CN111925321B - 一种百草枯半抗原、完全抗原、抗体、检测试纸及试剂盒 - Google Patents

一种百草枯半抗原、完全抗原、抗体、检测试纸及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种百草枯半抗原、完全抗原、抗体、检测试纸及试剂盒，该百草枯半抗原，具有下式Ⅰ的结构式。该百草枯半抗原分子结构与百草枯原药的相似度更高，使由该半抗原与蛋白偶联得到的完全抗原产生的抗体具有更强的百草枯原药亲和力和特异性，进而使该试剂盒对百草枯的检测灵敏度更高，可实现对生鲜乳，奶粉，鸡肉及鸡蛋中百草枯进行快速检测。

Description

一种百草枯半抗原、完全抗原、抗体、检测试纸及试剂盒
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种百草枯半抗原、完全抗原、抗体、检测试纸及试剂盒。
背景技术
百草枯（Paraquat，又称对草快、克芜踪，CAS号为1910-42-5），纯品为白色结晶，是一种联吡啶阳离子盐有机杂环类速效除草剂，极易溶于水，具有广谱性和触杀性，植物接触百草枯后，数小时后开始枯死。百草枯能被土壤胶体迅速、强烈吸附致钝化而不影响植物根部。百草枯对人毒性极大，每年均有人因百草枯中毒身亡，其作用的主要靶器官是肺，主要表现在肺内出血和水肿，目前无特效解毒药。百草枯已被20多个国家禁止或严格限制使用，我国自2014年7月1日起，撤销百草枯水剂登记和生产许可、停止生产，2016年7月1日停止水剂在国内销售和使用。《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》 GB2763-219规定了谷物、油料和油脂、蔬菜、水果、坚果、饮料类、哺乳动物肉类（海洋哺乳动物除外）、哺乳动物内脏（海洋哺乳动物除外）、禽肉类、禽类内脏、蛋类、生乳等食品中百草枯的最大残留限量，因此，需要对食品中百草枯残留量进行检测。
现有国内外技术对百草枯的检测主要有仪器分析法，例如液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法、分光光度法和高效毛细管电泳法等，仪器分析方法操作繁琐，灵敏度低，仪器价格昂贵，且不适合大量样本检测。免疫学分析法是以抗原与抗体之间的特异性识别和可逆性结合反应为基础的痕量分析方法，免疫分析具有特异性强、灵敏度高、简单、快速、适于大批量样品检测等优点。免疫学分析法包括酶联免疫法、胶体金免疫检测法、放射免疫分析法等，中国专利文献CN102633876B公开了一种合成百草枯抗原的方法及其应用，采用该人工合成的百草枯抗原与使用该抗原制备得到的单克隆抗体，以酶联免疫法检测样品中的百草枯，但酶联免疫法具有免疫酶活力不稳定及实际应用中受操作条件影响的缺陷。此外，检测中所使用的抗体对待测抗原的亲和性强弱、特异性强弱直接影响免疫学分析法的检测灵敏度，但该专利文献中的抗原及抗体用于酶联免疫法测定百草枯的灵敏度仍较低。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种百草枯半抗原、完全抗原、抗体、检测试纸及试剂盒，该百草枯半抗原分子结构与百草枯原药的相似度更高，使由该半抗原与蛋白偶联得到的完全抗原产生的抗体具有更强的百草枯原药亲和力和特异性，进而使该试剂盒对百草枯的检测灵敏度更高，可实现对生鲜乳，奶粉，鸡肉及鸡蛋中百草枯进行快速检测。
为了解决上述问题，本发明提供一种百草枯半抗原，具有下式Ⅰ的结构式：
Figure 993557DEST_PATH_IMAGE001
式Ⅰ。
半抗原设计的关键是确定半抗原分子结构中适当的修饰位点，以及在修饰位点用化学方法连接上具有一定碳链长度的且端基为活性基团的连接臂。本发明通过对百草枯半抗原分子结构进行适当的修饰，使其在分子结构、立体化学、电子分布等性质上与百草枯原药的相似度更高，以便能够将百草枯原有的分子特征结构暴露在完全抗原的表面，使完全抗原最大限度的被动物免疫活性细胞所识别，刺激机体产生特异性免疫应答，获得的抗体具有更强的百草枯原药亲和力和特异性，进而使该试剂盒对百草枯的检测灵敏度更高，可实现对生鲜乳，奶粉，鸡肉及鸡蛋中百草枯进行快速检测。
本发明的另一目的是提供一种制备上述的百草枯半抗原的方法，包括：
S1. 将2-氯-4,4'-联吡啶与碘甲烷溶于溶剂中，进行N-烷基化反应，得到式Ⅱ的化合物：
Figure 582801DEST_PATH_IMAGE002
式Ⅱ；
S2. 将式Ⅱ的化合物与6-氨基己酸于溶剂中加热反应，得到所述百草枯半抗原。
优选地，制备上述的百草枯半抗原的方法，包括：
S1. 取808mg 2-氯-4,4'-联吡啶，用丙酮溶解，4℃搅拌下，加入400uL 碘甲烷，4℃反应过夜，然后离心，用丙酮洗涤，干燥，得到式Ⅱ的化合物；
S2. 取0.4g式Ⅱ的化合物，用DMF溶解，加入238mg 6-氨基己酸，120℃回流反应4h，冷却，离心，洗涤，烘干得到百草枯半抗原。
一种具有下式Ⅰ的结构式的化合物作为百草枯半抗原的应用：
Figure 815069DEST_PATH_IMAGE003
式Ⅰ。
本发明的又一目的是提供一种百草枯完全抗原，具有下式Ⅲ的结构式：
Figure 529385DEST_PATH_IMAGE004
式Ⅲ。
其中，Protein表示载体蛋白，载体蛋白可以为牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、钥孔血蓝蛋白（KLH）、多聚赖氨酸（PLL）等。
本发明的又一目的是提供一种制备上述的百草枯完全抗原的方法，包括：通过碳化二亚胺法将上述的百草枯半抗原与载体蛋白偶联，得到所述百草枯完全抗原。
优选地，制备上述的百草枯完全抗原的方法，包括：
S1. 称取式Ⅰ的百草枯半抗原16mg，用DMF溶解，加入6mg NHS和20mg EDC，活化过夜，得到活化液；
S2. 称取30mg BSA和OVA，分别用3mL 0.01M PBS溶解，然后分别向其中各滴加一半步骤S1中得到的活化液，反应2h，得到所述百草枯完全抗原。
本发明的又一目的是提供一种百草枯抗体，能够与上述的百草枯半抗原或百草枯完全抗原特异性结合。
本发明的又一目的是提供一种百草枯单克隆抗体，能够与上述的百草枯半抗原或百草枯完全抗原特异性结合；由保藏编号为CGMCC No.19665的杂交瘤细胞1A2-1F5分泌产生。该百草枯单克隆抗体对百草枯具有极强的亲和力和特异性，利用该百草枯单克隆抗体可制备得到具有高灵敏度、强特异性的百草枯检测试纸。
本发明的又一目的是提供一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞为保藏编号为CGMCCNo.19665的杂交瘤细胞1A2-1F5。
本发明的又一目的是提供一种百草枯的检测试纸，包括上述的百草枯单克隆抗体。
其中，百草枯单克隆抗体可以利用荧光微球、胶体金或酶进行标记。
优选地，所述百草枯单克隆抗体利用荧光微球进行标记。荧光微球比胶体金具有更高的信号值，更高的灵敏度。
本发明的又一目的是提供一种百草枯时间分辨荧光检测试剂盒，包括：检测试纸和孔板；所述检测试纸包括背板，所述背板上依次排列设置样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线处包被有上述的百草枯完全抗原，所述检测线靠近所述样品垫一侧设置；所述质控线处包被有羊抗鼠抗抗体，所述质控线靠近所述吸水垫一侧设置；所述孔板中设有荧光微球标记的百草枯单克隆抗体。
优选地，所述孔板中还设有稀释液，所述稀释液含有0.01mol/L HEPES、1-2wt%的海藻糖、0.5-1wt%的PEG-20000、0.1-1wt%的BSA、2-4wt%的 Tween-20，所述荧光微球标记的百草枯单克隆抗体分散于所述稀释液中。稀释液中加入吐温及海藻糖，可提高T线荧光灵敏度，保护冻干微球的状态。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1. 本发明的百草枯半抗原、完全抗原，通过对百草枯半抗原分子结构进行适当的修饰，使其在分子结构、立体化学、电子分布等性质上与百草枯原药的相似度更高，以便能够将百草枯原有的分子特征结构暴露在完全抗原的表面，使完全抗原最大限度的被动物免疫活性细胞所识别，刺激机体产生特异性免疫应答，获得的抗体具有更强的百草枯原药亲和力和特异性，进而使该试剂盒对百草枯的检测灵敏度更高，可实现对生鲜乳，奶粉，鸡肉及鸡蛋中百草枯进行快速检测；
2. 本发明的百草枯单克隆抗体，是由上述的百草枯完全抗原免疫动物后经杂交瘤细胞技术制备，并筛选得到的，相比于其他单克隆抗体，筛选出的该单克隆抗体对百草枯原药具有极强的亲和力和特异性的，利用该单克隆抗体制备得到的百草枯检测试剂盒对百草枯的检测灵敏度更高，检测限更低；
3. 本发明的百草枯时间分辨荧光检测试剂盒，以荧光微球标记百草枯单克隆抗体，荧光微球比胶体金具有更高的信号值，更高的灵敏度。
生物保藏信息说明
杂交瘤细胞1A2-1F5于2020年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编为100101，保藏编号为CGMCC No. 19665。
附图说明
图1是本发明实施例4中采用间接Elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性的四参数拟合标准曲线；
图2是本发明实施例4中采用间接Elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性的三次样条函数拟合标准曲线；
图3是本发明对比例中采用间接Elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性的四参数拟合标准曲线；
图4是本发明对比例中采用间接Elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性的三次样条函数拟合标准曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 百草枯半抗原的制备
本实施例所述的百草枯半抗原的制备方法具体如下，反应式如下式1。
S1. 取808mg 2-氯-4,4'-联吡啶，用丙酮溶解，4℃搅拌下，加入400uL 碘甲烷，4℃反应过夜，然后离心，用丙酮洗涤，干燥，得到式Ⅱ的化合物；
S2. 取0.4g式Ⅱ的化合物，用DMF溶解，加入238mg 6-氨基己酸，120℃回流反应4h，然后冷却，经离心、洗涤、烘干，得到式Ⅰ的百草枯半抗原。
半抗原2-（（5-羧基戊基）氨基）-1,1'-二甲基-[4,4'-联吡啶] -1,1'-二鎓的核磁谱如下：
H-NMR（DMSO）1.29（2H，q），1.52-1.63（4H，m），2.30（2H，t），3.35（2H，t），4.0（1H，s），4.39（6H，s），7.69（1H，s），8.06（1H，d），8.47（1H，d），8.84（2H，d），8.95（2H，d），11.0（1H,s）
由此可以确定，制备得到的产物为式Ⅰ的化合物。
Figure 140495DEST_PATH_IMAGE005
式1
实施例2 百草枯完全抗原的制备
本实施例所述的百草枯完全抗原的制备方法具体如下，反应式如下式2。
S1. 称取式Ⅰ的百草枯半抗原16mg，用DMF溶解，加入6mg NHS和20mg EDC，活化过夜，得到活化液；
S2. 称取30mg BSA和OVA，分别用3mL 0.01M PBS溶解，然后分别向其中各滴加一半步骤S1中得到的活化液，反应2h，得到式Ⅲ的百草枯完全抗原。对载体蛋白BSA、OVA、百草枯半抗原和百草枯完全抗原进行紫外扫描测定，发现百草枯完全抗原与BSA、OVA、百草枯半抗原相比，吸收曲线有明显改变，表明百草枯半抗原与载体蛋白偶联成功。
Figure 290853DEST_PATH_IMAGE006
式2
实施例3 百草枯多克隆抗体及抗体效价测定
采用间接Elisa方法检测血清效价，将抗血清从1:200稀释，以OD450值大于或等于阴性对照的2倍（P/N≥2）所对应的血清效价最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。血清效价检测结果如表1，实验结果表明，1#小鼠百草枯-BSA血清效价最高为51200倍，抑制率60.32%，选择1号小鼠做融合实验。
表1
Figure 89045DEST_PATH_IMAGE008
实施例4 百草枯单克隆抗体的制备
1. 杂交瘤细胞株筛选制备
初次免疫：将实施例2制备得到的百草枯完全抗原（式Ⅲ）与弗氏完全佐剂乳化（1:3），皮下注射6周龄的BALB/C小鼠，免疫剂量为100 μg/只；从首次免疫开始，每4周加强免疫一次，共加强免疫2次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法与剂量同首次免疫；第2次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时，进行1次冲击免疫，即腹腔注射免疫原溶液0.1 mL，三天后取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆，得到并建立稳定分泌百草枯单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A2-1F5，1A3-2F6，9A7-1G6，6F4-7G8，10G-6H1，5D3-8B3，添加百草枯标品5ppb。检测结果如表2，检测结果显示6株细胞株均有较好的抑制率，均在67%以上，其中1A2-1F5抑制率可达87.64%。
表2
Figure 881421DEST_PATH_IMAGE009
2. 单克隆抗体的制备
细胞复苏：取出百草枯单克隆抗体杂交瘤细胞株 1A2-1F5冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.5 mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到百草枯单克隆抗体。
采用间接Elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性，结果见下表3。以百草枯各浓度(0，0.1，0.3，0.9，2.7，8.1ppb)横坐标，以百草枯各浓度对应的OD值为纵坐标，使用RIDASOFT四参数法绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（IC50）如图1、图2所示。结果表明，曲线R2=0.9999，IC50=0.323ppb，本发明的百草枯抗原获得的单克隆抗体，相对于专利CN108251381 A报道的百草枯单抗（IC50=0.97ng/ml）灵敏度显著更高。
表3
Figure 81458DEST_PATH_IMAGE010
实施例5 百草枯时间分辨荧光检测试剂盒的制备
1. 冻干荧光微球标记百草枯单克隆抗体的制备
S1. 取市售荧光微球（羧基修饰，Eu（Ⅲ）-螯合物掺杂的聚苯乙烯，直径为100~300nm）100 μL于900uL 50mmol/L、pH值为5.5-6.5乙磺酸中，混匀10min；
S2. 加入150uL 0.05mg/mL EDC，活化15min；
S3. 加入1 μL实施例4所得的百草枯单克隆抗体溶液（蛋白浓度10 mg/mL），混匀后室温震荡120 min；
S4. 加入20ul 20%的BSA封闭2h；
S5. 于4℃下，12000r/min的转速离心10min；
S6. 弃去上清，用100ul复溶液（0.02mol/L PB，0.1% BSA，1% Tween-20，pH7.4）复溶；
S7. 再加入400ul冻干稀释液（0.01mol/L HEPES、1%-2%海藻糖、0.5%-1% PEG-20000、0.1%-1% BSA、2%-4% Tween-20 ），混匀，30-60ul/孔分于96孔板中，冷冻干燥后备用。
2. 硝酸纤维素膜的制备
S1. 将硝酸纤维素膜粘贴到PVC板的相应位置
S2. 将实施例2所得百草枯完全抗原（式Ⅲ）（0.5mg/ml），用划膜仪以0.1μL /mm的体积喷涂到硝酸纤维素膜的检测线（T线）的位置，制成检测区；
S3. 将羊抗鼠抗抗体（0.2mg/ml），用划膜仪以0.1μL /mm的体积喷涂到硝酸纤维素膜的质控线（C线）的位置，制成质控区；
S4. 将硝酸纤维素膜置于37℃恒温干燥箱中，烘干16h，室温干燥贮存。
3. 检测试纸的组装
S1. 吸水纸：将吸水纸裁切成300mm×41mm，备用；
S2. 样品垫：将样品垫裁切成300mm×16mm，备用；
S3. 将吸水纸与样品垫贴在PCV 背板的相应位置；
S4. 用切条机将其切成4.05mm宽的小条；
S5. 将冻干荧光微球标记百草枯单克隆抗体与试纸条装入试纸筒中，百草枯时间分辨荧光检测试剂盒制备完毕。
对比例
1. 对比例百草枯半抗原、完全抗原的制备
本对比例采用中国专利文献CN102633876B中公开的方法制备百草枯半抗原，并按照其公开内容制备百草枯完全抗原。其百草枯半抗原及百草枯完全抗原的结构式如下式Ⅳ、式Ⅴ，具体步骤如下：
Figure 746925DEST_PATH_IMAGE011
式Ⅳ
Figure 953785DEST_PATH_IMAGE012
式Ⅴ
S1. N-甲基-二吡啶碘化物的合成：将250mL三颈圆底烧瓶密闭避光通氮，以排除瓶中空气；称取1g 4,4-联吡啶溶解于25mL无水丙酮中，搅拌冷却至4℃；缓慢滴加0.4mL碘甲烷，于4℃环境中搅拌过夜，使用无水丙酮洗涤，抽干，得黄色针状结晶。
S2. N-甲基-N，-戊酸乙酯基-二吡啶碘溴化物的合成：取黄色针状结晶0.8g，加入10mL新鲜蒸馏的无水二甲基甲酰胺（DMF）通氮搅拌溶解。120℃油浴磁力搅拌，缓慢加入1.6mL 5-溴戊酸乙酯，回流3h，自然冷却后室温放置过夜。抽滤，用无水DMF洗涤，真空干燥，得红色片状结晶。
S3. N-甲基-N，-戊酸基-二吡啶二溴化物的合成：取红色片状结晶0.3g，与20mL浓HCl混合，水浴加热回流1.5h，在旋转蒸发器上蒸去过量的酸和水，保持水浴温度不超过60℃，蒸干，冷却。加入少量丙酮结晶，过滤抽干，真空干燥，得粗品，再经95%乙醇重结晶，真空干燥，得百草枯半抗原。
S4. 取半抗原16mg溶于600μL二噁烷中，搅拌使其溶解，然后加入无水正丁胺70μL，将此混合物在4℃冰浴中冷却，并搅拌15min。
S5. 加入重蒸的氯甲酸异丁酯30μL，4度搅拌30min。
S6. 取52mg BSA和OVA溶于4.5mL水中，用0.1mol/L的氢氧化钠调ph至9.0。将上述物质溶液逐滴加入到溶解的蛋白中，并于4度轻微搅拌4h，整个过程维持pH在9.0，透析，分装，-20℃保存。
2. 对比例的百草枯多克隆抗体及抗体效价测定
采用间接Elisa方法检测血清效价，将抗血清从1:200稀释，以OD450值大于或等于阴性对照空的2倍（P/N≥2）所对应的血清效价最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。血清效价检测结果如表4，实验结果表明，1#小鼠百草枯-BSA血清效价最高为6400倍，抑制率为54.87%，选择1号小鼠做融合实验。
表4
Figure 97321DEST_PATH_IMAGE014
3. 对比例的百草枯单克隆抗体的制备
（1）杂交瘤细胞株筛选制备
初次免疫：将对比例制备得到的百草枯完全抗原（式Ⅴ）与弗氏完全佐剂乳化（1:3），皮下注射6周龄的BALB/C小鼠，免疫剂量为100 μg/只；从首次免疫开始，每4周加强免疫一次，共加强免疫2次，用弗式不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，方法与剂量同首次免疫；第2次加强免疫一周后眼底静脉采血测效价和抑制，有抑制且效价达到1:10000以上时，进行1次冲击免疫，即腹腔注射免疫原溶液0.1 mL，三天后取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆，得到并建立稳定分泌百草枯单克隆抗体的杂交瘤细胞株的杂交瘤细胞株1F2-1F5，1E3-4F6，6A7-10G6,添加百草枯标品5ppb。检测结果如表5，检测结果显示3株细胞株均有较好的抑制率，其中1F2-1F5抑制率可达64.48%。
表5
Figure 341745DEST_PATH_IMAGE015
（2）单克隆抗体的制备
细胞复苏：取出百草枯单克隆抗体杂交瘤细胞株1F2-1F5冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养；制备腹水与抗体纯化：采用体内诱生法，将Balb/c小鼠（8周龄）腹腔注入灭菌石蜡油0.5 mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5× 105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到百草枯单克隆抗体。
采用间接Elisa方法检测单克隆灵敏度及特异性，以百草枯各浓度(0，0.1，0.3，0.9，2.7，8.1ppb)横坐标，以百草枯各浓度对应的OD值为纵坐标，使用RIDA SOFT四参数法绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（IC50），如图3、图4所示。结果如表6，结果表明，曲线R2=0.9985，IC50=0.907ng/ml，
表6
Figure 178114DEST_PATH_IMAGE016
4. 对比例的百草枯时间分辨荧光检测试剂盒的制备
（1）冻干荧光微球标记百草枯单克隆抗体的制备
S1. 取市售荧光微球（羧基修饰，Eu（Ш）-螯合物掺杂的聚苯乙烯，直径为100~300nm）100 μL于900uL 50mmol/L、pH值为5.5-6.5乙磺酸中，混匀10min；
S2. 加入150uL 0.05mg/mL EDC，活化15min；
S3. 加入1 μL对比例的百草枯单克隆抗体溶液（蛋白浓度10 mg/mL），混匀后室温震荡120 min；
S4. 加入20ul 20%的BSA封闭2h；
S5. 于4℃下，12000r/min的转速离心10min；
S6. 弃去上清，用100ul复溶液（0.02mol/L PB，0.1% BSA，1% Tween-20，pH7.4）复溶；
S7. 再加入400ul冻干稀释液（0.01mol/L HEPES、1%-2%海藻糖、0.5%-1% PEG-20000、0.1%-1% BSA、2%-4% Tween-20 ），混匀，30-60ul/孔分于96孔板中，冷冻干燥后备用。
（2）硝酸纤维素膜的制备
S1. 将硝酸纤维素膜粘贴到PVC板的相应位置
S2. 将对比例所得百草枯完全抗原（式Ⅴ）（0.5mg/ml），用划膜仪以0.1μL /mm的体积喷涂到硝酸纤维素膜的检测线（T线）的位置，制成检测区；
S3. 将羊抗鼠抗抗体（0.2mg/ml），用划膜仪以0.1μL /mm的体积喷涂到硝酸纤维素膜的质控线（C线）的位置，制成质控区；
S4. 将硝酸纤维素膜置于37℃恒温干燥箱中，烘干16h，室温干燥贮存。
（3）检测试纸的组装
S1. 吸水纸：将吸水纸裁切成300mm×41mm，备用；
S2. 样品垫：将样品垫裁切成300mm×16mm，备用；
S3. 将吸水纸与样品垫贴在PCV 背板的相应位置；
S4. 用切条机将其切成4.05mm宽的小条；
S5. 将冻干荧光微球标记百草枯单克隆抗体与试纸条装入试纸筒中，对比例百草枯时间分辨荧光检测试剂盒制备完毕。
实施例6 本发明与对比例的百草枯时间分辨荧光试剂盒的检测灵敏度对比
1. 样本前处理
鸡肉组织及鸡蛋样本：称取5g均质好的组织样本，加入10ml DMF，涡旋提取5min，3800g离心10min；取2ml上清液，再加入4ml样本稀释液（0.02mol/L PB，5%NaCl），备用。
奶粉：称取1 .0± 0 .05 g牛奶粉至聚苯乙烯离心管中，加入8 mL 纯水溶解，振荡混匀，备用；
生鲜乳：取5ml生鲜乳，备用。
分别向肌肉组织、鸡蛋样本、奶粉及生鲜乳空白样本中加入百草枯标准品至终浓度为0ppb，0.5ppb，1ppb，4ppb，8ppb待测。
2. 用试纸条检测
吸取200 μL待检样本溶液加入冻干微球孔中，室温反应3min，将试纸条插入荧光检测仪中，开始对试纸卡进行扫描测试，通过仪器的显示屏幕上读取检测结果。
3. 检测结果分析
阴性（-）：样本中不含有百草枯或其浓度低于检测限。
阳性（+）：样本中含有百草枯，其浓度等于或高于检测限。
无效：若质控区未检出荧光信号强度，表明不正确的操作过程或试纸卡已失效。
分别采用本申请实施例5得到的百草枯时间分辨荧光试剂盒和对比例得到的百草枯时间分辨荧光试剂盒，对上述样品进行检测，本申请实施例5的试剂盒的检测结果为：百草枯浓度为8ppb、4ppb、1ppb时，检测为阳性，浓度为0pbb和0.5ppb时，检测为阴性，表明本试纸条对肌肉组织、鸡蛋样本、奶粉及生鲜乳中百草枯的检测限为1ppb；而对比例得到的试剂盒的检测结果为：百草枯浓度为8ppb时，荧光检测仪检测为阳性，浓度为4ppb、1ppb、0.5ppb、0ppb时，荧光检测仪检测为阴性，表明对比例的试剂盒对肌肉组织、鸡蛋样本、奶粉及生鲜乳中百草枯的检测限为8ppb。
以上结果表明：使用本发明的百草枯完全抗原和单克隆抗体的检测试剂盒灵敏度显著高于对比例百草枯完全抗原和单克隆抗体的检测灵敏度。
实施例7 本发明的百草枯时间分辨荧光试剂盒与市售百草枯胶体金试剂盒的检测灵敏度对比
1. 样本处理
按照说明处理奶粉样本，分别向奶粉和鲜奶样本中加入百草枯标准品，至终浓度分别为0ppb，0.5ppb，1ppb，5ppb，10ppb，20ppb。
2. 检测结果
加标浓度为0ppb、0.5ppb、1ppb、5ppb、10ppb时，市售百草枯胶体金试剂盒A检测结果均为阴性，加标浓度为20ppb时，检测结果为阳性；加标浓度为0ppb、0.5ppb、1ppb、5ppb时，市售百草枯胶体金试剂盒B检测结果均为阴性，加标浓度为10ppb、20ppb时，检测结果为阳性；加标浓度为0ppb、0.5ppb时，本发明实施例5所得百草枯时间分辨荧光试纸条检测结果为阴性，加标浓度为1ppb，5ppb，10ppb，20ppb时，检测结果为阳性，见表7。表明本发明的百草枯时间分辨荧光试剂盒比市售百草枯胶体金试剂盒的检测灵敏度显著更高，检测限更低。
表7
Figure 216477DEST_PATH_IMAGE017
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种百草枯半抗原，其特征在于，具有下式Ⅰ的结构式：
Figure 667104DEST_PATH_IMAGE001
式Ⅰ。
2.一种制备如权利要求1所述的百草枯半抗原的方法，其特征在
于，包括：
S1. 将2-氯-4,4'-联吡啶与碘甲烷溶于溶剂中，进行N-烷基化反应，得到式Ⅱ的化合物：
Figure 62313DEST_PATH_IMAGE002
式Ⅱ；
S2. 将式Ⅱ的化合物与6-氨基己酸于溶剂中加热反应，得到所述百草枯半抗原。
3.一种具有下式Ⅰ的结构式的化合物作为百草枯半抗原的应用：
Figure 876686DEST_PATH_IMAGE001
式Ⅰ。
4.一种百草枯完全抗原，其特征在于，具有下式Ⅲ的结构式：
Figure 636831DEST_PATH_IMAGE003
式Ⅲ
其中，Protein为载体蛋白。
5.一种制备如权利要求4所述的百草枯完全抗原的方法，其特征在于，包括：通过碳化二亚胺法将如权利要求1所述的百草枯半抗原与载体蛋白偶联，得到所述百草枯完全抗原。
6.一种百草枯单克隆抗体，其特征在于，能够与如权利要求1所述的百草枯半抗原或如权利要求4所述的百草枯完全抗原特异性结合；由保藏编号为CGMCC No.19665的杂交瘤细胞1A2-1F5分泌产生。
7.一种杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞为保藏编号为CGMCC No.19665的杂交瘤细胞1A2-1F5。
8.一种百草枯的检测试纸，其特征在于，包括如权利要求6所述的百草枯单克隆抗体。
9.一种百草枯时间分辨荧光检测试剂盒，其特征在于，包括：检测试纸和孔板；所述检测试纸包括背板，所述背板上依次排列设置样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线处包被有如权利要求4所述的百草枯完全抗原，所述检测线靠近所述样品垫一侧设置；所述质控线处包被有羊抗鼠抗抗体，所述质控线靠近所述吸水垫一侧设置；所述孔板中设有荧光微球标记的百草枯单克隆抗体，所述百草枯单克隆抗体为如权利要求6所述的百草枯单克隆抗体。
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