CN106987564B - 一株抗多巴胺单克隆抗体杂交瘤细胞株gz01及其应用 - Google Patents

一株抗多巴胺单克隆抗体杂交瘤细胞株gz01及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明一株抗多巴胺单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ01及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明的抗多巴胺单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.13089。此细胞株分泌的单克隆抗体，对多巴胺具有较好的特异性和检测灵敏度，IC50值为531 ng/mL，可用于食品中多巴胺残留检测。

Description

一株抗多巴胺单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ01及其应用
技术领域
本发明一株抗多巴胺单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ01及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
β-肾上腺受体兴奋剂是一类能够促进瘦肉生长的饲料添加剂，包括盐酸克伦特罗、溴布特罗、马布特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、盐酸多巴胺、硫酸特布他林、苯乙醇胺A、班布特罗、盐酸齐帕特罗、盐酸氯丙那林、西布特罗、酒石酸阿福特罗、富马酸福莫特罗15种药物。β-肾上腺受体兴奋剂加入到饲料中去，则能够显著提高猪、牛、羊等牲畜的瘦肉生长率，从而使体重也得以增加。这类药物能通过进食摄取，危害人体健康，导致明显的生理毒性，例如心悸、战栗、恶心呕吐、头晕目眩、神经过敏、血管舒张、心跳加速等，特别是对三高病人和甲亢患者有较为明显的危害，严重的甚至有可能导致死亡。欧盟、美国、中国等众多国家和地区均相应立法严令禁止使用β-兴奋剂作为动物饲料添加剂。我国农业部也先后颁布了176号、193号、235号、1519号等一系列公告，明确提出不得将以上 15 种β-肾上腺受体兴奋剂作为动物饲料及其饮用水的添加剂。
目前检测β-肾上腺受体兴奋剂的方法主要是气相色谱法(GC)，液相色谱法(HPLC)，分光光度法、分子印迹法、毛细管电泳、气质联用法、电化学免疫传感器等方法，但是这些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测，因此建立一种快速简便的检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高特异性和高灵敏度的单克隆单体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。
发明内容
本发明的目的在于提供一株抗多巴胺单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对多巴胺具有较好特异性，可以用来建立多巴胺的免疫学检测方法。
本发明提供一种对多巴胺具有较好特异性和检测灵敏度的单克隆抗体的制备方法。
本发明的技术方案：一株抗多巴胺单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.13089。
抗多巴胺单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No. 13089的抗多巴胺单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ01分泌产生。
所述的抗多巴胺单克隆抗体的应用，在食品中多巴胺残留分析检测中的应用。
本发明提供的GZ01细胞株的制备基本步骤为：
1）免疫原的合成：称取5.14 mg多巴胺（DL-DA）于棕色瓶中加入200 μL稀释了25倍的戊二醛溶液，4℃反应30 min，得到活化液；称取三份等量10mg蛋白质BSA并用2 mL碳酸盐缓冲溶液CBS溶解，按照活化液与蛋白质溶液体积比1︰1、2︰1、3︰1将活化液分别逐滴加入蛋白质溶液中，边滴加活化液，边调节pH至9.0，直至反应液颜色变黄色停止滴加活化液，4℃反应30 min得到反应物的摩尔比（DL-DA︰BSA）分别为30︰1、60︰1、90︰1的偶联产物透析，用紫外-可见分光光度法表征后供免疫小鼠使用，表征结果如图1所示；
2）包被原的合成：该抗体采用异源包被检测，称沙丁胺醇100 mg（0.42 mmol）溶于无水乙醇中；再加5.1 mg DMAP（4-二甲氨基吡啶）和0.5 mL无水吡啶，4℃冰浴反应，将63mg琥珀酸酐分成5等份，每隔0.5 h加一份到反应液体系中，冰浴环境下边搅拌边反应5 h；过滤反应液，将白色沉淀物质收集，用乙醇洗涤白色沉淀物，烘干，得到化合物A。称取9.4mg 化合物A于棕色小瓶中，加入400 μL的无水DMF和600 μL的pH 4.7、0.1 M MES缓冲溶液溶解；将15.9 mg EDC和9.5 mg NHS固体加入到溶解后的化合物A的反应瓶中，搅拌6～8 h，得到活化液；称取牛血清蛋白BSA溶解于CBS溶液中，将活化液加入到蛋白质溶液中，用1 MNaOH溶液调节pH至9.0，室温反应过夜。整个过程避光进行。通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；
3）小鼠的免疫：多巴胺完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。最后一次用多巴胺完全抗原（不含佐剂）冲刺免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；
4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG1500）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株GZ01；
5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ELISA法测定灵敏度和特异性。
本发明的有益效果：本发明获得的抗多巴胺单克隆抗体细胞株GZ01，对多巴胺有较好的特异性，IC50值为531 ng/mL。
生物材料样品保藏：一株抗多巴胺单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ01，巳保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13089，保藏日期为 2016年10月 31日。
附图说明
图1 多巴胺免疫原合成紫外表征图。
图2 GZ01分泌单克隆抗体的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将多巴胺完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对多巴胺有较好特异性的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例1： 杂交瘤细胞株GZ01的制备
1、完全抗原的合成
称取2.57 mg多巴胺于棕色瓶中加入200 μL稀释了25倍的戊二醛溶液， 4℃反应30 min，得到活化液；称取10 mg蛋白质BSA并用2 mL碳酸盐缓冲溶液CBS溶解，将活化液逐滴加入蛋白质溶液中，边滴加活化液，边调节pH至9.0，直至反应液颜色变黄色停止滴加活化液，4℃反应30 min得到偶联产物，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子，并通过紫外分光光度计鉴定。
2、动物免疫
选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取多巴胺完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。三免后7天采血，使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在四免后18天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。
3、细胞融合
在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为1500）方法进行细胞融合，具体步骤如下：（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照1︰10 的计数比混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
4、细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用多巴胺为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对多巴胺标准品有抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株GZ01。
5、单克隆抗体的制备与鉴定
取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于 -20℃保存。
使用间接竞争ELISA，测定单克隆抗体多巴胺的IC50为：531 ng/mL，可用于多巴胺免疫分析检测。
6、抗体应用
将杂交瘤细胞株GZ01通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于多巴胺的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：
（1）包被：将包被原sal-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从2µg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
（2）洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
（3）封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
（4）加样：在烘干后的板中分别加入磷酸盐缓冲液（PBS）和DL-DA标准品溶液，50μL/孔，将抗血清从1︰1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，50μL/孔，37℃反应30 min；充分洗涤后，加入1︰3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30 min；
（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
（6）终止和测定：每孔加入50μL 2M H2SO4终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值；
结果判读：以OD450值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00 g NaCl，0.2g KCl，0.2 g KH2PO4，2.9 g Na2HPO4·12H2O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；
PBST：含0.05% 吐温 20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一株抗多巴胺单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ01，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13089。
2.抗多巴胺单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.13089的抗多巴胺单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ01分泌产生。
3.权利要求2所述的抗多巴胺单克隆抗体的应用，其特征在于：在食品中多巴胺残留分析检测中的应用。
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