CN114113579B

CN114113579B - 一种新冠rbd蛋白荧光微球复合制剂

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Publication number: CN114113579B
Application number: CN202210089323.7A
Authority: CN
Inventors: 王丽娇; 彭洁; 张变强; 于迪; 盛长忠; 粟艳; 周泽奇
Original assignee: Dynamiker Biotechnology Tianjin Co Ltd
Current assignee: Dynamiker Biotechnology Tianjin Co Ltd
Priority date: 2022-01-26
Filing date: 2022-01-26
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2042-01-26
Also published as: CN114113579A; WO2023142398A1

Abstract

本发明提供了一种新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂，该复合制剂由包括如下质量百分比的原料制成：偶联蛋白0.5‑1%，糖类2.5‑5%，离子0.9‑1.3%，大分子物质0.05‑0.07%，表面活性剂0.05‑0.1%，缓冲液0.24‑1.21%，防腐剂0.02‑0.05%。本发明所述的新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂可用于新冠RBD蛋白荧光复合物及生物标本的保存、稀释及处理。饱和竞争法检测人血清、血浆与全血样本中的中和抗体，需将偶联有新冠RBD蛋白的时间分辨荧光微球复合物单独保存，所述的复合制剂可使荧光微球复合物不产生聚集沉淀，保持抗原活性，提高检测灵敏度。所述的生物标本包括血清、血浆。

Description

一种新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂

技术领域

本发明属于饱和竞争领域，尤其是涉及一种新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂。

背景技术

免疫学中直接竞争法，标记抗原与待测抗原均是液相，与抗体的结合机会是一样的，标记抗原的相对结合率为50%。饱和竞争法，固相抗原与抗体的接触面积较小，只有与待测抗原结合剩余的抗体才会与固相抗原结合，固相抗原的相对结合率为0%。因此，间接法的抑制曲线斜率会大于直接竞争法。饱和竞争法的高灵敏度有时在ELISA中较难实现，更高效率的时间分辨荧光层析法是个更好的选择，使用饱和竞争法检测新型冠状病毒中和抗体，可以提高检测灵敏度。荧光微球的稳定性对后续的检测步骤起着关键的作用，如果荧光微球保存不当，就会导致后续检测无法进行，影响到最终检测试剂的效能。时间分辨荧光微球标记新型冠状病毒RBD蛋白(以下简称新冠RBD蛋白荧光微球复合物)保存液可维持复合物在液体中的稳定，使其不产生聚集，保持抗原活性与性能。

针对大规模疫苗接种后的人群，使用简单、快速的时间分辨荧光微球免疫层析法，可快速评估每个接种者体内的抗RBD抗体及中和抗体的水平。饱和竞争法检测中和抗体原理是，将待测样本与新冠RBD蛋白荧光微球复合物结合10-20min后，再和固定在硝酸纤维素膜上的ACE2蛋白结合，反应10-15min后使用荧光分析仪读取结果，待测样本中中和抗体含量越高荧光信号越弱。使用饱和竞争法时间分辨荧光免疫层析法可快速评估每个接种者体内的抗RBD抗体及中和抗体的水平，检测灵敏度高，检测时间短。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂，该复合制剂由包括如下质量百分比的原料制成：

偶联蛋白 0.5-1%，

糖类 2.5-5%，

离子 0.9-1.3%，

大分子物质 0.05-0.07%，

表面活性剂 0.05-0.1%，

缓冲液 0.24-1.21%，

防腐剂 0.02-0.05%。

进一步，所述的偶联蛋白为牛血清白蛋白与卵清蛋白（OVA）、血蓝蛋白（KLH）或丝素蛋白（SF）的至少一种通过EDC偶联而成。牛血清白蛋白分子中含有大量的反应基团，如氨基、羧基等，能在水相或有机溶剂中充分溶解，结构中有17个二硫键和一个巯基，巯基的化学反应很活泼，二硫键有抗氧化还原的作用，因此可与多种阳离子，阴离子和小分子结合。与OVA、KLH、SF之间形成肽键，可减轻不利环境因素引起的RBD蛋白变性，还可防止RBD蛋白对杂质的吸附；可提高溶液中蛋白质的浓度，对RBD蛋白起保护作用，防止RBD单边的分解和非特异性反应，保持新冠RBD蛋白荧光微球复合物在2-8℃的活性，增强测试的灵敏度，可以降低由于运输条件和储存条件变化而造成的变异性，降低CV。

进一步，所述的偶联蛋白为牛血清白蛋白与聚赖氨酸通过EDC偶联而成，偶联顺序为聚赖氨酸-牛血清白蛋白。

所述的偶联蛋白为牛血清白蛋白和血蓝蛋白通过EDC偶联而成。

所述的偶联蛋白为牛血清白蛋白和丝素蛋白通过EDC偶联而成。

所述的偶联蛋白为牛血清白蛋白和卵清蛋白通过EDC偶联而成。

使用EDC活化聚赖氨酸末端的羧基后，与牛血清白蛋白的氨基脱水缩合形成肽键，可得到唯一产物。聚赖氨酸是一类具有较好生物相容性、可生物降解、含有丰富侧链官能团的仿生功能高分子，在蛋白质修饰方面具有突出的优势，偶联牛血清白蛋白后可使蛋白性质均一、重复性好，保留蛋白质活性。

所述的偶联蛋白的制备方法具体为：

（1）称取10mg聚赖氨酸加入到磷酸盐缓冲液（0.02-0.1M PBS，pH 7.2-7.4）中，再加入10-50mg/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC），避光反应15-30min；

（2）称取10mg牛血清白蛋白加入到活化后的聚赖氨酸溶液中；

（3）用磷酸盐缓冲液（0.02-0.1M PBS，pH 7.2-7.4）透析，去除EDC；

（4）经过亲和纯化后收集蛋白浓度较高的产物，得到偶联蛋白（ε-PL-BSA）。

所述的偶联蛋白的制备方法具体为：

（1）称取10mg卵清蛋白加入到磷酸盐缓冲液（0.02-0.1M PBS，pH 7.2-7.4）中，再加入10-50mg/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC），避光反应15-30min；

（2）称取10mg牛血清白蛋白和10mg血蓝蛋白加入到活化后的卵清蛋白溶液中；

（3）使用磷酸盐缓冲液（0.02-0.1M PBS，pH 7.2-7.4）透析，去除EDC；

（4）经过亲和纯化后收集分子量为三种蛋白分子量之和的产物，得到偶联蛋白（BSA-OVA-KLH）。

所述的偶联蛋白的制备方法具体为：

（1）称取10mg牛血清白蛋白加入到磷酸盐缓冲液（0.02-0.1M PBS，pH 7.2-7.4）中，再加入10-50mg/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC），避光反应15-30min；

（2）称取10mg丝素蛋白加入到活化后的牛血清白蛋白溶液中；

（4）经过亲和纯化后收集分子量为两种蛋白分子量之和的产物，得到偶联蛋白（BSA-SF）。

进一步，所述的糖类为蔗糖、海藻糖或葡萄糖中的至少一种。糖类为多羟基亲水化合物，可以与偶联蛋白形成氢键，对温度和湿度变化具有固有的稳定性和机械强度，能够在蛋白表面形成保护膜，避免了RBD蛋白受温度影响或酶的降解作用，保护RBD蛋白不变质失活，提高RBD蛋白的稳定性。

进一步，所述的离子为Na⁺、K⁺或Mg²⁺中的至少一种。检测样本类型包含全血，保存液中添加Na⁺、K⁺或Mg²⁺可保持红细胞有合适的渗透压，红细胞不会破碎导致试纸条背景不清晰，可以弥补封闭试剂和表面活性剂对假阳性消除效果的不足，同时有效降低样本中非特异性蛋白在包被膜上的非特异性吸附，可以明显改善假阳性问题。

复合制剂中添加的PEG4000可有效消除高血脂，降低样本粘稠度，有利于样本层析。

进一步，所述的大分子物质为PEG4000。PEG4000可有效消除血脂，降低样本粘稠度，有利于样本层析。

进一步，所述的缓冲液为Tris缓冲液；所述的Tris缓冲液的浓度为0.02-0.1M。

新型冠状病毒RBD蛋白等电点为7.5-8.5，最佳缓冲pH为PI+0.5，故选择缓冲体系pH范围为8.0-9.0，Tris缓冲液更适合该酸碱环境。

进一步，所述的表面活性剂为Tween-20、Tetronin1307或BRIJ35中的至少一种。适量添加的表面活性剂可改变蛋白的表面电荷分布，使得抗原抗体有更多的反应簇暴露，增强抗原抗体与标记蛋白的特异性结合；可以封闭RBD蛋白表面或内部的疏水基团，阻止RBD蛋白间的相互结合而起到稳定剂的作用；不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏；表面活性剂带有一定的正电荷，对微球表面电荷起到一定的补充，使得微球能稳定的存在溶液中。

进一步，所述的防腐剂为proclin 300或KroVin300M中的至少一种。防腐剂能使微生物的蛋白质凝固或变性。防腐剂可作用 KREBS 循环的不同位置：丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)，a -酮戊二酸脱氢酶(ketoglutarate dehydrogenase)，琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)和 NADH 脱氢酶(NADH dehydrogenase，从而抑制细胞生长代谢，大分子的合成，引起细胞内能量水平迅速下降。由于能量体系的崩溃，细胞不能合成日常代谢所需要的化合物。所有的细菌及真菌至少拥有部分KREBS 循环，可有效抑制微生物的生长和增殖。在推荐使用的浓度下易被生物降解为无毒无污染物质，与各种乳化剂、表面活性剂及蛋白质成分配伍性好，有很好的相容性，不会对偶联的荧光微球复合物和偶联蛋白的结合产生影响。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

本发明所述的新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂，可用于饱和竞争法中检测人血清、血浆与全血样本中的中和抗体，提高检测灵敏度；饱和竞争法需要将偶联有新冠RBD蛋白的时间分辨荧光微球复合物单独保存，所述的复合制剂可使荧光微球复合物不产生聚集沉淀，保持抗原活性，提高检测灵敏度。

本发明所述的新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂可直接用于处理样本，保存液中添加离子可有效改善样本离子环境，保持红细胞有合适的渗透压，红细胞不会破碎影响试纸条背景，有效降低非特异性蛋白的吸附，有效消除假阴结果或无效结果。

本发明所述的新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂可用于样本稀释。将所需样本加入到复合制剂中，混匀孵育15min后，可直接加样，减少操作步骤与耗材使用，节约检测时间与检测步骤，方便操作。

本发明所述的新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂可作为微球复溶液应用于其他荧光微球免疫层析试纸条制备中，制备出的荧光垫稳定性好，灵敏度高；可用于高血脂样本的处理，降低样本粘稠度；可用于样本稀释；可用于校准品/质控品的保存液。新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂可保持荧光微球与抗原/抗体的活性，提高检测灵敏度。

附图说明

图1为本发明实施例1-3与对比例1-7所述的复合制剂的荧光值柱状图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明。

实施例1

一种新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂，制备方法如下：

（4）经过亲和纯化后收集分子量为三种蛋白分子量之和的产物，得到偶联蛋白1（BSA-OVA-KLH）；

（5）称取2.5g海藻糖，0.9g NaCl，0.05g PEG4000，0.05g Tween 20，0.05gproclin 300，0.24gTris，100g工艺用水，加入偶联蛋白1使其终浓度为1%，调节pH为8.5，得到复合制剂。

实施例2

一种新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂，制备方法如下：

（4）经过亲和纯化后收集分子量为两种蛋白分子量之和的产物，得到偶联蛋白2（BSA-SF）。

（5）称取2.5g海藻糖，0.9g NaCl，0.05g PEG4000，0.05g Tween 20，0.05gproclin 300，0.24gTris，100g工艺用水，加入偶联蛋白2使其终浓度为1%，调节pH为8.5，得到复合制剂。

实施例3

一种新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂，制备方法如下：

（4）经过亲和纯化后收集蛋白浓度较高的产物，得到偶联蛋白3（ε-PL-BSA）；

（5）称取5g蔗糖，1.3g MgCl₂，0.05g PEG4000，0.02g Tetronin1307，0.02gKroVin300M，0.24gTris，100g工艺用水，加入偶联蛋白3使其终浓度为1%，调节pH为8.5，得到复合制剂。

对比例1

称取2.5g海藻糖，0.9g NaCl，0.05g PEG4000，0.05g Tween 20，0.05g proclin300，0.24gTris，0.33g牛血清白蛋白，0.33g卵清蛋白，0.33g血蓝蛋白，100g工艺用水，调节pH为8.5，得到复合制剂。

对比例2

称取2.5g海藻糖，0.9g NaCl，0.05g PEG4000，0.05g Tween 20，0.05g proclin300，0.24gTris，0.5g牛血清白蛋白，0.5g丝素蛋白，100g工艺用水，调节pH为8.5，得到复合制剂。

对比例3

称取0.9g NaCl，0.05g PEG4000，0.05g Tween 20，0.05g proclin 300，0.24gTris，100g工艺用水，加入偶联蛋白1使其终浓度为1%，调节pH为8.5，得到复合制剂。

对比例4

称取2.5g海藻糖，0.05g PEG4000，0.05g Tween 20，0.05g proclin 300，0.24gTris，100g工艺用水，加入偶联蛋白1使其终浓度为1%，调节pH为8.5，得到复合制剂。

对比例5

（2）称取10mg聚赖氨酸加入到活化后的牛血清白蛋白溶液中；

（4）经过亲和纯化后收集蛋白浓度较高的产物，得到偶联蛋白4（BSA-ε-PL）；

（5）称取5g蔗糖，1.3g MgCl₂，0.05g PEG4000，0.02g Tetronin1307，0.02gKroVin300M，0.24gTris，100g工艺用水，加入偶联蛋白4使其终浓度为1%，调节pH为8.5，得到复合制剂。

对比例6

称取2.5g海藻糖，0.9g NaCl，0.05g PEG4000，0.05g proclin 300，0.24gTris，100g工艺用水，加入偶联蛋白1使其终浓度为1%，调节pH为8.5，得到复合制剂。

对比例7

一种复合制剂，制备方法如下：称取0.15%葡萄糖，0.6%HEPES，1%NaCl，0.5%KCl，0.09%EDTA-2Na，0.03%SDS，1%BSA，0.05%曲拉通100，0.02%吐温-20，0.05%Proclin，混合后调节溶液至pH8.5即成。

将实施例1-3与对比例1-7中制备得到的复合制剂进行检测，具体方法如下：

1、时间分辨荧光微球标记RBD蛋白操作过程：荧光微球活化后使用HEPES缓冲液重悬，加入RBD蛋白，标记过夜，加入封闭液封闭2 h，离心后用分别使用实施例1-3与对比例1-7中制备得到的复合制剂保存，得到的新冠RBD蛋白荧光微球复合物50μL/管分装，对比0天与2-8℃下保存30天后的结果，若荧光值的CV≤15%，相对偏差绝对值（相对偏差绝对值=|第0天荧光值平均值-第30天荧光值平均值|/第0天荧光值平均值）≤10%，阴阳性符合率≥95%，则该复合制剂符合要求，重复性、稳定性、检测灵敏度较好。

2、鸡IgY抗体标记及结合物释放垫制备操作过程：荧光微球活化后使用HEPES缓冲液重悬，加入鸡IgY抗体，标记过夜，加入封闭液封闭2 h，离心后重悬到微球保存液中，4μL/cm喷涂在结合物释放垫上（0.7*30cm），37℃烘干4h。

3、样品垫处理过程：样品垫处理液：含1%蔗糖、1%BSA、0.2%Tween-20、0.4mg/mLRBC抗体的0.02M Tris缓冲液，调节pH到8.0-8.5，6cm/mL涂布样品垫（2.5*30cm），37℃烘干4h。

4、T线固定：使用含0.5-1%BSA的0.01MPB缓冲液将新型冠状病毒ACE2蛋白稀释至0.1-0.5mg/mL，1μL/cm，50mm/s固定在硝酸纤维素膜（2*30cm）上，37℃烘干2h。

5、C线固定：使用含0.5-1%BSA的0.01MPB缓冲液将抗鸡IgY抗体稀释至0.1-0.5mg/mL，1μL/cm，50mm/s固定在硝酸纤维素膜上，37℃烘干2h。

6、大板组装与试纸条装壳：按照吸水垫（3*30cm）-硝酸纤维素膜-鸡IgY结合物释放垫-样品垫依次互相交错搭接粘贴在8*30cm的PVC背板上，切割成4mm±0.4mm的试纸条，装入卡壳中。

7、样本准备：将50μL样本加入到分装好的新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂中，震荡混匀；全血样本上下颠倒轻柔混匀，常温孵育10-15min。

8、样本检测：85-95μL/孔加样，常温孵育10-15min。

9、结果处理：使用干式荧光分析仪读取数值，得到荧光值或抑制率，具体结果如表1所示。

表1 荧光值检测结果

备注：相对偏差绝对值（相对偏差绝对值=|第0天荧光值平均值-第30天荧光值平均值|/第0天荧光值平均值）

表2 样本阴阳性符合率检测结果

实施例1、实施例2和实施例3的CV≤15%，相对偏差绝对值≤10%，阴阳性符合率≥95%，重复性、稳定性、样本符合率较好。实施例1与实施例3荧光数值在微小、可控范围内的差异，不代表其有升高的趋势，只是该方法学的正常的波动。

对比例1和对比例2因直接添加蛋白，不进行偶联，蛋白之间没有形成肽键，放置30天后可能无法保持完整结构，对RBD蛋白荧光微球复合物的保护作用降低，导致RBD蛋白的降解，活性降低，检测结果的重复性、稳定性变差，饱和竞争法荧光值越低阳性越强，所以阳性符合率升高，阴性符合率下降。

对比例3中未添加糖类，RBD蛋白表面保护膜的缺失导致RBD蛋白变性，检测结果的重复性、稳定性和样本符合率变差。

对比例4中未添加离子，检测全血样本时血细胞由于缓冲液渗透压无法保持完整，血细胞破碎导致NC膜背景不清晰，荧光分析仪无法获得样本荧光值最高峰导致假阴结果；复合制剂中离子的缺失也会使RBD蛋白在包被膜上出线非特异性吸附，使检测结果的重复性、稳定性和样本符合率变差。

对比例5中BSA与聚赖氨酸偶联顺序不同，EDC活化BSA的羧基后，可与1个或多个BSA的氨基结合，得到产物BSA-n*BSA（n=N+）；也可与1个或多个聚赖氨酸的氨基结合，得到产物BSA-n*聚赖氨酸（n=N+），无法控制批间差。只有BSA-聚赖氨酸的偶联组合才能使RBD蛋白性质均一，活性好。对比例5的结果具有偶然性。

对比例6中未添加表面活性剂，RBD蛋白之间可能会结合，造成荧光复合物聚集；标记抗原与包被抗体之间特异性结合降低，导致重复性、稳定性和样本符合率变差。

对比例7中，使用现有复合制剂，蛋白浓度较低，且离子型表面活性剂SDS会破坏蛋白结构，保存30天后样本信号值与本底值相同，重复性、稳定性和样本符合率变差。

对比例1-7制备得到的复合制剂在保存30天后信号值下降20-90%，相对偏差绝对值、CV和样本符合率有至少一项不符合要求（要求CV≤15%，相对偏差绝对值≤10%，阴阳性符合率≥95%），稳定性和重复性变差。实施例1-3制备得到的复合制剂在保存30天后信号基本未下降，重复性较好。

从结果中可以看出实施例1、实施例2和实施例3无明显差异，故选择实施例1进行精密度评估实验。

试验方案

取4个血清样本（1例阴性样本、1例临界阳性样本、1例中阳性样本、1例强阳性样本）用3个机型分别检测，每种机型2个操作人员，共6个操作人员，每种机型分别使用3个批次的试剂盒，检测5天，每天每个样本做5个重复（3个机型×3个试剂盒批次×5天×5个重复/天=225个结果/样本）。

数据分析方法

（1）（中或强）阳性样本数据分析

要求阳性检出率为100%且重复性≤15%、室内精密度≤15%、批间精密度≤20%。

（2）临界阳性样本数据分析

计算阳性检出率。要求阳性检出率≥95%。

（3）阴性样本数据分析

计算阴性检出率。要求阴性检出率应为100%。

试验结果

表3 （中或强）阳性样本数据分析结果

表4 临界阳性样本数据分析结果

表5 阴性样本数据分析结果

从上表数据分析结果可知，三种机型检测中阳性样本和强阳性样本的重复性、室内精密度和批间精密度CV均小于15%，符合要求（重复性CV≤15%，批间CV≤20%）；临界阳性样本的阳性符合率≥95%，符合要求；阴性样本的阴性符合率均为100%，符合要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂，其特征在于：该复合制剂由包括如下质量百分比的原料制成：

偶联蛋白 0.5-1%，

糖类 2.5-5%，

离子 0.9-1.3%，

大分子物质 0.05-0.07%，

表面活性剂 0.05-0.1%，

缓冲液 0.24-1.21%，

防腐剂 0.02-0.05%；

所述的偶联蛋白为牛血清白蛋白与聚赖氨酸、血蓝蛋白、丝素蛋白或卵清蛋白的至少一种通过EDC偶联而成；

所述的糖类为蔗糖、海藻糖或葡萄糖中的至少一种；

所述的离子为Na⁺、K⁺或Mg²⁺中的至少一种；

所述的大分子物质为PEG4000；

所述的缓冲液为Tris缓冲液；

所述的表面活性剂为Tween-20、Tetronin1307或BRIJ35中的至少一种；

所述的防腐剂为proclin 300或KroVin300M中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂，其特征在于：所述的偶联蛋白为牛血清白蛋白与聚赖氨酸通过EDC偶联而成，偶联顺序为聚赖氨酸-牛血清白蛋白。

3.根据权利要求1所述的新冠RBD蛋白荧光微球复合制剂，其特征在于：所述的Tris缓冲液的浓度为0.02-0.1M。