FI102698B - Menetelmä ja testausjärjestelmä hemoglobiinin Alc:n määrittämiseksi - Google Patents

Description

102698

Menetelmä ja testausjärjestelmä hemoglobiinin Ale:n määrittämiseksi Tämä keksintö koskee analyysimenetelmää hemoglo-5 biinin Ale määrittämiseksi verinäytteestä, jossa menetelmässä (a) verinäyte käsitellään hajottavalla/denaturoival-la reagenssilla, jolloin erytrosyytit hajoavat ja detek-toitavissa oleva määrä erytrosyyteistä vapautunutta mainittua hemoglobiinijohdannaista denaturoituu, ja (b) 10 tuloksena olevasta seoksesta mitataan immuunimäärityksellä siinä olevan mainitun hemoglobiinijohdannaisen denaturoituneen muodon määrä. Keksintö koskee myös testaus-järjestelmää hemoglobiinin Ale määrittämiseksi verinäytteestä, joka järjestelmä käsittää (1) hajottavaa/denatu-15 roivaa reagenssia, joka hajottaa erytrosyyttejä ja denaturoi detektoitavissa olevan määrän erytrosyyteistä vapautunutta mainittua hemoglobiinijohdannaista, ja (2) rea-gensseja verinäytteessä olevan mainitun hemoglobiinijohdannaisen denaturoidun muodon määrän mittaamiseksi im-20 muunimäärityksellä verinäytteestä.

Verenkierrossa tiettynä in vivo -prosessien syn-nyttämänä johdannaismuotona esiintyvän hemoglobiinin suhteellisen määrän määrittämisellä on huomattava merkitys lääketieteelliselle diagnostiikalle. Erityisen merkityk- '. 25 sellistä on glykatoituneiden hemoglobiinien mittaaminen veren glukoosin pitkäaikaiskontrollin aikaansaamiseksi sokeritaudin yhteydessä. Sokeritaudin hoidossa ehkä tärkein glykatoitunut hemoglobiinin muoto on johdannainen, joka tunnetaan yleisesti hemoglobiini Alc:nä. Tätä hemo-30 globiinijohdannaista tuottaa in vivo glukoosin ei-entsy- maattinen reaktio hemoglobiiniproteiinin kanssa. Glukoosi kiinnittyy toisiintuneessa muodossa kovalenttisesti luontaisen hemoglobiinin beeta-ketjun aminoterminaaliseen va-liiniryhmään. Normaaliyksilöiden kokonaishemoglobiinista 35 noin 3 - 6 % on Alc-muodossa, kun taas hoitamattomalla 4 102698 biiniseos ennen immuunimäärityksen tekemistä. Hajotta-vien/denaturoivien anionien litiumsuolamuotojen on havaittu olevan tehokkaita erytrosyyttien nopeassa hajotuksessa ja vapautuneen hemoglobiinin denaturoinnissa pitoisuuk-5 sinä, jotka ovat niin pieniä, että immuunimääritysreaktio voi tapahtua ilman merkittäviä häiriöitä suoraan denaturoidussa seoksessa.

Niinpä mainitut litiumsuolat ovat käyttökelpoisia hajottavina/denaturoivina reagensseina analyyttisissä 10 menetelmissä tietyn hemoglobiinijohdannaisen määrit tämiseksi verinäytteestä. Keksinnön mukaisessa menetelmässä verinäyte käsitellään hajottavalla/denaturoivalla reagenssilla, jolloin erytrosyytit hajoavat ja detek-toitavissa oleva määrä erytrosyyteistä vapautunutta 15 hemoglobiinijohdannaista denaturoituu, ja tuloksena ole valle seokselle tehdään immuunimääritys siinä olevan hemoglobiinijohdannaisen denaturoidun muodon detektoimi-seksi. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Kiinnostuksen 20 kohteena olevan hemoglobiinijohdannaisen määrä halutaan normaalisti ilmoittaa osuutena tai prosenttiosuutena näytteessä olevan hemoglobiinin kokonaismäärästä. Tällaisessa tapauksessa verinäyte käsitellään lisäksi hapettimellä, kuten ferrisyanidisuolalla, vapautuneen hemoglobiinin (sen 25 kaikki johdannaismuodot mukaan luettuina) muuttamiseksi met-hemoglobiinimuotoonsa. Tuloksena oleva seoksen sisältämä met-hemoglobiini voidaan sitten määrittää spekt-rofotometrisesti, jolloin saadaan näytteen kokonais-hemoglobiinipitoisuus ja kiinnostuksen kohteena olevan 30 hemoglobiinijohdannaismuodon prosenttiosuus voidaan laskea spektrofotometrisen met-hemoglobiinimäärityksen ja hemoglobiini johdannaisen immuunimäärityksen tuloksista.

Hajottavien/denaturoivien anionien litiumsuolamuotojen parannettujen ominaisuuksien keksimisen aikana ha-35 valttiin myös, että nimenomaan litiumtiosyanaatti- ja li- 3 102698 EP-julkaisussa 315 864 kuvataan erästä parannettua denaturointireagenssia käytettäväksi hemoglobiinijohdannaisten, kuten hemoglobiini Alc:n immuunimäärityksessä. Verinäyte käsitellään tiosyanaattisuolan ja hapettimen 5 yhdistelmällä näytteessä olevan hemoglobiinin vapauttamiseksi ja hemoglobiinin muuttamiseksi spektrofotometrisesti detektoitavissa olevaan met-hemoglobiinimuotoon. Tällä tavalla voidaan määrittää kokonaishemoglobiini mittaamalla met-hemoglobiinin absorbanssi ja määrittää Alc-osa ja suh-10 teuttaa se kokonaishemoglobiinisisältöön immuunimäärityk- sellä.

Met-hemoglobiinin hapettimen läsnäolon denaturoin-nin aikana havaittiin suurentavan merkitsevästi hemoglobiinin denaturoitumisnopeutta ja lyhentävän siten määri-15 tykseen kuluvaa kokonaisaikaa ja parantavan määrityksen luotettavuutta. Optimaalisen denaturoinnin vaatiman tio-syanaattipitoisuuden on kuitenkin havaittu olevan niin korkea, että on havaittu alentunut immuunimääritysreaktio. Niinpä yleensä tarvitaan laimennusvaihetta denaturoinnin 20 jälkeen tiosyanaattipitoisuuden alentamiseksi tasolle, joka ei merkitsevästi häiritse vasta-aineen kykyä sitoutua paljastettuun Alc-epitooppiin.

Yllättävästi on havaittu, että denaturoivassa suolassa olevan vastaionin luonteella, varsinkin denaturoivan t 25 suolan ollessa tiosyanaattisuola, on merkittävä vaikutus suolan kykyyn denaturoida hemoglobiinia hemoglobiinijohdannaisten, kuten hemoglobiini Ale:n, detektoimiseksi im-muunimäärityksellä. On havaittu, että erytrosyyttejä hajottamaan ja vapautunutta hemoglobiinia (mukaan luettuina 30 tutkittavassa näytteessä olevat johdannaismuodot) denatu- roimaan pystyvän anionin litiumsuolamuodon käyttö nopeuttaa merkitsevästi hajotusta ja denaturointia häiritsemättä merkittävästi immuunimääritystä. Merkittävää on, että tässä kuvattujen denaturoivien litiumsuolojen käytön on 35 havaittu poistavan tarpeen laimentaa denaturoitu hemoglo- * 102698 kiinnostuksen kohteena hemoglobiinijohdannainen on määrä vapauttaa ja denaturoida, on tehokas lämpötila-alueella suunnilleen huoneen lämpötilasta (ts. noin 20 - 25 °C) lievästi korotettuihin lämpötiloihin (esimerkiksi suunnil-5 leen lämpötilaan 37 °C asti) ja hapettimen läsnä ollessa (kuvataan yksityiskohtaisesti jäljempänä). Hajotus ja de-naturointi on tehokkaimmillaan pitoisuuden ollessa noin 1,25 mol/1, vaikka suunnilleen arvoon 3,5 mol/1 ulottuvien pitoisuuksien on havaittu olevan siedettäviä immuunimääri-10 tyksessä ilman laimennusta. Jotta voitaisiin toimia käyttämällä pitoisuuksia, jotka ovat korkeampia kuin noin 3.0 mol/1, voi olla välttämätöntä muuntaa immuunimääritys-reagensseja tai määritysohjelmaa, jotka ovat taloudellisesti epäkäytännöllisiä tai epätoivottavia, esimerkiksi 15 suurentamalla vasta-ainereagenssipitoisuutta. Hajotukseen voidaan käyttää suurempia pitoisuuksia, esimerkiksi pitoisuuteen 6 mol/1 asti, mutta tuloksena oleva seos vaatii normaalisti laimentamista pitoisuuden 3,5 mol/1 alapuolelle immuunimääritystä varten. Siksi litiumtiosyanaattipi-20 toisuus hajotus-/denaturointiväliaineessa on tavallisesti noin 0,5 - 3,5 mol/1, edullisemmin pienempi kuin noin 3.0 mol/1. Eräs melko edullinen pitoisuusalue on noin 1.0 - 2,0 mol/1, ja pitoisuutta 1,25 mol/1 pidetään tällä hetkellä optimaalisena ja edullisimpana.

25 Edellä esitetyt pitoisuusalueet vaihtelevat jonkin verran lämpötilan ja hapetinpitoisuuden mukaan. Ammattimies pystyy optimoimaan hajotus-/denaturointiolosuhteet tietyn hemoglobiinijohdannaisen immuunimääritystä varten. Hajotus-/denaturointireagenssin pitoisuusalueet, hapetti-30 men vaikutus, lämpötilan vaikutus tms. voidaan määrittää < helposti empiirisesti kunkin määrityksen kohdalla. Tällä hetkellä edullisimmat olosuhteet ovat 1,25 mol/1 litium-tiosyanaattia ja hapettimena 0,76 mol/1 ferrisyanidia lämpötilassa 37 °C.

5 102698 tiumperkloraattisuolat ovat muita kationimuotoja parempia erytrosyyttien hajotuksessa denaturoinnista riippumatta. Näiden litiumsuolojen tämä ominaisuus on käyttökelpoinen menetelmissä, analyysimenetelmät mukaan luettuina, jotka * 5 vaativat erytrosyyttien hajottamista esimerkiksi detek- toitavan aineen vaputtamiseksi, häiriöiden poistamiseksi tms.

Kuviot 1-4 ovat käyriä, jotka kuvaavat punasolujen (RBC) hajotusta ajan funktiona käytettäessä erilaisia 10 tiosyanaattisuoloja. Tulokset osoittavat, että litiumsuola on tehokkain punasolujem hajottamisessa.

Kuvio 5 on käyrä, joka kuvaa punasolujen hajotusta ajan funktiona käytettäessä tiosyanaatin ja perkloraatin litium- ja natriumsuolamuotoja. Litiumsuola oli natrium-15 suolaa tehokkaampi kaikissa tapauksissa.

Kuvio 6 on käyrä, joka kuvaa hemoglobiinin denatu-rointia ajan funktiona käytettäessä erilaisia tiosyanaattisuoloja. Tulokset osoittavat, että litiumsuola on tehokkain hemoglobiinin denaturoinnissa.

20 Tämän keksinnön yhteydessä käytetään anionin, jota kutsutaan tässä hajottavaksi/denaturoivaksi anioniksi, litiumsuolamuotoa. Hajottava/denaturoiva anioni voi olla mikä tahansa anioni, jonka tiedetään tai havaitaan olevan tehokas erytrosyyttien hajottamisessa hemoglobiinin va-25 pauttamiseksi siitä ja kiinnostuksen kohteena olevan hemoglobiini johdannaisen denaturoimiseksi riittävästi immuuni-määrityksellä tehtävää detektointia varten. Edullisin anioni on tiosyanaatti. Muihin anioneihin, joita voidaan käyttää, kuuluvat mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta 30 perkloraatti, syanidi, jodaatti ja perjodaatti. Alalla työskentelevät tiennevät muita toimivia anioneja, tai niitä on helposti määritettävissä rutiinikokein.

Edullisin hajottava/denaturoiva reagenssi on siten litiumtiosyanaatti. Yleensä litiumtiosyanaattipitoisuus 35 yli noin 0,5 mol/1 väliaineessa tai seoksessa, jossa β 102698 määritystä. Kirjallisuuden perusteella tiedetään, että monet erilaiset hapettimet muuttavat tehokkasti hemoglobiinin met-hemoglobiinimuotoon [katso Advances in Clinical Chemistry 8 (1965) 142 - 185] . Hapettimiin, jotka ovat 5 kelvollisia hapetuspotentiaalin suhteen, kuuluvat ferri-syanidi, jodaatti, kloraatti, bromaatti, kromaatti, elohopea (II) kloridi, cerium(IV)- ja talliumionit, hypokloriitti, perjodaatti, jodidi, hydroksiamiini, bromisukkinimidi, kloorisukkinimidi, klooriamiini, perkloraatti ja perok-10 sidi. Denaturointiin kuluvaa aikaa lyhentävän denaturaa-tiokinetiikan edistämisen aste vaihtelee luonnollisesti käytettävän hapettimen mukaan. On helppo tehdä empiirisiä kokeita, jotta pystytään valitsemaan hapetin, joka yhdistettynä litiumtiosyanaattiin saa aikaan riittävän nopean 15 denaturoitumisen.

Tässä yhteydessä riittävän denaturoinnin tulee ymmärtää tarkoittavan pistettä, jossa verinäytteen hemoglobiinin denaturointi antaa suurin piirtein maksimimäärän kiinnostuksen kohteena olevan hemoglobiinijohdannaisen 20 denaturoitunutta muotoa, joka on detektoitavissa käytet täessä valittua immuunimääritystä. Siksi riittävä denaturointi ei välttämättä tarkoita hemoglobiiniproteiinin koko tertiääri- ja sekundaarirakenteen täydellistä rikkomista vaan valitulla immuunimääritysvälineellä detektoitavan ' 25 hemoglobiinijohdannaisen epitoopin maksimaalista paljastamista. Immuunimääritys perustuu normaalisti monoklonaa- lisen vasta-aineen spesifisyyteen ainutlaatuiselle epitoo-pille, joka on tunnusmerkillinen hemoglobiinijohdannaiselle .

30 Hapetinta lisätään ylimäärin, esimerkiksi 5-ker- / täinen määrä näytteessä normaalisti olevaan hemimäärään nähden. Jopa 20-kertaista ylimäärää voidaan edullisesti käyttää. Alalla työskentelevä voi määrittää tiettyyn määritykseen sopivat määrät.

7 102698

Tietyn hemoglobiinijohdannaisen pitoisuus tai määrä verinäytteessä voidaan määrittää hapettimen poissa ollessa. Hapetin edistää tiosyanaatin denaturointivaikutuksia hajottavana/denaturoivana anionina ja myös hemoglobiinin 5 muuttumista met-hemoglobiiniksi, jolloin saadaan aikaan keino kokonaishemoglobiinin mittaamiseksi. Haluttaessa voidaan määrittää hemoglobiinijohdannaisen absoluuttinen pitoisuus tai määrä (jättäen huomiotta kokonaishemoglobii-nipitoisuus tai -määrä näytteessä) immuunimäärityksellä 10 tai tehdä erillinen kokonaishemoglobiinimääritys toisesta näytteestä ja suhteuttaa tulokset hemoglobiinijohdannaisen immuunimääritystulosten kanssa johdannaismuodossa olevan hemoglobiinin prosenttiosuuden tai osuuden laskemiseksi.

On erityisen edullista määrittää hemoglobiinijoh-15 dannaisen suhteellinen määrä yhdestä ainoasta verinäytteestä. Hajottavan/denaturoivan litiumtiosyanaattireagens-sin käyttö yhdistettynä hapettimeen tarjoaa keinon käytännöllisesti kaiken verinäytteessä olevan hemoglobiinin muuttamiseksi denaturoituun tiosyaani-met-hemoglobiinimuo-20 toon. Tämä hemoglobiinin muoto toimii pohjana näytteen kokonaishemoglobiinin mittaukselle, jolloin kiinnostuksen kohteena olevan hemoglobiinijohdannaisen denaturoitunut muoto toimii analysoitavana aineena immuunimäärityksessä. Kuten jäljempänä kuvataan, immuunimääritys perustuu edul-; 25 lisesti monoklonaalisen vasta-aineen spesifiseen affini teettiin kiinnostuksen kohteena olevan hemoglobiinijohdannaisen suhteen.

Kun käytetään hapetinta, se voi olla lähes mikä tahansa epäorgaaninen tai orgaaninen hapetin, jolla on 30 riittävä sähkökemiallinen potentiaali luontaisen hemoglobiinin rauta (II) ionin muuttamiseksi met-hemoglobiinin rauta (III) ionimuotoon. Hapetuspotentiaalinsa perusteella valittu hapetinehdokas testataan luonnollisesti määritysjärjestelmässä sen takaamiseksi, ettei se merkitsevästi häi-35 ritse kokonaishemoglobiinin ja hemoglobiinijohdannaisen 10 102698

Hemoglobiinijohdannainen määritetään normaalisti immuunimäärityksellä. Kuten edellä mainituissa US-patent-tijulkaisuissa 4 647 654 ja 4 658 022 kuvataan, voidaan kehittää monoklonaalisia vasta-aineita, jotka sitoutuvat 5 spesifisesti denaturoidussa proteiinissa olevaan epitoop-piin, joka on karakteristinen hemoglobiinijohdannaiselle, esimerkiksi hemoglobiini Ale:lie. Kulloinkin käytettävä immuunimääritysmenetelmä ja -muoto samoin kuin leimaustapa ja muodostettava detektointisignaali eivät ole ratkaisevia 10 tämän keksinnön kannalta. Periaatteessa ovat edullisia menetelmät, joissa ei käytetä radioisotooppeja, kuten menetelmät, jotka perustuvat entsyymimerkkiaineiden käyttöön (ELISA) tms.

Eräs menetelmä, joka on erityisen käyttökelpoinen, 15 koska se voidaan toteuttaa ilman erotusvaihetta ja antaa mitattavissa olevan absorbanssimuutoksen suhteessa analysoitavan aineen pitoisuuteen, on hiukkasagglutinaatiomää-ritys. Tällainen määritys perustuu vasta-ainehiukkasrea-genssin ja agglutinointireagenssin väliseen spesifiseen 20 vuorovaikutukseen. Vasta-ainehiukkasreagenssi käsittää vasta-ainetta tai sen fragmenttia sidottuna veteen suspen-doitavissa olevaan hiukkaseen (esimerkiksi polystyreeniin tai muuhun lateksiin). Agglutinointiaine käsittää useita epitooppisia sitoutumiskohtia vasta-ainereagenssia varten. 25 Analysoitavan aineen poissa ollessa vasta-ainehiukkanen ja agglutinointiaine sitoutuvat toisiinsa, jolloin muodostuu valoa sirottava kompleksi, joka on helppo määrittää kvantitatiivisesti turbidimetrisella mittauksella. Kasvavien analysoitavan aineen määrien ollessa läsnä liuoksen sameus 30 vähenee, kun vasta-ainehiukkaset sitoutuvat analysoitavaan aineeseen eivätkä pysty sitoutumaan agglutinointiainee-seen. Agglutinointiaine voi kätevästi käsittää polymeeri-rungon, johon liitetään joukko orgaanisia ryhmittymiä, esimerkiksi peptidiryhmiä, jotka määräävät epitoopin, joka 35 on karakteristinen kiinnostuksen kohteena olevalle hemo- 9 102698

Denaturoiva tiosyanaatti-/hapetinpari voidaan sekoittaa verinäytteen kanssa vaiheittain tai, kuten olisi edullista, samanaikaisesti. Normaalisti valmistetaan tio-syanaatista ja hapettimesta denaturointireagenssiliuos ja 5 sekoitetaan se suoraan verinäytteen kanssa. Stabiilius-syistä denaturointireagenssiliuos valmistetaan usein vasta välittömästi ennen käyttöään määrityksessä. Stabiiliuden salliessa tai käytettäessä stabilointiaineita tai laiterakenteita, jotka mahdollistavat tiosyanaattisuolan ja ha-10 pettimen yhdessäolon, denaturointireagenssiliuosta voidaan säilyttää ja/tai pitää pakattuna pitkiä aikoja. Denatu-rointiainekomponentit voivat olla kuivassa muodossa, ja ne voidaan sekoittaa tai yhdistää muulla tavalla, niin että muodostuu reagenssiliuos kostutettaessa seos tutkittavalla 15 näytteellä ja/tai laimennusaineella tai puskurilla.

Tässä kuvatulla menetelmällä voidaan määrittää glykatoituneita hemoglobiineja, joita muodostuu glukoosin reagoidessa ei-entsymaattisesti hemoglobiiniproteiinin reaktiivisten amiiniryhmien kanssa. Tämä keksintö soveltuu 20 erityisesti edellä määritellyn hemoglobiini Ale:n määrittämiseen.

Haluttaessa määrittää hemoglobiini johdannaisen suhteellinen määrä verinäytteessä käsitelty, denaturoitu verinäyte tutkitaan erikseen kokonaismet-hemoglobiinin ja " 25 kiinnostuksen kohteena oleva hemoglobiinijohdannaisen suh teen, minkä jälkeen tulokset suhteutetaan matemaattisesti, jolloin saadaan kiinnostuksen kohteena olevan johdannais-muodon suhteellinen osuus veren hemoglobiinista. Kokonaismet -hemoglobiini voidaan määrittää millä tahansa tavan-30 omaisella menetelmällä, kuten Drabkinsin menettelyllä (Na-*. tional Commission for Clinical Laboratory Standards of the U.S., Proposed Standard PSH-15). Kätevin menetelmä kokonaismet -hemoglobiinin mittaamiseksi on mitata sen absor-banssi liuoksessa karakteristisella aallonpituudella, esi-35 merkiksi aallonpituudella 540 nm.

12 102698 säiliöitä käsittävästä testivälineistöstä yhtenä yksikkönä olevaan tesivälineeseen, joka sisältää kaikki testissä tarvittavat reagenssit ja joka on käytettävissä siten, että se toteuttaa kaikki määritysvaiheet yhden laitteen 5 sisällä (erästä esimerkkiä viimeksi mainituista kuvataan EP-patenttihakemusjulkaisussa 339 277.

Kuten edellä mainittiin, keksittäessä keksinnön mukaisten litiumsuolojen parantuneet ominaisuudet hajottavi-na/denaturoivina reagensseina hemoglobiinijohdannaismääri-10 tyksissä havaittiin myös, että tietyillä litiumsuoloilla on parannetut erytrosyyttienhajotusominaisuudet riippumatta vapautuneen hemoglobiinin denaturoinnista. Verrattuina vastaaviin natrium-, kalium- tai ammoniumsuoloihin litium-suoloilla oli odottamattomasti parempi kyky hajottaa eryt-15 rosyyttejä. Kuten jäljempänä olevissa esimerkeissä osoitetaan, kahdella erityisellä litiumsuolalla, litiumtiosya-naatilla ja litiumperkloraatilla, oli parantuneet hajotus-ominaisuudet verrattuina muihin kationimuotoihinsa. Tällaiset litiumsuolat ovat edullisia, kun halutaan hajottaa 20 erytrosyyttejä riippumatta siitä, halutaanko vai ei lisäksi denaturoida niistä vapautuneita rakenneosia.

On osoittautunut, että erytrosyyttejä hajottavina aineina litiumtiosyanaatti- ja litiumperkloraattisuolat saavat aikaan nopeamman ja täydellisemmän hajotuksen pie-: 25 nempinä pitoisuuksina kuin vastaavat natrium-, kalium- ja ammoniumsuolat. Toisaalta on osoittautunut, että muilla suoloilla on vähäinen tai olematon kyky hajottaa tehokkaasti erytrosyyttejä, erityisesti kloridi-, hydroksidi-ja asetaattisuoloilla kationista riippumatta. Ajatellaan, 30 että kun tietyn anionin natrium-, kalium- tai ammonium-·. suolalla on erytrosyyttejä hajottavia ominaisuuksia, täl laisen suolan litiummuoto saa aikaan tehokkaamman hajotuksen. Niinpä tällaisten litiumsuolojen ajatellaan olevan tämän keksinnön hengen mukaisia ja niitä pidetään näiden 11 102698 globiinijohdannaiselle. Hemoglobiini Ale -määritysten yhteydessä epitoopit voivat olla esimerkiksi muutaman amino-happoyksikön kokoisia glykatoituneita peptidiryhmiä, jotka vastaavat hemoglobiini Alc:n glykatoituneen N-terminaali-5 sen ryhmän sekvenssiä.

Vastaavat kokonaismet-hemoglobiini- ja johdannais-hemoglobiinimääritykset voidaan tehdä käsitellyn verinäytteen samasta osasta tai eri osista. Viimeksi mainitussa tapauksessa määritetään met-hemoglobiini suoraan ensimmäi-10 sestä tilavuusosasta käsiteltyä näytettä, joka on tavallisesti ensin laimennettu asianmukaisesti puskurilla, ja toisesta tilavuusosasta määritetään denaturoitunut hemoglobiini johdannainen edellä kuvatulla tavalla. On myös mahdollista tehdä molemmat määritykset peräkkäin samasta 15 käsitellystä näytteestä, esimerkiksi laimentamalla käsi telty näyte asianmukaisesti, määrittämällä tiosyaani-met-hemoglobiini ja lisäämällä sitten joko immuunimääritysjär-jestelmän reagenssit tai liuos mainitunlaisiin reagenssei-hin.

20 Tämä keksintö tarjoaa käyttöön myös testijärjestel- män kiinnostuksen kohteena olevan hemoglobiinijohdannaisen määrittämiseksi verinäytteestä. Keksinnön mukaiselle testausjärjestelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 6 esitetään. Testijärjestelmä käsittää : 25 hajottavaa/denaturoivaa reagenssia ja reagenssit sen vaikutuksesta erytrosyyteistä vapautuneen hemoglobiini johdannaisen denaturoidun muodon määrän määrittämiseksi im-muunimäärityksellä verinäytteestä, jolle on tehty hajotus ja denaturointi. Kun määrityksellä on tarkoitus mitata 30 kiinnostuksen kohteena olevassa johdannaismuodossa olevan ’ hemoglobiinin suhteellinen määrä, testijärjestelmä käsit tää edullisesti lisäksi edellä kuvatun kaltaista hapetin-ta.

Testijärjestelmä voi olla monissa erilaisissa muo-35 doissa eri reagenssikomponentit sisältäviä yksittäisiä 1Λ 102698 14 200 mmol/1 glysiiniä ja 0,25 % kaliumferrisyanidia {pH 9), ja tasapainotettiin lämpötilassa 37 °C. Hajoamisnopeuden mittaamiseksi tiosyanaattiliuokseen (2,5 ml) pipetoitiin 5 μΐ tuoretta kokoverta. Mitattiin absorbanssi aallonpi-5 tuudella 540 rekisteröiden sitä 30 s:n väliajoin 10 min:n ajan. Hajoamisnopeus määritettiin aikana, joka kului ab-sorbanssiminimin saavuttamiseen (täydellinen hajotus). Tulokset esitetään kuvissa 1 - 4 ja yhteenveto niistä taulukossa 2.

10 TAULUKKO 2

Kationi Tiosyanaattipitoi- Täydelliseen hajotuk- suus (mol/1) seen kulunut aika (min) 15 _____

Kalium 0,1 >10 0,5 >10 1,0 >10 1.25 > 10 20 1,5 6 3.5 1,5

Natrium 0,1 >10 0,5 >10 1,0 > 10 25 1,25 > 10 1.5 5 3.5 4

Ammonium 0,1 >10 0,5 > 10 30 1,0 9 1.25 6 1.5 4 1.5 4 3.5 < 0,5 13 102698 käyttötarkoituksien yhteydessä litiumtiosyanaatin ja li-tiumperkloraatin vastineina.

Tätä keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä haluamatta kuitenkaan rajoittaa sitä.

5 Esimerkit A. Punasolujen (RBC:iden) hajotus tiosyanaatti-suoloilla

Valmistettiin tiosyanaattiliuoksia, joiden konsen-traatio oli 1,5 mol/1 ja jotka sisälsivät erilaisia katio-10 neja, liuokseen, joka sisälsi 200 mmol/1 glysiiniä ja 0. 25 % kaliumferrisyanidia (pH 9), ja tasapainotettiin liuokset lämpötilassa 37 °C. Pipetoitiin 5 μΐ tuoretta kokoverta tiosyanaattiliuokseen (2,5 ml) ja mitattiin ab-sorbanssi aallonpituudella 540 nm lämpötilassa 37 °C re- 15 kisteröiden sitä 30 s:n väliajoin noin 10 min:n ajan. Ha-joamisnopeus ferrisyanidihapettimen läsnä ollessa määritettiin aikana, joka kuluu absorbanssiminimin saavuttamiseen (täydellinen hajotus). Tulokset esitetään taulukossa 1.

20 TAULUKKO 1

Kationi Täydelliseen hajotukseen kulunut aika t‘ 25 Guanidiini < 1 min*

Litium * 1 min

Ammonium * 3 min

Natrium » 5 min

Kalium * 8 min 30 * Guanidiini ei ole yhteensopiva HbAlc-immuunimäärityksen *· kanssa

Edellä kuvattu koe toistettiin käyttämällä pitoisuudeltaan erilaisia tiosyanaattiliuoksia. Tiosyanaat- 35 tiliuokset valmistettiin liuokseen, joka sisälsi 16 102698 magneettisekoittimen levystä käsin. Tämä voidaan tehdä ripustamalla astia sekoittimen levyn yläpuolelle, niin että väliin jää noin 2,5 cm ilmaa eristeeksi.

Kun seosta on sekoitettu 15 tuntia, tuloksena oleva 5 suspensio jaetaan tasaisesti polypropeenisiin sentrifugi-putkiin (noin 10 ml putkea kohden), jotka sopivat Sorvali SS-34 -roottoriin. (DuPont, Wilmington, DE, USA). Suspensiota sentrifugoidaan kierrosnopeudella 15 000 min'1 (kiihtyvyydellä 2700*g) 60 min. Supernatantti dekantoidaan.

10 Pelletti pestään kahdesti 10 mmol/1 glysiinipuskurilla, joka sisältää haluttua päällystysproteiinia [tyypillisesti 1 % proteaasitonta naudan seerumialbumiinia (BSA-pf), jota myy Miles Inc., Elkhart, IN, USA]. Pelletin pesemiseksi lisätään putkessa alun perin ollutta liuostilavuutta vas-15 taava määrä pesuliuosta. Pelletti suspensoidaan uudelleen pyörösekoittamalla voimakkaasti ja tekemällä lyhyt äänikä-sittely (10 - 15 s kerrallaan). Ensimmäisen uudelleensus-pensoinnin jälkeen Ab-lateksin annetaan seistä huoneen lämpötilassa yksi tunti ennen sentrifugointia uudelleen. 20 Ensimmäisen uudelleensuspensoinnin ja sentrifugoinnin jälkeen myöhemmät uudelleen suspensoidut seokset sentrifugoidaan välittömästi pelletin dispergoiduttua täydellisesti. Toisen pesun jälkeen pelletit suspensoidaan uudelleen alkuperäistä reaktiotilavuutta vastaavaan tilavuuteen. Sus-' 25 pensio suodatetaan 0,8 μπΐ:η suodattimen läpi ja säilyte tään lämpötilassa 5 °C.

Pitoisuus määritetään mittaamalla alkuperäisen supernatant in, ensimmäisessä ja toisessa pesussa saadun supernatant in ja suhteessa 1:100 laimennetun lopullisen 30 näytteen absorbanssi aallonpituudella 546 nm. Näiden ab-sorbanssien summan oletetaan olevan 100 % eli vastaavan 0,5-%:ista lateksia. Lopullisen näytteen absorbanssi jaetaan 100%risen absorbanssin laskemiseen käytettyjen absor-banssien summalla. Suhteessa 1:100 laimennetun lopullisen ib 102698

Litium 0,1 >10 0,5 > 10 1,0 5 1,25 1 5 1,5 < 0,5 B. Punasolujen hajotus ja hemoglobiinin denaturoin- ti käyttämällä tiosyanaattisuoloja

Reagenssit 10 (1) Hajottava/denaturoiva reagenssi: 0,5, 1,0 tai 1,5 mol/1 litiumtiosyanaattia tai 1,5 mol/1 ammoniumtio-syanaattia liuoksessa, joka sisältää 200 mmol/1 glysiiniä ja 0,25 % kaliumferrisyanidia (pH 9,0).

(2) Vasta-aine-lateksireagenssi: Vasta-ainepäällys-15 tys tehdään lateksipitoisuuden ollessa 0,5 % (polystyree-nilateksi, läpimitta 0,085 μτη, Seragen, Indianapolis, IN, USA) ja vasta-ainetta [monoklonaalinen vasta-aine, joka on valmistettu US-patenttijulkaisussa 4 647 654 kuvatulla tavalla, puhdistettu vesivatsanesteestä proteiini A - af-20 finiteettikromatografiällä (BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA] käytetään päällystysreaktiossa normaalisti lop-pupitoisuutena 1 mg/1.

Vasta-aineliuos, jonka pitoisuus on kaksinkertainen, valmistetaan laimentamalla tarvittava määrä vasta-25 ainetta 10 mmol/1 glysiinipuskurilla, johon on lisätty NaClta, niin että lopullinen johtokyky on haluttu (0,5 -1,8 mS) . Lateksi, jonka pitoisuus on 2 %, laimennetaan kaksinkertaiseen pitoisuuteen (eli l-%:iseksi) sekoittamalla joukkoon yhtä suuri tilavuus 10 mmol/1 glysiinipus-30 kuria. Reaktio käynnistetään kaatamalla lateksisuspensio *. astiaan, joka sisältää vasta-aineliuoksen. Vasta-aineliu- osta sekoitetaan magneettisekoittimella lisättäessä lateksia. Kaikki liuokset ovat huoneen lämpötilassa. Jatketaan sekoitusta yön yli (vähintään 15 tuntia) huolehtien siitä, 35 että astia on eristetty, niin ettei tapahdu kuumenemista 18 102698

Aminofunktionalisoitua polymeeriä sisältävät fraktiot yhdistettiin ja kylmäkuivattiin. Aminoryhmien määrä polymeerillä määritettiin Habeebin TNBS-määrityksellä [Anal. Biochem. 14 (1966) 328 -336] ja sen havaittiin olevan 5 22/mg polymeeriä.

Aminofunktionalisoitu poly(asparagiinihappo) (10,7 mg) ja SMCC (30 mg) liuotettiin DMF:ään. Reaktiseos-ta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Seokseen lisättiin jäävettä ja aktivoitu polymeeri erotettiin seok-10 sesta BioRad P6-DG -geelikolonnilla. Aktivoidun polymeerin annettiin sitten reagoida 3 min glykatoituneen peptidin (20 mg) kanssa,

/A0H

^ i/cH^-Val-His-Leu-Thr-Tvr-Cvs

OH

joka oli valmistettu menetelmillä, joita kuvataan EP-jul-kaisussa 185 870. Reaktion jälkeen tuote puhdistettiin 20 jälleen P6-DG-geelikolonnilla ja kylmäkuivattiin.

Maleimidoryhmien lukumäärä akivoiduissa polymeereillä määritettiin PDS-määrityksellä [Grassetti ja Murray, Arch. Biochem. Biophys. 119 (1967) 44 - 49] ja sen havaittiin olevan 0,46 jumol/mg polymeeriä. Glc-peptidin 25 määrä polymeereillä määritettiin UV/Vis-absorptiomittauk- sella käyttämällä tyrosiinin moolista ekstinktiokerrointa aallonpituudella 275 nm ja myös sen havaittiin olevan 0,46 /xmol/mg polymeeriä.

Työskentelyliuos valmistetaan varastoliuoksesta, 30 joka sisältää 1,0 mg/ml agglutinointireagenssia vedessä.

Liuos, jossa pitoisuus on 50 μg/ml, valmistetaan laimen-tamalla varastoliuos 20 mmol/1 sitraattipuskurilla (pH 4) , joka sisältää 0,1 % BSA-pf:ää.

102698 näytteen absorptio kerrotaan 100:11a, jolloin saadaan lopullisen näytteen absorbanssi.

Esimerkki: 5 Näyte Ä546

Supernatantti 0,044

Ensimmäinen pesuliuos 0,034

Toinen pesuliuos 0,021

Lopullinen näyte (laimen- 10 nettu suhteessa 1:100) 0,051 x 100 = 5,1 100 % (eli 0,5-%:inen lateksi) = 5,10 + 0,044 + 0,034 + 0,021 = 5,199

Lopullisen näytteen lateksipitoisuus = (5,1/5,199) x 0,5 % = 0,49 % 15 Väkevä Ab-lateksi laimennetaan pitoisuuteen 2,5 % 200 mmol/1 glysiinipuskurilla (pH 9), joka sisältää 0,05 % BSA-pf:ää. Puskuri voi sisältää myös 4 % mannitolia. Laimennuksen jälkeen liuos äänikäsitellään nopeasti (5 - 10 %) .

20 (3) Agglutinointireagenssi: poly(asparagiinihappo) valmistettiin Alpertin menetelmällä [J. Chromatography 266 (1983) 23] .

Aminoetanoli (80 mmol) ja 4,9-dioksa-l,12-dodekaa-nidiamiini (20 mmol) liuotettiin dimetyyliformamidiin ' 25 (DMF) argonin alla. Tämä liuos käsiteltiin poly(asparagii- nihappoa) (10 mmol) ja DMF:ää sisältävällä liuoksella. Reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 1 tunti ja sitten lämpötilassa 70 °C 2 tuntia. Sitten seos jäähdytettiin ja suurin osa nesteestä poistettiin haihduttamalla 30 alipaineessa. Öljymäinen jäännös pestiin useaan kertaan eetterillä ja sitten lämpimällä tetrahydrofuraanilla. Tuote kiinteytettiin ja otettiin talteen suodattamalla. Raa-katuote liuotettiin veteen ja pH säädetiin neutraaliksi. Sitten liuos puhdistettiin BioRad P6-DG -suolanpoistogee-35 likolonnilla (BioRad Labroratories, Richmond, CA, USA) .

20 102698

Menettely

Kokoveri esilaimennettiin sekoittamalla 1 osa verta 4 osaan tislattua vettä punasolujen hajottamiseksi täydellisesti ja veren tarkemman siirtämisen mahdollistamiseksi.

5 Laimennettu näyte (5 μΐ) sekoitettiin hajottavan/denatu-roivan reagenssin (500 μΐ) kanssa ja inkuboitiin sitten lämpötilassa 37 °C. 0,5 ml käsiteltyä verinäytettä sekoitettiin sopivin aikavälein vasta-aine-lateksireagenssin (2,5-%:inen, 10 μΐ) ja agglutinointireagenssin (10 μg/ml, 10 10 μΐ) kanssa ja immuunireaktiota seurattiin mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 540 nm. Täydellinen denatu roituminen määritettiin aikana, joka kului minimiabsor-banssin saavuttamiseen, ja tulokset esitetään kuvassa 5 ja taulukossa 4.

15 TAULUKKO 4

Kationi Tiosyanaattipitoi- Denaturointiin kulunut suus (mol/1) aika (min) 2 0 _

Kalium 0,1 >10 0,5 >10 1,0 > 10 1.25 9-10 25 2,5 riittämätön reaktiivisuus

Natrium 0,1 >10 0,5 > 10 1,0 > 10 1.25 9-10 30 riittämätön reaktiivisuus *: Ammonium 0,1 >10 0,5 >10 1,0 9-10 1.25 2-3 35 riittämätön reaktiivisuus I* 102698

Menettely

Kokoveri (10 μΐ) sekoitettiin hajottavan/denaturoi-van reagenssin (5 ml) kanssa ja annettiin seistä lämpötilassa 37 °C. Sekoitettiin eri aikavälein 0,5 ml käsiteltyä 5 verinäytettä vasta-aine-lateksireagenssin (2,5-%:inen, 10 μΐ) ja agglutinointireagenssin (50 μg/ml) kanssa ja seurattiin immuunireaktiota mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 540 nm. Täydellinen denaturoituminen määritettiin aikana, joka kului minimiabsorbanssin saavuttami-10 seen, ja tulokset esitetään taulukossa 3.

TAULUKKO 3

Kationi Pitoisuus Täydelliseen denaturointiin 15 kulunut aika

Ammonium 1,5 mol/1 » 4 min

Litium 0,5 mol/1 = 2,5 min

Litium 1,0 mol/1 » 1 min

Litium 1,5 mol/1 « 1 min 20 C. Punasolujen hajotus ja hemoglobiinin denaturoin- ti erilaisilla tiosyanaatin kationisuoloilla

Reagenssit Käytettiin samoja reagensseja kuin edellä osassa B 25 seuraavin poikkeuksin: (a) Käytettiin seuraavaa sarjaa hajottavia/de-naturoivia reagensseja: 0,1, 0,5, 1,0, 1,25 ja 2,5 mol/1 tiosyanaattiliuos (litium-, ammonium-, kalium- tai natrium) 200 mmol/1 30 glysiiniliuoksessa, joka sisältää 0,25 % kaliumferrisyanidia (pH 9,0), ja (b) agglutinointireagenssityöskentelyliuos valmistettiin varastoliuoksesta (1,0 mg/ml vedessä) laimentamalla 10 μg/ml liuokseksi 35 20 mmol/1 sitraattipuskurilla (pH 4), joka sisälsi 0,1 % BSA-pf:ää.

Claims (8)

1. 22 1 0 2 6 9 8
2. 1. Analyysimenetelmä hemoglobiinin Ale määrittämiseksi verinäytteestä, jossa menetelmässä (a) verinäyte 5 käsitellään hajottavalla/denaturoivalla reagenssilla, jol loin erytrosyytit hajoavat ja detektoitavissa oleva määrä erytrosyyteistä vapautunutta mainittua hemoglobiini johdannaista denaturoituu, ja (b) tuloksena olevasta seoksesta mitataan immuunimäärityksellä siinä olevan mainitun hemo-10 globiinijohdannaisen denaturoituneen muodon määrä, tunnettu siitä, että hajottavana/denaturoivana reagenssina käytetään erytrosyyttejä hajottamaan ja hemoglobiini johdannaista denaturoimaan pystyvän anionin li-tiumsuolamuotoa, jolloin erytrosyyttien hajotus ja hemo-15 globiinijohdannaisen denaturointi tapahtuu nopeasti li-tiumsuolapitoisuudella, joka ei merkitsevästi häiritse im-muunimääritysvaihetta.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hajottavana/denaturoivana reagens- 20 sinä käytetään litiumtiosyanaattia ja sitä lisätään edullisesti määrä, joka antaa tulokseksi suunnilleen pitoisuuden 0,5 - 3,5 mol/1.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se toteutetaan lämpötilassa, joka 25 on noin huoneen lämpötila - 37 °C.
5. 4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että litiumtiosyanaattia lisätään määrä, joka antaa tulokseksi suunnilleen pitoisuuden 1,25 mol/1.
6. 5. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-4 mukai- nen menetelmä mainitun johdannaisen muodossa olevan hemoglobiinin suhteellisen määrän määrittämiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että verinäyte käsitellään lisäksi hapettimella, edullisesti ferrisyanidisuolalla, jolloin 35 käytännöllisesti katsoen kaikki hajottavan/denaturoivan 21 102698 Litium 0,1 >10 0,5 8-9 1,0 3-4 1,25 < 1 5 2,5 riittämätön reaktiivisuus D. Punasolujen hajotus eri anxonien natrium- ja litiumsuoloilla Valmistettiin hajotusliuokset, jotka sisälsivät 10 1,5 mol/1 perkloraatin, tiosyanaatin, kloridin, hydrok sidin ja asetaatin natrium- ja litiumsuoloja, 200 mmol/1 glysiiniliuokseen (pH 9) ja tasapainotettiin liuokset lämpötilassa 37 °C. Tuore kokoverinäyte (5 μΐ) pipetoitiin hajotusliuokseen (2,5 ml) ja mitattiin absorbanssi aallon-15 pituudella 540 nm lämpötilassa 37 °C rekisteröiden sitä 30 s:n aikavälein 10 min:n ajan. Hajotusnopeus määritettiin absorbanssiminimin saavuttamiseen kuluvana aikana. Tulokset esitetään kuvassa 6 ja ne on koottu taulukkoon 5.
7. 20 TAULUKKO 5 Suolalius Täydelliseen hajotukseen (1.5 mol/1) kulunut aika_ LiSCN 1 min . 25 NaSCN 4 min LiCl04 2 min NaC104 6 min Li-asetaatti hidas ja epätäydellinen
8. 30 Kloridi- ja hydroksidisuolojen kohdalla ei havaittu : hajotusta pitoisuuteen 2,8 mol/1 mennessä määrityspuskuri- järjestelmässä. Asetaatin ollessa kyseessä havaittiin jonkin verran hajotusta, mutta se oli epätäydellinen. Keksintöä on kuvattu edellä yksityiskohtaisesti ja 35 esimerkkien avulla. On selvää, että keksinnöstä voidaan tehdä muita variaatioita ja muunnoksia poikkeamatta sen ; hengestä ja suoja-alasta. 24 102698