，但该配方成分复杂，易沉淀分层，影响使用效果。
传统的毒品检测和监控方法主要包括高效液相色谱、气相色谱、液质或气质连用等。这些色谱方法具有很好的灵敏度和特异性，但操作复杂，通量不高，从取样到检测耗时较长，仪器设备昂贵且需要专业的操作人员。如专利CN101750458A公开了采用HPLC-Chip-MS/MS检测人体毛发、尿液、汗液及唾液中的毒品残留；专利CN108627595A公开了采用LC-MS/MS检测毛发中12种碱性毒品的方法，但都不能作为毛发中毒品快速筛查特别是现场快速筛查的方法。酶联免疫吸附测定(ELISA)法具有检测速度快，价格便宜，操作简单等优点，仪器简单便于携带甚至不需要专门仪器，是目前的毒品快速检测的主流技术。但传统ELISA法存在一定的局限性，如特异性低、易出现交叉反应、线性范围窄、只能定性而不能准确定量等。如专利CN101620231A公开了一种检测去甲氯胺酮的ELISA测试盒及制备方法，该方法干扰物释放过多，易出现交叉反应；专利CN104422762A公开了一种检测尿液、唾液、血液、毛发中毒品的酶联免疫试剂盒和检测方法，该方法水解过程提取率低，容易造成假阴性。
因此，开发兼顾灵敏度高、特异性强、操作简单的检测方法是毛发中毒品检测的重要发展方向。
发明内容
术语：
除非另外定义，本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
酶联免疫吸附测定法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)
生物素-亲和素生物反应放大系统(Biotin-avidin System，BAS)
生物素-抗体(Biotin-IgG)
辣根过氧化物酶标记亲和素(Streptavidin-HRP)
牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)
甲基苯丙胺(Methamphetamine，MDMA)
吗啡(Morphine，MOP)
氯胺酮(Ketamine，KET)
四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine，TMB)
二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)
针对特异性低、操作不够简便等问题，本发明通过小鼠免疫制备和筛选特异性甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮的单克隆抗体，采用生物素标记特异性抗体，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素为二抗，通过生物素和亲和素的高特异性结合，组成一个生物素-亲和素生物反应放大系统(Biotin-avidin System，BAS)，提高免疫反应的特异性和灵敏度。
一方面，本发明提供了一种检测毛发中毒品含量的试剂盒，所述的试剂盒包括毛发消化液，所述的消化液包括处理液A和处理液B，所述的处理液A包括角蛋白酶、蛋白酶K、DTT和氢氧化钠，处理液B包括盐酸。
具体地，所述的处理液A包括角蛋白酶1-200μg/mL，蛋白酶K 1-200μg/mL，DTT 10-100μmol/mL，氢氧化钠0.01-0.5mol/L，所述的处理液B包括盐酸0.01-0.5mol/L。酶解可将固化在角蛋白中的甲基苯丙胺，吗啡，氯胺酮等毒品释放，DTT常用于蛋白质二硫键的还原，使溶剂中的溶解的蛋白质被还原。
进一步具体地，所述的处理液A包括角蛋白酶5-100μg/mL，蛋白酶K 5-100μg/mL，DTT 20-80μmol/mL，氢氧化钠0.04-0.4mol/L(pH11-12)，所述的处理液B包括盐酸0.04-0.4mol/L(pH 2-3)。
进一步具体地，所述的处理液A包括角蛋白酶30-50μg/mL，蛋白酶K 30-50μg/mL，DTT 30-40μmol/mL，氢氧化钠0.05-0.2mol/L(pH11.5-12)，所述的处理液B包括盐酸0.05-0.2mol/L(pH 2-2.5)。
具体地，所述的检测毛发中毒品含量的试剂盒还包括：抗原-BSA包被的酶标板、试剂一：生物素标记的特异性抗体冻干粉、试剂二：Streptavidin-HPR冻干粉、标准品、洗涤液、溶解液、显色液、终止液。
进一步具体地，所述的抗原-BSA的制备方法如下：按质量比1:3分别取甲基苯丙胺、吗啡或氯胺酮和K2CO3，按照料液比20mg:1mL溶解于甲苯中，在氮气保护下，按照甲苯:溴乙酰溴体积比为40:1，向上述溶液中缓慢加入溴乙酰溴，常温搅拌4-6h，将所得溶液旋转蒸干，用磷酸盐缓冲溶液溶解残渣，将含有BSA的磷酸盐溶液缓慢加至上述溶液，搅拌过夜，冷冻干燥即得抗原-BSA。
进一步具体地，所述的抗原-BSA包被的酶标板的制备方法如下：用0.01-2.5μg/mL抗原-BSA溶液包被96孔板，4℃过夜；次日用脱脂牛奶在37℃条件下封闭96孔板2h，用洗涤液洗板3次，拍干后冷藏4℃备用。
进一步具体地，所述的抗原-BSA溶液的浓度为0.01-1.0μg/mL。
进一步具体地，所述的中抗原-BSA溶液的浓度为0.1-0.5μg/mL。
进一步具体地，所述的生物素标记的特异性抗体的制备方法如下：
1)动物免疫与血清效价的测定：取一定量的抗原(甲基苯丙胺、吗啡或氯胺酮)稀释至适宜浓度，加入等量的弗氏佐剂，用注射器来回抽吸充分乳化，取6周龄左右的Balb/c小鼠，采用皮下多点注射的免疫方式进行小鼠免疫，免疫间隔两周。待小鼠效价达到融合要求后，直接腹腔注射50μg抗原进行加强免疫。
2)骨髓瘤细胞的培养：骨髓瘤SP2/0细胞，用含10％FBS的RPMI-1640完全培养基培养SP2/0细胞，每天更换新鲜培养基使成为对数分裂期生长旺盛的细胞。融合前将SP2/0细胞用含8-氮鸟嘌呤(8-AG)的完全培养基进行培养传代4-5次，防止SP2/0细胞的反祖，保证细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷型，防止对融合后杂交瘤细胞的筛选带来的影响。
3)杂交瘤细胞的筛选：取免疫鼠脾脏，分离淋巴细胞，与SP2/0细胞在50％PEG溶液的条件下以1:10的比例进行融合，经选择培养液培养后，将效价高的细胞进行亚克隆分离得到分泌抗体的单克隆细胞株，将培养状态良好的阳性细胞株进行小鼠体内诱生产生抗体，纯化抗体。
4)抗体生物素标记：采用生物素标记试剂盒标记纯化后的单克隆抗体。
进一步具体地，所述的生物素标记的特异性抗体冻干粉的制备方法如下：
取0.5-5μg/mL生物素标记的特异性抗体加入冻干瓶中，按照体积比1:1加入冻干保护剂，按下述方法进行冷冻干燥：预冻温度-40℃，维持2-3h；主干燥温度-20℃，维持6-10h，0℃维持2-5h，10℃维持2-5h，20℃维持2-5h；后干燥温度30-50℃，维持4-10h，不同温度间升温速率为10℃/h。
进一步具体地，所述的Streptavidin-HPR冻干粉的制备方法如下：
取0.5-5μg/mL Streptavidin-HPR加入冻干瓶中，按照体积比1:1加入冻干保护剂，按下述方法进行冷冻干燥：预冻温度-40℃，维持2-3h；主干燥温度-20℃，维持6-10h，0℃维持2-5h，10℃维持2-5h，20℃维持2-5h；后干燥温度30-50℃，维持4-10h，不同温度间升温速率为10℃/h。
进一步具体地，所述的冻干保护剂包括：脱脂牛奶，海藻糖(10-200mg/mL)，乳糖(10-200mg/mL)，右旋糖苷(10-200mg/mL)，牛血清白蛋白(10-200mg/mL)中的一种或几种的混合物。
进一步具体地，所述的标准品包括甲基苯丙胺标准品、吗啡标准品或氯胺酮标准品，所述甲基苯丙胺标准品的浓度为0.167-40.5ng/mL，所述吗啡标准品的浓度为0.167-40.5ng/mL，所述氯胺酮标准品的浓度为0.167-40.5ng/mL。
进一步具体地，所述洗涤液为pH 6.0，0.15M PBS，所述洗涤液制备方法如下：KH2PO4 0.2g，Na2HPO4-12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，0.05％Tween-20 0.5mL，加蒸馏水至1000mL。
进一步具体地，所述溶解液为将所述洗涤液调至pH 6.0，在该洗涤液中加入脱脂牛奶，使脱脂牛奶在洗涤液中的浓度为0.01g/mL。
进一步具体地，所述显色液为TMB显色液。
进一步具体地，所述终止液为2M H2SO4，所述终止液制备方法如下：蒸馏水178.3mL，逐滴加入98％浓硫酸21.7mL。
具体地，所述的毛发包括头发、阴毛、腋毛、胸毛和腿毛。
进一步具体地，所述的毛发为头发，进一步优选为头顶后部自发根起长度为3厘米以内的头发。长于3厘米的头发，需从发根端截取3厘米。
另一方面，本发明提供了一种采用本申请所述的试剂盒检测毛发中毒品含量的方法，包括如下步骤：
1)称取毛发，剪成细段，放入离心管中，按照毛发:处理液A为1mg:0.1mL的比例，加入处理液A，90℃恒温孵育4-6min，取出静置至室温，按照处理液A:处理液B体积比为1:1加入处理液B，混匀，静置后待用；
2)按照冻干前溶液总体积:溶解液体积为1:5分别向试剂一和试剂二的冻干粉加入溶解液，混匀后备用，取封闭好的96孔板，使孔板温度恢复室温，逐孔加入包板抗原对应的系列标准品和待测样品，按照系列标准品/待测样品:试剂一:试剂二体积比为1:1:1依次加入试剂一和试剂二，37℃温育30min，用洗涤液洗板3次，拍干；
3)按照试剂一/试剂二:TMB显色液体积比为1:2加入TMB显色液，37℃条件下孵育15min；
4)加入TMB显色液等量终止液终止显色反应，以试剂空白为对照，在450nm波长下测吸光值，以吸光值A为纵坐标，标准品浓度的对数c为横坐标，绘制标准曲线，将待测样品测得的吸光度值代入标准曲线公式，即可得到毛发样品中包板抗原对应毒品的浓度。
具体地，步骤1)中所述的毛发被剪成0.5-5mm的细段，优选为0.5-2mm的细段，进一步优选为1mm的细段。
具体地，步骤2)中试剂一的工作浓度为0.1-1.0μg/mL，优选为0.1-0.6μg/mL，进一步优选为0.2-0.6μg/mL。
具体地，步骤2)中试剂二的工作浓度为0.1-1.0μg/mL，优选为0.1-0.6μg/mL，进一步优选为0.1-0.3μg/mL。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)本发明通过免疫小鼠试验筛选得到甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮的高特异性单克隆抗体抗体，并通过生物素标记的方法得到特异性抗体标记物，大大提高了毛发检测试剂盒的灵敏度，使甲基苯丙胺的检出限达到0.167ng/mL，吗啡的检出限达到0.167ng/mL，氯胺酮的检出限达到0.167ng/mL。
(2)本发明所述毛发消化液在碱性条件下酶解(角蛋白酶和蛋白酶K)毛发得到毒品类物质，特异性强、灵敏度高，同时，加入微量的DTT使溶解的蛋白还原，有效解决阴性样品假阳性的问题，避免交叉反应。
(3)本发明所述毒品检测试剂盒能够有效释放毛发中的甲基苯丙胺、吗啡和氯胺酮类毒品并对其进行准确检测，检测特异性强、灵敏度高，应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明的技术路线图。
图2为甲基苯丙胺检测标准曲线图。
图3为吗啡检测标准曲线图。
图4为氯胺酮检测标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1抗原-BSA包被的酶标板的制备
1分别取100mg甲基苯丙胺、吗啡或氯胺酮和300mg K2CO3溶于20mL甲苯中，在氮气保护下向上述溶液中缓慢加入500μL溴乙酰溴，常温搅拌5h。将所得溶液旋转蒸干，用磷酸盐缓冲溶液溶解残渣。称取50mgBSA溶于5mL的磷酸盐溶液(0.01M，pH7.2)缓慢加至上述溶液，搅拌过夜，冷冻干燥即得抗原-BSA。
2用0.4μg/mL抗原-BSA溶液包被96孔板，4℃过夜。
3次日用脱脂牛奶在37℃条件下封闭96孔板2h，用洗涤液洗板3次，拍干后冷藏4℃备用，制备得到抗原-BSA包被的酶标板。
实施例2生物素标记的单克隆抗体冻干粉及Streptavidin-HPR冻干粉的制备
1生物素标记的单克隆抗体冻干粉的制备
(1)生物素标记的单克隆抗体的制备
1)动物免疫与血清效价的测定：取一定量的抗原(甲基苯丙胺、吗啡或氯胺酮)用水稀释至100μg/mL，加入等量的弗氏佐剂，用注射器来回抽吸充分乳化，取6周龄左右的Balb/c小鼠，采用皮下多点注射的免疫方式进行小鼠免疫，免疫间隔两周。待小鼠效价达到融合要求后，直接腹腔注射50μg抗原进行加强免疫。
2)骨髓瘤细胞的培养：骨髓瘤SP2/0细胞(购于上海生科院细胞资源中心，货号31800022)，用含10％FBS的RPMI-1640完全培养基培养SP2/0细胞，每天更换新鲜培养基使成为对数分裂期生长旺盛的细胞。融合前将SP2/0细胞用含8-氮鸟嘌呤(8-AG)的完全培养基进行培养传代4-5次，防止SP2/0细胞的反祖，保证细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷型，防止对融合后杂交瘤细胞的筛选带来的影响。
3)杂交瘤细胞的筛选：取免疫鼠脾脏，分离淋巴细胞，与SP2/0细胞在50％PEG溶液的条件下以1:10的比例进行融合，经选择培养液培养后，将效价高的细胞进行亚克隆分离得到分泌抗体的单克隆细胞株，将培养状态良好的阳性细胞株进行小鼠体内诱生产生抗体。按照金斯瑞ProteinG纯化试剂盒说明书纯化抗体。
4)抗体生物素标记：采用生物素标记试剂盒(EBLK0002，Elabscience)标记纯化后的单克隆抗体。
(2)生物素标记的单克隆抗体冻干粉的制备
取2.5μg/mL生物素标记的特异性抗体200μL加入冻干瓶中，加入200μL脱脂牛奶，按下述方法进行冷冻干燥：预冻温度-40℃，维持2-3h；主干燥温度-20℃，维持6-10h，0℃维持2-5h，10℃维持2-5h，20℃维持2-5h；后干燥温度30-50℃，维持4-10h，不同温度间升温速率为：10℃/h。
2Streptavidin-HPR冻干粉的制备
取0.5μg/mLStreptavidin-HPR200μL加入冻干瓶中，加入200μL脱脂牛奶，按下述方法进行冷冻干燥：预冻温度-40℃，维持2-3h；主干燥温度-20℃，维持6-10h，0℃维持2-5h，10℃维持2-5h，20℃维持2-5h；后干燥温度30-50℃，维持4-10h，不同温度间升温速率为：10℃/h。
实施例3毛发消化液的制备
毛发消化液包括处理液A和处理液B，其中，处理液A包括角蛋白酶50μg/mL，蛋白酶K 50μg/mL，DTT 40μmol/mL，氢氧化钠0.1mol/L(pH 11.83)，所述的处理液B包括盐酸0.1mol/L(pH 2.13)。
实施例4检测毛发中毒品(甲基苯丙胺或吗啡或氯胺酮)含量的试剂盒组成
a)甲基苯丙胺-BSA或吗啡-BSA或氯胺酮-BSA包被的酶标板；
b)试剂一：生物素标记的特异性抗体冻干粉；
c)试剂二：Streptavidin-HRP冻干粉；
d)甲基苯丙胺标准品：浓度为0.167，0.5，1.5，4.5，13.5，40.5ng/mL；或吗啡标准品：浓度为0.167，0.5，1.5，4.5，13.5，40.5ng/mL；或氯胺酮标准品：浓度为0.167，0.5，1.5，4.5，13.5，40.5ng/mL；
e)处理液A：角蛋白酶50μg/mL，蛋白酶K 50μg/mL，DTT 40μmol/mL，氢氧化钠0.1mol/L(pH 11.83)；
f)处理液B：0.1M盐酸溶液(pH2.13)；
g)洗涤液(pH 6.0，0.15M PBS)：KH2PO4 0.2g，Na2HPO4-12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl0.2g，Tween-20(0.05％)0.5mL，加蒸馏水至1000mL；
h)溶解液：所述溶解液为将所述洗涤液调至pH 6.0，在该洗涤液中加入脱脂牛奶，使脱脂牛奶在洗涤液中的浓度为0.01g/mL；
i)显色液：TMB显色液；
j)终止液(2M H2SO4)：蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7mL；
k)产品说明书。
实施例5
1)准确称取5份5mg毛发，其中2份为健康成人头发为阴性样品，另外3份为来自北京某戒毒所的吸毒成瘾人员毛发，分别为M样品(男性，45岁，吸食海洛因10年人员毛发样本)；G样品(女性，32岁，吸食冰毒5年人员毛发样本)；Q样品(男性，28岁，吸食K粉2年人员毛发样本)为阳性对照样品，将其分别剪成1mm的细段，放入1.5mL离心管中，加入0.5mL处理液A，90℃恒温孵育5min，取出静置至室温，加入0.5mL处理液B，用旋涡混合器混匀，静置后待用。
2)取出已包被好的酶标板和所有冷藏试剂，室温下回温0.5-1h。
3)将试剂一和试剂二的冻干粉分别加入2mL溶解液，混匀后备用。按包板抗原的类型，逐孔加入对应的甲基苯丙胺或吗啡或氯胺酮标准品或待测样品50μL，每孔再依次加入溶解好的试剂一(工作浓度为0.5μg/mL)和试剂二(工作浓度为0.1μg/mL)各50μL，37℃温育30min，用洗涤液洗板3次，拍干。
4)加入TMB显色液100μL，37℃条件下孵育15min。
5)加入终止液100μL终止显色反应。以试剂空白为对照，在450nm波长下测吸光值，以吸光值A为纵坐标，标准品浓度的对数c为横坐标，绘制标准曲线。取不同来源的毛发样品按照上述步骤检测，将450nm波长下测得的吸光度值代入标准曲线公式，得到毛发样品的毒品浓度。根据公安部《涉毒人员毛发样本检测规范》(公禁毒[2018]938)的规定，设定本方法检测毛发中毒品-/+性临界浓度为1ng/mL。
表1 ELISA试剂盒的方法测定甲基苯丙胺标准品含量(ng/mL)
Figure BDA0002717261560000101
根据表1检测结果可知，浓度为0.167ng/mL时，变异系数为3.68％<15％，因此该项目的最低检测限为0.167ng/mL，浓度范围为0.167-40.5ng/mL时，产品的线性相关系数R2＝0.9955>0.99，精密度良好，可完全区分阴阳性，符合筛查使用，因此该项目检测范围为0.167-40.5ng/mL。
表2 ELISA试剂盒的方法测定吗啡标准品含量(ng/mL)
Figure BDA0002717261560000111
根据表2检测结果可知，浓度为0.167ng/mL时，变异系数为3.54％<15％，因此该项目的最低检测限为0.167ng/mL，浓度范围在0.167-40.5ng/mL时，产品的线性相关系数R2＝0.9975>0.99，精密度良好，可完全区分阴阳性，符合筛查使用，因此该项目检测范围为0.167-40.5ng/mL。
表3 ELISA试剂盒的方法测定氯胺酮标准品含量(ng/mL)
Figure BDA0002717261560000112
Figure BDA0002717261560000121
根据表3检测结果可知，浓度为0.167ng/mL时，变异系数为3.16％<15％，因此该项目的最低检测限为0.167ng/mL，浓度范围在0.167-40.5ng/mL时，产品的线性相关系数R2＝0.9970>0.99，精密度良好，可完全区分阴阳性，符合筛查使用，因此该项目检测范围为0.167-40.5ng/mL。
实施例6准确度检测
1.取1.5ng/mL、4.5ng/mL、13.5ng/mL的甲基苯丙胺标准品，用实施例5的方法进行检测，重复检测六次，取平均值进行计算。回收率＝检测浓度/实际浓度*100％。
表4甲基苯丙胺准确度实验
Figure BDA0002717261560000122
根据检测结果可知，甲基苯丙胺的浓度准确度检测变异系数<10％。
2.取1.5ng/mL、4.5ng/mL、13.5ng/mL的吗啡标准品，用实施例5的方法进行检测，重复检测六次，取平均值进行计算。回收率＝检测浓度/实际浓度*100％。
表5吗啡准确度实验
Figure BDA0002717261560000131
根据检测结果可知，吗啡的浓度准确度检测变异系数<10％。
3.取1.5ng/mL、4.5ng/mL、13.5ng/mL的氯胺酮标准品，用实施例5的方法进行检测，重复检测六次，取平均值进行计算。回收率＝检测浓度/实际浓度*100％。
表6氯胺酮准确度实验
Figure BDA0002717261560000132
根据检测结果可知，氯胺酮的浓度准确度检测变异系数<10％。
实施例7精密度检测
1.取三批(A\B\C)实施例4的试剂盒，分别检测1.5ng/mL、4.5ng/mL、13.5ng/mL的甲基苯丙胺标准品，每个浓度重复检测10次，取平均值进行计算。
表7甲基苯丙胺精密度实验
Figure BDA0002717261560000141
根据检测结果可知，甲基苯丙胺的浓度精密度检测变异系数<10％。
2.取三批(A\B\C)实施例4的试剂盒，分别检测1.5ng/mL、4.5ng/mL、13.5ng/mL的吗啡标准品，每个浓度重复检测10次，取平均值进行计算。
表8吗啡精密度实验
Figure BDA0002717261560000142
Figure BDA0002717261560000151
根据检测结果可知，吗啡的浓度精密度检测变异系数<10％。
3.取三批(A\B\C)实施例4的试剂盒，分别检测1.5ng/mL、4.5ng/mL、13.5ng/mL的氯胺酮标准品，每个浓度重复检测10次，取平均值进行计算。
表9氯胺酮精密度实验
Figure BDA0002717261560000152
根据检测结果可知，氯胺酮的浓度精密度检测变异系数<10％。
实施例8稳定性检测
将试剂盒保存在-20℃保存2年，2-8℃保存1年，室温保存1月后检测线性标准品浓度，每个浓度检测3次，取平均值进行计算。
表10试剂盒稳定性数据
Figure BDA0002717261560000161
试剂盒经长时间保存后，分别检测甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮的浓度，变异系数均<10％。
实施例9 LC-MS方法验证
用实施例5中所述方法对毛发中毒品检测试剂盒(ELISA-BAS法)检测的临床标本进行检测，结果如下：
100份阳性标本，本方法检测出阳性份，灵敏度符合率100％；
100份阴性标本，本方法未检测出阳性，特异性符合率91％。
表11头发样本试剂盒测试结果
标本种类 总数 阳性数量 阴性数量 灵敏度符合率 特异性符合率
阳性标本 100 100 0 100％ -
阴性标本 100 9 91 - 91％
灵敏度符合率计算方法：真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％，即正确判断吸毒人员的比例。
特异性符合率计算方法：真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％，即正确判断非吸毒人员的比例。
将处理后的头发消化液过0.22μm滤膜后上样，经LC-MS的方法验证可得：样品中甲基苯丙胺的回收率在90-110％之间，与试剂盒检测得到的结果基本一致，故本试剂盒准确性较好。
对比例1
专利CN110208072A所述痕量毒品检测的人体毛发快速裂解液：65nM碱性蛋白酶AH-101、0.8％巯基乙酸(pH11)、50mM甘氨酸、45mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl，pH7.8)、50mM氯化钠-氢氧化钠缓冲液(NaCl-NaOH，pH10.5)、0.8％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)和80mM二硫苏糖醇(DTT)。
对比例2
消化液配方：
处理液A包括角蛋白酶10μg/mL，蛋白酶K 10μg/mL，DTT 40μmol/mL，氢氧化钠0.01mol/L；
处理液B包括盐酸0.01mol/L。
对比例3
处理液A包括角蛋白酶50μg/mL，蛋白酶K 50μg/mL，DTT 10μmol/mL，氢氧化钠0.05mol/L；
处理液B包括盐酸0.05mol/L。
实验例1
分别按照实施例3和对比例1、对比例2、对比例3的毛发裂解液进行头发样本的裂解，后按照本发明实施例5所述检测方法检测1.5ng/mL标准品，重复三次，取平均值进行计算。结果详见下表12。
表12不同裂解液效果检测
Figure BDA0002717261560000181
由表12检测结果可知，本发明所述的毛发消化液具有较好的裂解效果，提高了甲基苯丙胺、吗啡、氯胺酮检测的稳定性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种检测毛发中毒品含量的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括毛发消化液，所述的消化液包括处理液A和处理液B，所述的处理液A包括角蛋白酶、蛋白酶K、DTT和氢氧化钠，处理液B包括盐酸。
2.根据权利要求1所述的检测毛发中毒品含量的试剂盒，其特征在于，所述的处理液A包括角蛋白酶1-200μg/mL，蛋白酶K1-200μg/mL，DTT 10-100μmol/mL，氢氧化钠0.01-0.5mol/L，所述的处理液B包括盐酸0.01-0.5mol/L。
3.根据权利要求2所述的检测毛发中毒品含量的试剂盒，其特征在于，所述的处理液A包括角蛋白酶5-100μg/mL，蛋白酶K5-100μg/mL，DTT 20-80μmol/mL，氢氧化钠0.04-0.4mol/L，pH 11-12，所述的处理液B包括盐酸0.04-0.4mol/L，pH 2-3。
4.根据权利要求3所述的检测毛发中毒品含量的试剂盒，其特征在于，所述的处理液A包括角蛋白酶30-50μg/mL，蛋白酶K30-50μg/mL，DTT 30-40μmol/mL，氢氧化钠0.05-0.2mol/L，pH 11.5-12，所述的处理液B包括盐酸0.05-0.2mol/L，pH 2-2.5。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测毛发中毒品含量的试剂盒，其特征在于，所述的检测毛发中毒品含量的试剂盒还包括：抗原-BSA包被的酶标板、试剂一：生物素标记的特异性抗体冻干粉、试剂二：Streptavidin-HPR冻干粉、标准品、洗涤液、溶解液、显色液、终止液。
6.根据权利要求5所述的检测毛发中毒品含量的试剂盒，其特征在于，
所述的抗原-BSA的制备方法如下：按质量比1:3分别取甲基苯丙胺、吗啡或氯胺酮和K2CO3，按照料液比20mg:1mL溶解于甲苯中，在氮气保护下，按照甲苯:溴乙酰溴体积比为40:1，向上述溶液中缓慢加入溴乙酰溴，常温搅拌4-6h，将所得溶液旋转蒸干，用磷酸盐缓冲溶液溶解残渣，将含有BSA的磷酸盐溶液缓慢加至上述溶液，搅拌过夜，冷冻干燥即得抗原-BSA；
所述的抗原-BSA包被的酶标板的制备方法如下：用0.01-2.5μg/mL抗原-BSA溶液包被96孔板，4℃过夜，抗原-BSA溶液的浓度优选为0.01-1.0μg/mL，优选为0.1-0.5μg/mL；次日用脱脂牛奶在37℃条件下封闭96孔板2h，用洗涤液洗板3次，拍干后冷藏4℃备用；
所述的生物素标记的特异性抗体的制备方法如下：
1)动物免疫与血清效价的测定：取一定量的抗原甲基苯丙胺、吗啡或氯胺酮稀释至适宜浓度，加入等量的弗氏佐剂，用注射器来回抽吸充分乳化，取6周龄左右的Balb/c小鼠，采用皮下多点注射的免疫方式进行小鼠免疫，免疫间隔两周，待小鼠效价达到融合要求后，直接腹腔注射50μg抗原进行加强免疫；
2)骨髓瘤细胞的培养：骨髓瘤SP2/0细胞，用含10％FBS的RPMI-1640完全培养基培养SP2/0细胞，每天更换新鲜培养基使成为对数分裂期生长旺盛的细胞，融合前将SP2/0细胞用含8-氮鸟嘌呤的完全培养基进行培养传代4-5次，防止SP2/0细胞的反祖，保证细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型，防止对融合后杂交瘤细胞的筛选带来的影响；
3)杂交瘤细胞的筛选：取免疫鼠脾脏，分离淋巴细胞，与SP2/0细胞在50％PEG溶液的条件下以1:10的比例进行融合，经选择培养液培养后，将效价高的细胞进行亚克隆分离得到分泌抗体的单克隆细胞株，将培养状态良好的阳性细胞株进行小鼠体内诱生产生抗体，纯化抗体；
4)抗体生物素标记：采用生物素标记试剂盒标记纯化后的单克隆抗体；
所述的生物素标记的特异性抗体冻干粉的制备方法如下：
取0.5-5μg/mL生物素标记的特异性抗体加入冻干瓶中，按照体积比1:1加入冻干保护剂，按下述方法进行冷冻干燥：预冻温度-40℃，维持2-3h；主干燥温度-20℃，维持6-10h，0℃维持2-5h，10℃维持2-5h，20℃维持2-5h；后干燥温度30-50℃，维持4-10h，不同温度间升温速率为10℃/h；
所述的Streptavidin-HPR冻干粉的制备方法如下：
取0.5-5μg/mL Streptavidin-HPR加入冻干瓶中，按照体积比1:1加入冻干保护剂，按下述方法进行冷冻干燥：预冻温度-40℃，维持2-3h；主干燥温度-20℃，维持6-10h，0℃维持2-5h，10℃维持2-5h，20℃维持2-5h；后干燥温度30-50℃，维持4-10h，不同温度间升温速率为10℃/h；
所述的冻干保护剂包括：脱脂牛奶，海藻糖10-200mg/mL，乳糖10-200mg/mL，右旋糖苷10-200mg/mL，牛血清白蛋白10-200mg/mL中的一种或几种的混合物；
所述标准品包括甲基苯丙胺标准品、吗啡标准品或氯胺酮标准品，所述甲基苯丙胺标准品的浓度为0.167-40.5ng/mL，所述吗啡标准品的浓度为0.167-40.5ng/mL，所述氯胺酮标准品的浓度为0.167-40.5ng/mL；
所述洗涤液为0.15M PBS，制备方法如下：KH2PO4 0.2g，Na2HPO4-12H2O 2.9g，NaCl8.0g，KCl 0.2g，0.05％Tween-20 0.5mL，加蒸馏水至1000mL；
所述溶解液为将所述洗涤液调至pH 6.0，在该洗涤液中加入脱脂牛奶，使脱脂牛奶在洗涤液中的浓度为0.01g/mL；
所述显色液为TMB显色液；
所述终止液为2M H2SO4，制备方法如下：蒸馏水178.3mL，逐滴加入98％浓硫酸21.7mL。
7.一种采用权利要求1-6所述的试剂盒检测毛发中毒品含量的方法，其特征在于，所述的检测方法包括如下步骤：
1)称取毛发，剪成细段，放入离心管中，按照毛发:处理液A为1mg:0.1mL的比例，加入处理液A，90℃恒温孵育4-6min，取出静置至室温，按照处理液A:处理液B体积比为1:1加入处理液B，混匀，静置后待用；
2)按照冻干前溶液总体积:溶解液体积为1:5分别向试剂一和试剂二的冻干粉中加入溶解液，混匀后备用，取封闭好的96孔板，使孔板温度恢复室温，逐孔加入包板抗原对应的系列标准品和待测样品，按照系列标准品/待测样品:试剂一:试剂二体积比为1:1:1依次加入试剂一和试剂二，37℃温育30min，用洗涤液洗板3次，拍干；
3)按照试剂一/试剂二:TMB显色液体积比为1:2加入TMB显色液，37℃条件下孵育15min；
4)加入TMB显色液等量终止液终止显色反应，以试剂空白为对照，在450nm波长下测吸光值，以吸光值A为纵坐标，标准品浓度的对数c为横坐标，绘制标准曲线，将待测样品测得的吸光度值代入标准曲线公式，即可得到毛发样品中包板抗原对应毒品的浓度。
8.根据权利要求7所述的检测毛发中毒品含量的方法，其特征在于，步骤1)中所述的毛发包括头发、阴毛、腋毛、胸毛或者腿毛。
9.根据权利要求7所述的检测毛发中毒品含量的方法，其特征在于，步骤2)中所述的试剂一的工作浓度为0.1-1.0μg/mL；试剂二的工作浓度为0.1-1.0μg/mL。
10.根据权利要求9所述的检测毛发中毒品含量的方法，其特征在于，步骤2)中所述的试剂一的工作浓度为0.1-0.6μg/mL，优选为0.2-0.6μg/mL；试剂二的工作浓度为0.1-0.6μg/mL，优选为0.1-0.3μg/mL。
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