CN108251381B - 一种百草枯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种百草枯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明经筛选得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对百草枯具有较好的特异性和检测灵敏度，IC50值为0.97ng/mL，可实现对蔬菜、水资源及土壤中百草枯残留量的检测，为食品中百草枯残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一种百草枯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及一种百草枯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
百草枯(paraquat，简写为Para)，化学名称为1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐，是一种速效触杀型灭生性除草剂，由于对绿色植物组织有很强的破坏作用而在农业中被推广应用。目前，百草枯在全世界的使用已经超过100个国家，其用量仅次于除草剂草甘膦，也是我国进口量最大的农药品种之一。由于百草枯在土壤中有极强的吸附作用而在土壤中产生残留，并对水资源产生严重污染，且百草枯对人毒性极大，并无特效解毒药，口服中毒死亡率可达90％以上，目前已被20多个国家禁止或者严格限制使用。我国自2014年7月1日起，撤销百草枯水剂登记和生产许可、停止生产；但保留母药生产企业水剂出口境外使用登记、允许专供出口生产，停止水剂在国内销售和使用。尽管如此，百草枯中毒现象仍呈逐年上升趋势。在萨尔瓦多，平均每年由于百草枯中毒案件达2万起；在日本，每年百草枯中毒死亡达1000例以上；在我国，据不完全统计，1991-2008年百草枯中毒人数达8370例，并呈增长趋势，但目前临床上仍无有效的治疗手段，中毒死亡率较高。因此，建立百草枯安全、快速、高效的检测方法的研究受到广泛重视。
百草枯的传统检测方法有气质联用法、毛细管电泳法、高效液相色谱法和毛细管电泳质谱联用法等，然而这些方法的前处理比较复杂、费时，不适用于大量样品的快速检测。为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对百草枯的高效、快速的检测方法，而酶联免疫法(ELISA)前处理简单，成本低，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对百草枯的高特异性单克隆单体。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14688，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的第二个目的是提供百草枯单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo.14688的单克隆细胞株分泌产生。
本发明的第三个目的是提供所述百草枯单克隆抗体的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于食品中百草枯残留物的分析检测。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于水体中百草枯残留物的分析检测。
在本发明的一种实施方式中，所述应用是制备ELISA竞争法检测百草枯的试剂。
本发明的第四个目的是提供所述单克隆细胞株的制备方法，所述方法是将百草枯抗原化，再将百草枯的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，免疫小鼠，取高效价(OD>1.4)，低IC50(小于10ng/mL)的的免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经过ELISA检测，筛选亚克隆获得杂交瘤细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述百草枯抗原化是先合成N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶二溴化物，再经过衍生化反应后引入连接臂获得。
在本发明的一种实施方式中，所述百草枯单克隆抗体杂交瘤细胞株LH1的制备基本步骤为：
1)半抗原的衍生：
Figure BDA0001619265840000021
原药Mol.Wt:257.159；
由于百草小分子不具有免疫原性，不能刺激小鼠产生免疫应答，进而产生抗体，因此需通过蛋白连接技术将百草枯偶联到蛋白上，使其获得免疫原性；蛋白偶联技术中常用的活泼基团有氨基，羧基，羟基，巯基等，鉴于Para分子结构式中不含有这些活泼基团，因此需要衍生；以4，4’-联吡啶和碘甲烷为起始原料，合成了N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶二溴化物，作为百草枯的半抗原，记为Para-COOH；
Figure BDA0001619265840000022
3)完全抗原Para-COOH-KLH的制备：称取2.7mg Para-COOH，2.7N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于300μL无水的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min；再称取4.8mgN,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)，用100μL无水DMF溶解后，加入到Para-COOH溶液中，室温搅拌反应6-8h(称为A液)；取6.8mgKLH，加1mL 0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH＝7.4)稀释(称为B液)，再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原Para-COOH-KLH，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；
3)小鼠的免疫：将Para完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100ug/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50ug/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25ug/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
4)细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇(PEG4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基(HAT培养基)筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养；融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆；按上述方法进行三次亚克隆后获得Para的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株LH1；
5)杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性；
Para完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫(100μg/只)用完全弗氏佐剂，多次加强免疫(50μg/只)用不完全弗氏佐剂，最后一次冲刺免疫用Para完全抗原(25μg/只，不含佐剂)进行小鼠腹腔注射；取特异性高，IC50低的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过ic-ELISA法筛选细胞和三次亚克隆，得到一株高分泌特异抗体的杂交瘤细胞株。
本发明还提供含有所述单克隆抗体的检测试剂或检测试剂盒。
本发明的有益效果：本发明提供的细胞株LH1分泌的单克隆抗体，对Para具有较好的特异性(对百草枯类似物交叉小于10％，交叉率＝(百草枯的IC50/类似物的IC50)×100)和检测灵敏度(IC50值为0.97ng/mL)，可实现对蔬菜，水资源等中的Para残留量检测，为食品中Para残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。
生物材料保藏
一种单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14688，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1为单克隆抗体的抑制标准曲线。
具体实施方式
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用。
磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05％吐温20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4.12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按5：1混合即为TMB显色液，现用现混。
实施例1杂交瘤细胞株LH1的制备
1、半抗原的衍生：4，4’-联吡啶和碘甲烷为起始原料,合成了N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶二溴化物，作为百草枯的半抗原，记为Para-COOH。
2、完全抗原Para-COOH-KLH的制备：称取2.7mg Para-COOH，2.7N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于300μL无水的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min；再称取4.8mgN,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)，用100μL无水DMF溶解后，加入到Para-COOH溶液中，室温搅拌反应6-8h(称为A液)。取6.8mgKLH，加1mL 0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH＝7.4)稀释(称为B液)，再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原Para-COOH-KLH，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；
3、动物免疫：将Para完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100ug/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50ug/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25ug/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
4、细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1-4*107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5min。离心(800rpm，10min)，弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20％胎牛血清，2％50×HAT的RPMI-1640选择性培养基(HAT培养基)，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
5、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20％胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液(HT培养基)进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用百草枯为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对百草枯标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得百草枯单克隆抗体细胞株LH1。
6、单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106百草枯杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
实施例2
(1)包被：将包被原Para-COOH-OVA用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h。
(2)洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min.
(3)封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用。
(4)加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min。
(5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min.
(6)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。采用OriginPro 8.5做图，结果如图1所示。获得LH1标准抑制曲线，其R2＝0.996，Y＝0.106+1.48/(1+(X/0.994)1.102)，检测限(抑制率20％-80％对应的加标量)为0.283-3.496ng/mL。IC50为：0.97ng/mL，说明对百草枯有很好的灵敏度，可用于百草枯免疫分析检测。
实施例3
以水资源为例，检测其中的百草枯残留量
(1)样品前处理：从江苏省进出口检验检疫局获得阴性样品(命名为样品1和样品2)，加标Para后离心，取上清50μL(或进行一定稀释)用于检测.
(2)样品检测：按照实例2步骤，拉标和实际检测同时进行，结果如表1。回收率在83.4％-110.9％，基质干扰较小，结果较理想。
表1.ic-ELISA检测加标后的水样(n＝6)
Figure BDA0001619265840000061
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种单克隆细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14688，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种百草枯单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的单克隆细胞株分泌产生。
3.权利要求2所述百草枯单克隆抗体在检测食品中百草枯残留物方面的应用。
4.权利要求2所述百草枯单克隆抗体在检测水体中百草枯残留物方面的应用。
5.权利要求2所述百草枯单克隆抗体在制备ELISA竞争法检测百草枯的试剂中的应用。
6.含有权利要求2所述单克隆抗体的检测试剂。
7.含有权利要求2所述单克隆抗体的检测试剂盒。
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Application publication date: 20180706

Assignee: WUXI JIESHENGJIEKANG BIO-TECH CO.,LTD.

Assignor: Jiangnan University|WUXI DETERMINE BIO-TECH CO.,LTD.

Contract record no.: X2022320000200

Denomination of invention: A hybridoma cell line of paraquat monoclonal antibody and its application

Granted publication date: 20200904

License type: Common License

Record date: 20221012

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