CN111057064A - 14-羟基钩吻素己半抗原和人工抗原及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供14‑羟基钩吻素己半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。14‑羟基钩吻素己半抗原的结构如式（I）所示：

Description

14-羟基钩吻素己半抗原和人工抗原及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体地说，涉及14-羟基钩吻素己半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。

背景技术

钩吻（Gelsemium elegans）是一种剧毒植物，也称之为大茶药、断肠草等，广泛分布于我国华南山区，此外，在东南亚和南亚亦有其分布。由于钩吻花朵呈明黄色，较为艳丽，人们往往将其误以为金银花等其它中药而误服，从而导致中毒反应甚至致人死亡。由于华南山区钩吻分布广泛，我国每年均有因误食钩吻而中毒的事件报道。此外，钩吻还是我国主要有毒蜜源植物之一，在其盛花期，蜜蜂会采集其花蜜酿制有毒蜂蜜，人一旦食用钩吻蜂蜜，也会发生中毒反应，严重者甚至致人死亡。钩吻植物的茎、叶和花中含有丰富的生物碱，其中多数生物碱具有强烈生物毒性，如神经毒性和肝肾毒性等。目前，已鉴定的生物碱种类多达上百种，基于其化学结构的不同，将钩吻生物碱主要分为6大类型，分别为gelsedine型、gelsemine型、humantenine型、koumine型、sarpaginetype型和yohimbane型。其中gelsemine型钩吻生物碱毒性最大，其在小鼠中半数致死量往往低于1.0 µg/kg b.w.，属于剧毒性化合物。而14-羟基钩吻素己便是gelsemine型钩吻生物碱的典型化合物，而且其在钩吻根、茎、叶和花中含量较高，是钩吻植物致人中毒关键植物毒素之一。而如何准确识别和检测14-羟基钩吻素己是当前钩吻中毒诊断和保障食品安全的重要举措之一。

当前14-羟基钩吻素己的检测主要依赖高效液相色谱或者高效液相串联质谱等技术，这些仪器分析方法需要用到昂贵的仪器设备，且对分析人员具有较高的专业和技术要求，难以满足当前钩吻中毒快速诊断和食品安全检测的需求。免疫分析具有方法简单、方便、高灵敏和高特异性等优点，非常适合现场快速检测和实验室半定量分析，已经在临床医学诊断和食品安全检测领域得到广泛应用。免疫分析方法的核心是抗体，一旦获得优良的抗体，便可设计多种多样的免疫分析模式进行研发，可以满足不同场地的检测的需求。而优良抗体获得的关键便是半抗原的设计与改造，只有设计合理的半抗原才能有效地刺激机体产生高灵敏度和高特异性的抗体。作为钩吻植物体中主要生物碱，目前，尚未见14-羟基钩吻素己免疫分析方法的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有14-羟基钩吻素己抗原合成技术的空白，提供14-羟基钩吻素己半抗原和人工抗原及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种14-羟基钩吻素己半抗原（HGE-HS），其结构如式（I）所示：

式(I)

第二方面，本发明提供HGE-HS半抗原的制备方法，14-羟基钩吻素己与琥珀酸酐反应得到14-羟基钩吻素己半抗原。除了琥珀酸酐，马来酸酐、邻苯二甲酸酐等均可用于反应制备得到含不同C原子数间隔臂长度的14-羟基钩吻素己半抗原。

所述方法包括：用6.0 mL无水吡啶分别溶解14-羟基钩吻素己20 mg与琥珀酸酐10mg，将两种溶液混合，置于油浴磁力搅拌器，于50℃ 240 rpm避光反应9 h；反应体系加水淬灭后，用乙酸乙酯萃取，然后用0.1M稀盐酸洗涤，有机相干燥浓缩后，柱色谱分离即得。

第三方面，本发明提供14-羟基钩吻素己人工抗原，由HGE-HS半抗原与载体蛋白偶联后得到。即，一种14-羟基钩吻素己完全抗原，是HGE-HS半抗原与载体蛋白的偶联物。所述14-羟基钩吻素己人工抗原可以作为免疫原也可以作为包被原。

其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白；优选BSA和OVA。

第四方面，本发明提供所述人工抗原的制备方法，通过碳二亚胺、活泼酯法或混合酸酐法使14-羟基钩吻素己半抗原与载体蛋白偶联制备得到人工抗原；优选活泼酯法。

所述方法包括以下步骤：

1）按照1:2:2的摩尔质量比（或物质的量比）称取14-羟基钩吻素己半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺于反应瓶（如玻璃反应瓶）中，并用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解；将反应瓶置于磁力搅拌器上，400 rpm室温避光反应4 h，离心取上清，得到14-羟基钩吻素己半抗原活化液；

2）称取载体蛋白，溶解于含10% N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的磷酸盐缓冲液（PBS, 0.01M, pH为7.4）中，得到浓度为6 mg/mL的载体蛋白溶液；将14-羟基钩吻素己半抗原活化液逐滴加到载体蛋白溶液中，边滴加边搅拌，使活化的钩吻素己半抗原与载体蛋白的摩尔比达1-60:1（优选20:1），4℃搅拌过夜反应；将反应液置于透析袋中，并用磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 M, pH为7.4）透析3天，离心取上清，即得。

第五方面，本发明提供由所述14-羟基钩吻素己人工抗原制备的特异性抗体，所述抗体可通过14-羟基钩吻素己人工抗原免疫实验动物（如Balb/c小鼠，新西兰大白兔，绵羊等，优选Balb/c小鼠），收集血清纯化获得，所述抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体，优选多克隆抗体。

优选地，所述人工抗原由所述14-羟基钩吻素己半抗原与BSA偶联得到。

第六方面，本发明提供所述14-羟基钩吻素己半抗原或14-羟基钩吻素己人工抗原的以下任一应用：

（1）用于制备抗14-羟基钩吻素己特异性抗体；

（2）用于检测14-羟基钩吻素己。

第七方面，本发明提供所述特异性抗体的以下任一应用：

（1）用于检测14-羟基钩吻素己；

（2）用于制备14-羟基钩吻素己免疫层析试纸条；

（3）用于制备14-羟基钩吻素己酶联免疫分析试剂盒。

本发明所述人工抗原分为免疫原和包被原，免疫原可以是HGE-HS-BSA，包被原可以是HGE-HS-OVA。

在本发明的一个具体实施方式中，免疫Balb/c小鼠的方法为：首次免疫时，免疫原用等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫6-8周龄Balb/c小鼠5只；加强免疫时，用相同剂量的免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后免疫Balb/c小鼠。

其中，所述首次免疫及加强免疫的所述免疫原的剂量为100 µg/只，免疫原浓度为1 mg/mL（稀释液为0.01 M PBS），乳化后每只Balb/c小鼠的免疫剂量为0.2 mL/只。

上述加强免疫次数为3次。

上述加强免疫具体为在每次免疫后4周各进行一次加强免疫。

所述小鼠抗血清即为鼠源多克隆抗体，在第三次加强免疫一周后，眼球静脉采血分离获得血清。

所述分析测定方法为酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）。

所述ELISA检测方法包括：间接ELISA法，检测14-羟基钩吻素己抗体血清效价；间接竞争ELISA法，测定抗体的半数抑制浓度（IC₅₀）和特异性。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

（一）本发明首次提供一种新型的14-羟基钩吻素己半抗原、人工抗原及其制备方法，用所述14-羟基钩吻素己人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的特异性抗体。本发明提供的HGE-HS及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的14-羟基钩吻素己检测方法提供了新手段。

（二）本发明提供的14-羟基钩吻素己半抗原在尽可能保持14-羟基钩吻素己结构不变的情况下，得到活泼基团为羧基的半抗原。将所获得的纯化后的半抗原偶联载体蛋白用于制备包被原或抗体，继而建立免疫分析方法，具有广阔的应用前景。

（三）本发明提供的14-羟基钩吻素己半抗原的合成方法，在14-羟基钩吻素己的羟基位引入长度为4个碳原子间隔臂，则14-羟基钩吻素己可作为抗原决定簇，暴露于载体蛋白表面，可以很好地刺激机体产生免疫反应，为高灵敏度抗14-羟基钩吻素己抗体的制备奠定基础。

（四）利用本发明14-羟基钩吻素己半抗原制备的14-羟基钩吻素己多克隆抗体，IC₅₀低达0.66 ng/mL，具有灵敏度高，实用价值高等独特优点。基于抗体所制备的ELISA试剂盒及胶体金试纸条等免疫分析方法在食品毒素检测中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中式（I）所示HGE-HS制备的流程图。

图2为本发明实施例1中14-羟基钩吻素己（A）和14-羟基钩吻素己半抗原（B）的质谱图。

图3为本发明实施例2中免疫原HGE-HS-BSA的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图（MALDI-TOF-MS）。

图4为本发明实施例3中利用抗血清HGE-HS-BSA-1#检测14-羟基钩吻素己的标准曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1 14-羟基钩吻素己半抗原（HGE-HS）的制备和鉴定

（1）用6.0 mL无水吡啶分别溶解14-羟基钩吻素己（20 mg）与琥珀酸酐（10 mg），将两种溶液混合，并置于油浴磁力搅拌器避光反应9 h（50℃，240 rpm），得到反应产物。合成路线见图1。

（2）反应体系加水淬灭，用乙酸乙酯萃取，然后用0.1M稀盐酸洗涤，有机相干燥浓缩。

（3）柱色谱分离即得白色目标化合物14-羟基钩吻素己半抗原（21.3 mg, 产率83%）。

用高分辨质谱对纯化后的半抗原进行鉴定，结果如图2所示。14-羟基钩吻素己:MS m/z 343.16523 [M+H]⁺；HGE-HS: MS m/z 443.181283 [M+H]⁺。HGE-HS的m/z与14-羟基钩吻素己的相比，恰好增加了100 Da，表明HGE-HS制备成功；此外高分辨质谱提供的精确质量数和元素组成(C₂₃H₂₇N₂O₇ ⁺)结果进一步表明半抗原HGE-HS合成成功，可以用于抗体的制备。

实施例2 14-羟基钩吻素己人工抗原的制备

（1）分别称取14-羟基钩吻素己半抗原（10 mg）、N-羟基琥珀酰亚胺（4.5 mg）和二环己基碳二亚胺（9 mg）于玻璃反应瓶中，加入1 mL DMF。将装有反应液的玻璃瓶置于磁力搅拌器上，400 rpm室温避光反应5 h。

（2）取60 mg BSA（OVA），溶于10 mL含10%（体积百分含量）DMF的PBS缓冲液中，得到蛋白溶液。

（3）将完成步骤（1）的液相逐滴加入到步骤（2）制备的蛋白溶液中，将反应液置于磁力搅拌器，4℃反应5 h。

（4）将步骤（3）中蛋白活化液转移到截留分子量为7 KDa的透析袋中，然后将透析袋置于PBS缓冲液中4℃透析3天（每12小时换液一次）。

（5）完成步骤（4）后，取出透析袋，将其中的液相以3000 rpm离心5 min，收集上清液，即为人工抗原HGE-HS-BSA（HGE-HS-OVA）溶液。

HGE-HS-BSA经MALDI-TOF-MS鉴定（图3），可得载体蛋白BSA与半抗原HGE-HS的偶联摩尔比为10.5:1，结果证明免疫原合成成功，可用于小鼠免疫，制备单克隆抗体。

实施例3 14-羟基钩吻素己多克隆抗体的制备和鉴定

一、14-羟基钩吻素己多克隆抗体的制备

将实施例2制备的HGE-HS-BSA作为免疫原免疫小鼠，将HGE-HS-OVA作为包被原用来检测小鼠抗血清。用Bradford法测定完全抗原的浓度，经测定可得HGE-HS-BSA和HGE-HS-OVA的浓度均为5.5 mg/mL。

首次免疫时将免疫原稀释至1 mg/mL (用0.01 M PBS，pH为7.4进行稀释)，取稀释后的免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，并充分乳化，颈背部皮下多点接种6-8周龄Balb/c小鼠（免疫5只小鼠），接种免疫原剂量为100 μg/只，注射剂量为0.2 mL/只。然后，每隔4周加强免疫一次，加强免疫时将免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化。免疫原的免疫剂量与首次免疫剂量相同，加强免疫次数为3次。

二、小鼠多克隆抗体的检测

在第3次加强免疫完成一周后对小鼠眼球采血，3000 rpm离心共获得5种抗血清（即多克隆抗体），抗血清分别按照HGE-HS-BSA-1#的编号依次进行命名。用经典棋盘法测定抗血清效价以及用间接竞争ELISA法测抗血清灵敏度。

1、抗血清效价的测定

用间接ELISA法对抗体效价进行检测。间接ELISA法步骤如下：

(1)包被：用碳酸盐缓冲液（0.05 M, pH 9.6）将包被原HGE-HS-BSA稀释成0.25 μg/mL，并加入96孔透明酶标板中（100 μL/孔），37 °C温箱孵育2 h，用PBST缓冲液（含0.05%Tween-20 PBS，pH 7.4）洗板3次。

(2)封闭：加入封闭液（5%脱脂牛奶）150 μL/孔，37 °C温箱孵育1 h，弃封闭液，用PBST缓冲液洗涤1次，拍干。

(3)加待测抗体：各列孔加入50 μL 0.01 M PBS（pH7.4），再加入50 μL稀释后的14-羟基钩吻素己多克隆抗体，抗体从1:2000开始，以2倍为梯度用0.01 M PBS进行稀释，共稀释8个梯度。加样量为每孔50 μL，37 °C温箱反应30 min，PBST缓冲液洗涤3次，拍干。

同时设置未经免疫的小鼠抗血清作为阴性对照。

(4)加酶标二抗：加入用酶标二抗稀释液按照体积比1:5000 稀释的 HRP 标记羊抗鼠IgG抗体，100 μL/孔，37 °C温箱反应30 min，PBST 缓冲液洗涤3次，拍干。

(5)显色：将辣根过氧化物酶底物3,3’,5,5’- 四甲基联苯胺溶液和质量分数为30%的过氧化氢按照1:1的体积比混合，加入微孔板中（100 μL/孔），37 °C温箱显色15min。

(6)终止：每孔加入50 μL 2 mol/L的浓硫酸。

(7)读数：以OD₄₅₀波长测定各孔OD值。以阴性OD值≤0.15，以最大OD值在1.5-1.8之间对应的抗体稀释度为抗体效价。抗血清的最佳稀释度见表1，由表中数据可得，所有抗血清的稀释度均在1:8000以上，说明用合成的半抗原偶联载体蛋白去免疫小鼠，可以获得较好的免疫效果。其中抗血清HGE-HS-BSA-1#的效价最高，为1:64000。

2、多克隆抗体IC₅₀的测定

(1)包被、封闭过程同上。

(2)加标准品和抗体：每孔加入50 μL 14-羟基钩吻素己标准品溶液和50 μL抗体稀释液（按照表1中的抗体效价进行稀释），37℃孵育30 min，然后用PBST溶液洗涤3次，拍干。标准品溶液的溶剂为PBS缓冲液，标准品浓度分别为0、0.125、0.25、0.5、1、2、4和8 ng/mL的溶液，每个浓度三个平行。

(3)加酶标二抗，显色，终止及读数过程同上。

将所测得的数据以-log10（竞争物）值为横坐标，以OD₄₅₀值为纵坐标，利用 Origin8.0 的四参数方程进行拟合，建立标准曲线获得IC₅₀值。6种多克隆抗体的IC₅₀值见表1，由表中数据可知，HGE-HS-BSA-1#的IC₅₀最低，为0.66 ng/mL（图4）。结果表明，本发明中所设计的半抗原结构HGE-HS作为抗原决定簇，可以很好地刺激小鼠产生高灵敏度抗体。

3、多克隆抗体特异性的检测

选取抗血清IC₅₀最低的HGE-HS-BSA-1#，进行特异性的测定。检测方法同上。14-羟基钩吻素己结构类似物（钩吻素甲、钩吻素己、钩吻素子）的浓度调整为0、1、3、9、27、81、243、729ng/mL，设定3个平行，测定抗体的特异性。抗体的特异性用交叉反应率（CR）来表示，具体计算公式为：

CR（%）=IC₅₀（14-羟基钩吻素己）/IC₅₀（结构类似物）×100%

结果见表2，HGE-HS-BSA-1#可以特异性识别14-羟基钩吻素己，对其他结构类似物的交叉反应率均小于40.7%。

HGE-HS-BSA-1#对14-羟基钩吻素己的线性检测范围（IC₂₀-IC₈₀）为0.37-1.18 ng/mL，IC₅₀为0.66 ng/mL。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.14-羟基钩吻素己半抗原，其特征在于，其结构如式（I）所示：

式(I)。

2.权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于，14-羟基钩吻素己与琥珀酸酐反应得到14-羟基钩吻素己半抗原。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：用6.0 mL无水吡啶分别溶解14-羟基钩吻素己20 mg与琥珀酸酐10 mg，将两种溶液混合，置于油浴磁力搅拌器，于50℃ 240rpm避光反应9 h；反应体系加水淬灭后，用乙酸乙酯萃取，然后用0.1M稀盐酸洗涤，有机相干燥浓缩后，柱色谱分离即得。

4.14-羟基钩吻素己人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述14-羟基钩吻素己半抗原与载体蛋白偶联后得到；

其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白；优选BSA、OVA。

5.权利要求4所述人工抗原的制备方法，其特征在于，通过碳二亚胺、活泼酯法或混合酸酐法使14-羟基钩吻素己半抗原与载体蛋白偶联制备得到人工抗原；优选活泼酯法。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）按照1:2:2的摩尔质量比称取14-羟基钩吻素己半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺于反应瓶中，并用N,N-二甲基甲酰胺溶解；将反应瓶置于磁力搅拌器上，400rpm室温避光反应4 h，离心取上清，得到14-羟基钩吻素己半抗原活化液；

2）称取载体蛋白，溶解于含10% N,N-二甲基甲酰胺的磷酸盐缓冲液中，得到浓度为6mg/mL的载体蛋白溶液；将14-羟基钩吻素己半抗原活化液逐滴加到载体蛋白溶液中，边滴加边搅拌，使活化的钩吻素己半抗原与载体蛋白的摩尔比达1-60:1，4℃搅拌过夜反应；将反应液置于透析袋中，并用磷酸盐缓冲液透析3天，离心取上清，即得。

7.由权利要求4所述人工抗原制备的特异性抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。

8.权利要求1所述半抗原或权利要求4所述人工抗原的以下任一应用：

（1）用于制备抗14-羟基钩吻素己特异性抗体；

（2）用于检测14-羟基钩吻素己。

9.抗14-羟基钩吻素己多克隆抗体，其特征在于，由权利要求4所述人工抗原免疫实验动物获得；

优选地，所述人工抗原由所述14-羟基钩吻素己半抗原与BSA偶联得到。

10.由权利要求7所述特异性抗体或权利要求9所述多克隆抗体的以下任一应用：

（1）用于检测14-羟基钩吻素己；

（2）用于制备14-羟基钩吻素己免疫层析试纸条；

（3）用于制备14-羟基钩吻素己酶联免疫分析试剂盒。

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