KR101491835B1

KR101491835B1 - 하이브리도머 세포주 10g4 및 그가 생성하는 항아플라톡신 b1, b2, g1, g2 총량 모노클론 항체

Info

Publication number: KR101491835B1
Application number: KR1020137019060A
Authority: KR
Inventors: 페이우 리; 신인 리; 치이 장; 쇼우샤 딩; 워언 장; 라안 리; 조오위 장
Original assignee: 중국농업과학원유료작물연구소
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2013-01-17
Publication date: 2015-02-23
Also published as: WO2013155882A1; US8841419B2; KR20130127998A; CN102747042A; US20140057294A1; NZ613306A; CN102747042B

Abstract

본 발명은 하이브리도머 세포주 10g4 및 그가 분비 생성하는 항아플라톡신 총량 모노클론 항체에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 하이브리도머 세포주 10G4(CCTCC NO. C201016)는 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체를 제조하는데 사용될 수 있으며, 또한 일반적인 비경쟁 효소결합 면역 흡착 분석(ELISA) 법으로 측정한 10G 4의 쥐 복수 항체의 역가는 5.12×10⁵에 달할 수 있다. 본 발명이 제공하는 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체는 아플라톡신 B1, B2, G1, G2를 일관성있게 식별할 수 있으며, 아플라톡신 B1, B2, G1, G2에 대한 50% 억제 농도 IC₅₀ 은 순서대로 2.09ng/mL, 2.23ng/mL, 2.19ng/mL, 3.21ng/mL이며, 아플라톡신 B1, B2, G1, G2에 대한 교차반응률 범위는 65.2%~100%이다. 또한, 이는 아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량을 정량 측정하는데 응용될 수 있다.

Description

하이브리도머 세포주 10G4 및 그가 생성하는 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체{A hybridoma cell line 10G4 and a monoclonal antibody against the total of aflatoxin B1, B2, G1 and G2}

본 발명은 하이브리도머 세포주 10G4 및 그가 생성하는 항아플라톡신 총량 모노클론 항체에 관한 것이다.

아플라톡신은 주로 아스퍼질루스 플라부스와 아스퍼질루스 파라시티커스로부터 분비되어 생성되는 이차 대사산물로서, 사람과 가축에게 각종 손상을 입힐 수 있는 천연 유독 화합물이다. 아플라톡신의 품종은 비교적 많은데, 지금까지 20여종이 이미 발견되었다. 아플라톡신은 오염범위가 넓고, 독성이 강하며, 위해가 심각하다는 등의 특징이 있다. 따라서, 전세계적으로 지금까지 적어도 70여 국가에서 농산품 및 식품 중 아플라톡신 제한량 표준을 확정해 놓았으며, 많은 국가들은 더 나아가 주요 아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량의 제한량 표준을 확정하였다. 따라서 아플라톡신 총량 분석 방법이 특히 중요하다는 것을 분명히 알 수 있다.

종래의 아플라톡신의 검출방법에는 박층 크로마토그래피법, 정밀기기 분석법 및 면역학 분석법이 있는데, 그 중 박층 크로마토그래피법은 아플라톡신을 검출하는데 가장 흔히 사용되는 검출방법으로서, 특수한 기기 설비가 필요 없고, 일반 실험실에서 모두 실시 가능하다. 그러나 시제의 용량이 크고 조작이 번거로우며, 기타 성분의 간섭이 심하고 정확성이 떨어져 정확하게 양을 정할 수 없을 뿐만 아니라, 실험자와 주변 환경오염에 대한 위험성이 커서 현장에서 신속하게 검출하기에 적합하지 않다. 정밀기기 분석법은 형광분광 광도법과 고효율 액상 크로마토그래피법을 포함하는데, 감도가 높고 정확성이 우수하나 기기가 비싸고 아플라톡신 샘플의 순화 정도에 대한 요구가 높으며, 샘플의 예처리 과정이 번거롭고 소모 시간이 길며, 실험 환경에 대한 요구가 높아 신속한 검출을 실현하기 어렵다. 최근 발전된 면역분석 기술은 전술한 양자의 단점을 극복하여 특이성이 강하고, 감도가 높으며, 샘플의 예처리가 간단하고 원가가 낮으며, 실험자와 주위 환경에 대한 오염의 위험이 작아 현장에서 대량으로 검출하기 적합하다는 등의 장점을 갖추었다.

면역분석은 항원과 항체의 특이성 반응과 항체(또는 항원) 상의 표지물의 생물, 물리 또는 화학 증폭 작용을 이용하여 초미량 잔류물질에 대하여 성질, 수량 검출을 실시하기 때문에, 아플라톡신 총량 분석방법 중 어느 한 가지 면역학 검출 기술을 연구 구축하려면 반드시 항아플라톡신 B1, B2, G1, G 2 총량의 항체를 먼저 제조해야 한다. 사실 국내 또는 국외를 막론하고 아플라톡신 항체의 연구 제조에 대한 보고가 매우 많고, 아플라톡신의 일반 항체 역시 보고된 바 있으며, 심지어 개별적인 학자 중에는 아스퍼질루스 플라부스 일반 항체를 아플라톡신 총량 분석 방법을 구축하는데 사용하기도 하였다. 아플라톡신 일반 항체는 주로 항체가 각종 아플라톡신에 대해 비교적 강력한 특이성 결합 반응을 발생시킬 수 있어, 각 아플라톡신마다 면역 분석 방법을 개별적으로 구축하는데 사용될 수 있음을 강조하고 있다. 그런데 아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 항체는 항체가 각종 아플라톡신에 대하여 비교적 강력한 특이성 결합반응을 발생시킬 수 있음을 강조할 뿐만 아니라, 또한 상기 항체를 응용하여 구축한 각종 아플라톡신의 면역분석방법의 감도에 대한 일관성이 강해야 한다는 것도 더 강조하였다. 국내외에서 종래에 보고된 아플라톡신 일반 항체의 통용성은 비교적 강하나, 단 각종 아플라톡신의 분석 감도의 일관성이 통상적으로 나쁜 편이기 때문에, 이러한 보고된 아플라톡신 일반 항체는 아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 분석 방법을 사용하기에 적합하지 않으며, 설사 아플라톡신 총량 분석방법을 구축하였더라도, 그 정량 분석의 정확성 역시 크게 떨어질 수 있다. 따라서, 아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 항체를 연구 제조하는 것은 아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 면역의 신속한 정량 검출을 실현하는데 있어서 중요한 의미를 지니게 되었다.

본 발명이 해결하고자 하는 문제는 하이브리도머 세포주 10G4 및 그가 생성하는 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체를 제공하고자 하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 하이브리도머 세포주 10G4를 제공하였으며, 상기 세포주는 이미 기탁기관에 보관되어 있다. 기탁기관은 중국 무한의 무한대학 소재의 중국 전형배양물 보존센터(CCTCC)이고, 보관센터수탁번호는 CCTCC NO. C201016이며, 수탁연월일은 2010년 7월 13일이며, 배양물 명칭은 작은 쥐의 하이브리도머 세포 10G4이다. 이는 서열표 중 SEQ ID NO.1로 표시된 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체의 중사슬 가변영역 암호화 유전자 서열과 서열표 중 SEQ ID NO.2로 표시된 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체 경사슬 가변영역 암호화 유전자 서열을 구비한다.

항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체는, 저장번호가 CCTCC NO. C201016인 하이브리도머 세포주 10G4에 의해 분비되어 생성된다. 그 중사슬 가변영역은 서열표 중 SEQ ID NO.3로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 있다.

경사슬 가변영역은 서열표 중 SEQ ID NO.4로 표시되는 아미노산 서열을 갖고 있다.

본 발명에서 제공하는 하이브리도머 세포주 10G4는 투스텝 선별법을 통해 획득된다. 그 구체적인 단계는 아래와 같다.

BALB/c 작은 쥐를 아플라톡신 완전항원 AFB1-BSA에 4-6회 면역시킨 후, 전회 면역제 투여양의 두 배인 아플라톡신 완전항원 AFB1-BSA로 마지막회에 면역을 보강하고, 3일 후 세포 융합을 실시한다. ELISA 방법으로 두 단계로 나누어 융합 세포를 선별한다. 제1단계는 간접 ELISA법으로 아플라톡신 B1에는 저항하나 수송단백질 BSA에는 저항하지 않는 양성 웰을 선별한다. 두 번째 단계에서 간접 경쟁 ELISA법을 사용하여, 제1 단계에서 선별한 양성 웰 배양액에 대하여 검출을 실시한다. 국내외에서 종래에 보고된 아플라톡신 일반 항체의 아플라톡신 G2에 대한 교차반응률은 가장 작기 때문에（<50%）, 아플라톡신 G2를 경쟁원으로 삼아, 흡광치와 감도가 모두 비교적 높은 웰을 선택하여, 제한희석법으로 클로닝을 실시하며, 클로닝 후 10일 정도에 동일한 투스텝 선별법으로 검출을 실시한다. 이와 같이 2-3회 클로닝을 반복 실시한 후, 최종적으로 하이브리도머 세포주 10G4를 획득한다.

항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체를 아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 측정에 응용한다.

본 발명에서 제공하는 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체의 제조방법은 단계가 다음과 같다.먼저 프로인트 불완전 보조제로 처리한 BALB/c 작은 쥐에게 하이브리도머 세포주 10G4를 주입시키고, 상기 작은 쥐의 복수를 수집하며, 순화시켜 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체를 획득한다.

상기 방법에 따르면, 상기 순화방법은 카프릴산-황산암모늄법으로서, 구체적인 절차는 아래와 같다. 이중 여과지로 작은 쥐의 복수를 여과한 후, 4℃에서 12000r/min로 15min 이상 원심분리하여, 상청액을 흡취한 후, 획득한 복수 상청액을 4배 부피의 초산염 완충액과 혼합시킨다. 교반하면서 천천히 n-카프릴산을 투입하되, 복수 1ml당 필요한 n-카프릴산의 부피는 30~35μL이며, 실온에서 30~60min간 혼합시키며, 4℃에서 2h 이상 정지시킨다. 그 후에 4℃, 12000r/min로 30min 이상 원심분리하고, 침전물을 버린 후, 획득된 상청액을 이중 여과지로 여과한 후, 1/10 여과액 부피의 몰 농도가 0.1mol/L 및 pH값이 7.4인 인산염 완충액을 첨가시키며, 2mol/L의 수산화나트륨 용액으로 상기 혼합액의 pH 값을 7.4로 조절시키며, 4℃에서 예비냉각시키며,, 황산암모늄을 최종농도가 0.277g/mL이 될 때까지 천천히 투입시키며, 4℃에서 2h 이상 정지시킨다. 그 후에 4℃, 12000r/min으로 30min 이상 원심분리시키고, 상청액을 버린 후, 획득된 침전액을 원 복수 부피의 1/10인 0.01mol/L의 인산염 완충액으로 재부유시킨 후, 투석주머니에 담그며, 순수를 투석시켜, 충분히 투석된 단백용액을 -70℃의 냉동실에 넣어 냉동시킨 후, 냉동건조기로 냉동건조시키며, 냉동건조 분말을 수집하여, 순화된 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체를 획득하며, 항체를 -20℃의 냉동실에 저장시킨다..

상기 초산염 완충액은 0.29g의 초산나트륨이며, 이는 0.141mL 초산에 물을 첨가하여 부피가 100mL에 이르면 된다. 상기 0.1mol/L의 인산염 완충액은 0.8g의 염화나트륨, 0.29g의 인산수소이나트륨 12수화물, 0.02g의 염화칼륨, 인산이수소칼륨 0.02g이며, 이는 물을 첨가하여 부피가 100mL에 이르면 된다.

본 발명의 효과는 아래와 같다.

(1) 본 발명이 제공하는 하이브리도머 세포주 10G4는 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체의 제조에 사용될 수 있다. 일반적인 비경쟁 효소결합 면역흡착 분석(ELISA)법으로 측정한 10G4의 쥐복수 항체의 역가는 5.12×10⁵에 달할 수 있다.

(2) 본 발명이 제공하는 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체는 아플라톡신 B1, B2, G1, G2를 일관성있게 식별할 수 있으며, 아플라톡신 B1, B2, G1, G2에 대한 50% 억제 농도 IC₅₀ 은 순서대로 2.09ng/mL, 2.23ng/mL, 2.19ng/mL, 3.21ng/mL이며, 아플라톡신 B1, B2, G1, G2에 대한 교차반응률 범위는 65.2%~100%이다.

(3) 본 발명이 제공하는 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체는 아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량의 정량 측정에 응용될 수 있다.

실시예 1

하이브리도머 세포주 10G4의 제조

1. 동물 면역

6주령의 BALB/c 작은 쥐 6마리를 구입하여, 시중의 아플라톡신 B1 완전항원 AFB1-BSA로 면역한다. 1차 면역은 아플라톡신 B1 완전항원과 동일한 량의 프로인트 완전 보조제를 유화시킨 후, 작은 쥐의 목 뒷부분 피하에 다점 주사시킨다. 2차 면역은 4주 후에 실시한다. 프로인트 불완전 보조제와 동일한 량의 아플라톡신 B1 완전항원을 유화시킨 후, 작은 쥐의 복강에 주사시킨다. 3차 면역과 2차 면역의 간격은 4주이며, 면역 방식은 같다. 4차 면역은 3차 면역의 3주 후에 실시하며, 면역 방식은 2차 면역과 같으며, 즉 복강에 주사시킨다. 4회 면역제 투여량은 같으며, 모두 쥐 1마리당 50μg을 투여한다. 앞의 3회는 매회 면역 후 8일에 꼬리의 정맥에서 채혈하여 혈청을 분리하고, 간접 ELISA법으로 작은 쥐의 혈청 역가를 검측한다. 4회는 면역 후 8일에 꼬리의 정맥에서 채혈하여 혈청을 분리하고, 간접 ELISA법으로 작은 쥐의 혈청 역가를 검측하며, 동시에 간접 경쟁 ELISA법으로 작은 쥐의 혈청 영민도를 측정하여, 역가를 선별하며, 영민도가 비교적 높은 혈청에 대응되는 작은 쥐를 선택하여 마지막 회에 면역제 투여량을 이전의 2배로 하여 면역을 보강한다. 아플라톡신 B1 완전항원 AFB1-BSA는 Sigma-Aldrich사에서 구입하였다.

2. 세포 융합

마지막회에 면역을 보강한지 3일 후, 50%(중량백분비)의 폴리에틸렌글리콜, 즉 PEG(분자량은 1450)를 융합제로 사용하여, 일반적인 방법으로 세포 융합을 실시하였다. 구체적인 단계는: 무균 조건에서 면역된 작은 쥐를 죽여 비장 세포를 분리시키고, 쥐 골수종 세포 SP2/0와 5:1의 개수 비율로 혼합시키며, RPMI-1640 기초배양액으로 혼합 세포를 세척한 후 50%의 PEG로 1분 동안 융합시킨다. 그 후에 RPMI-1640 기초 배양액을 가득 채우고, 원심분리하여 상청액을 제거한 후, 작은 쥐의 비장세포와 마우스 골수종 세포 SP2/0이 형성한 융합세포를 72mL RPMI-1640 기초배양액으로 재부유시키며, 재부유된 세포를 96웰의 세포 배양판 내에 적가시키며, 2방울/웰, 37℃의 이산화탄소 배양상자에 담아 배양시킨다. 상기 RPMI-1640 기초배양액은 20%(부피백분율)의 소태아혈청, 2%(중량백분율)의 생장인자 및 1%(중량백분율)의 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 즉 HAT를 함유한다. 상기 SP2/0은 상해 판켈 생물기술 유한회사에서 구입하였고, RPMI-1640 기초배양액은 Hyclone사에서 구입하였으며, 1%의 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 즉 HAT는 Sigma-Aldrich사에서 구입하였다.

3. 세포주의 선별 및 클로닝

세포 융합 후 12일째 정도에, 세포군체가 웰 바닥의 1/2 크기를 차지할 정도로 자라고, 배양액이 누렇게 변하면 항체 검측을 실시할 수 있다. ELISA 방법을 사용하여 하이브리도머 세포가 생장한 배양웰에 대하여 선별을 실시하며, 선별은 두 단계로 나누어 진행한다. 제 1단계는 간접 ELISA법으로 아플라톡신 B1에는 저항하나 수송단백 BSA에는 저항하지 않는 양성 웰을 선별한다. 두 번째 단계에서 간접 경쟁 ELISA법을 사용하여 제 1단계에서 선별한 양성 웰 배양액에 대하여 검측을 실시하며, 아플라톡신 G2를 경쟁원으로 삼아, 흡광치와 영민도가 모두 비교적 높은 웰을 선택하여(흡광치가 높다는 것은 경쟁원이 0인 웰, 즉 양성 대조 웰의 최종 측정치가 높다는 것이다. 영민도가 높다는 것은 억제율이 50%일 때의 경쟁원 농도, 즉 IC₅₀치가 작다는 것이다), 제한희석법으로 클로닝을 실시하며, 클로닝 후 10일 정도에 동일한 투스텝 선별법으로 검측을 실시한다. 이와 같이 2-3회 클로닝을 반복 실시한 후, 하이브리도머 세포주 10G4를 획득한다.

실시예 2

항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체 하이브리도머 세포주계 10G4 항체 가변영역 서열 측정

(1) 총 RNA 추출: Tiangen사의 총RNA 추출 시제 키트를 사용하여 설명서에 따라 하이브리도머 세포주계 10G4를 생산할 수 있는 총 RNA를 추출한다.

(2) cDNA 합성: 단계 1에서 획득한 총 RNA를 견본으로 , oligo(dT)₁₅를 프라이머로 하여, SuperScript™-2 Ⅱ 역전사효소 설명서에 따라 역전사를 실시하며, cDNA 제1 사슬을 합성한다. 프라이머 oligo(dT)₁₅는 Invitrogen에서 구입하였다.

(3) PCR법으로 가변영역 유전자 클로닝: GENEBANK에서 작은 쥐항체 유전자 서열의 보수 위치점을 근거로 프라이머를 설계하여, cDNA를 견본으로 항체의 경, 중사슬 가변영역 유전자를 확장한다. PCR 프로그램은: 94℃ 30s, 55℃ 1min, 72℃ 1min으로 30개의 사이클을 확장하고, 마지막으로 72℃에서 10min 동안 연장한다. PCR 생성물은 1%(중량백분율)의 아가로오스 겔 전기냉동을 거쳐 분리시킨 후, 시제키트로 순화시켜 DNA 세그먼트를 회수하여, 매체 pMD18-T에 연결시키며, 대장간균 DH5α 수용세포로 전환시켜, 양성 클론을 선별한 후, 상해 Sunny 생물기술 유한회사로 보내어 서열 측정을 실시한다. 그 중 프라이머의 서열은 각각: 중사슬 가변영역의 프라이머는 5·-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3(22mer) 및 5·-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3(32mer)이며, 그 중 S, M, R과 W는 축퇴염기로서, M=A/C, R=A/G, S=C/G, W=A/T이며, 경사슬 가변영역 프라이머는 5·-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC -3·(24mer) 및 5·-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3·(24mer)이다.

획득된 유전자 서열 결과는 아래와 같다. 중사슬 가변영역 인코딩 유전자 서열의 길이는 356bp이고, 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되며, 획득된 유전자 서열을 근거로 상기 유전자 서열은 암호화된 중사슬 가변영역이 118개의 아미노산으로 조성된 것을 도출하였으며, 서열은 SEQ ID NO:3으로 표시된 바와 같다. 경사슬 가변영역 암호화 유전자 서열의 길이는 332bp이고, 서열은 SEQ ID NO:2에 표시된 바와 같다. 획득된 유전자 서열을 근거로 도출되는 상기 유전자 서열은 인코딩된 경사슬 가변영역이 110개의 아미노산으로 조성된 것을 도출하였으며, 서열은 SEQ ID NO:4에 표시된 바와 같다.

실시예 3

항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체의 제조 순화, 아형 및 특성 감정

실시예 2로 획득된 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체 하이브리도머 세포주 10G4를 미리 프로인트 불완전 보조제로 처리한 BALB/c 작은 쥐에게 주사하여, 작은 쥐의 복수를 수집하며, 카프릴산-황산암모늄법을 사용하여 항체를 순화시킨다. 구체적인 절차는 아래와 같다. 이중 여과지로 작은 쥐의 복수를 여과한 후, 4℃에서 12000r/min로 15min 원심분리시켜, 상청액을 흡취한 후, 획득한 복수 상청액을 4배 부피의 초산염 완충액과 혼합시킨다. 교반하면서 천천히 n-카프릴산을 투입하되, 복수 1ml당 필요한 n-카프릴산의 부피는 33μL이며, 실온에서 30min간 혼합하며, 4℃에서 2h 정지시킨다. 그 후에, 4℃, 12000r/min로 30min간 원심분리하고, 침전물을 버린 후, 획득된 상청액을 이중 여과지로 여과시킨 후, 1/10 여과액 부피의 몰 농도가 0.1mol/L 및 pH값이 7.4인 인산염 완충액을 첨가시키며, 2mol/L의 수산화나트륨 용액으로 상기 혼합액의 pH 값을 7.4로 조절시키며, 4℃에서 예비냉각시키며, 황산암모늄을 최종농도가 0.277g/mL이 될 때까지 천천히 투입시킨다. 4℃에서 2h 정지시키고, 4℃, 12000r/min으로 30min간 원심분리시키며, 상청액을 버린 후, 획득된 침전액을 원 복수 부피의 1/10인 0.01mol/L의 인산염 완충액으로 재부유시키며, 투석주머니에 담그며, 순수에 대하여 투석시켜, 충분히 투석된 단백용액을 -70℃의 냉동실에 넣어 냉동시킨다. 그 후에 냉동건조기에서 냉동건조시키고, 냉동건조 분말을 수집한다. 즉 순화된 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체를 획득하며, 항체를 -20℃의 냉동실에 저장시킨다. 상기 초산염 완충액은 0.29g의 초산나트륨이며, 이는 0.141mL 초산에 물을 첨가하여 부피가 100mL에 이르면 된다.상기 0.1mol/L의 인산염 완충액은 0.8g의 염화나트륨, 0.29g의 인산수소이나트륨 12수화물, 0.02g의 염화칼륨, 인산이수소칼륨 0.02g이며, 이는 물을 첨가하여 부피가 100mL에 이르면 된다.

시중의 아형 감정 시제 키트로, 하이브리도머 세포주 10G4가 분비하는 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체를 감정하는 아형은 IgG1이다.

일반적인 비경쟁 효소결합 면역흡착 분석(ELISA)법으로 10G4를 측정한 쥐 복수 항체의 역가는 5.12×10⁵에 달할 수 있으며, 즉 쥐의 복수 항체를 5.12×10⁵배로 희석했을 때의 용액 측정 결과는 양성이다. 일반적인 간접 경쟁 ELISA법으로 감정한 아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량에 대한 영민도 50% 억제 농도 IC₅₀은 순서대로 2.09ng/mL, 2.23ng/mL, 2.19ng/mL, 3.21ng/mL이며, 아플라톡신 B1, B2, G1, G2에 대한 교차반응률 범위는 65.2%~100%이다.

실시예 4

아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체 10G4의 응용

실시예 3에서 획득한 아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총 4개의 표준 곡선을 평균화 처리하여, 하나의 새로운 정량분석 곡선을 획득하며, 이를 아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 분석 곡선으로 간주한다. 5분량의 땅콩 실제 샘플의 아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 검측에 사용하며, 동시에 GB/T 18979-2003 고효율 액상 크로마토그래피 표준 방법을 사용하여 검측을 비교하였다. 결과는 두 가지 방법의 일관성은 비교적 이상적인 것으로 나타났으며, 상세한 결과는 다음과 같다.

샘플 1: 항체 10G4의 총량 ELISA 방법을 기준으로 검측한 결과는 0.23ng/mL이며, GB/T 18979-2003 고효율 액상 크로마토그래피 표준 방법으로 검측한 결과는 0.2ng/mL이다.

샘플 2: 항체 10G4의 총량 ELISA 방법을 기준으로 검측한 결과는 1.47ng/mL이며, GB/T 18979-2003 고효율 액상 크로마토그래피 표준 방법으로 검측한 결과는 1.2ng/mL이다.

샘플 3: 항체 10G4의 총량 ELISA 방법을 기준으로 검측한 결과는 0.88ng/mL이며, GB/T 18979-2003 고효율 액상 크로마토그래피 표준 방법으로 검측한 결과는 1.1ng/mL이다.

샘플 4: 항체 10G4의 총량 ELISA 방법을 기준으로 검측한 결과는 음성이고, GB/T 18979-2003 고효율 액상 크로마토그래피 표준 방법으로 검측한 결과도 음성이다.

샘플 5: 항체 10G4의 총량 ELISA 방법을 기준으로 검측한 결과는 0.92ng/mL이며, GB/T 18979-2003 고효율 액상 크로마토그래피 표준 방법으로 검측한 결과는 0.8ng/mL이다.

서열표 자유내용

<110> 중국 농업 과학원 유과작물 연구소

<120> 하이브리도머 세포주 10G4 및 그가 생성하는 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체

<160> 4

<210> 1

<211> 356bp

<212> DNA

<213> 작은 쥐

<400> 1

aggtgcagct gcaggagtca gggggaggct tagtgaagcc tggagggtcc 50

ctgaaactct cctgtgcagc ctcaggattc actctcagta gtaatgacat 100

gtcttgggtt cgccagacac cggagaagag gctggagtgg gtcgcaagta 150

ttagtagagg tggtaggtac acctactatc cagacagtgt gaaggggcga 200

ttcaccatct ccagagacaa agccaagaac accctgtatc tgcaaatgaa 250

cagtctgagg tctgaggata cggccatgta ttattgtgca agacactatg 300

gtagctactg gtacttcgat gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 350

tcctca 356

<210> 2

<211> 332bp

<212> DNA

<213> 작은 쥐

<400> 2

ccgtttgatt tccagcttgg tgccccctcc gaacgtgtaa gctccctaat 50

gtgctgacag taataggttg cagcatcctc ctcctccaca ggatggatgt 100

tgagggtgaa gtctgtccca gacccactgc cactgaacct ggcagggacc 150

ccagattcta ggttggatac aagatagatg aggagtctgg gtggctgtcc 200

tggtttctgt tggttccagt gcatataact atagccagat gtactgacac 250

ttttgctggc cctgtatgag atggtggccc tctgccccag agatacagct 300

aaggaagctg gagactgggt gagctcaatg tc 332

<210> 3

<211> 118

<212> PRT

<213> 작은 쥐

<400> 3

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser 1 5 10 15 20

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Tyr Leu Ser Ser Asn Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro 25 30 35 40

Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro 45 50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Tyr Gly

85 90 95 100

Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

105 110 115

<210> 4

<211> 110

<212> PRT

<213> 작은 쥐

<400> 4

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr

1 5 10 15 20

Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn

25 30 35 40

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser

45 50 55 60

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg

85 90 95 100

Ser Glu Gly Ala Pro Ser Trp Lys Ser Asn

105 110

<110> OILCROPS RESEARCH INSTITUTE OF CHINESE ACADAMY OF AGRICULTURE SCIENCE <120> A hybridoma cell line 10G4 and a monoclonal antibody against the total of aflatoxin B1, B2, G1 and G2 <130> PIA1132 <150> CN 201210117612.X <151> 2012-04-20 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 356 <212> DNA <213> mouse <400> 1 aggtgcagct gcaggagtca gggggaggct tagtgaagcc tggagggtcc ctgaaactct 60 cctgtgcagc ctcaggattc actctcagta gtaatgacat gtcttgggtt cgccagacac 120 cggagaagag gctggagtgg gtcgcaagta ttagtagagg tggtaggtac acctactatc 180 cagacagtgt gaaggggcga ttcaccatct ccagagacaa agccaagaac accctgtatc 240 tgcaaatgaa cagtctgagg tctgaggata cggccatgta ttattgtgca agacactatg 300 gtagctactg gtacttcgat gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctca 356 <210> 2 <211> 332 <212> DNA <213> mouse <400> 2 ccgtttgatt tccagcttgg tgccccctcc gaacgtgtaa gctccctaat gtgctgacag 60 taataggttg cagcatcctc ctcctccaca ggatggatgt tgagggtgaa gtctgtccca 120 gacccactgc cactgaacct ggcagggacc ccagattcta ggttggatac aagatagatg 180 aggagtctgg gtggctgtcc tggtttctgt tggttccagt gcatataact atagccagat 240 gtactgacac ttttgctggc cctgtatgag atggtggccc tctgccccag agatacagct 300 aaggaagctg gagactgggt gagctcaatg tc 332 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> mouse <400> 3 Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Tyr Leu Ser Ser Asn Asp 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala 35 40 45 Ser Ile Ser Arg Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg His Tyr Gly Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 110 <212> PRT <213> mouse <400> 4 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 85 90 95 Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Ala Pro Ser Trp Lys Ser Asn 100 105 110

Claims

BALB/c 작은 쥐에 아플라톡신 완전항원 AFB1-BSA를 4 내지 6회 면역시킨 후, 상기 4 내지 6회의 면역 중 마지막회 면역에 사용된 아플라톡신 완전항원 AFB1-BSA의 2배 중량을 투여하고, 1차면역과 2차면역 및 2차면역과 3차면역의 간격은 각각 4주이고, 3차면역과 4차면역의 간격은 3주인 면역단계;
면역된 BALB/c 작은 쥐의 세포를 쥐 골수종 세포와 융합시키는 단계; 및
아플라톡신 G2를 경쟁원으로 이용하여 간접 경쟁 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)를 통하여 아플라톡신 B1, B2, G1 및 G2에 대해 특이적이고 서열번호 3 및 서열번호 4를 포함하는 항체를 생산하는 융합세포를 선별하는 단계;를 포함하고,
상기 항체의 아플라톡신 B1, B2, G1, 및 G2에 대한 50% 억제 농도 (IC₅₀)는 순서대로 각각 2.09ng/mL, 2.23ng/mL, 2.19ng/mL, 및 3.21ng/mL인
중국 전형 배양물 보관 센터에 보관번호 CCTCC NO. C201016로 보관된 하이브리도머 세포주 10G4의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 융합세포가 생산하는 항체는 모노클론 항체인 것을 특징으로 하는 하이브리도머 세포주 10G4의 제조방법.
제 2항에 있어서,
상기 항체는 아플라톡신 B1, B2, G1, 및 G2와의 항원-항체반응을 통하여 샘플 내에 존재하는 전체 아플라톡신 B1, B2, G1, 및 G2의 양을 측정하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 하이브리도머 세포주 10G4의 제조방법.
제 2항에 있어서,
상기 항체는 프로인트 불완전 보조제로 처리한 BALB/c 작은 쥐에게 하이브리도머 세포주 10G4를 투입시키고, 상기 작은 쥐의 복수를 수집하며, 이를 순화시켜 항아플라톡신 B1, B2, G1, G2 총량 모노클론 항체를 생성하는 단계를 통하여 제조되는 것인 하이브리도머 세포주 10G4의 제조방법.