CN103849604B - 杂交瘤细胞株st03、抗黄曲霉毒素生物合成前体物st单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及杂交瘤细胞株ST03、黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体及其应用。本发明提供的杂交瘤细胞株ST03（保藏编号为CCTCC NO.C2013187）可以用于制备高效价抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体，抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得的效价可达6.4×105。抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体灵敏度高，对黄曲霉毒素生物合成前体物ST的50% 抑制浓度IC50为0.36 ng/mL，与黄曲霉毒素B1，黄曲霉毒素B2，黄曲霉毒素G1，黄曲霉毒素G2均无交叉反应，可应用于黄曲霉毒素生物合成前体物ST含量测定。

Description

杂交瘤细胞株ST03、抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及杂交瘤细胞株ST03、抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素中间体杂色曲霉素即ST是黄曲霉毒素合成的前期中间体，主要是由杂色曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、细皱曲霉等真菌产生，可污染大多数粮食和饲草，尤其对小麦、玉米、花生和饲草等污染更为严重。黄曲霉毒素生物合成前体物ST的基本结构是由二呋喃环与氧杂蒽酮连接组成，结构类似于黄曲霉毒素，其毒性仅次于黄曲霉毒素，其具有肝毒性，肾毒性，细胞遗传毒性和强致癌性，它污染食品及饲料后，直接或间接进入人类食品链，威胁人类的健康和生命安全，危害程度与黄曲霉毒素生物合成前体物ST的摄入量成正相关。我国属于黄曲霉毒素生物合成前体物ST污染较重的地区，加强对食品及饲料中黄曲霉毒素生物合成前体物ST的检测是增强食品安全性的一个重要环节。因此，对可能污染黄曲霉毒素生物合成前体物ST的谷物及其制品进行检测是非常必要的。
目前，黄曲霉毒素生物合成前体物ST的检测方法主要有薄层层析法（TLC）和液相色谱法，其中，TLC方法具有操作简单，不需要复杂精密的仪器设备的优点，但灵敏度较低，准确性不高；黄曲霉毒素生物合成前体物ST的最低检出量是大米、玉米、小麦为25μg/kg；黄豆、花生样品为50μg/kg。近年来，高效液相色谱法(HPLC)在真菌毒素检测中得到广泛应用，对黄曲霉毒素生物合成前体物ST的检测也有报道，但是前处理繁琐、仪器设备昂贵、需要严格的操作环境以及专业的操作人员等限制了此方法在基层检测中的应用。因此，研究开发新兴的黄曲霉毒素生物合成前体物ST快速检测技术是我国检测市场的迫切需求，对保障我国食品消费安全具有重要意义。
近些年发展起来的免疫分析技术具有灵敏度高、检测时间短、操作简单等优点，并逐渐成为黄曲霉毒素等污染物快速检测技术研究的热点，但针对黄曲霉毒素生物合成前体物ST的快速检测技术还鲜为报道。抗原和抗体是免疫分析技术的核心试剂和技术源头。黄曲霉毒素生物合成前体物ST分子量为324，属小分子化合物（≤1000），不能直接刺激动物产生抗体，只有和牛血清蛋白(BSA) 、卵清白蛋白(OVA)、多聚赖氨酸等载体蛋白质共价偶联后，才能转化为既具有反应原性又具有免疫原性的的人工抗原，刺激动物产生抗体。目前，黄曲霉毒素生物合成前体物ST人工抗原主要由硼氢化钠还原法制备获得，其合成的抗原制备得到的抗体灵敏度往往不高。
发明内容
本发明的目的在于提供杂交瘤细胞株ST03、抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体及其应用。
本发明提供了杂交瘤细胞株ST03，该细胞株已于2013年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. C2013187；其具有序列表中SEQ ID No:1所示的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID No:2所示的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。
抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体，它是由保藏编号为CCTCC NO. C2013187的杂交瘤细胞株ST03分泌产生；其重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:3所示；轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:4所示；该抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素生物合成前体物ST，对黄曲霉毒素生物合成前体物ST的50%抑制浓度IC50 为0.36 ng/mL。
抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体在黄曲霉毒素生物合成前体物ST含量测定中的应用。
本发明提供的杂交瘤细胞株ST03是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：将Balb/c小鼠经黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原（黄曲霉毒素生物合成前体物ST-BSA）免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素生物合成前体物ST作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株ST03。
本发明提供的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体的制备方法，步骤如下：将获得的杂交瘤细胞株ST03注射到预先用福氏不完全佐剂处理过的Balb/c小鼠的腹部，收集该小鼠的腹水，纯化后得到抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体。
按上述方案，所述的纯化为辛酸-硫酸铵纯化法，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33μL，室温混合30～60min，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4 ℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h以上，然后4℃，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-70℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用；
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容到100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容到100mL所得。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明提供的杂交瘤细胞株ST03可以用于制备高效价抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体，抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得的效价可达6.4×105；
（2）该抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体灵敏度高，对黄曲霉毒素生物合成前体物ST的50% 抑制浓度IC50为0.36 ng/mL，与黄曲霉毒素B1，黄曲霉毒素B2，黄曲霉毒素G1，黄曲霉毒素G2均无交叉反应；
（3）本发明提供的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体可应用于黄曲霉毒素生物合成前体物ST含量的测定。
附图说明
图1为实施例1中的紫外-可见光谱连续扫描图谱，图中：ST为黄曲霉毒素生物合成前体物ST紫外-可见光谱连续扫描图谱曲线；BSA为牛血清白蛋白紫外-可见光谱连续扫描图谱曲线；ST-BSA为黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原紫外-可见光谱连续扫描图谱曲线。
图2为本发明的快速检测黄曲霉毒素生物合成前体物ST的免疫层析试纸的正视图，图中：1 纸板；2 吸水垫；3 检测垫；4 金标垫；5 样品垫；6 质控线；7 检测线。
图3为本发明的快速检测黄曲霉毒素生物合成前体物ST的免疫层析试纸的左视图，图中：1 纸板；2 吸水垫；3 检测垫；4 金标垫；5 样品垫。
图4为实施例5中应用本发明提供的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体制备的试纸条检测样品的结果判定图，图中：6 质控线；7 检测线；8 对照试纸条；9 检测试纸条。
具体实施方式
实施例1  黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原的合成
（1）取市售的羟基乙酸（水分～1%） 0.1克溶于0.4  mL 三氟乙酸；称取1 mg 黄曲霉毒素生物合成前体物 ST 溶于0.4  mL 乙腈中；用注射器吸取黄曲霉毒素生物合成前体物ST乙腈溶液轻轻吹打入羟基乙酸/三氟乙酸的混合物中，室温（20℃~30℃）条件下磁力搅拌反应4 h；将反应溶液旋转蒸发溶剂，得到淡黄绿色油状物即黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原；
（2）取1 mg黄曲霉毒素生物合成前体物ST半抗原、4mg N-羟基琥珀酰亚胺置于反应瓶中，室温条件下磁力搅拌反应1h；称取7mg 碳二亚胺溶于0.2mL的1,4-二氧六烷中；将碳二亚胺的1,4-二氧六烷溶液缓慢滴加于反应瓶中，室温条件磁力搅拌4h，直至反应瓶中有白色沉淀生成；反应结束后，将反应物室温静置过夜，次日，在8000 r/min条件下离心5min，取上清；称取4 mg 牛血清白蛋白（BSA）溶于5 mL PBS溶液中（0.2 mol/L,pH 8.0）；将上述上清逐滴加入BSA的PBS溶液中，加样结束后计时，反应4 h，得到水相的黄曲霉毒素生物合成前体物ST完全抗原；
（3）将上述步骤（2）中水相的黄曲霉毒素生物合成前体物ST完全抗原密闭于透析袋中，以0.01 mol/L pH 8.0的磷酸盐缓冲液作为透析液，共透析3天，每间隔12小时更换1次透析液；最后1次透析结束后，将透析袋中的溶液分装于离心管中，经冷冻干燥，即得到黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原：黄曲霉毒素生物合成前体物ST-牛血清白蛋白。
上述合成的黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原的鉴定：
1、通过紫外-可见光谱扫描图谱鉴定黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原，结果见图1，从图1中可以看出黄曲霉毒素生物合成前体物ST与载体牛血清白蛋白偶联成功。由偶联物在特征紫外吸收波长413 nm处的吸光度值及消光系数可以算出黄曲霉毒素生物合成前体物ST-牛血清白蛋白的偶联率为3.4:1。
2、免疫动物证明产生了抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST的抗体：
（1）小鼠免疫试验：用0.85%的生理盐水将上述合成的黄曲霉毒素生物合成前体物ST-牛血清白蛋白配成0.67 毫克每毫升的溶液，第一次免疫用0.45毫升完全弗氏佐剂与上述配好的黄曲霉毒素生物合成前体物ST-牛血清白蛋白等体积混合，充分乳化后，每只6-8周龄的Balb/c小鼠皮下注射0.3毫升，相当于100 微克蛋白质。每隔3周加强免疫1次，加强免疫中将佐剂换用不完全弗氏佐剂，其他方法与第一次免疫方法相同。每次加强免疫后第7-10天从小鼠尾部取血，制备抗血清。
（2）非竞争ELISA检测抗体效价试验：以pH 9.6的碳酸盐缓冲液将包被抗原黄曲霉毒素生物合成前体物ST-牛血清白蛋白稀释成0.5微克每毫升，酶标板每孔加入100 微升，4 ℃过夜，倾去包被液，用常规磷酸盐-吐温洗涤液每孔洗涤三次，扣干；每孔加入200微升1.5% 脱脂奶粉，37 ℃封闭2小时，倾去封闭液，每孔洗涤三次，扣干；从500倍开始倍比稀释抗血清，每孔加入100微升，并平行设置对照孔，以阴性血清为阴性对照，以0.15摩尔每升pH 7.4的磷酸盐缓冲液作空白对照，37℃保温保湿2小时，洗涤三次，扣干；每孔加入100微升用0.15摩尔每升 pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释5000倍的羊抗鼠IgG:HRP酶标二抗，37℃保温保湿2小时，每孔洗涤六次，扣干；每孔加反应底物液100微升，37 ℃避光反应10-15分钟后，每孔加入50微升2摩尔每升硫酸溶液终止反应，5分钟后以空白对照孔调零，450 nm测吸光值；以两倍于阴性血清吸光值的抗血清测定值对应的抗血清稀释倍数为抗血清效价，结果如表1：                 
表1 黄曲霉毒素生物合成前体物ST抗血清效价测定结果
从表1的数据可以证明本发明方法制备的黄曲霉毒素生物合成前体物ST人工抗原通过免疫后可以得到效价在80000以上的抗血清。
（3）ELISA竞争抑制试验：ELISA操作步骤同上，不同的是将倍比稀释的抗血清换为含有不同浓度黄曲霉毒素生物合成前体物ST标准品的抗血清溶液；若随着黄曲霉毒素生物合成前体物ST浓度的增加吸光值下降，则证明抗血清中的抗体能够与黄曲霉毒素生物合成前体ST发生结合反应；竞争性ELISA试验所得结果如下表2：            
表2 黄曲霉毒素生物合成前体物ST ELISA竞争抑制试验结果
 表2竞争性ELISA抑制试验结果表明小鼠产生了抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST的抗体，从而证明本发明方法制备的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST人工抗原是成功的；同时从表2中可以得到抗体对黄曲霉毒素生物合成前体物ST的IC50值为0.41ng/mL，这说明本发明方法合成的黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原免疫小鼠后可以得到高灵敏度的抗体。
（4） 抗体特异性试验：ELISA操作步骤同上，不同的是将倍比稀释的抗血清换为含有不同浓度黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2标准品的抗血清溶液；若随着黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2标准品浓度的增加吸光值发生无规律变化，则证明抗血清中的抗体不与黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2发生结合反应；竞争性ELISA试验所得结果如下表3：
表3 黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2  ELISA竞争抑制试验结果
 表3抗体特异性试验结果表明小鼠产生的抗体不与黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2发生反应，说明本发明方法合成的黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原免疫小鼠后可以得到高特异性抗体。
实施例2 杂交瘤细胞株ST03的制备
1.动物免疫
       购买6周龄Balb/c小鼠8只，免疫实施例1合成的黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原：黄曲霉毒素生物合成前体物ST-BSA。第一次免疫将黄曲霉毒素生物合成前体物ST-BSA与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于3周后进行，采用弗氏不完全佐剂与等体积的黄曲霉毒素生物合成前体物ST-BSA乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔3周，免疫方式与其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式与第三次免疫相同，同样为腹腔注射。4次免疫剂量相同，均为每鼠50μg。前3次每次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价。第4次免疫后8天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法检测小鼠血清抗体效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清抗体灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为前面的2倍。
2.细胞融合
于最后一次加强免疫3天后，采用50%（重量百分数）的聚乙二醇即PEG（分子量为1450）作融合剂，按常规方法进行细胞融合，具体步骤：无菌条件下杀死免疫小鼠，分离脾细胞，将脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞SP2/0以5~8:1的个数比混合，用RPMI-1640基础培养液洗混合细胞，用50%PEG融合，融合1分钟，然后缓慢加入RPMI-1640基础培养液，离心，移去上清，小鼠脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞SP2/0形成的融合细胞用20mL 含1% HAT的细胞完全培养基重悬，将悬起的细胞加入到 80 mL半固体培养基中，混匀后加到6孔细胞培养板上，1.5mL/孔，置于37℃二氧化碳培养箱培养。所述的含1% HAT的细胞完全培养基含有20%（体积百分数）胎牛血清，75%（体积百分数）RPMI-1640基础培养液，1%（重量百分数）L-谷氨酰胺，1%（体积百分数）HEPES，1%（体积百分数）双抗（10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素），2%（重量百分数）生长因子和1%（重量百分数）次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT；所述的半固体培养基为含1%（质量百分数）甲基纤维素的细胞完全培养基；RPMI-1640基础培养液，HEPES，双抗，L-谷氨酰胺购于Hyclone公司；1%次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT，甲基纤维素购于Sigma-Aldrich公司。
3.细胞株的筛选及克隆
待细胞融合后2-3周，细胞集落长到人肉眼可见时，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至96孔细胞培养板采用液体放大培养，每孔移入1个克隆，待细胞长至满孔底1/2～2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，即进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选，筛选分两步进行，第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测，用黄曲霉毒素生物合成前体物ST作为竞争原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔（吸光值较高是指竞争原为0的孔即阳性对照孔的最终测定值较高，灵敏度较高是指抑制率为50%时的竞争原浓度亦即IC50值较小），采用有限稀释法进行亚克隆，亚克隆后采用同样的两步法进行检测，如此重复亚克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株ST03。
实施例3  抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体杂交瘤细胞株系ST03抗体可变区序列测定
（1）提取总RNA：采用天根公司的总RNA提取试剂盒并按照说明书提取可获得杂交瘤细胞株系ST03的总RNA；
（2）合成cDNA：以步骤1获得的总RNA 为模板，oligo (dT) 15为引物，按照SuperScriptTM-2 Ⅱ反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链；引物oligo (dT) 15 由Invitrogen购得；
（3）PCR法克隆可变区基因：根据GENEBANK中小鼠抗体基因序列的保守位点设计引物，以cDNA为模版扩增抗体轻、重链可变区基因。PCR程序为：94℃ 30s、58℃ 1min、72℃ 1min ，扩增 30 个循环，最后 72℃延伸 10min。PCR 产物经过1％（重量百分数）的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收DNA片段，连接到载体pMD18-T中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。其中引物的序列分别为：重链可变区引物为5，-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3，（22mer）和5，-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3，（32mer）其中S、M、R和W为兼并碱基，M=A/C，R=A/G，S=C/G，W=A/T，轻链可变区引物为5，-GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA -3，（24mer）和5，-CCG TTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC-3，（24mer）。
得到的基因序列结果：重链可变区编码基因序列长336bp，序列如SEQ ID NO:1所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由112个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示。轻链可变区编码基因序列长324bp，序列如SEQ ID NO:2所示，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由108个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例4  抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体的制备、纯化及特性鉴定
将实施例2获得的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体杂交瘤细胞株系ST03注射预先用福氏不完全佐剂处理过的Balb/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：用双层滤纸过滤小鼠腹水，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清，将所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 μL，室温混合30min，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH值至7.4，4 ℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL，4℃静置2h，然后4℃，12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，对纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置-74℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体，将抗体置于-20℃冰箱中备用；
所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得；所述的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至100mL所得。
用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株ST03分泌的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体的亚型为IgG2a。
用常规非竞争酶联免疫吸附分析（ELISA）法测得注射ST03杂交瘤细胞的Balb/c小鼠腹水获得的抗体效价可达6.4×105，即抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体稀释6.4×105倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对黄曲霉毒素生物合成前体物ST的灵敏度为0.36 ng/mL，与黄曲霉毒素B1，黄曲霉毒素B2，黄曲霉毒素G1，黄曲霉毒素G2均无交叉反应。
实施例5：抗体应用
将杂交瘤细胞株ST03分泌的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体用于制备黄曲霉毒素生物合成前体物ST免疫层析试纸条，制备方法包括以下步骤：
（1）    吸水垫的制备
将吸水纸剪裁成长15~20mm宽3.4mm的规格，即得吸水垫；
（2）    检测垫的制备
检测垫的制备：硝酸纤维素膜 HF135，长25mm，宽3.4mm（购于美国 Millipore 公司）即为检测垫。
检测线的包被：
将黄曲霉毒素生物合成前体物ST-BSA配制成浓度为0.4mg/mL的包被液A；于距硝酸纤维素膜上沿15mm的位置，用点喷方式将包被液A横向包被于硝酸纤维素膜上，得到检测线，每厘米检测线所需黄曲霉毒素生物合成前体物ST的人工抗原ST-BSA的包被量为200ng，然后于37℃条件下干燥30分钟；
所述的包被液A为：4mg自己合成黄曲霉毒素生物合成前体物ST-BSA，0.1g牛血清白蛋白，0.002g叠氮化钠，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容到10 mL所得。
质控线的包被：                                                
将兔抗鼠多克隆抗体配成浓度为0.25mg/mL的包被液B；于距检测线6mm的位置，用点喷方式将包被液B横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100ng，然后于37℃条件下干燥1小时；
所述的包被液B为将2.5mg市售兔抗鼠多克隆抗体（购于美国 Sigma 公司），0.002g叠氮化钠，0.08g氯化钠，0.029g十二水磷酸氢二钠，0.002g氯化钾，0.002g磷酸二氢钾，加水定容至10mL所得。
（3）样品垫的制备：
将玻璃纤维膜剪裁成长13mm宽3.4mm的规格，放入封闭液A中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；
所述的封闭液A为2g牛血清白蛋白，2.5g蔗糖，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得。
（4）金标垫的制备：
将玻璃纤维膜剪裁成长10mm宽3.4mm的规格，放入封闭液B中浸湿，取出，于37℃条件下干燥6小时，于干燥好的玻璃纤维膜上，用点喷方式将纳米金标记的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体溶液横向喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体为350ng，然后真空冷冻干燥2.5h，置干燥器中室温保存；
所述的封闭液B为2g牛血清白蛋白，2.5g蔗糖，1.6775g氯化钠，50μL吐温-20，0.5g聚乙烯吡咯烷酮，0.02g叠氮化钠， 0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；
所述的纳米金标记的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体溶液的具体制备方法为：量取50.0mL质量浓度为0.01%的纳米金溶液，用425μL 0.1 mol/L碳酸钾水溶液调节溶液pH值；在搅拌的状态下缓慢加入2.5mL 0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体水溶液，继续搅拌反应30min；加入质量浓度为10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的终质量浓度为1%，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，1500r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30 min，弃去上清液，加入30.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30 min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL纳米金标记的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体浓缩液，置4℃冰箱备用，其中纳米金标记的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体的质量浓度为0.05mg/mL；
所述纳米金溶液中纳米金的粒径为15nm；
所述的0.1 mol/L碳酸钾水溶液为：13.8g碳酸钾溶于纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得；所述的0.1mg/mL抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体水溶液为1mg本发明制备得到的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体溶解在10 mL纯水中制成；所述的10%牛血清白蛋白水溶液为10g牛血清白蛋白溶解在100mL纯水中，0.22μm滤膜过滤所得；所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235g硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。
（5）试纸条的组装：
在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1~2mm，即得黄曲霉毒素生物合成前体物ST免疫层析试纸条，见图2和图3。
上述黄曲霉毒素生物合成前体物ST免疫层析试纸条的应用：
小麦样品的处理：取20g小麦样品用研磨机研磨，磨碎后加入80mL 70%（体积分数）的甲醇水，搅拌反应2分钟，制得样品混合液，并将该混合液手动摇晃3分钟，然后用双层滤纸过滤，收集滤液2mL，加入6mL纯水稀释滤液，混匀，得到样品检测液。
黄曲霉毒素生物合成前体物ST试纸条检测小麦样品：制备小麦样品检测液1#和2#，吸取1#和2#小麦样品检测液各100μL，分别逐滴加入黄曲霉毒素生物合成前体物ST免疫层析试纸条的样品垫，将其作为检测试纸条；同时取100μL不含黄曲霉毒素生物合成前体物ST的空白小麦样品检测液逐滴加入另一黄曲霉毒素生物合成前体物ST免疫层析试纸条的样品垫，将其作为对照试纸条，15分钟后读取结果。
检测结果（见图4）：对照试纸条的质控线和检测线均显示出红色条带；1#检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅，则表明1#小麦样品检测液中黄曲霉毒素生物合成前体物ST的含量等于或高于0.37并低于1.5ng/mL，见图4-1；2#检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线不显色，则表明2#小麦样品检测液中黄曲霉毒素生物合成前体物ST的含量高于1.5 ng/mL，见图4-2。
序列表
 
＜110＞  中国农业科学院油料作物研究所
 
 
＜120＞  杂交瘤细胞株ST03、抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体及其应用
 
 
＜160＞  4
 
＜210＞  1
＜211＞  336bp
＜212＞  DNA
＜213＞  小鼠
 
＜400＞  1
gtgcaactgc  aggagtctgg  ggctgaactg  gcaagacctg  gggcctcagt  gaagatgtcc    60 
tgcaaggctt  ctggctacac   ctttactacc   tacacgatac  actggctaaa  acagaggcct   120
ggacagggtc  tggaatggat  tggatacatt   aatcctagca  gtggttatac   taattacaat    180
cagaaattca  aggacaaggc  cacattgact   gcagacaaat  cctccagcac  agcctacatg   240
caactgagca  gcctgacatc  tgaggactct   gcagtctatt   actgtactag  aaggggggac   300
tactggggcc  aagggaccac  ggtcaccgtc  tcctca                             336
 
＜210＞  2
＜211＞  324bp
＜212＞  DNA
＜213＞  小鼠
 
＜400＞  2
gacattgagc  tcacccagtc   tccatcctcc  ttatctgcct  ctctgggaga  aagagtcagt   60
ctcacttgtc   ggacaagtca  ggacattggt  agtagtttag  cctggcttca  gcagaaatca   120
gatggaagta  ttaaacgcct   gatctccgcc  acatccagtt  tagaatctgg  tgtccccaaa   180
aggttcagcg  gcagtaggtc  tgggtcagat  tattctctca  ccatcagcag  ccttgagtct    240
gaagattttg   ttgactatta   ctgtctacaa  tatgctaatt   ttccgctcac  gttcggttct    300
gggaccaagc  tggaaataaa   acgg                                     324
 
＜210＞  3
＜211＞  112
＜212＞  PRT
＜213＞  小鼠
＜400＞  3
Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser
1                  5                      10                      15                     20
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Thr Ile His Trp Leu Lys Gln Arg Pro
                   25                     30                     35                      40
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn
                   45                     50                     55                      60
Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
                   65                     70                     75                      80
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Gly Asp
             85                     90                     95                     100
Tyr  Trp  Gly  Gln  Gly  Thr  Thr  Val  Thr  Val  Ser  Ser
                   105                      110
 
 
＜210＞  4
＜211＞  108
＜212＞  PRT
＜213＞  小鼠
＜400＞  4
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser
1                  5                      10                     15                      20
Leu Thr Cys Arg Thr Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ser Leu Ala Trp Leu Gln Gln Lys Ser
                   25                     30                     35                      40
Asp Gly Ser Ile Lys Arg Leu Ile Ser Ala Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Lys
            45                     50                     55                      60
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
                   65                     70                      75                     80
Glu Asp Phe Val Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Asn Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ser
                   85                     90                      95                    100
Gly  Thr  Lys  Leu  Glu  Ile  Lys  Arg
                    105             
 
 

Claims (3)

1.杂交瘤细胞株ST03，其特征在于：其保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO. C2013187。
2.抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体，其特征在于：其是权利要求1所述的保藏编号为CCTCC NO. C2013187的杂交瘤细胞株ST03分泌产生。
3.权利要求2所述的抗黄曲霉毒素生物合成前体物ST单克隆抗体在黄曲霉毒素生物合成前体物ST含量测定中的应用。
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