CN112625135A - 一种三氯杀螨醇单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种三氯杀螨醇单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三氯杀螨醇单克隆抗体及其应用，该抗体包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO：1所示、CDR2序列如SEQ ID NO：2所示、CDR3序列如SEQ ID NO：3所示；重链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO：4所示、CDR2序列如SEQ ID NO：5所示、CDR3序列如SEQ ID NO：6所示。该抗体对三氯杀螨醇具有较好的检测灵敏度和添加回收率，可实现对农产品中三氯杀螨醇残留量的检测，为三氯杀螨醇残留量的免疫检测提供了原料。并且首次测得该抗体的可变区基因序列，为后续抗体试剂应用于检测试剂盒时采用规模化表达生产提供了序列基础。

Description

一种三氯杀螨醇单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于农药残留免疫分析技术领域，具体涉及一种三氯杀螨醇单克隆抗体及其应用。
背景技术
三氯杀螨醇 (Dicofol)属于有机氯杀虫剂，主要用于防治棉花、果树、花卉的多种害螨。然而，三氯杀螨醇的残留对鱼类、爬行类、鸟类、哺乳类和人类有毒性和雌激素效应，对水生生物有极高毒性。
目前，对三氯杀螨醇残留的检测方法主要是仪器分析方法，包括气相色谱法(Gaschromatography，GC)、气相色谱-质谱串联法(GC-MS)等。这些方法结果可靠，灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考。但由于需要昂贵的仪器、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、成本高、时间长，因此不能更好地满足快速简便的现场检测要求。
与仪器分析方法相比，免疫检测方法因其简便、经济、快速等优点而在农药残留检测领域中受到越来越多的关注。ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)方法是常用的免疫检测方法，但是其却有操作步骤相对较多，检测时间较长，检测结果不够直观，不能在线进行检测等缺陷。因而ELISA在三氯杀螨醇的快速检测上的应用受到很大的限制。胶体金试纸条无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟即可判定结果，不仅操作简便、快速，且结果直观准确、成本低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三氯杀螨醇单克隆抗体及其应用，该抗体对三氯杀螨醇具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立三氯杀螨醇的免疫学检测方法。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种抗三氯杀螨醇的单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，其中，
所述轻链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO：1所示；
所述轻链可变区的CDR2序列如SEQ ID NO：2所示；
所述轻链可变区的CDR3序列如SEQ ID NO：3所示；
所述重链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO：4所示；
所述重链可变区的CDR2序列如SEQ ID NO：5所示；
所述重链可变区的CDR3序列如SEQ ID NO：6所示。
以上所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
本发明所述的单克隆抗体在制备三氯杀螨醇免疫检测产品中的应用。
抗三氯杀螨醇单克隆抗体的制备步骤为：
（1）免疫原的制备：以三氯杀螨醇为原料，将三氯杀螨醇与琥珀酸酐进行反应得到三氯杀螨醇半抗原琥珀酸酯，再利用活泼酯法将半抗原与KLH反应制备免疫原；利用活泼酯法制备包被抗原，方法与免疫原相同，用BSA代替KLH。
（2）小鼠的免疫：将免疫原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周；第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；
（3）细胞融合与单克隆抗体的制备：通过聚乙二醇（PEG 2000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨
髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株；使用特异性的细胞株制备腹水并用Protein A进行抗体纯化，之后用超滤离心管去盐，冷冻抽干获得干粉状抗体，并于-20 ℃冻存备用。
有益效果：本发明提供了一种三氯杀螨醇单克隆抗体及其应用，该抗体对三氯杀螨醇具有较好的检测灵敏度（IC50值为1.38ng/mL），添加回收率为90-108%，可实现对农产品中三氯杀螨醇残留量的检测，为三氯杀螨醇残留量的免疫检测提供了原料，具有重要的实际应用价值。并且首次测得该抗体的可变区基因序列，为后续抗体试剂应用于检测试剂盒时采用规模化表达生产提供了序列基础。
附图说明
图1 为实施例中三氯杀螨醇检测的抑制曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 杂交瘤细胞株的制备
（1）完全抗原的制备
将三氯杀螨醇2g、琥珀酸酐4g、无水吡啶1mL进行混合，于95℃下磁力搅拌反应4h，将反应物降至室温，减压蒸馏去除吡啶，加入10mL冰水，然后加入氯仿进行萃取，分离有机层，重复萃取一次，得到三氯杀螨醇半抗原琥珀酸酯。
利用活泼酯法制备免疫抗原。分别称取0.1 mmol 半抗原与0.1 mmol NHS，用600μL DMF溶解于反应装置中；称取0.1 mmol DCC，用400 μL DMF溶解；将DCC/DMF溶液缓慢滴加到上述反应装置中。在磁力搅拌下室温密封反应7小时。反应终液置4 ℃冰箱冷却2小时以上，经8000 rpm离心5分钟，取上清活泼酯液十分缓慢的加入到5 mL 15 mg/mL的KLH蛋白中，反应在磁力搅拌下室温搅拌4小时。待反应完成后，将反应液置于透析袋内，于0.02mol/L pH7.4的PBS缓冲液中4 ℃搅拌透析，每四小时换一次透析液，共透析60小时。透析结束后将透析袋中的液体取出，经4 ℃ 12000 rpm离心5分钟，取上清分装保存于-20 ℃冰箱中。
利用活泼酯法制备包被抗原。方法与免疫抗原相同，用BSA代替KLH。
（2）动物免疫
选择的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫，将以上制得的1mg/mL的完全抗原与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后21天冲刺免疫，准备融合。
（3）细胞融合
在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（分子量为2000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，
将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到1-4*107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、将脾细胞和SP2/0细胞按照计数比1：10 的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
（4）细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步以三氯杀螨醇作为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得抗三氯杀螨醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
实施例2 抗三氯杀螨醇单克隆抗体的制备
取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
实施例3 抗三氯杀螨醇单克隆抗体灵敏度的鉴定
（1）包被：将包被原用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液从12ng/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
（2）洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
（3）封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h，洗涤后烘干备用；
（4）加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应
30min。
（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应
15min；
终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。图1为测得的抑制曲线图，其R2＝0.991，Y=0.065+1.35/（1+（X/1.427）2.689），IC50为：1.38ng/mL，
（6）对三氯杀螨醇的灵敏度较好，可用于三氯杀螨醇分析检测。
实施例4 添加回收实验
以阴性水作为实验样本，向阴性样本中添加不同含量的三氯杀螨醇标准品，按照实施例2的步骤进行标准曲线的测定和检测样本的测定，结果如表1所示，从表1中得出，三氯杀螨醇的回收率在90％-108％，符合样本的添加回收要求。
表1 添加回收结果（n=5）
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE001
实施例5 三氯杀螨醇单克隆抗体的氨基酸序列测序及分析
将筛选到的最佳的杂交瘤细胞株交于抗体序列测序服务公司测得抗体的氨基酸序列，所得单克隆抗体的具体序列如下：
抗体轻链可变区氨基酸序列为：
ASSKSTCKSQGAPESSLEHYKPATDSQRSFSEAIMHPKYSWCYRYKTLPGTFGSGGWMTYRWTIVISAVSAPSGMAGWAGYSLTQEISTDSYMKGTSAQGSY（SEQ ID NO：7）。
轻链可变区的CDR1序列为：RSFSEAI（SEQ ID NO：1）；
轻链可变区的CDR2序列为：FGSGGW（SEQ ID NO：2）；
轻链可变区的CDR3序列为：TQEISTDS（SEQ ID NO：3）；
抗体重链可变区氨基酸序列为：
QSGPSLSYTLTKNATYYLTCSSGETEYDTDNWFPMQCYSYDNGVVITTKSKIQLTKILQVKNGYTQVNWWSVYNGGKANRGIRYLRGINYNYFDGYTWQSGSSISRDLVSSQLPFLTFSGPSKLV（SEQ ID NO：8）；
重链可变区的CDR1序列为：DTDNWF（SEQ ID NO：4）；
重链可变区的CDR2序列为：IQLTKIL（SEQ ID NO：5）；
重链可变区的CDR3序列为：IRYLRGIN（SEQ ID NO：6）。
序列表
<110> 苏州快捷康生物技术有限公司
<120> 一种三氯杀螨醇单克隆抗体及其应用
<141> 2020-11-27
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 1
Arg Ser Phe Ser Glu Ala Ile
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 2
Phe Gly Ser Gly Gly Trp
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 3
Thr Gln Glu Ile Ser Thr Asp Ser
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 4
Asp Thr Asp Asn Trp Phe
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 5
Ile Gln Leu Thr Lys Ile Leu
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 6
Ile Arg Tyr Leu Arg Gly Ile Asn
1 5
<210> 7
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 7
Ala Ser Ser Lys Ser Thr Cys Lys Ser Gln Gly Ala Pro Glu Ser Ser
1 5 10 15
Leu Glu His Tyr Lys Pro Ala Thr Asp Ser Gln Arg Ser Phe Ser Glu
20 25 30
Ala Ile Met His Pro Lys Tyr Ser Trp Cys Tyr Arg Tyr Lys Thr Leu
35 40 45
Pro Gly Thr Phe Gly Ser Gly Gly Trp Met Thr Tyr Arg Trp Thr Ile
50 55 60
Val Ile Ser Ala Val Ser Ala Pro Ser Gly Met Ala Gly Trp Ala Gly
65 70 75 80
Tyr Ser Leu Thr Gln Glu Ile Ser Thr Asp Ser Tyr Met Lys Gly Thr
85 90 95
Ser Ala Gln Gly Ser Tyr
100
<210> 8
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 8
Gln Ser Gly Pro Ser Leu Ser Tyr Thr Leu Thr Lys Asn Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Tyr Leu Thr Cys Ser Ser Gly Glu Thr Glu Tyr Asp Thr Asp Asn Trp
20 25 30
Phe Pro Met Gln Cys Tyr Ser Tyr Asp Asn Gly Val Val Ile Thr Thr
35 40 45
Lys Ser Lys Ile Gln Leu Thr Lys Ile Leu Gln Val Lys Asn Gly Tyr
50 55 60
Thr Gln Val Asn Trp Trp Ser Val Tyr Asn Gly Gly Lys Ala Asn Arg
65 70 75 80
Gly Ile Arg Tyr Leu Arg Gly Ile Asn Tyr Asn Tyr Phe Asp Gly Tyr
85 90 95
Thr Trp Gln Ser Gly Ser Ser Ile Ser Arg Asp Leu Val Ser Ser Gln
100 105 110
Leu Pro Phe Leu Thr Phe Ser Gly Pro Ser Lys Leu Val
115 120 125

Claims (3)

1.一种抗三氯杀螨醇的单克隆抗体，包括轻链可变区和重链可变区，其特征在于：
所述轻链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO：1所示；
所述轻链可变区的CDR2序列如SEQ ID NO：2所示；
所述轻链可变区的CDR3序列如SEQ ID NO：3所示；
所述重链可变区的CDR1序列如SEQ ID NO：4所示；
所述重链可变区的CDR2序列如SEQ ID NO：5所示；
所述重链可变区的CDR3序列如SEQ ID NO：6所示。
2. 根据权利要求1所述的一种抗三氯杀螨醇的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
3.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备三氯杀螨醇免疫检测产品中的应用。
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