CN112680420B - 一株分泌维生素b6单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

一株分泌维生素B₆单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明分泌维生素B₆单克隆抗体杂交瘤细胞株MTB，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19183。首先合成维生素B₆半抗原，再制备维生素B₆完全抗原，免疫BALB/c小鼠，取高效价、低IC₅₀小鼠脾细胞，通过PEG方法与骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法的筛选和三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株MTB。此细胞株分泌的单克隆抗体，对维生素B₆具有较好的特异性和检测灵敏度。

Description

一株分泌维生素B6单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一株分泌维生素B₆单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。

背景技术

维生素B₆代表一组具有高生物利用度的3-羟基-2-甲基吡啶衍生物，包括吡哆醇，吡哆醛，吡哆胺及其磷酸化形式。维生素B₆参与氨基酸，碳水化合物和脂质代谢中的多种酶促反应。此外维生素B₆在神经系统功能，激素功能，血红蛋白合成中起重要作用。有趣的是，最近发现维生素B₆偶联物是靶向协同癌症治疗中的潜在药物载体，人类无法在体内合成维生素B₆。因此，仅能从膳食，补充剂和肠道菌群中获取维生素B₆。维生素B₆存在于多种食物中，包括家禽，小麦，坚果，鱼，牛奶，蔬菜和番茄中。尽管维生素B₆缺乏症并不常见，但在某些特殊情况下维生素B₆缺乏的风险很高。维生素B₆缺乏会引起多种症状，例如抑郁，易怒，疲劳，发炎和贫血。为了预防和治疗维生素B₆缺乏症，市面上有各种维生素B₆强化食品和补充剂。因此，可靠地确定膳食及补充剂中的维生素B₆含量是必需的。

目前，维生素B₆含量分析方法主要是仪器方法及微生物法，最常用的定量分析技术有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气质联用(GC-MS)、液质联用(LC-MS)等。尽管仪器方法准确，灵敏，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，复杂的提取步骤，成本高，时间长，不适用于在短时间内筛查大量测试样品。微生物法基于样品或标准品中维生素B₆存在时微生物的生长，从而检测维生素B₆含量。尽管微生物法具有高灵敏度和特异性，但其较长的孵育时间(通常20-24小时)和复杂的步骤限制了目标物的快速检测。因此建立快速简便的维生素B₆检测方法具有重要意义。

作为一种有效的替代方法，免疫测定方法如酶联免疫吸附测定(ELISA) 具有简单，低成本和高效的优点，使其快速实现筛选目的。目前，使用免疫测定法同时检测几种分析物引起了越来越多的关注。

发明内容

本发明的目的是提供一株分泌维生素B₆单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对维生素B₆具有较高的检测灵敏度，可以用来建立维生素B₆的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一种分泌维生素B₆单克隆抗体杂交瘤细胞株MTB，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19183。

一种维生素B₆单克隆抗体，其由所述CGMCC No.19183的杂交瘤细胞株MTB分泌产生。

维生素B₆半抗原的制备方法，化学反应方程式如下：

步骤如下：

a、化合物2：化合物1和2，2-二甲氧基丙烷溶解于丙酮，随后加入对甲苯磺酸，高温下搅拌过夜；将反应混合物冷却并倒入冰水中，二氯甲烷萃取水层，合并有机相，盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并浓缩，所需产物用乙醚重结晶，过滤混合物，得到白色固体化合物2；

b、化合物3：在氮气条件下，将NaH溶液加入到THF中，在此悬浮液中加入溶解于THF中的化合物2；将所得混合物回流，回流期间产生大量沉淀物，冷却至室温后，逐滴加入苄基溴，并将所得混合物再次回流；室温下向混合物加入冰，然后与饱和氯化铵溶液混合，二氯甲烷萃取；收集有机萃取物，用盐水洗涤，干燥，浓缩，得到深棕色油状物；再通过二氧化硅柱纯化，得到棕色油状化合物3；

c、化合物4：化合物3溶解在蒸馏水中，加入甲酸，混合物搅拌，用饱和碳酸氢钠溶液调节pH，中和后用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，干燥并浓缩得到深棕色固体；粗产物通过柱色谱法纯化，得到白色固体化合物4；

d、化合物5：氮气条件下，将苄基二甲基苯基氯化铵溶解于无水甲醇，并加入甲醇钠，然后向该混合物中加入溶解于甲醇溶液的化合物4，室温下搅拌后，旋蒸上述混合物，倒入装有热甲苯的圆底烧瓶中，反应后，浓缩混合物，将反应中将油状残余物溶于饱和氯化铵溶液，二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥并浓缩；通过硅胶柱纯化，得到化合物5；

e、化合物6：化合物5溶解于二氯甲烷中，加入戴斯-马丁氧化剂，室温搅拌过夜；将混合物倒入水中，乙胺萃取，合并有机层，盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油状物化合物6；

f、化合物7：将化合物6和乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦在四氢呋喃THF溶液中搅拌过夜，将混合物浓缩，混合物通过硅胶柱纯化，得到黄色固体化合物 7；

g、化合物8：化合物7溶于乙酸乙酯溶液，加入NaBH₄搅拌，然后加入 CaCl₂，室温反应；将混合物倒入水中，用乙胺稀释，过滤，用乙胺冲洗固体，滤液用乙胺萃取，合并有机层，盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油油状化合物8；

h、化合物9：在室温下，向化合物8的二氯甲烷溶液中加入甲磺酰氯和三乙醇胺，搅拌过夜；将混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取水层，合并有机层，盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油状物化合物9；

i、化合物10：在室温下向化合物9的二甲亚砜溶液中加入NaCN，搅拌过夜，将混合物倒入水中；乙胺萃取，合并有机层，盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油状物化合物10；

j、化合物11：在室温下将化合物10在HCl/MeOH溶液中搅拌过夜，浓缩混合物，得到黄色油状物化合物11；

k、化合物12：向化合物11的MeOH的溶液中加入Pd(OH)₂，室温氢气条件下搅拌过夜，过滤混合物并浓缩，得到黄色油状物化合物12；

l、化合物13：将化合物12溶于HCl中，室温搅拌过夜，过滤混合物并浓缩，得到棕色油状化合物13，即为维生素B₆半抗原。

免疫原维生素B₆-KLH的制备方法，步骤为：称取维生素B₆半抗原溶解于N,N-二甲基甲酰胺DMF中，加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温反应；随后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，室温反应得到反应液A；取蛋白KLH溶液，加入碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，得到溶液B；随后，逐滴将反应液A液加入到溶液B液中，室温反应，即得偶联物维生素B₆-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，最终得到免疫原维生素 B₆-KLH。

进一步地，具体步骤如下：称取3.0mg维生素B₆半抗原溶解于1mL DMF 中，加入4.6mg NHS，室温反应15min；随后加入7.67mg EDC，室温反应30min 得到反应液A；取3mL、含有15mg KLH的溶液，加入3mL、pH 9.6碳酸盐- 碳酸氢盐缓冲液，得到溶液B；随后，逐滴将反应液A液加入到溶液B液中，室温反应8h，即得偶联物维生素B₆-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原维生素B₆-KLH。

包被原维生素B₆-OVA的制备方法，步骤为：称取维生素B₆半抗原溶解于 DMF中，加入NHS，室温反应；随后加入EDC，室温反应得到反应液C；称取OVA，溶解于碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中，得到溶液D；随后，逐滴将反应液C液加入到溶液D液中，室温反应，即得偶联物维生素B₆-OVA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到包被原维生素B₆-OVA。

进一步地，具体步骤为：称取1.5mg维生素B₆半抗原溶解于1mL DMF，加入2.3mgNHS，室温反应15min；随后加入3.83mg EDC，室温反应30min 得到反应液C；称取5mg OVA，溶解于2mL、pH 9.6碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，得到溶液D；随后，逐滴将反应液C液加入到溶液D液中，室温反应8h，即得偶联物维生素B₆-OVA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到包被原维生素B₆-OVA。

本发明的维生素B₆单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法，主要包括以下步骤：

(1)小鼠的免疫：将免疫原维生素B₆-KLH与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用维生素B₆-KLH完全抗原(不含佐剂)冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测血清效价和抑制；

(2)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG 4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法 (ic-ELISA)检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得分泌维生素B₆单克隆抗体杂交瘤细胞株；

(3)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。

所述维生素B₆单克隆抗体的应用，建立维生素B₆含量的免疫检测方法，应用于食品中维生素B₆的检测。

进一步地，所述检测领域为婴幼儿乳品和其他特殊医学用途食品。

本发明的有益效果：本发明提供的维生素B₆单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对维生素B₆具有较好的特异性和检测灵敏度(吡哆醇IC₅₀为 272.50ng/mL、吡哆醛IC₅₀为354.11ng/mL、吡哆胺IC₅₀为488.80ng/mL)，为检测婴幼儿乳品和其他特殊医学用途食品中维生素B₆含量提供了免疫学方法。本发明提供的维生素B₆单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测维生素B₆的试剂盒，具有实际应用价值。

生物材料样品保藏：一株分泌维生素B₆单克隆抗体杂交瘤细胞株MTB，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19183。

附图说明

图1MTB单克隆抗体对维生素B₆的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将维生素B₆完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对维生素B₆有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例1杂交瘤细胞株MTB的制备

(1)完全抗原的制备：

维生素B₆半抗原的制备：

半抗原合成路线如下：

a、化合物2：化合物1(20.0g，118mmol)和2，2-二甲氧基丙烷(200mL) 溶解于200mL丙酮，随后加入对甲苯磺酸(81.4g，473mmol)，130℃下搅拌过夜。将反应混合物冷却并倒入冰水中，二氯甲烷萃取水层，合并有机相，盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥并浓缩，所需产物用乙醚重结晶，过滤混合物，得到白色固体化合物2(13.0g)。

b、化合物3：在氮气条件下，于0℃将NaH溶液(6.88g，287mmol，60％含油量)加入到70.0mL THF中，在此悬浮液中加入溶解于200mL THF中的化合物2(15.0g,71.7mmol)。将所得混合物回流30min，回流期间产生大量沉淀物，冷却至室温后，逐滴加入苄基溴(24.5g，143mmol)，并将所得混合物再次回流4h。室温下向混合物加入冰，然后与饱和氯化铵溶液混合，二氯甲烷萃取。收集有机萃取物，用盐水洗涤，干燥，浓缩，得到深棕色油状物。残余物再通过二氧化硅柱纯化，得到棕色油状化合物3(12.0g)。

c、化合物4:化合物3(12.0g，40.1mmol)溶解在24.0mL蒸馏水中，加入24.0mL 98％的甲酸，混合物在50℃下搅拌24h,用饱和碳酸氢钠溶液调节pH 至7.0，中和后用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，干燥并浓缩得到深棕色固体。粗产物通过柱色谱法纯化(60％乙酸乙酯/己烷)，得到白色固体化合物4 (10.0g)。

d、化合物5：氮气条件下，于0℃将苄基二甲基苯基氯化铵(7.60g， 26.6mmol)溶解于30mL无水甲醇，并加入甲醇钠(1.80g，34.0mmol)，然后向该混合物中加入溶解于60.0mL的甲醇溶液的化合物4(4.50g，17.4mmol)，室温下搅拌20min后，旋蒸上述混合物,倒入装有500mL热甲苯的圆底烧瓶中, 反应30min后，浓缩混合物，将反应中油状残余物溶于饱和氯化铵溶液，二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥并浓缩。通过硅胶柱纯化，得到化合物5(2.50g)。

e、化合物6:化合物5(11.0g，31.5mmol)在110mL二氯甲烷中溶解，加入戴斯-马丁氧化剂(20.0g，47.2mmol)，室温搅拌过夜。将混合物倒入水中，乙胺萃取，合并有机层，盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油状物化合物6(9.00g)。

f、化合物7：将化合物6(9.00g，25.9mmol)和乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦(9.01g，25.9mmol)在THF(90.0mL)溶液中于80℃搅拌过夜，将混合物浓缩，混合物通过硅胶柱纯化，得到黄色固体化合物7(7.90g)。

g、化合物8：化合物7(3.50g，8.39mmol)溶于35.0mL乙酸乙酯溶液，加入NaBH₄(2.23g，58.7mmol)，0℃搅拌30min，然后加入CaCl₂(4.65g， 41.9mmol)，室温反应2h。将混合物倒入水中，用乙胺稀释，过滤，用乙胺冲洗固体，滤液用乙胺萃取，合并有机层，盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油油状化合物8(2.70g)。

h、化合物9：在室温下，向化合物8(3.00g，7.95mmol)的二氯甲烷(30.0mL) 溶液中加入甲磺酰氯(1.00g，8.54mmol)和三乙醇胺(1.00g，10.3mmol)，搅拌过夜。将混合物倒入水中，用二氯甲烷萃取水层，合并有机层，盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油状物化合物9(2.00g)。

i、化合物10：在室温下向化合物9(2.00g，4.39mmol)的二甲亚砜(20.0mL) 溶液中加入NaCN(0.32g，6.59mmol)，搅拌过夜，将混合物倒入水中。乙胺萃取，合并有机层，盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥浓缩，残余物通过硅胶柱纯化，得到黄色油状物化合物10(1.51g)。

j、化合物11：在室温下将化合物10(1.51g，3.91mmol)在HCl/MeOH (15.0mL)溶液中搅拌过夜，浓缩混合物，得到黄色油状物化合物11(1.20g)。

k、化合物12：向化合物11(1.20g，2.86mmol)的MeOH(30.0mL)的溶液中加入Pd(OH)₂(100mg)，室温氢气条件下(50psi)搅拌过夜，过滤混合物并浓缩，得到黄色油状物化合物12(0.45g)。

l、化合物13：将化合物12(0.45g，1.88mmol)溶于4.50mL HCl中，室温搅拌过夜，过滤混合物并浓缩，得到棕色油状化合物13(0.31g)。

(2)免疫原维生素B₆-KLH的制备：称取3.0mg维生素B₆半抗原溶解于 1mL DMF，加入4.6mg NHS，室温反应15min；随后加入7.67mg EDC，室温反应30min得到反应液A；取3mL KLH(15mg)溶液,加入3mL碳酸盐- 碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)，得到溶液B；随后，逐滴将反应液A液加入到溶液 B液中，室温反应8h，即得偶联物维生素B₆-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原维生素B₆-KLH。

包被原维生素B₆-OVA的制备：称取1.5mg维生素B₆半抗原溶解于1mL DMF，加入2.3mg NHS，室温反应15min；随后加入3.83mg EDC，室温反应 30min得到反应液C；称取5mgOVA,溶解于2mL碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)，得到溶液D；随后，逐滴将反应液C液加入到溶液D液中，室温反应8h，即得偶联物维生素B₆-OVA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到包被原维生素B₆-OVA。

(3)动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取三种不同摩尔比的维生素B₆完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21 天。第三次免疫后7天采血(小鼠断尾采血5μL+995μL抗体稀释液＝抗血清)，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。

(4)细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡 5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200 目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640 培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO₂培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到﹙1～4﹚×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min。第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm， 8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(5)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行 RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清、1％的100×HT 的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用维生素B₆为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对维生素B₆标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株MTB。

(6)单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS 溶液(pH 7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体，置于-20℃保存。

实施例2维生素B₆单克隆抗体的IC₅₀的测定

碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液(PBS)：8.0g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12 H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

洗涤液(PBST)：1000mL的0.01mol/L pH7.4的PBS溶液中加入0.5mL 的Tween–20；

PBST：含0.05％Tween–20的PBS；

抗体稀释液：含有0.1％明胶的洗涤缓冲液；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至 1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用现混。

(1)包被：将包被原维生素B6-OVA用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液从1 μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；

(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

(3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；

(4)加样：将抗血清(小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清)从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔， 37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/ 孔，37℃反应30min；

(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液， 37℃避光反应15min；

(6)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值。

用ic-ELISA测定单克隆抗体维生素B₆的IC₅₀(吡哆醇IC₅₀为272.50ng/mL、吡哆醛IC₅₀为354.11ng/mL、吡哆胺IC₅₀为488.80ng/mL)，说明对维生素B₆有很好的灵敏度，可用于维生素B₆免疫分析检测。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (4)

1.一种分泌维生素B₆单克隆抗体杂交瘤细胞株MTB，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19183。

2.一种维生素B₆单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号 为 CGMCCNo.19183的杂交瘤细胞株MTB分泌产生。

3.权利要求2所述维生素B₆单克隆抗体的应用，其特征在于：建立维生素B₆含量的免疫检测方法，应用于食品中维生素B₆的检测。

4.如权利要求3所述维生素B₆单克隆抗体的应用，其特征在于：所述检测领域为婴幼儿乳品和医学用途食品。

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