CN103215229B - 杂交瘤细胞株afb3g1、其单克隆抗体及半定量化检测黄曲霉毒素b1的多检测线免疫层析试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杂交瘤细胞株AFB3G1、其单克隆抗体及半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条。杂交瘤细胞株AFB3G1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO.C201015。其分泌产生的单克隆抗体可识别黄曲霉毒素B1，灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素B1的50％抑制浓度IC₅₀为86pg/mL。由其获得的半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条用于黄曲霉毒素B1含量的测定，可实现对黄曲霉毒素B1高、中、低三个浓度的半定量化检测，操作简单快速，灵敏度高，对检测溶液中黄曲霉毒素B1含量的最低检测限可达0.03ng/mL。

Description

杂交瘤细胞株AFB3G1、其单克隆抗体及半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株AFB3G1、其单克隆抗体及半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最强，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。历史上发生过很多AFB1污染食物链引发的人类中毒事件。奶牛摄入了AFB1污染了的谷物后，经体内代谢后形成另一种致癌物质黄曲霉毒素M1(AFM1)，AFM1进入牛奶中则会严重威胁人类健康。另外，AFB1还能污染多种原料，包括水果、干果、蔬菜、调味品、油料作物、烟草及中草药等，由此可见：AFB1对食物链的污染极其广泛，几乎在食物链的每个环节都能发现存在。除此，在热带和亚热带地区农产品和食品中AFB1的检出率更高，污染更严重，花生、玉米和花生油等粮油食品污染最为严重，同时，AFB1超标而导致的农产品国际贸易纠纷事件也时常发生，1999年、2000年、2001年我国出口欧盟的花生到岸后，40％以上被欧盟检出黄曲霉毒素总量和AFB1分量超标，遭到退货或被迫转口贸易，致使我国农产品进出口贸易蒙受巨大损失，影响了我国农产品国际市场声誉。因此，加强花生等农产品及制品中AFB1的检测、特别是速测，及时了解和掌握农产品中AFB1的污染情况对保障我国食品消费安全具有重要意义。

现有的黄曲霉毒素检测方法主要包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中薄层层析法是黄曲霉毒素检测最常用的检测方法，该方法不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可开展，但存在试剂消耗量大、操作繁琐、结果易受干扰、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大等不足，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法等，这些方法灵敏度高，检测结果准确，但所需的仪器设备昂贵，样品前处理过程繁琐，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，检测过程耗时，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近年来发展起来的用于黄曲霉毒素检测的免疫分析技术克服了前两者的一些缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、检测成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小等优点，适于现场批量检测等。其中基于纳米金的免疫层析快速检测技术具有简便、快速、灵敏、适于现场检测的优点，具有极大的应用价值和应用前景。但是，常见的黄曲霉毒素B1免疫层析检测试纸条仅有一条检测线，只能对样品中的黄曲霉毒素B1进行定性检测，且灵敏度较低。所以研究建立针对黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析快速检测试纸条，从而实现对样品中的黄曲霉毒素B1高、中、低三个浓度含量的半定量检测，对监控食品和农产品中的黄曲霉毒素B1具有重要的意义和很高的应用价值。发明内容

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株AFB3G1、其单克隆抗体及半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条。

本发明提供了杂交瘤细胞株AFB3G1，该细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCNO.C201015。其具有序列表中SEQ ID NO.1所示的单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID NO.2所示的单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。

单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO.C201015的杂交瘤细胞株AFB3G1分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。该单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素B1，对黄曲霉毒素B1的50％抑制浓度IC₅₀为0.086ng/mL。

本发明提供的杂交瘤细胞株AFB3G1是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：将BALB/c小鼠经黄曲霉毒素B1完全抗原AFB1-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素B1完全抗原AFB1-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，待细胞融合后2-3周，用微量移液器将单个细胞集落移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，进行第一次克隆，采用ELISA方法分两步筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素B1而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素B1作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株AFB3G1。

本发明提供的单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株AFB3G1注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后即得。

按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作步骤为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，过滤后的腹水于4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30～35μL，室温混合30～60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，然后用冷冻真空干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液：0.29g醋酸钠加入0.141mL醋酸，纯水定容至100mL；

所述的0.01mol/L磷酸盐缓冲液：0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL；

所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100mL所得。

半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条(见图1和图2)，包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线、检测线I、检测线II和检测线III，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线I、检测线II和检测线III分别包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，所述的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201015的杂交瘤细胞株AFB3G1分泌产生的单克隆抗体。

按上述方案，所述的吸水垫长16-18mm，宽2-4mm；检测垫长25-30mm，宽2-4mm；金标垫长6-9mm，宽2-4mm；样品垫长12-18mm，宽2-4mm，相邻各垫的交叠长度为1-3mm。

按上述方案，所述的吸水垫为吸水纸。

按上述方案，所述检测垫上检测线I、检测线II和检测线III距硝酸纤维素膜上沿的距离分别为11～17mm、13～19mm、15～21mm，且每相邻两条检测线的间距最小为2mm；所述质控线与检测线I的距离为5～11mm。

按上述方案，所述检测垫上每厘米检测线I、检测线II和检测线III上所需黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)的包被量分别为120～600ng，40～200ng和20～100ng；每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为200～500ng。

按上述方案，所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm。

按上述方案，所述金标垫上每厘米喷涂长度所需纳米金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体的用量为60～216ng。

半定量化检测黄曲霉毒素B1的高灵敏度免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)吸水垫的制备

将吸水纸剪裁即得吸水垫；

(2)检测垫的制备

检测线的包被：

将市售黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)配制成0.1～0.5mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上沿11～17mm、13～19mm、15～21mm的位置，用点喷方式将其依次横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线I、检测线II和检测线III，且每条检测线之间的间距至少为2mm，每厘米检测线I、检测线II和检测线III所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)的包被量分别为120～600ng，40～200ng和20～100ng，再于37～40℃条件下干燥8～20分钟；

质控线的包被：

将兔抗鼠多克隆抗体配制成0.4～0.6mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上检测线I的距离为5～11mm，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为200～500ng，然后于37～40℃条件下干燥8～20分钟；

(3)样品垫的制备

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥10～16小时，得样品垫，然后置于干燥器中室温保存；

(4)金标垫的制备

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥10～16小时，于已干燥的玻璃纤维膜上用点喷方式将纳米金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液横向进行喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的量为60～216ng，真空冷冻干燥2～6h，即得金标垫，然后置于干燥器中室温保存；所述的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201015的杂交瘤细胞株AFB3G1分泌产生的单克隆抗体；

(5)半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条的组装

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条(见图1和图2)。

按上述方案，所述步骤(2)中配制黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)包被液中所使用的包被缓冲液为：每100mL中含有牛血清白蛋白1～2g，蔗糖1～2g，叠氮化钠0.02～0.05g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；

配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每100mL中含有叠氮化钠0.02～0.05g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。

按上述方案，所述步骤(3)和步骤(4)中的封闭液为每100mL中含有牛血清白蛋白1～2g，曲拉通X-1000.1～0.2mL，聚乙烯吡咯烷酮0.3g，蔗糖2～5g，叠氮化钠0.02～0.05g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。

按上述方案，所述的纳米金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液的制备方法为：量取50.0mL市售质量浓度为0.01％纳米金溶液，调节纳米金溶液的pH值为5.5；在搅拌的状态下缓慢加入2mL0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％的牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1％，继续搅拌30min；在4℃条件下放置2h后，1500r/min离心15min，吸出上清，弃沉淀；将吸出的上清液12000r/min离心30min，弃上清液，加入50mL标记洗涤保存液，再12000r/min离心30min，弃上清液，将得到的沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置于4℃保存备用；

所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮化钠，0.1235克硼酸，加水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。

如上所述的半定量化检测黄曲霉毒素B1多检测线免疫层析试纸条的应用：称取已磨碎的待测样品，加入60-80％(体积分数)的甲醇水溶液，在50～60℃水浴下超声提取5～10分钟，静置5～10分钟，将上层清液即提取液用水稀释，使稀释液中甲醇的终体积浓度为20～30％，得到待测样品溶液，然后取80-150μL待测样品溶液作为检测液逐滴加入半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条的样品垫，其作为检测试纸条，另取等体积的甲醇浓度一致的甲醇水溶液作为阴性对照液，逐滴加入另一半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条的样品垫，其作为对照试纸条，15-20分钟后将检测试纸条和对照试纸条进行显色对照，获得检测结果：

结果评估：(1)阳性：待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，而若三条检测线中的检测线I颜色比对照试纸条稍浅，检测线II、检测线III颜色与对照试纸条基本相同，则待测样品溶液中的黄曲霉毒素B1含量在0.03～0.12ng/mL之间；若三条检测线中检测线I不显色，检测线II、检测线III颜色与对照试纸条基本相同，则样品中的黄曲霉毒素B1含量为0.12ng/mL；若三条检测线中检测线I不显色，检测线II颜色比对照试纸条浅，检测线III颜色与对照试纸条基本相同，则样品中的黄曲霉毒素B1含量在0.12～0.3ng/mL之间；若试纸条三条检测线的检测线I、检测线II不显色，检测线III颜色与对照试纸条基本相同，则样品中的黄曲霉毒素B1含量为0.3ng/mL；若三条检测线中检测线I、II不显色，检测线III颜色比对照试纸条稍浅，则样品中的黄曲霉毒素B1含量在0.3～0.9ng/mL之间；若三条检测线均不显色，则样品中的黄曲霉毒素B1含量不低于0.9ng/mL；(2)阴性：待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，三条检测线的颜色与对照试纸条的相应检测线的颜色均接近，为阴性结果，表明待测样品中的黄曲霉毒素B1含量低于0.03ng/mL；(3)无效：无论待测样品检测试纸条的检测线显示或不显示出红色线条，只要质控线不显示出红色线条，该试纸条判为无效；

最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素B1的含量。

该试纸条的工作原理为：当样品溶液加入到试纸条下端的样品垫上后，样品溶液通过毛细管作用沿试纸条向吸水垫方向移动，其移动至金标垫时，纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体被溶解。当样品中含有黄曲霉毒素B1时，黄曲霉毒素B1将和金标垫上的纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合并一同向上泳动，其到达固定着抗原的三条检测线时，抗原将和黄曲霉毒素B1竞争结合纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体上有限的抗原结合位点，样品中黄曲霉毒素B1含量越高，检测线上的抗原能够结合的纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体将越少，形成的显色带越少、颜色越浅。当抗原所结合的纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体少于一定的数量时，检测线处将不会有红色线条出现。无论样品中是否含有黄曲霉毒素B1，未被检测线截获的纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体或纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体与黄曲霉毒素B1的结合物将继续移动到质控线并与上面的第二抗体结合并被富集显色，所以不管样品中是否含有黄曲霉毒素B1，质控线都将显色。当样品中不含黄曲霉毒素B1即为阴性时，试纸条出现四条红色条带，即质控线和三条检测线均为红色；当样品中含有一定量黄曲霉毒素B1即为阳性时，检测后的试纸条上可能观察到以下6种情况：(1)检测线I为浅红色，检测线II、检测线III均为红色，质控线为红色；(2)检测线I不显色，检测线II、检测线III均为红色，质控线为红色；(3)检测线I不显色，检测线II为浅红色，检测线III为红色，质控线为红色；(4)检测线I、检测线II均不显色，检测线III为红色，质控线为红色；(5)检测线I、检测线II均不显色，检测线III为浅红色，质控线为红色；(6)检测线I、检测线II和检测线III均不显色，质控线为红色；而质控线没有色带出现则表明该试纸条失效。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的杂交瘤细胞株AFB3G1可以用于制备高效价单克隆抗体。鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法的效价可达8.4×10⁵，即小鼠腹水抗体稀释8.4×10⁵倍时的溶液测定结果为阳性。

(2)本发明提供的B1单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素B1的50％抑制浓度IC₅₀为86pg/mL，与其他黄曲霉毒素及呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素的交叉反应率均小于2.5％。

(3)本发明提供的单克隆抗体制备的黄曲霉毒素B1免疫层析试纸条用于黄曲霉毒素B1含量的测定，可实现对黄曲霉毒素B1进行高、中、低三个浓度的半定量化检测，操作简单，快速，灵敏度高，对检测溶液中黄曲霉毒素B1含量的最低检测限可达到0.03ng/mL。

附图说明

图1为本发明提供的半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条的示意图。

图2为本发明提供的半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条的侧视图。

图3为实施例2的结果判定示意图。

图中：1纸板；2吸水垫；3检测垫；4金标垫；5样品垫；6质控线；7检测线I；8检测线II；9检测线III；10对照试纸条；11检测试纸条。

具体实施方式

实施例1：杂交瘤细胞株AFB3G1的筛选

1.动物免疫

购买6周龄BALB/c小鼠6只，免疫市售的黄曲霉毒素B1完全抗原AFB1-BSA。第一次免疫将黄曲霉毒素B1完全抗原与等体积的福氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于4周后进行，采用福氏不完全佐剂与等体积的黄曲霉毒素B1完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔4周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式与第二次免疫相同，同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同，均为每鼠80μg。前3次每次免疫后8～10天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价。第4次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为前面的2倍。

黄曲霉毒素B1完全抗原AFB1-BSA购于Sigma-Aldrich公司。

2.细胞融合

于最后一次加强免疫3天后，采用50％(重量百分数)的聚乙二醇即PEG(分子量为1450)作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5∶1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用50％PEG融合，融合1分钟，然后缓慢加入RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用20mL含1％HAT的细胞完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到80mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板上，1.5mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养。

所述的含1％HAT的细胞完全培养基含有20％(体积百分数)胎牛血清，75％(体积百分数)RPMI-1640基础培养液，1％(重量百分数)L-谷氨酰胺，1％(体积百分数)HEPES，1％(体积百分数)双抗(10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素)，2％(重量百分数)生长因子(HFCS)和1％(重量百分数)次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT；半固体培养基为含1％(质量百分数)甲基纤维素的细胞完全培养基；RPMI-1640基础培养液、HEPES、双抗和L-谷氨酰胺购于Hyclone公司；1％次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT和甲基纤维素购于Sigma-Aldrich公司。

3.细胞株的筛选及克隆

待细胞融合后2-3周，细胞集落长到人肉眼可见时，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，每孔移入1个克隆，待细胞长至满孔底1/2～2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，即进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素B1而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用黄曲霉毒素B1作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高指抑制率为50％时的竞争原浓度亦即IC₅₀值较小)，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株AFB3G1。

3.杂交瘤细胞株AFB3G1的可变区序列测定

(1)提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交瘤细胞株AFB3G1的总RNA；

(2)合成cDNA：以步骤1获得的总RNA为模板，oligo(dT)₁₅为引物，按照SuperScript^TM-2II反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo(dT)₁₅由Invitrogen购得；

(3)PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃30s、58℃1min、72℃1min，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经过1％(重量百分数)的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5’-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3’(22mer)和5’-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’(32mer)其中S、M、R和W为兼并碱基，M＝A/C，R＝A/G，S＝C/G，W＝A/T，轻链可变区引物为5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC-3’(24mer)和5’-CCG TTT CAG CTC CAGCTT GGT CCC-3’(24mer)。

得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长345bp，序列如SEQ ID NO：1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由115个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO：3所示。轻链可变区编码基因序列长324bp，序列如SEQ ID NO：2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由108个氨基酸组成，序列如SEQ IDNO：4所示。

4.单克隆抗体的特性鉴定

将杂交瘤细胞株AFB3G1注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000f/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的单克隆抗体，将抗体置于-20℃冰箱中备用；

所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到100mL所得。

用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株AFB3G1分泌的单克隆抗体的亚型为IgGl。

用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得注射杂交瘤细胞AFB3G1株的BALB/c小鼠腹水抗体的效价可达8.4×10⁵，即小鼠腹水抗体稀释8.4×10⁵倍时的溶液测定结果为阳性。采用常规竞争ELISA方法鉴定抗体特性，结果表明，细胞株AFB3G1产生的抗体AFB3G1对黄曲霉毒素B1的50％抑制浓度IC₅₀为86pg/mL，与供试的其他黄曲霉毒素及呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素的交叉反应率均小于2.5％。

实施例2：半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸的制备及应用

(1)吸水垫的制备

将吸水纸剪裁成长16mm宽3mm的规格，得吸水垫；

(2)检测垫的制备

检测线的包被：

将市售黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物AFB1-BSA配制成0.1mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿12mm、15mm、18mm的位置，用点喷方式将其依次横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线I、检测线II和检测线III，每厘米检测线I、检测线II和检测线III上黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物AFB1-BSA的包被量分别为130ng、65ng和32ng，再于37℃条件下干燥8分钟；

上述包被液配制中的包被缓冲液为为2g牛血清白蛋白，2g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

质控线的包被：

将兔抗鼠多克隆抗体配制成0.5mg/mL的包被液，于距检测线I5mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为200ng，然后于37℃条件下干燥8分钟；

上述包被液配制中的包被缓冲液为0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

所述的硝酸纤维素膜长25mm，宽2.8mm。

(3)样品垫的制备

将玻璃纤维膜剪裁成长15mm宽2.8mm的规格，放入封闭液A中浸湿，于37℃条件下干燥12小时，得样品垫，然后置于干燥器中室温保存；

所述的封闭液A为2g牛血清白蛋白，0.1mL曲拉通X-100，0.3g聚乙烯吡咯烷酮，2.5g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

(4)金标垫的制备

将玻璃纤维膜剪裁成长15mm宽2.8mm的规格，放入上述封闭液A中浸湿，用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液横向喷涂于该样品垫上，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为190ng，真空冷冻干燥6h即得金标垫，然后置于干燥器中室温保存；

所述质量浓度为0.05mg/mL的纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液的制备方法为：量取50.0mL市售质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.1mol/L碳酸钾水溶液调节纳米金溶液的pH值为5.5；在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL的0.1mg/mL抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入10％牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终浓度为1％，继续搅拌30min；在4℃条件下放置2h后，1500r/min离心15min，吸出上清，弃沉淀；将吸出的上清液12000r/min离心30min，弃上清液，加入50mL标记洗涤保存液，再12000r/min离心30min，弃上清液，将得到的沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置于4℃保存备用，其中纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液的质量浓度为0.05mg/mL；

所述纳米金溶液中纳米金的粒径为15nm；

所述的0.1mol/L碳酸钾溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述的0.1mg/mL抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的水溶液为：1mg抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体加水定容至10mL所得；所述的10％牛血清白蛋白水溶液为：10g牛血清白蛋白加水定容至100mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮化钠，0.12g硼酸，加水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。

(5)半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条的组装

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1.3mm，即得黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条(见图1和图2)。

上述制备得到的半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条在黄曲霉毒素B1花生加标样品黄曲霉毒素B1含量检测中的应用：6个黄曲霉毒素B1花生加标样品(1#-6#，采用无黄曲霉毒素污染的花生样品添加黄曲霉毒素B1标准物质制备而成)各取20g，用研磨机研磨，磨碎后加入80mL70％(体积分数)的甲醇水，搅拌反应2分钟，制得样品混合液，并将该混合液手动摇晃3分钟，然后用双层滤纸过滤，收集滤液2mL，加入6mL纯水稀释滤液，混匀，得到待测样品溶液。取100μL待测样品溶液作为检测液逐滴加入半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条(作检测试纸条)的样品垫，同时取100μL与待测样品溶液中甲醇浓度一致的甲醇水溶液作为阴性对照液，逐滴加入另一半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条(作对照试纸条)的样品垫，15分钟后读取结果。

结果如下：1#待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，三条检测线中的检测线I颜色比对照试纸条稍浅，检测线II、检测线III颜色与对照试纸条基本相同，由此判定，此为阳性结果，待测样品溶液中黄曲霉毒素B1含量在0.03～0.12ng/mL之间，即样品中的黄曲霉毒素B1含量在0.48～1.9ng/g之间，见图3-1；

2#待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，三条检测线中检测线I不显色，检测线II、III颜色与对照试纸条基本相同，由此判定为阳性结果，待测样品溶液中黄曲霉毒素B1含量为0.12ng/mL，即样品中的黄曲霉毒素B1含量为1.9ng/g，见图3-2；

3#待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，三条检测线中检测线I不显色，检测线II颜色比对照试纸条浅，检测线III颜色与对照试纸条基本相同，由此判定为阳性结果，待测样品溶液中黄曲霉毒素B1含量在0.12-0.3ng/mL之间，即样品中的黄曲霉毒素B1含量在1.9～4.8ng/g之间，见图3-3；

4#待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，三条检测线的检测线I、检测线II不显色，检测线III颜色与对照试纸条基本相同，由此判定为阳性结果，待测样品溶液中黄曲霉毒素B1含量为0.3ng/mL，即样品中的黄曲霉毒素B1含量为4.8ng/g，见图3-4；

5#待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，三条检测线中检测线I、II不显色，检测线III颜色比对照试纸条稍浅，由此判定为阳性结果，待测样品溶液中黄曲霉毒素B1含量在0.3-0.9ng/mL之间，即样品中的黄曲霉毒素B1含量在4.6～14.4ng/g之间，见图3-5；

6#待测样品检测试纸条的质控线显示出红色线条，三条检测线均不显色，由此判定为阳性结果，待测样品溶液中黄曲霉毒素B1含量不低于0.9ng/mL，即样品中的黄曲霉毒素B1含量不低于14.4ng/g，见图3-6。

实施例2：半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸的制备及应用

(1)吸水垫的制备

将吸水纸剪裁成长16mm宽3mm的规格，得吸水垫；

(2)检测垫的制备

检测线的包被：

将市售黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物AFB1-BSA用包被缓冲液配制成0.5mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿12mm、15mm、18mm的位置，用点喷方式将其依次横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线I、检测线II和检测线III，每厘米检测线I、检测线II和检测线III上黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物AFB1-BSA的包被量分别为500ng、150ng和80ng，再于40℃条件下干燥8分钟；

上述包被缓冲液为2g牛血清白蛋白，2g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

质控线的包被：

将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配制成0.4mg/mL的包被液，于距检测线I7mm的位置，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为400ng，然后于40℃条件下干燥8分钟；

上述包被缓冲液为0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

所述的硝酸纤维素膜长30mm，宽2.8mm。

(3)样品垫的制备

将玻璃纤维膜剪裁成长15mm宽2.8mm的规格，放入封闭液A中浸湿，于37℃条件下干燥12小时，得样品垫，然后置于干燥器中室温保存；

所述的封闭液A为2g牛血清白蛋白，0.1mL曲拉通X-100，0.3g聚乙烯吡咯烷酮，2.5g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。

(4)金标垫的制备

将样品垫剪裁成长8mm宽2.8mm的规格，放入上述封闭液A中浸湿，用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液横向喷涂于该样品垫上，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为80ng，真空冷冻干燥6h即得金标垫，然后置于干燥器中室温保存；

所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液的制备方法为：量取50.0mL市售质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.1mol/L碳酸钾水溶液调节纳米金溶液的pH值为5.5；在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL的0.1mg/mL抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入10％牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终浓度为1％，继续搅拌30min；在4℃条件下放置2h后，1500r/min离心15min，吸出上清，弃沉淀；将吸出的上清液12000r/min离心30min，弃上清液，加入50mL标记洗涤保存液，再12000r/min离心30min，弃上清液，将得到的沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置于4℃保存备用，其中纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液的质量浓度为0.05mg/mL；

所述纳米金溶液中纳米金的粒径为20nm；

所述的0.1mol/L碳酸钾溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述0.1mg/mL抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的水溶液为：1mg抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体加水定容至10mL所得；所述的10％牛血清白蛋白水溶液为：10g牛血清白蛋白加水定容至100mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮化钠，0.12g硼酸，加水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。

(5)半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条的组装

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，即得黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条。

上述制备得到的半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条在大米黄曲霉毒素B1含量检测中的应用：各取20g大米样品(1-6#)，用研磨机研磨，磨碎后加入80mL80％(体积分数)的甲醇水，在50～60℃水浴下超声提取5～10分钟，静置5～10分钟，将上层清液即提取液用水稀释4倍，得到待测样品溶液。取100μL待测样品溶液作为检测液逐滴加入半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条(作检测试纸条)的样品垫，同时取100μL水与待测样品溶液中甲醇浓度一致的甲醇水溶液作为阴性对照液，逐滴加入另一半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条(作对照试纸条)的样品垫，15分钟后读取结果，得：6个大米样品的检测结果依次为：＜0.48ng/g、0.48～1.9ng/g、0.48～1.9ng/g、＜0.48ng/g、1.9～4.8ng/g。采用国家标准高效液相色谱方法检测上述样品，结果依次为未检出、1.2ng/g、1.4ng/g、未检出、2.3ng/g，与上述多检测线免疫层析试纸条结果一致。

Claims (10)

1.杂交瘤细胞株AFB3G1，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO.C201015。

2.单克隆抗体，其特征在于：它由保藏编号为CCTCC NO.C201015的杂交瘤细胞株AFB3G1分泌产生。

3.半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于：它包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线、检测线Ⅰ、检测线Ⅱ和检测线Ⅲ，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线Ⅰ、检测线Ⅱ和检测线Ⅲ分别包被有黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，所述的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为由权利要求1所述的杂交瘤细胞株AFB3G1分泌产生的单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于：所述的吸水垫长16-18mm，宽2-4mm；检测垫长25-30mm，宽2-4mm；金标垫长6-9mm，宽2-4mm；样品垫长12-18mm，宽2-4mm，相邻各垫的交叠长度为1-3mm。

5.根据权利要求3或4所述的半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测垫上检测线Ⅰ、检测线Ⅱ和检测线Ⅲ距硝酸纤维素膜上沿的距离分别为11～17mm、13～19mm、15～21mm，且每相邻两条检测线的间距最小为2mm；所述质控线与检测线Ⅰ的距离为5～11mm。

6.根据权利要求3或4所述的半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于：所述检测垫上每厘米检测线Ⅰ、检测线Ⅱ和检测线Ⅲ上所需黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)的包被量分别为120～600ng，40～200ng和20～100ng；每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为200～500ng。

7.根据权利要求3或4所述的半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条，其特征在于：所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需纳米金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体的用量为60～216ng。

8.半定量化检测黄曲霉毒素B1的高灵敏度免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)吸水垫的制备

将吸水纸剪裁即得吸水垫；

(2)检测垫的制备

检测线的包被：

将市售黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)配制成0.1～0.5mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上沿11～17mm、13～19mm、15～21mm的位置，用点喷方式将其依次横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线Ⅰ、检测线Ⅱ和检测线Ⅲ，且每条检测线之间的间距至少为2mm，每厘米检测线Ⅰ、检测线Ⅱ和检测线Ⅲ所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)的包被量分别为120～600ng，40～200ng和20～100ng，再于37～40℃条件下干燥8～20分钟；

质控线的包被：

将兔抗鼠多克隆抗体配制成0.4～0.6mg/mL的包被液；于距硝酸纤维素膜上检测线Ⅰ的距离为5～11mm，用点喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为200～500ng，然后于37～40℃条件下干燥8～20分钟；

(3)样品垫的制备

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥10～16小时，得样品垫，然后置于干燥器中室温保存；

(4)金标垫的制备

将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥10～16小时，于已干燥的玻璃纤维膜上用点喷方式将纳米金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液横向进行喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的量为60～216ng，真空冷冻干燥2～6h，即得金标垫，然后置于干燥器中室温保存；所述的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为由权利要求1所述的保藏编号为CCTCC NO.C201015的杂交瘤细胞株AFB3G1分泌产生的单克隆抗体；

(5)半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条的组装

在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得半定量化检测黄曲霉毒素B1的多检测线免疫层析试纸条。

9.根据权利要求8所述的半定量化检测黄曲霉毒素B1的高灵敏度免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中配制黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物(AFB1-BSA)包被液中所使用的包被缓冲液为：每100mL中含有牛血清白蛋白1～2g，蔗糖1～2g，叠氮化钠0.02～0.05g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；

所述步骤（2）中配制兔抗鼠多克隆抗体包被液中所使用的包被缓冲液为：每100mL中叠氮化钠0.02～0.05g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g；

所述步骤（3）和步骤（4）中的封闭液为每100mL中含有牛血清白蛋白1～2g，曲拉通X-1000.1～0.2mL，聚乙烯吡咯烷酮0.3g，蔗糖2～5g，叠氮化钠0.02～0.05g，氯化钠0.8g，十二水磷酸氢二钠0.29g，氯化钾0.02g，磷酸二氢钾0.02g。

10.根据权利要求8所述的半定量化检测黄曲霉毒素B1的高灵敏度免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述的纳米金标记的黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液的制备方法为：量取50.0mL市售质量浓度为0.01%纳米金溶液，调节纳米金溶液的pH值为5.5；在搅拌的状态下缓慢加入2mL0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10%的牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅拌30min；在4℃条件下放置2h后，1500r/min离心15min，吸出上清，弃沉淀；将吸出的上清液12000r/min离心30min，弃上清液，加入50mL标记洗涤保存液，再12000r/min离心30min，弃上清液，将得到的沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置于4℃保存备用；

所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮化钠，0.1235克硼酸，加水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。

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