CN107698653B - 一种雷公藤甲素半抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食品安全与检测，具体公开了一种雷公藤甲素半抗原及其制备方法与应用。所述雷公藤甲素半抗原的分子结构式如式Ⅰ所示。本发明还公开了使用所述雷公藤甲素半抗原进行全抗原的合成，并进行多克隆抗体的制备以及检测试剂盒研发。本发明的雷公藤甲素多克隆抗体及其试剂盒可用于有毒蜂蜜、中药、生物基质中剧毒物质雷公藤甲素及雷公藤二萜物质的检测分析。

Description

一种雷公藤甲素半抗原及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及食品安全与检测，具体地说，涉及一种雷公藤甲素半抗原及其制备方法与应用。
背景技术
雷公藤甲素(Triptolide，TPL)是从传统中药雷公藤中提取出来的环氧二萜内酯类化合物，是雷公藤的主要有效成分之一。具有免疫调节、抗炎、抗生育及抗肿瘤等多种生物活性，临床使用广泛，但雷公藤甲素治疗窗窄，不合理使用常常导致人发生中毒反应，危害人类健康。
近年来，我国南方地区陆续爆发多起蜂蜜中毒致人死亡的恶性事件，如2014年的福建泰宁和2015年的湖北恩施村民食野生蜂蜜意外中毒。通过对事发当地的调研和实验室分析发现蜜蜂采集雷公藤花粉产生蜂蜜，人们食用蜂蜜之后便出现了中毒反应。经检测这些蜂蜜中含有大量的雷公藤甲素，其含量介于200-1500μg/kg。因此，检测蜂蜜等食品中雷公藤甲素很有必要。
目前，检测雷公藤甲素的方法大多是采用高效液相色谱或者液相串联质谱技术检测。通常这些检测方法需要昂贵的分析仪器，对检测样本的预处理也较为繁琐，难以适用于中毒反应的快速诊断和推广。因此，为了检测生物样本和蜂蜜中的雷公藤甲素，急需开发一种较为灵敏、快速、可靠的快检方法。
免疫分析方法是基于抗原和抗体之间的特异性结合而建立起来的一种生物分析方法。与传统的理化分析方法相比，免疫分析具有操作简便、分析时间较短、灵敏度高、分析成本低廉等优点，尤其适用阳性样本的快速筛查。在免疫分析方法中，抗体是其核心试剂，而抗体的优劣与半抗原的设计高度相关。因此，有必要设计合成可产生较灵敏抗体的半抗原，开发一种简单、快捷、用于检测雷公藤甲素的试剂盒。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种雷公藤甲素半抗原及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种雷公藤甲素半抗原C24H28O9，分子结构式如式Ⅰ所示，分子量为460.47。
进一步地，本发明提供所述雷公藤甲素半抗原的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)称取100mg雷公藤甲素溶于10mL无水二氯甲烷中，向上述溶液中加入300mg丁二酸酐，100mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)，反应体系室温搅拌12小时，后将反应体系倒入分液漏斗，用稀盐酸洗涤三次，收集有机相，干燥浓缩；
(2)以乙酸乙酯：石油醚＝1:1体系作为展开剂柱色谱分离得白色目标化合物；上述步骤中涉及到的质量和体积可等比例扩大或缩小。
更进一步地，基于前述半抗原的开发，本发明提供一种雷公藤甲素抗原，采用活化酯法将载体蛋白偶联于前述雷公藤甲素半抗原(TPL)的羧基碳上而得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或鸡卵清白蛋白(OVA)，所得雷公藤甲素抗原为TPL-BSA或TPL-OVA。
在后续实验操作和试剂盒的制备中，以TPL-BSA作为免疫原，TPL-OVA作为包被原。
所述雷公藤甲素抗原的制备方法具体包括如下步骤：
(1)称取20mg所述雷公藤甲素半抗原溶解于500μL DMF中，得到半抗原溶液；
(2)在上述半抗原溶液，加入30mg二环己基碳二亚胺(DCC)和20mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，300rpm室温反应5h；
(3)称取60mg载体蛋白溶于10mL PBS缓冲液中，得到蛋白溶液；
(4)将步骤(2)的液相逐滴加入到步骤(3)制备的蛋白溶液中，边滴加边搅拌；上述步骤中涉及到的质量和体积可等比例扩大或缩小。
以牛血清白蛋白(BSA)为例，所得雷公藤甲素抗原的分子结构式如式II所示：
第二方面，本发明提供一种雷公藤甲素抗体，由本发明所述雷公藤甲素抗原免疫动物后制备得到。
所述雷公藤甲素抗体可为采用本领域常规制备抗体手段制备得到的单克隆抗体或多克隆抗体。
当将所述雷公藤甲素抗体应用与雷公藤二萜类物质的检测时，优选所述抗体为雷公藤甲素多克隆抗体。
本发明进一步提供了所述雷公藤甲素抗体在检测雷公藤二萜类物质中的应用。尤其是雷公藤甲素多克隆抗体，除了对雷公藤甲素具有特异性结合之外，还对雷公藤内酯酮和雷公藤三醇等雷公藤二萜物质具有较好的交叉反应率。
优选地，以雷公藤甲素抗原TPL-BSA作为免疫原，本发明制备雷公藤甲素多克隆抗体的方法包括如下步骤：
(1)免疫原用等体积的弗氏完全佐剂乳化后首次免疫Balb/c小鼠，再将首次免疫中所用的免疫原剂量减半，并用等体积的弗氏不完全佐剂乳化后对首次免疫的Balb/c小鼠进行加强免疫；
(2)上述首次免疫的所述免疫原的剂量为0.1mg/只，乳化好后每只Balb/c小鼠的免疫剂量为0.2ml/只，免疫方式为颈背部免疫4-8点；
(3)上述加强免疫次数为3次，每次免疫后一周，眼球采血，收集抗血清，用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定小鼠抗血清效价及抑制情况；
(4)上述加强免疫具体为在首次免疫后第21天各进行一次加强免疫；
(5)最后一次加强免疫后两周，摘眼球采血，收集小鼠抗血清。
进一步地，本发明提供了一种酶联免疫检测试剂盒，含有前述雷公藤甲素抗体，优选为雷公藤甲素多克隆抗体。
所述试剂盒还进一步包括本领域常规使用的试剂/成分，例如包被原、包被液、封闭液、生物酶标记的第二抗体、洗涤液、显色剂和终止液。
其中：
上述包被原为TPL-OVA；
上述包被液为碳酸盐缓冲液，其pH为9.6；
上述封闭液为2％的脱脂牛奶；
上述生物酶标记的第二抗体为羊抗鼠IgG，生物酶为辣根过氧化物酶(HRP)；
上述洗涤液为PBST；即在PBS中加入Twen-20配制而成；
上述显色剂为2％四甲基联苯胺(TMB)和30％过氧化氢。
上述终止液为2M H2SO4。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明首次对雷公藤甲素结构进行了改造，得到半抗原，制备了雷公藤甲素的多克隆抗体，填补了国内外空白。在此之前没有雷公藤甲素抗体制备及相关免疫分析方法的相关信息。利用本发明提供的半抗原与载体蛋白的偶联物制备雷公藤甲素抗体，制备过程简单、经济、灵敏度高、实用价值高。利用本发明制备的多克隆抗体制备的试剂盒具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明雷公藤甲素半抗原的合成路径图。
图2为本发明雷公藤甲素半抗原的质谱图。
图3为本发明雷公藤甲素抗原TPL-BSA的结构示意图。
图4为BSA及免疫原基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图。
图5为多抗血清对雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯的标准曲线图。
图6为雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯交叉反应率图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1雷公藤甲素半抗原的合成与鉴定
一、雷公藤甲素半抗原的合成
称取100mg雷公藤甲素溶于10mL无水二氯甲烷中，向上述溶液中加入300mg丁二酸酐，100mg4-二甲氨基吡啶(DMAP),反应体系室温搅拌12小时,后将反应体系倒入分液漏斗，用稀盐酸洗涤三次，收集有机相，干燥浓缩。以乙酸乙酯：石油醚＝1:1体系作为展开剂柱色谱分离得白色目标化合物。
二、雷公藤甲素半抗原结构的鉴定
将雷公藤甲素半抗原进行质谱鉴定，鉴定结果见图2。可以明显看到[M+H]+峰：m/z461.18005(误差为-2.41ppm，其理论精确质量数为461.18116)，其元素组成为C24H29O9，与目标分子完全相符。
最终结果表明，雷公藤甲素半抗原结构与目标化合物相符，合成成功。
实施例2雷公藤甲素抗原的制备和鉴定
将实施例1制备得到的雷公藤甲素半抗原分别与BSA和OVA偶联，得到人工抗原TPL-BSA和TPL-OVA，其中TPL-BSA作为免疫原，TPL-OVA作为包被原。
一、雷公藤甲素免疫原的制备与鉴定
1、称取20mg半抗原溶解于500μL DMF中，得到半抗原溶液。
2、取步骤1制备的半抗原溶液，加入30mg DCC和20mg NHS，置于磁力搅拌器上，300rpm室温反应5h。
3、取60mg BSA，溶于10mL PBS缓冲液中，得到蛋白溶液。
4、将完成步骤2的液相逐滴加入到步骤3制备的蛋白溶液中，边滴加边用磁力搅拌器搅拌，反应10h。然后转移到截留分子量为7KDa的透析袋中，然后将透析袋置于PBS缓冲液中，4℃透析72h(每12小时换液一次)。
5、完成步骤4后，取所述透析袋，取出其中的液相，3000rpm离心5min，收集上清液，即为TPL-BSA(免疫原结构见图3)。
6、用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted LaserDesorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)法测定TPL-BSA溶液中BSA与半抗原的结合比。结果见图4。
结合比＝{M(偶联物)－M(蛋白质)}/M(半抗原)
BSA的分子量为64806，雷公藤甲素半抗原的分子量为460.47。由质谱最高峰值分析偶联物的分子量为71849，经计算得出BSA与半抗原的结合比为15，即一个BSA分子上分别平均偶联15个半抗原。
二、雷公藤甲素包被原的制备
用60mg OVA代替60mg BSA，步骤同上述免疫原制备，得到雷公藤甲素包被原TPL-OVA。
实施例3Balb/c小鼠的免疫
以考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度测定试剂盒测定TPL-BSA的蛋白浓度。
首次免疫时将TPL-BSA免疫原稀释至1mg/mL(用0.01mol/L PBS稀释)，与弗氏完全佐剂等体积混合，并充分乳化，颈背部皮下多点接种6周龄Balb/c小鼠5只，接种抗原剂量为100μg/只，小鼠注射剂量为0.2ml/只。之后，每隔21天加强免疫一次，加强免疫时将免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化。免疫原的免疫剂量与首次免疫剂量相同，加强免疫次数为3次。第三次加强免疫后两周，对小鼠采取摘除眼球采血方式，离心收集抗血清，获得多克隆抗体。
实施例4雷公藤甲素小鼠抗血清的检测与收集
在二免后，每次免疫一周后采血。对3种免疫原免疫后的小鼠眼球采血，采血量为50-80μl，离心，收集血清。用经典棋盘法测效价以及用间接竞争ELISA法测灵敏度。
一、抗血清效价的测定
用间接ELISA法对抗体效价进行检测。间接ELISA法步骤如下：
1、包被：用0.05M的碳酸盐缓冲液(pH 9.6)将包被原TPL-OVA稀释成0.2μg/mL，在96孔透明酶标板中每孔加入100μL，37℃温箱孵育2h，用PBST缓冲液(pH 7.4)洗板3次。
2、封闭：加入封闭液(2％脱脂牛奶)150μL/孔，37℃温箱孵育1h，弃封闭液，PBST缓冲液(pH 7.4)洗涤3次，拍干。
3、加待测抗体：各列孔加入50μL 0.01M PBS(pH7.4)，再加入50μL稀释后的雷公藤甲素抗血清，抗体从1:4000开始，以2为梯度用0.01M PBS开始稀释，一共稀释4个剃度。加样量为每孔50μL，37℃温箱反应30min，PBST缓冲液(pH 7.4)洗涤3次，拍干。
同时设置未经免疫的Balb/c小鼠抗血清作为阴性对照。
4、加酶标二抗：加入用酶标二抗稀释液按照体积比1:5000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG抗体，每孔100μL，37℃温箱反应30min，PBST缓冲液(pH 7.4)洗涤3次，拍干。
5、显色：将A液与B液以1:1的体积比混合，每孔100μL，37℃温箱显色15min。
6、终止：每孔加入50μL 2mol/L的浓硫酸。
7、读数：以OD450波长测定各孔OD值。以阴性OD值不大于0.15，以最大OD值在1.5-1.8之间对应的抗体稀释度为抗体效价。
二、抗血清灵敏度以及特异性的检测
1.包被、封闭过程同上述“一、抗体效价的测定”中包被与封闭过程。
2.加标准品和抗体
每孔加入50μL雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯标准品溶液和50μL步骤一制备的抗体稀释液，37℃孵育30min，然后用PBST溶液洗涤3次，拍干。
标准品溶液的溶剂为PBS缓冲液，标准品浓度分别为0，0.11，0.33，1，3，9，27，81ng/mL的溶液，每个浓度设置三个平行，37℃温箱反应30min，PBST缓冲液(pH 7.4)洗涤3次，拍干。
3.加酶标二抗
每孔加入100μL酶标二抗稀释液，37℃孵育30min，然后用PBST溶液洗涤3次，拍干。
4.显色
每孔加入100μL显色液，37℃孵育15min。
5.终止
每孔加入50μL 2mol/L浓硫酸。
6.读数
以OD450nm波长测定各孔OD值。
以－log10(竞争物)值为横坐标，以OD值(测定OD 450nm)为纵坐标，利用Origin8.0的四参数方程进行拟合，建立标准曲线获得IC50值。多抗血清对雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯的标准曲线图见图5。
计算雷公藤内酯酮、雷酚内酯两种结构类似物与雷公藤甲素的交叉反应率。
交叉反应率＝IC50(雷公藤内酯)/IC50(结构类似物)
通过四参数方程分析可得，雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯的IC50分别为1.46ng/ml,0.54ng/ml,18ng/ml。通过计算可得，抗体对雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯的交叉反应率分别为100％，270％，8％(见图6)。
三、雷公藤甲素小鼠抗血清的收集
通过小鼠抗血清的筛选，选取效价高，IC50值低的小鼠，在最后一次加强免疫后两周，摘眼球采血，收集小鼠抗血清，得到多克隆抗体。
实施例5雷公藤甲素小鼠多抗血清间接竞争ELISA方法的建立
一、最佳包被浓度和雷公藤甲素抗体最佳稀释度的确定
以0.4μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL浓度稀释的包被原TLP-OVA包被酶标板，37℃温箱反应2h，2％脱脂牛奶封闭1h。用单点竞争的方法，在酶标板中分别加入50μL0.01M PBS溶液和50μL5ng/mL的雷公藤甲素标准品，后分别加入1万、2万，4万，8万，16万倍比稀释的多克隆抗体，37℃温箱孵育30min。加入酶标二抗，显色后选取最大OD值在1.5-1.8之间，抑制率较高情况下对应的包被原、抗体稀释度，即为抗原抗体最佳稀释度。
抑制率＝OD(5ng/mL标准品孔)/OD(PBS孔)
经测定最佳包被浓度为0.2μg/mL，抗体最佳稀释度为4万倍稀释。
二、ELISA检测蜂蜜中雷公藤甲素含量方法的建立
以最佳包被浓度包被酶标板，分别用PBS及用PBS进行5倍、10倍、20倍稀释的市售蜂蜜稀释雷公藤甲素标准品(以稀释的方法去除蜂蜜的基质效应)，浓度分别为0，0.11，0.33，1，3，9，27，81ng/mL建立标准曲线。选取与PBS建立的曲线形状、IC50最接近的蜂蜜稀释度为去除基质效应最佳稀释度。
实验结果可得当蜂蜜10被稀释时，基本上可以消除基质效应，IC50为1.6ng/mL。
实施例6检测雷公藤甲素间接竞争ELISA试剂盒的组建
ELISA试剂盒包括一下组分：
雷公藤甲素标准溶液：浓度分别为0，0.11，0.33，1，3，9，27和81ng/mL，共8瓶。
包被TLP-OVA的96孔聚苯乙烯酶标板。
雷公藤甲素多克隆抗体。
辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠酶标二抗。
洗涤液：含0.05％吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7.4。
酶标物稀释液：含0.01％吐温-20的PBST缓冲液，pH值为7.4。
样品稀释液为0.01mol/L PBS缓冲液，pH值为7.4。
底物显色液：A液为0.1mol/L pH值为5.0的醋酸钠-柠檬酸钠缓冲液配成0.3％过氧化氢储备液，每1mL缓冲液加入14μL储备液，制成使用液；B液为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液，先用丙酮配成0.2mg/mL溶液，用0.1mol/L pH值为5.0的醋酸钠-柠檬酸钠缓冲液制成0.2mg/mL溶液。
终止液：2mol/L H2SO4
试剂盒的保存温度为4℃保存。
实施例7利用ELISA试剂盒检测蜂蜜中雷公藤甲素残留
对20份蜂蜜样品处理后，用ELISA试剂盒检测样品中雷公藤甲素残留量，并用传统的仪器分析方法对试验进行确证。ELISA试剂盒检测方法如下：
分别称取20份蜂蜜样本2g于50mL离心管中加入38mL PBS缓冲液稀释样品，后混合液置于涡旋仪涡旋5分钟，静置。准备ELISA试剂盒，将抗体浓度稀释至4万倍。分别取浓度为0，0.11，0.33，1，3，9，27，81ng/mL的雷公藤甲素和20份蜂蜜样本50微升于微孔中，加入稀释后的抗体溶液，建立标准曲线。通过Origin 8.0计算样本中雷公藤甲素的含量。
检测结果显示，用ELISA试剂盒与传统的仪器分析方法结果较为一致，方法准确，可以用来检测蜂蜜中雷公藤甲素的含量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种雷公藤甲素抗原，其特征在于，由雷公藤甲素半抗原与载体蛋白偶联得到，所述雷公藤甲素半抗原的分子结构式如式Ⅰ所示：
所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或鸡卵清白蛋白(OVA)。
2.根据权利要求1所述雷公藤甲素抗原，其特征在于，所述雷公藤甲素半抗原的制备方法包括如下步骤：
(1)称取100mg雷公藤甲素溶于10mL无水二氯甲烷中，向上述溶液中加入300mg丁二酸酐，100mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)，反应体系室温搅拌12小时，后将反应体系倒入分液漏斗，用稀盐酸洗涤三次，收集有机相，干燥浓缩；
(2)以乙酸乙酯：石油醚＝1:1体系作为展开剂柱色谱分离得白色目标化合物；
上述步骤中涉及到的质量和体积可等比例扩大或缩小。
3.权利要求1或2所述的雷公藤甲素抗原的制备方法，其特征在于，采用活化酯法将载体蛋白偶联于所述雷公藤甲素半抗原的羧基碳上。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)称取20mg所述雷公藤甲素半抗原溶解于500μL DMF中，得到半抗原溶液；
(2)在上述半抗原溶液，加入30mg二环己基碳二亚胺(DCC)和20mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，300rpm室温反应5h；
(3)称取60mg载体蛋白溶于10mL PBS缓冲液中，得到蛋白溶液；
(4)将步骤(2)的液相逐滴加入到步骤(3)制备的蛋白溶液中，边滴加边搅拌；
上述步骤中涉及到的质量和体积可等比例扩大或缩小。
5.一种雷公藤甲素抗体，其特征在于，由权利要求1所述的雷公藤甲素抗原免疫动物后制备得到。
6.根据权利要求5所述的雷公藤甲素抗体，其特征在于，所述抗体为雷公藤甲素多克隆抗体。
7.权利要求5或6所述的抗体在检测雷公藤二萜类物质中的应用。
8.一种酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求5或6所述的抗体。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包被原、包被液、封闭液、生物酶标记的第二抗体、洗涤液、显色剂和终止液。
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