CN111518114B

CN111518114B - 一种羟基马桑内酯半抗原及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111518114B
Application number: CN202010624457.5A
Authority: CN
Inventors: 杨术鹏; 李熠; 傅怡; 周金慧; 张金震; 杨宇晖
Original assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-07-02
Filing date: 2020-07-02
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2040-07-02
Also published as: CN111518114A

Abstract

本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种羟基马桑内酯半抗原及其制备方法与应用。羟基马桑内酯半抗原，具有如下结构：

Description

一种羟基马桑内酯半抗原及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种羟基马桑内酯半抗原及其制备方法与应用。

背景技术

马桑(Coriaria Sinica Maxim)是桑科马桑属的一种有毒植物，又名醉鱼草。马桑植中含有丰富的倍半萜酯类有毒物质，如马桑内酯、羟基马桑内酯、马桑宁和马桑亭等，因此，马桑全株有毒，尤其是未成熟的果实毒性最大。由马桑引起的中毒事件屡见不鲜，主要是儿童误食马桑果。马桑中毒患者初期表现为恶心、呕吐、头晕、头痛等症状，严重中毒者会出现频繁的抽搐、持续癫痫、昏迷等症状。若中毒严重患者得不到及时有效地医学救治，会因呼吸衰竭而致人死亡。此外，当周围蜜源匮乏时候，蜜蜂会采集寄生在马桑表面的蚜虫的排泄物酿制蜂蜜，该采蜜途径会将马桑中的毒素迁移、并富集在蜂蜜中，形成有毒蜂蜜，人一旦食用这样蜂蜜，便会爆发蜂蜜中毒事件。当前中毒患者的确诊主要是通过询问患者的是否食用马桑果、草药和蜂蜜等进行初步判断，然后采用液相色谱或者液相串联质谱等分析其胃内容物中的马桑毒素的含量进行确诊。由于仪器分析的方法往往需要繁琐的样本前处理和专业检测人员的操作，且耗时较长，因此难以满足临床医生快速做出判断的需要。如何快速、准确的识别和鉴定马桑毒素成为当前临床医学和食品安全领域急需解决的问题之一。

虽然马桑中的植物毒素种类繁多，高达几十种，但是羟基马桑内酯和马桑内酯的含量较高，且两者的毒性最大(两者在小鼠中LD₅₀均小于 3 mg/kg.B.W)，故两者是导致马桑中毒的关键植物毒素。检测中毒患者胃内容物中两种植物毒素的含量已经成为当前临床医生进行中毒原因的确证的主要方式。如何开发适用于现场诊断马桑中毒的方法依然匮乏。基于免疫分析开发的小分子检测方法具有高灵敏度、高准确度、检测速度快、成本低、操作简单等优点，目前已经报道了众多基于免疫分析的植物毒素快速检测方法，但是有关羟基马桑内酯和马桑内酯的免疫检测分析尚未见报道。在小分子免疫分析方法开发中，获得高灵敏度和特异性的抗体最为关键，而半抗原的设计与改造是获得高质量抗体的核心。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明首次提供了基于羟基马桑内酯改造的半抗原，用于免疫动物获得特异性抗体，并为后期开发羟基马桑内酯与马桑内酯的检测方法，从而为马桑中毒的临床诊断提供数据和技术支撑。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供羟基马桑内酯半抗原，具有如下结构：

。

本发明的第二目的在于提供所述的羟基马桑内酯半抗原的制备方法，将羟基马桑内酯与琥珀酸酐在55~65℃（更优选为60℃）下反应，得到所述羟基马桑内酯半抗原。

本发明发现，在上述条件下，可以在羟基马桑内酯的特定羟基位点引入间隔臂琥珀酸酐，获得本发明所述的羟基马桑内酯半抗原。

在此基础上，本发明进一步对制备方法进行了优化，得到如下方案：

在一些优选方案中，所述反应在在吡啶中进行；优选所述的吡啶为无水吡啶。

在一些优选方案中，所述羟基马桑内酯与所述琥珀酸酐的摩尔比为1:0.8~1.2，更优选为1:1。

在一些优选方案中，所述反应在避光条件下进行。

在一些优选方案中，所述反应在油浴条件下反应7~9 h，更优选为8 h。

作为优选，在所述反应后，还包括纯化过程，所述纯化过程具体为：用乙酸乙酯萃取反应产物后，用稀盐酸洗涤有机相，在有机相干燥浓缩后，经C18色谱柱分离纯化，即可获得羟基马桑内酯半抗原。

本领域人员可对上述优选方案进行组合，得到本发明较佳实施案例。

在一个优选方案中，所述羟基马桑内酯半抗原的制备方法具体如下：用3.5 mL无水吡啶分别溶解羟基马桑内酯(20 mg)与琥珀酸酐(6.8 mg)，将两种反应液混合，并置于油浴磁力搅拌器避光反应8 h (60 ^oC，240 rpm)，得到反应产物。反应体系加水淬灭后，用乙酸乙酯萃取，后用稀盐酸洗涤，有机相干燥浓缩后，经制备色谱分离纯化后即可获得目标化合物羟基马桑内酯半抗原。

第三方面，本发明提供一种羟基马桑内酯人工抗原，将所述羟基马桑内酯半抗原与载体蛋白偶联后得到；所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白；优选牛血清白蛋白、卵清蛋白。

作为优选，所述羟基马桑内酯半抗原与载体蛋白摩尔比为5.2~5.6:1，更优选为5.4：1。

本发明所述人工抗原分为免疫原和包被原，免疫原为羟基马桑内酯-BSA，包被原为羟基马桑内酯-OVA。

本发明进一步提供所述羟基马桑内酯人工抗原的制备方法，通过碳二亚胺、活泼酯法或混合酸酐法使所述羟基马桑内酯半抗原与载体蛋白偶联。优选活泼酯法。

作为优选，所述方法包括以下步骤：

(1) 按摩尔比为1：（1.8~2.2）：（1.8~2.2）的比例称取所述羟基马桑内酯半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，用N,N-二甲基甲酰胺溶解后得到反应液，将所述反应液在350~400 rpm下室温避光反应5 h，离心取上清，获得羟基马桑内酯半抗原活化液；

将所述载体蛋白溶于磷酸盐（PBS）缓冲液中，得到终浓度为2.8~3.2 mg/mL载体蛋白溶液；

(2) 将所述羟基马桑内酯半抗原活化液滴入所述载体蛋白溶液中，使所述羟基马桑内酯半抗原与载体蛋白的摩尔比达到（18~22）:1，4 ℃搅拌过夜反应。

在上述步骤(1)中，所述羟基马桑内酯半抗原活化液和所述载体蛋白溶液的制备过程不分先后，可根据实际情况进行调整。

优选在所述步骤(2)后，还包括：

(3) 将步骤(2)得到的反应液置于透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析3天，离心取上清，即得羟基马桑内酯人工抗原。

第四方面，本发明提供所述的羟基马桑内酯半抗原或所述的羟基马桑内酯人工抗原在以下任一方面的应用：

①在制备羟基马桑内酯特异性抗体中的应用；

②在检测抗羟基马桑内酯特异性抗体中的应用。

本发明进一步提供一种抗体，以所述的羟基马桑内酯人工抗原为免疫原，免疫动物制备得到；所述抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体。

优选地，所述所述羟基马桑内酯人工抗原由所述的羟基马桑内酯半抗原和牛血清蛋白偶联得到。

所述动物可以为Balb/c小鼠，新西兰大白兔，绵羊等，优选Balb/c小鼠。

第五方面，本发明提供所述的抗体在以下任一方面的应用：

（1）在检测羟基马桑内酯和/或马桑内酯中的应用；

（2）在制备羟基马桑内酯和/或马桑内酯的免疫层析试纸条中的应用；

（3）在制备羟基马桑内酯和/或马桑内酯的酶联免疫分析检测试剂盒中的应用。

进一步的，本发明提供一种检测试剂或检测试纸，含有所述的抗体。

基于上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

（1）本发明首次公开了一种新型羟基马桑内酯半抗原、人工抗原及其制备方法，用所述羟基马桑内酯人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高的特异性抗体。本发明提供羟基马桑内酯人工抗原及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的羟基马桑内酯检测方法提供了新手段。

（2）本发明提供的羟基马桑内酯人工抗原可保持羟基马桑内酯的化学结构不变，并暴露于蛋白表面作为抗原决定簇，为高灵敏度抗羟基马桑内酯抗体的制备奠定基础。

（3）利用本发明提供的羟基马桑内酯人工抗原制备羟基马桑内酯抗体（多克隆抗体），制备过程简单、经济，抗体效价最高可达135000，检测灵敏度为7.7 ng/mL，实用价值高，在公共卫生安全检测中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中羟基马桑内酯半抗原的精确提取离子流色谱图(A)和负离子模式下的全扫描质谱图(B)；

图2为实施例2中羟基马桑内酯-BSA的MALDI-TOF-MS图；

图3为实施例3中抗血清5#标准曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1 羟基马桑内酯半抗原的制备和鉴定

(1)用3.5 mL无水吡啶分别溶解羟基马桑内酯(20 mg)与琥珀酸酐(6.8 mg)，将两种溶液混合，并置于油浴磁力搅拌器避光反应8 h (60 ^oC，240 rpm)，得到反应产物。

(2)反应体系加水淬灭，用乙酸乙酯萃取，然后用0.1M稀盐酸洗涤，有机相干燥浓缩。

(3)柱色谱分离即得白色目标化合物羟基马桑内酯半抗原。

采用液相串联高分辨质谱对羟基马桑内酯及纯化后的半抗原进行鉴定，结果见图1，其中，A图为精确提取离子流色谱图，B图为负离子模式下的全扫描质谱图。根据其合成路线可知，若目标物的化学结构中连接上了琥珀酸酐，则半抗原与羟基马桑内酯相比，精确分子量增加100 Da。羟基马桑内酯在[M -H]^-模式下m/z为293.10343，羟基马桑内酯I半抗原m/z为393.11953 (图1B)，半抗原的精确分子量与羟基马桑内酯相比增加100 Da，表明目标物的化学结构中连接上了琥珀酸酐，说明羟基马桑内酯半抗原合成成功，可以用于抗体的制备。

实施例2 羟基马桑内酯人工抗原的制备

(1)分别称取实施例1制得的羟基马桑内酯半抗原(8 mg)、N-羟基琥珀酰亚胺(4.1mg)和二环己基碳二亚胺(8.2 mg)于玻璃反应瓶中，加入1 mL DMF。将装有反应液的玻璃瓶置于磁力搅拌器上，400 rpm室温避光反应5 h。

(2)取30 mg BSA，溶于9.5 mL含10% (体积百分含量)DMF的PBS缓冲液中，得到蛋白溶液。

(3)将完成步骤(1)的液相逐滴加入到步骤(2)制备的蛋白溶液中，将反应液置于磁力搅拌器，4 ^oC反应5 h。

(4)将步骤(3)中蛋白活化液转移到截留分子量为7 KDa的透析袋中，然后将透析袋置于PBS缓冲液中4 ℃透析3天（每12 h换液一次）。

(5)完成步骤(4)后，取出透析袋，将其中的液相以3000 rpm离心5 min，收集上清液，即为人工抗原羟基马桑内酯-BSA溶液。

将步骤（2）中的BSA 替换为OVA，即可得到羟基马桑内酯-OVA。

免疫原羟基马桑内酯-BSA经MALDI-TOF-MS鉴定(图2)，可得载体蛋白BSA(分子量为66849.617)与羟基马桑内酯半抗原的偶联摩尔比为1:5.4，结果证明免疫原合成成功，可用于小鼠免疫，制备单克隆抗体。

实施例3 羟基马桑内酯多克隆抗体的制备和鉴定

一、羟基马桑内酯多克隆抗体的制备

将实施例2制备的羟基马桑内酯-BSA作为免疫原免疫小鼠，将羟基马桑内酯-OVA作为包被原用来检测小鼠抗血清。用Bradford法测定完全抗原的浓度，经测定可得免疫原和包被原的浓度均为2.9 mg/mL。

首次免疫时将免疫原稀释至1 mg/mL (用0.01 M，pH为7.4的PBS进行稀释)，取稀释后的免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，并充分乳化，颈背部皮下多点接种6周龄Balb/c小鼠(免疫6只小鼠)，接种免疫原剂量为100 μg/只，注射剂量为0.2 mL/只。每隔4周加强免疫一次，加强免疫时将免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化。免疫原的免疫剂量与首次免疫剂量相同，加强免疫次数为3次。

二、小鼠多克隆抗体的检测

在第3次加强免疫完成一周后对小鼠眼球采血，3000 rpm离心共获得6种抗血清(即多克隆抗体)，抗血清分别按照1#-6#的编号依次进行命名。用经典棋盘法测定抗血清效价以及用间接竞争ELISA法测抗血清灵敏度。

1、抗血清效价的测定

用间接ELISA法对抗体效价进行检测，具体步骤如下：

(1)包被：用碳酸盐缓冲液(0.05 M, pH 9.6)将包被原羟基马桑内酯-OVA稀释成1.0 μg/mL，并加入96孔透明酶标板中(100 μL/孔)，37 °C温箱孵育2 h，用PBST缓冲液(含0.05% Tween-20 PBS，pH 7.4)洗板3次。

(2)封闭：加入封闭液(5%脱脂牛奶) 150 μL/孔，37 °C温箱孵育1 h，弃封闭液，用PBST缓冲液洗涤1次，拍干。

(3)加待测抗体：各列孔加入50 μL 0.01 M PBS (pH 7.4)，再加入50 μL稀释后的羟基马桑内酯多克隆抗体，抗体从1:500开始，以3倍为梯度用0.01 M PBS进行稀释，共稀释8个梯度。加样量为每孔50 μL，37 °C温箱反应30 min，PBST缓冲液洗涤3次，拍干。

同时设置未经免疫的小鼠抗血清作为阴性对照。

(4)加酶标二抗：加入用酶标二抗稀释液按照体积比1:5000倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG抗体，100 μL/孔，37 °C温箱反应30 min，PBST 缓冲液洗涤3次，拍干。

(5)显色：将辣根过氧化物酶底物3,3’,5,5’- 四甲基联苯胺溶液和质量分数为30%的过氧化氢按照1:1的体积比混合，加入微孔板中(100 μL/孔)，37 °C温箱显色15 min。

(6)终止：每孔加入50 μL 2 mol/L的浓硫酸。

(7)读数：以OD₄₅₀波长测定各孔OD值。以阴性OD值≤0.15，以最大OD值在1.5-1.8之间对应的抗体稀释度为抗体效价。抗血清的最佳稀释度见表1，由表中数据可得，所有抗血清的稀释度均在1:1500以上，说明用合成的半抗原偶联载体蛋白免疫小鼠，可以获得较好的免疫效果。其中抗血清5#的效价最高，为1:13500。

2、多克隆抗体IC₅₀的测定

(1)包被、封闭过程同上。

(2)加标准品和抗体：每孔加入50 μL羟基马桑内酯标准品溶液和50 μL稀释后的抗体溶液(按照表1中的抗体效价进行稀释)，37 ℃孵育30 min，然后用PBST溶液洗涤3次，拍干。标准品溶液的溶剂为PBS缓冲液，标准品浓度分别为0.5, 1.5, 4.5, 13.5, 40.5,121.5和364.5 ng/mL的溶液，每个浓度三个平行。

(3)加酶标二抗，显色，终止及读数过程同上。

将所测得的数据以-log10 (竞争物)值为横坐标，以OD₄₅₀值为纵坐标，利用Origin8.0软件中的四参数方程进行拟合，建立标准曲线获得IC₅₀值。6种多克隆抗体的IC₅₀值见表1，由表中数据可知，5#抗血清的IC₅₀最低，为5.2 ng/mL，线性检测范围(IC₂₀-IC₈₀)为1.1-56.6 ng/mL，IC₅₀为7.7 ng/mL(图3)。结果表明，本发明中所设计的半抗原结构作为抗原决定簇，可以很好地刺激小鼠产生高灵敏度抗体。

表1 抗血清性质表征表

注：IC₅₀测定时的检测标准物为羟基马桑内酯。

3、多克隆抗体特异性的检测

选取抗血清IC₅₀最低的5#抗血清进行特异性的测定。检测方法同上。羟基马桑内酯结构类似物(马桑内酯、马桑亭和马桑宁)的曲线浓度调整为0、1、3、9、27、81、243、729 ng/mL，设定3个平行，测定抗体的特异性。抗体的特异性用交叉反应率(CR)来表示，具体计算公式为：CR(%)=IC₅₀(羟基马桑内酯)/IC₅₀(结构类似物)×100%

结果见表2，5#抗血清可以特异性识别羟基马桑内酯和马桑内酯(交叉反应率为83.7%)，对其他结构类似物，如马桑宁和马桑亭的交叉反应率均小于1.0%。

表2 抗血清5#的交叉反应率表

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种羟基马桑内酯半抗原，其特征在于，具有如下结构：

。

2.权利要求1所述的羟基马桑内酯半抗原的制备方法，其特征在于，将羟基马桑内酯与琥珀酸酐在55~65℃下反应，得到所述羟基马桑内酯半抗原。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反应的溶剂为无水吡啶，所述反应在避光条件下进行。

4.一种羟基马桑内酯人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述的羟基马桑内酯半抗原与载体蛋白偶联后得到；

其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。

5.根据权利要求4所述的羟基马桑内酯人工抗原，其特征在于，所述羟基马桑内酯半抗原与载体蛋白的摩尔比为5.2~5.6:1。

6.权利要求1所述的羟基马桑内酯半抗原或权利要求4或5所述的羟基马桑内酯人工抗原在制备羟基马桑内酯特异性抗体中的应用。

7.一种抗体，其特征在于，以权利要求4或5所述的羟基马桑内酯人工抗原为免疫原，免疫动物制备得到；所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的抗体在以下任一方面的应用：

（1）在制备检测羟基马桑内酯和/或马桑内酯的试剂中的应用；

9.一种检测试剂或检测试纸，其特征在于，含有权利要求7所述的抗体。