CN114480295B - 一株分泌抗仲丁灵单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株分泌抗仲丁灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明分泌抗仲丁灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株1G5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株BZD，保藏日期2021年12月16日，保藏编号CGMCC No.45018。将仲丁灵的完全抗原免疫BALB/c小鼠，将高效价、低IC₅₀小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，采用选择培养基，筛选出两种细胞融合后的杂交细胞；再经间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，最终得到一株杂交瘤细胞株1G5。1G5分泌的单克隆抗体，对仲丁灵具有较好的检测灵敏度(IC₅₀值为12.7ng/mL)，可用于仲丁灵的残留检测。

Description

一株分泌抗仲丁灵单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一株分泌抗仲丁灵单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

仲丁灵(Butralin，Dibutaline，Amexine)，又名止芽素，化学名称为N-仲丁基-4-特丁基-2，6-二硝基苯胺，分子式为C₁₄H₂₁N₃O₄，分子质量为295.33。仲丁灵为甲苯胺类除草剂，纯品为橙黄色结晶体，易溶于有机溶剂，而难溶于水，有挥发性，受光后易分解，对人畜等动物类毒性较低。制剂外观为橙色或红棕色油状液体，无悬浮物和沉淀。该药为选择性萌前除草剂。药剂进入植物体后，主要抑制分生组织的细胞分裂，从而抑制杂草的幼芽及幼根生长，导致杂草死亡。

目前，仲丁灵检测方法主要为仪器检测，常用的有高效液相色谱法和气相色谱-质谱法等。尽管这些基于色谱的方法具有很高的灵敏度和特异性，但存在一些缺点，例如需要彻底的样品净化，高溶剂消耗，昂贵的设备以及熟练的技术人员。因此，需要一种快速，简单的分析仲丁灵残留物的方法。

酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，因此得到了广泛应用。而使用酶联免疫法检测仲丁灵的前提是得到对仲丁灵具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对仲丁灵具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。发明人尝试通过杂交瘤细胞制备仲丁灵单克隆抗体，但在制备能分泌仲丁灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备仲丁灵半抗原和仲丁灵完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出仲丁灵单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的仲丁灵单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。

发明内容

本发明的目的是在于提供一株分泌仲丁灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的单克隆抗体对仲丁灵具有较好的亲和力和灵敏度(IC₅₀值为12.7ng/mL)，可以用于建立仲丁灵的免疫学检测方法，或建立胶体金免疫层析试纸条快速检测方法，用以检测仲丁灵的残留。

技术方案：为实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明的第一个目的是，提供一株分泌仲丁灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株BZD，保藏日期为2021年12月16日，保藏编号为CGMCC No.45018。

本发明的第二个目的是，提供一种仲丁灵单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCCNo.45018的杂交瘤细胞株BZD分泌产生。

本发明的第三个目的是，提供一种仲丁灵半抗原，用于制备上述的杂交瘤细胞株，结构简式如下式(I)：

本发明的第四个目的是，提供一种仲丁灵半抗原的合成方法，包括以下步骤：

S1.将6-氨基己酸溶于无水甲醇，冰浴下加入SOCl₂，反应后旋干，得产物a即氨基酸甲酯盐酸盐；

S2.将2-羟基-5-叔丁基-1，3-二硝基苯溶于甲苯，加入DMF和SOCl₂混合回流8h反应后冷却，旋干，残留液过滤、洗涤，得产物b即2-氯-5-叔丁基-1，3-二硝基苯；

S3.产物a用水溶解，浓氨水调节PH＝8.5，加入氯仿萃取，有机相旋干得到无色或淡黄色液体，再与添加有产物b及(iPr)₂EtN的THF溶液混合，室温搅拌反应24h，纯化得到产物c即6-((4-(叔丁基)-2，6二硝基苯基)氨基)己酸甲酯；

S4.产物c与LiOH溶于THF和H₂O的混合溶液中，室温搅拌，水解完成后调PH＝5，乙酸乙酯萃取，干燥、旋干得仲丁灵半抗原。

在本发明的一个实施例中，所述步骤S1中，6-氨基己酸、SOCl₂的摩尔比为1∶2。

在本发明的一个实施例中，所述步骤S2中，2-羟基-5-叔丁基-1，3-二硝基苯、SOCl₂的摩尔比为1∶3。

在本发明的一个实施例中，所述步骤S3中，2-氯-5-叔丁基-1，3-二硝基苯、(iPr)2EtN、氨基酸甲酯盐酸盐的摩尔比为1∶2.1∶3。

在本发明的一个实施例中，所述步骤S4中，产物c与LiOH的摩尔比为1∶2。

在本发明的一个实施例中，所述步骤S4中，THF和H₂O的体积比为3∶1。

本发明的第五个目的是，提供一种仲丁灵完全抗原的制备方法，包括以下步骤：将仲丁灵半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺NHS及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶解于N，N-二甲基甲酰胺DMF中，搅拌反应，活化6-8h后的活化液加入载体蛋白溶液中，室温搅拌反应后透析，即得所述仲丁灵完全抗原；

所述仲丁灵半抗原为上述的仲丁灵半抗原，结构如下式(I)所示：

所述载体蛋白溶液由载体蛋白溶于碳酸盐缓冲溶液中制得，所述载体蛋白包括BSA、OVA其中任意一种。

在本发明的一个实施例中，所述仲丁灵半抗原与所述载体蛋白的摩尔比为30∶1。

在本发明的一个实施例中，所述仲丁灵半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1∶3∶3。

本发明的第六个目的是，提供一种仲丁灵完全抗原，根据上述的方法制备得到。

在本发明的一个实施例中，所述仲丁灵完全抗原的结构简式如下式(II)：

在本发明的一个实施例中，一种分泌仲丁灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：

(1)设计仲丁灵半抗原与制备仲丁灵完全抗原(仲丁灵免疫原)，将获得的仲丁灵完全抗原配制弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；

(2)将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；

(3)将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中仲丁灵抗体含量高的获得免疫的小鼠；

(4)将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的仲丁灵完全抗原进行；

(5)将进行冲刺免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌仲丁灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)中的首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18～21天。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)中的首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)中的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫；

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的细胞融合是通过聚乙二醇(PEG4000)法进行的。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的培养基为RPMI-1640培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的亚克隆次数为3次。

本发明的第七个目的是，提供上述仲丁灵单克隆抗体的应用，具体是建立抗仲丁灵含量的免疫检测方法，用于食品中仲丁灵残留的检测。

在本发明的一个实施例中，采用仲丁灵单克隆抗体制备仲丁灵的免疫检测试剂盒、检测板以及胶体金试纸条用于检测。

在本发明的一种实施例中，所述检测主体还包括仲丁灵包被原，所述仲丁灵包被原由仲丁灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白包括KLH、BSA、OVA其中任意一种。其中，关于载体蛋白的选择，制备包被原所采用的载体蛋白与制备免疫原所采用的载体蛋白是不同的两种载体蛋白。

本发明的有益效果：

(1)本发明获得的仲丁灵单克隆抗体，对仲丁灵有较好的检测灵敏度(IC₅₀值为12.7ng/mL)，可实现对水、果蔬、谷物中仲丁灵残留量的检测，为食品中仲丁灵残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

(2)本发明获得的仲丁灵单克隆抗体细胞株可以用于免疫分析检测，用于制备仲丁灵的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，为食品中仲丁灵的检测提供有力的检测方法及手段。

(3)提供了一种新的合成仲丁灵半抗原和免疫原的方法，合成步骤更加简化，有效，为今后人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法。

生物材料样品保藏：一株分泌抗仲丁灵单克隆抗体杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称单克隆细胞株BZD，保藏编号为CGMCCNo.45018，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2021年12月16日。

附图说明

图1是本发明实施例中仲丁灵半抗原的合成路径。

图2是本发明实施例制得的仲丁灵半抗原的LC-MS表征。

图3是本发明实施例中仲丁灵单克隆抗体对仲丁灵的抑制标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

本申请实施例通过将仲丁灵完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对仲丁灵有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

下述实施例中涉及的培养基如下：

RPMI-1640培养基(mg/L)：L-精氨酸290、L-门冬酰胺50、L-门冬氨酸20、L-胱氨酸二盐酸盐65.15、L-谷氨酸20、甘氨酸10、L-组氨酸15、L-羟脯氨酸20、L-异亮氨酸50、L-亮氨酸50、L-赖氨酸盐酸盐40、L-甲硫氨酸15、L-苯丙氨酸15、L-脯氨酸20、L-丝氨酸30、L-苏氨酸20、L-色氨酸5、L-酪氨酸23.19、L-缬氨酸20、对氨基苯甲酸1、硝酸钙100、无水硫酸镁48.84、无水磷酸二氢钠676.13、氯化钾400、氯化钠6000、葡萄糖2000、还原谷胱甘肽1、酚红5、L-谷氨酰胺300、生物素0.2、D-泛酸钙0.25、叶酸1、i-肌醇35、烟酰胺1、氯化胆碱3、盐酸吡哆醇1、核黄素0.2、盐酸硫胺素1、维生素B 120.005、碳酸氢钠2000。

下述实施例中涉及的试剂如下：

碳酸盐缓冲液(CBS)：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液(PBS)：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH₂PO₄，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05％吐温20的PBS；

抗体稀释液：含0.1％明胶的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mg TMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5∶1混合即为TMB显色液，现用现混。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

仲丁灵抑制率检测方法：通过棋盘试验选择ic-ELISA中最合适的抗原和抗体浓度。用碳酸盐缓冲液(CBS)将抗原稀释至0.01，0.03，0.1和0.3μg/mL，并用抗体稀释液将抗体稀释至0.01，0.03，0.1和0.3μg/mL。选择最佳工作点后，将仲丁灵标准品稀释为8个浓度(0，0.6，2，6，20，60，180，540ng/mL)，按照ic-ELISA操作步骤，最后用OriginPro8.5做图(结果如图1所示)，获得仲丁灵标准抑制曲线，计算IC₅₀。

实施例1仲丁灵半抗原衍生步骤

衍生步骤如图1所示，包括以下步骤：

1.将6-氨基己酸(1eq)溶于无水甲醇中，在冰浴下逐渐滴加SOCl₂(2eq)，常温过夜或回流8h，反应后直接真空旋蒸蒸干溶剂，得到白色固体a(产物a，即氨基酸甲酯盐酸盐)备用。

2.将2-羟基-5-叔丁基-1，3-二硝基苯(1eq)溶解于甲苯中，加入DMF和SOCl₂(3eq)混合回流8h后冷却，旋蒸去除甲苯，残留液倒入水中，过滤，固体用水和石油醚洗至滤液无色，得到粗产物为褐黄色固体b(产物b，即2-氯-5-叔丁基-1，3-二硝基苯)。

3.取干燥圆底烧瓶加入产物b即2-氯-5-叔丁基-1，3-二硝基苯(1eq)，用THF溶解并加入(iPr)2EtN(2.1eq)，得产物b的THF溶液；步骤1中得到的产物a即氨基酸甲酯盐酸盐(3eq)用水溶解，浓氨水调节PH＝8.5，加入氯仿萃取，有机相旋干得到无色或淡黄色液体，用注射器注入圆底烧瓶中，与上述的产物b的THF溶液室温搅拌24h，柱色谱纯化得到产物c即6-((4-(叔丁基)-2，6二硝基苯基)氨基)己酸甲酯。

4.产物c加入圆底烧瓶，加入LiOH(2eq)，THF和H₂O(体积比为3∶1)室温搅拌，TLC监测至水解完成，加1M HCl调PH＝5，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，旋干得产物d，即为仲丁灵半抗原。

需要说明的是，如无特殊说明，上述衍生步骤中涉及到的当量比eq均指摩尔比。

产物d的LC-MS表征如图2所示，说明仲丁灵半抗原成功制备，结构式如下式(I)：

实施例2：仲丁灵完全抗原的合成

完全抗原包括免疫原和包被原，其中，免疫原用于动物免疫，包被原用于后续的试剂盒检测时包板使用，先包板再用于抗体检测。仲丁灵免疫原和仲丁灵包被原的制备方法分别如下：

1.仲丁灵免疫原的合成

称取实施例1制备得到的1mg(0.003mmo1)仲丁灵半抗原，1mg(0.009mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于300μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应5min；再加入1.6mg(0.009mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，室温搅拌反应6-8h(称为A液)。取6mg(0.00009mmol)BSA，用0.01M碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至3mg/mL(称为B液)，再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应12h；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到仲丁灵免疫原，用于后续的实施例3步骤(1)动物免疫。

2.仲丁灵包被原的合成

将实施例1制备得到的1.4mg(0.004mmol)仲丁灵半抗原、1.4mg(0.012mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于300μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应5min；再加入2.3mg(0.012mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，室温搅拌反应6-8h(称为A液)。取6mg(0.00013mmol)OVA，用0.01M碳酸盐缓冲液(CBS)稀释至3mg/mL(称为B液)，再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应12h；将反应液用0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS透析3d除去未反应的小分子，得到仲丁灵包被原，用于后续的实施例6抗体检测应用中步骤(1)包被。

所制得的仲丁灵完全抗原结构式如下式(Π)所示：

实施例3：分泌抗仲丁灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备

(1)动物免疫的获得：将实施例2制得的仲丁灵免疫原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫(冲刺免疫除外)；首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只；首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天；通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；

(2)细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为1500)方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、断尾取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心(1200rpm，8min)，用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；

b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO₂培养箱中培养，融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到(1～4)×10⁷，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期，融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、融合过程7min：第1min，将1mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置；第3min和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640培养基；第7min，每10s滴加1mL的RPMI-1640培养基；然后37℃温浴5min；离心(800rpm，8min)，弃上清，重悬入含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

3、细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20％胎牛血清、1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选；

筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用仲丁灵为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定；

选择对仲丁灵标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测；

按上述方法进行三次亚克隆，最终获得仲丁灵单克隆抗体细胞株，于2021年12月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称单克隆细胞株BZD，保藏编号为CGMCC No.45018，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例4：仲丁灵单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶仲丁灵杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。

在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M的PBS溶液(pH7.4)溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。

使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG2b型。

使用间接竞争ELISA，测得仲丁灵单克隆抗体的IC₅₀值为12.7ng/mL，如表1所示。

表1仲丁灵单克隆抗体的交叉反应性

从表1的结果可以看出，该单克隆抗体对其他类似物没有交叉，说明对仲丁灵有很好的灵敏度和特异性，可用于仲丁灵免疫分析检测。

实施例6：仲丁灵单克隆抗体的应用

将实施例5得到的单克隆抗体应用于仲丁灵的ELISA检测试验，具体步骤如下：

(1)将用碳酸盐缓冲液(CBS)稀释好的浓度为0.03μg/mL的包被原(即为实施例2制得的仲丁灵包被原)包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(2)用含0.2％明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

(3)用磷酸盐缓冲液(PBS)分别配置0，0.6，2，6，20，60，180，540ng/mLng/mL的仲丁灵标准溶液，将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL稀释至0.3μg/mL的抗仲丁灵单克隆抗体，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

(4)每孔加入100μL用含0.1％明胶的PBS以1∶3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

(5)每孔加入100μL的TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M的H₂SO₄终止液，450nm测吸光值；

采用ic-ELISA检测对仲丁灵的灵敏度，如图3所示，根据所得到的标准方程，用ic-ELISA测定单克隆抗体对仲丁灵的IC₅₀为12.7ng/mL，说明对仲丁灵有很好的灵敏度，可用于仲丁灵免疫分析检测。

本发明杂交瘤细胞株分泌产生的抗仲丁灵单克隆抗体，对仲丁灵具有较好亲和力和较高灵敏度，尤其对仲丁灵的50％抑制浓度IC₅₀达到12.7ng/mL，可用于制备仲丁灵的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条、检测板、试剂等检测主体，用于食品安全检测中仲丁灵残留的分析检测，尤其为食品中仲丁灵的检测提供有力的检测方法及手段。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一株分泌抗仲丁灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株BZD，保藏日期为2021年12月16日，保藏编号为CGMCCNo.45018。

2.仲丁灵单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.45018的杂交瘤细胞株BZD分泌产生。

3.权利要求2所述仲丁灵单克隆抗体的应用，其特征在于，建立抗仲丁灵含量的免疫检测方法，用于食品中仲丁灵残留的检测。

4.根据权利要求3所述仲丁灵单克隆抗体的应用，其特征在于：采用仲丁灵单克隆抗体制备仲丁灵的免疫检测试剂盒、检测板或胶体金试纸条用于检测。

5.根据权利要求3所述仲丁灵单克隆抗体的应用，其特征在于，所述检测主体还包括仲丁灵包被原，所述仲丁灵包被原由仲丁灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白包括KLH、BSA、OVA其中任意一种。