CN110923208A - 一株硫酸多粘菌素b单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一株硫酸多粘菌素b单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

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Abstract

一株硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明经筛选得到一株硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株OVA17，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18516。此细胞株分泌的单克隆抗体，对硫酸多粘菌素B具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为13.13ng/mL），可实现对饲料及畜禽食品中硫酸多粘菌素B残留量的检测，为食品中硫酸多粘菌素B残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及一株硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
硫酸多粘菌素B (多粘菌素B) 英文名：Polymyxin B Sulfate (PMB)，是由多粘芽胞杆菌产生的一组多肽类抗生素。PMB为白色结晶性粉末，易溶于水，有引湿性，在酸性溶液中稳定，其中性溶液在室温放置一周不影响效价，在碱性溶液中不稳定。多粘菌素B抗菌谱及临床应用与多粘菌素E相似，对革兰氏阴性杆菌，如大肠杆菌、绿脓杆菌、副大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌及痢疾杆菌等有抑制或杀菌作用。临床上主要用于敏感菌引起的感染及绿脓杆菌引起的泌尿系统感染、以及眼、气管、脑膜炎、败血症、烧伤感染以及皮肤粘膜感染等。同时在畜禽养殖中也用作饲料添加剂，且有明显促生长作用。
多粘菌素B、E一直用作抗菌药物的最后一道防线。但是，在2016年中国首次报道了针对多粘菌素的耐药性基因MCR-1，随后MCR-1被报道存在于30多个国家和地区。据报道，早在1980年代中期，MCR-1就存在于大肠杆菌中，并且在动物饲料中使用粘菌素可能加速了MCR-1在动物中的传播，随后传至人类。然而，由于粘菌素抗菌谱广，促生长作用显著，一些养殖者仍非法在饲料中添加粘菌素。因此，为了阻止MCR-1的传播，维护消费者的利益，有必要建立一种针对PMB的可靠、高效、快速的检测方法。酶联免疫法（ELISA）具有前处理简单，成本低，可实现大量样品的现场快检等优势，但建立此方法的一个重要前提是需筛选出针对硫酸多粘菌素B的高特异性单克隆单体。
发明内容
本发明的目的是提供一株硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的抗体对硫酸多粘菌素B具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立硫酸多粘菌素B的免疫学检测方法。
本发明的技术方案，一株硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株OVA17，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18516。
硫酸多粘菌素B单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.18516的硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株OVA17分泌产生。
所述硫酸多粘菌素B单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中硫酸多粘菌素B残留的分析检测。
杂交瘤细胞株OVA17的制备方法：其通过硫酸多粘菌素B的完全抗原免疫小鼠后，经过培养筛选出两种细胞融合后的杂交细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株OVA17。
本发明提供的硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株OVA17的制备基本步骤为：
（1）半抗原的制备：半抗原PMB的结构式如下：
Figure 9686DEST_PATH_IMAGE001
原药 Mol. Wt: 1301.56
由于PMB化学结构式中含有多个活泼基团（氨基），因此本发明将原药直接作为半抗原；
（2）完全抗原PMB-GMBS-BSA的制备：采用6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯（GMBS）双功能交联剂将PMB半抗原与载体蛋白偶联以制备完全抗原。具体步骤为：
称取PMB 14mg，加入1.5mL 0.1M PBS溶解，充分溶解后向其中加入0.5mL溶有2.8 mgGMBS的四氢呋喃溶液，并于30℃搅拌30 min。氮吹除去四氢呋喃，再用3 mL乙醚-二氯甲烷（V/V=2/1）洗涤3次，除去多余的GMBS，最终获得PMB-GMBS溶液，即A液；取10 mg BSA，溶解于0.2 mL 0.1M PBS中，并加入50 µL现配的0.5M羟胺溶液，25℃搅拌10 min后加入3mL 0.1MPBS（含3M尿素）稀释，获得B液。将B液立即加入到A液中，并于25℃剧烈搅拌30min。混合液用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原PMB-GMBS-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；
（3）小鼠免疫：将PMB完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量减半为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基（HAT培养基）筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得PMB的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株OVA17；
（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。
本发明的有益效果：本发明提供的细胞株OVA17分泌的单克隆抗体，对PMB具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为13.13ng/mL），可实现对饲料及畜禽产品中PMB残留量的检测，为食品中PMB残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株OVA17，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18516。
附图说明
图1 OVA17单克隆抗体的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过小鼠免疫，细胞融合，ic-ELISA筛选，杂交瘤细胞有限稀释亚克隆，最终得到了针对硫酸多粘菌素B具有高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。
实施例1 杂交瘤细胞株OVA17的制备
（1）半抗原：硫酸多粘菌素B化学结构式中含活泼基团（-NH2），即可直接作为半抗原。
（2）完全抗原的制备：称取PMB 14 mg，加入1.5 mL 0.1M PBS溶解，充分溶解后向其中加入0.5 mL溶有2.8 mg GMBS的四氢呋喃溶液，并于30℃搅拌30 min。氮吹除去四氢呋喃，再用3 mL乙醚-二氯甲烷（V/V=2/1）洗涤3次，除去多余的GMBS，最终获得PMB-GMBS溶液，即A液。取10 mg BSA，溶解于0.2 mL 0.1M PBS中，并加入50 µL现配的0.5M羟胺溶液，25℃搅拌10 min后加入3mL 0.1M PBS（含3M尿素）稀释，获得B液。将B液立即加入到A液中，并于25℃剧烈搅拌30min。混合液用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原PMB-GMBS-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；
（3）小鼠免疫：将PMB完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，减半为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
（4）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞： 融合前 7-10 天，将 SP2/0 瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到﹙1～4﹚×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min： 第1min，将1mL的PEG 4000 由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min 和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min 和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。37℃温浴5 min后离心（800 rpm，10 min），弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20%胎牛血清，2% 50×HAT的RPMI-1640选择性培养基（HAT培养基），按照200μL/孔加到 96 孔细胞板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；
（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20% 胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液（HT培养基）进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用硫酸多粘菌素B为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对硫酸多粘菌素B标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得硫酸多粘菌素B单克隆抗体细胞株OVA17；
（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106 硫酸多粘菌素B杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
6.1包被：将包被原PMB-GMBS-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
6.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
6.3封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
6.4加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；
6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
6.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450值。
用ic-ELISA测定硫酸多粘菌素B单克隆抗体的IC50为：13.13ng/mL，说明对硫酸多粘菌素B有很好的灵敏度，可用于硫酸多粘菌素B免疫分析检测。
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05 % 吐温20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4 .12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mgTMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。

Claims (8)

1.一株硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株OVA17，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCCNo.18516。
2.硫酸多粘菌素B单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.18516的硫酸多粘菌素B单克隆抗体杂交瘤细胞株OVA17分泌产生。
3.权利要求2所述硫酸多粘菌素B单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全检测中硫酸多粘菌素B残留的分析检测。
4.权利要求1所述杂交瘤细胞株OVA17的制备方法，其特征在于：其通过硫酸多粘菌素B的完全抗原免疫小鼠后，经过培养筛选出小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞两种细胞融合后的杂交细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株OVA17。
5.根据权利要求4所述杂交瘤细胞株OVA17的制备方法，其特征在于所述硫酸多粘菌素B的完全抗原的制备过程如下：采用硫酸多粘菌素B，即PMB作为硫酸多粘菌素B半抗原，随后采用双功能交联剂6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯GMBS将PMB半抗原与载体蛋白偶联以制备硫酸多粘菌素B的完全抗原。
6.根据权利要求5所述杂交瘤细胞株OVA17的制备方法，其特征在于所述PMB的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
7.根据权利要求5所述杂交瘤细胞株OVA17的制备方法，其特征在于所述硫酸多粘菌素B的完全抗原的制备具体为：称取PMB 14mg，加入1.5 mL 0.1M PBS溶解，充分溶解后向其中加入0.5 mL溶有2.8 mg GMBS的四氢呋喃溶液，并于30℃搅拌30 min；氮吹除去四氢呋喃，再用3 mL乙醚-二氯甲烷混合溶液洗涤多次，除去多余的GMBS，最终获得PMB-GMBS溶液，即A液；取10mg BSA，溶解于0.2 mL 0.1M PBS中，并加入50 µL现配的0.5M羟胺溶液，25℃搅拌10 min后加入3mL含3M尿素的0.1M PBS缓冲液稀释，获得B液；将B液立即加入到A液中，并于25℃剧烈搅拌30min；混合液用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原PMB-GMBS-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
8.根据权利要求7所述杂交瘤细胞株OVA17的制备方法，其特征在于：所述乙醚-二氯甲烷混合溶液为，乙醚：二氯甲烷的体积比为2：1。
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