JP2000180446A

JP2000180446A - 干渉作用を回避する方法及び試薬

Info

Publication number: JP2000180446A
Application number: JP35247498A
Authority: JP
Inventors: Sachiko Yamamoto; 幸子山本; Shinzo Obata; 伸三小畠
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1998-12-11
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2000-06-30
Anticipated expiration: 2018-12-11
Also published as: JP4178632B2

Abstract

(57)【要約】【課題】自動分析装置による補体価測定における血清試
料等の測定試料による測定系への干渉作用を軽減させた
測定方法及び測定用試薬を提供する。【解決手段】ヒト免疫グロブリンに特異的に結合する抗
体の存在下で補体価を測定することを特徴とする、補体
価測定方法、補体価測定試薬および補体価測定キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の補体価を
定量分析するための測定方法及び試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】補体系はヒトなどの動物の血清中に存在
する約20種の蛋白質の総称であり、主として免疫複合体
により活性化される古典的経路と、多糖類などにより活
性化される第二経路の二つの活性化経路を持つ。古典的
経路とは、主に細菌等の細胞膜上の抗原に、これに対す
る抗体が結合して形成される免疫複合体により補体成分
が秩序をもって次々と活性化され、最後は細胞膜を破壊
し、細菌等は死滅又は溶解するという作用を示す。ま
た、溶血素で感作された赤血球が補体により溶血に到る
反応や、ハプテンで感作されたリポソームに抗ハプテン
抗体を反応させると補体によりリポソーム膜が破壊され
る反応は古典的経路の作用による。一方、第二経路では
抗体の関与は必要なく、例えば細菌の細胞壁の構成成分
である多糖やウイルスとの接触のみで補体が活性化され
る。

【０００３】近年、補体系の活性、即ち補体価の測定
は、急性糸球体腎炎、自己免疫疾患等の診断や、治療の
指標として注目されている。

【０００４】現在、一般的に補体価の測定は、溶血素で
感作したヒツジ赤血球を用いて、補体の溶血活性を測定
するMayerの50％溶血法及びその変法が広く用いられて
いる［「臨床検査法提要」,1233〜1234頁,第29版第5刷,
昭和60年,金原出版(株)；J.Clin.Chem.,12,143(1983)
等］。しかし、この方法では同一検体につき何種類かの
希釈度に希釈した試料を用意しなければならず、それが
測定に誤差を与える原因となっており、また、50％溶血
が起こる量をグラフより求めるという繁雑な方法でもあ
る。更に、ヒツジ赤血球を用いるが、生体由来の赤血球
は不安定であり、動物の個体差により赤血球の補体に対
する感受性が異なる（ロット間差がある）等の問題があ
る。

【０００５】一方、より簡便に補体価を測定するために
反応時間を短くし（５〜10分）、自動分析装置への適応
を可能とした方法として、感作血球により活性化された
補体によって生じる感作血球懸濁液の濁度の変化に基づ
いて補体活性値を求める、赤血球を用いる補体価測定方
法（臨床検査、32(12)、1537-1540、1998）や、赤血球
の代わりに、より安定でロット間差が少なく、補体活性
により膜損傷を受けるリポソームを用いた補体価測定方
法（YAMAMOTO.S Clin.Chem.41/4,586-590,1994、特開平
7-110331号公報、特開平7-140147号公報等）が近時提案
されている。

【０００６】しかし、Mayer法では補体価を測定する際
の反応時における血清試料の希釈倍率が、約160〜480倍
であるのに対し、自動分析装置への適応を可能とした補
体価測定用試薬に於けるその希釈倍率は、赤血球を使う
試薬で約100〜110倍、リポソームを使う試薬では35〜45
倍程度である。そのため、血清試料の試薬に対する比率
が相対的に高くなるため、自動分析装置による補体価測
定の際には、血清試料による測定系への干渉作用が懸念
されており、実際に、赤血球及びリポソームを用いた補
体価測定において、リウマチ因子陽性血清試料を用いる
と、試料により干渉作用を受けている可能性が示唆され
ている（「第４４回日本臨床衛生検査学会要旨集」,演
題365,1995、「医学と薬学」35(5),1163-1167,1996）。

【０００７】

【本発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した
如き状況に鑑みなされたもので、自動分析装置による補
体価測定における血清試料等の測定試料による測定系へ
の干渉作用を軽減させた測定方法及び測定用試薬を提供
することを目的とする。

【０００８】

【問題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するためになされたものであり、「ヒト免疫グロブリ
ンに特異的に結合する抗体の存在下で補体価を測定する
ことを特徴とする、補体価測定方法。」，「ヒト免疫グ
ロブリンに特異的に結合する抗体を含有する、補体価測
定用試薬。」，「ヒト免疫グロブリンに特異的に結合す
る抗体を含有する試薬と、膜上に抗原が固定化された標
識物質内包リポソームを含有する試薬と、膜上に固定化
された抗原に対する抗体を含有する試薬とを含んでなる
補体価測定用試薬キット。」及び「ヒト免疫グロブリン
に特異的に結合する抗体を含有する試薬と、溶血素感作
血球を含有する試薬とを含んでなる補体価測定用試薬キ
ット。」に関する。

【０００９】即ち本発明者らは、赤血球及びリポソーム
を用いて補体価を測定するに際し、測定試料中の例えば
リウマチ因子等から受ける干渉作用を抑制する方法を見
出すべく鋭意研究の結果、測定時にヒト免疫グロブリン
に特異的に結合する抗体（以下、本発明に係る抗体と略
記する場合がある。）を共存させることにより、測定試
料中の共存物質から受ける干渉作用を軽減し、より正確
な補体価測定が可能となることを見出し、本発明を完成
するに至った。

【００１０】本発明に係る抗体としては、ヒト免疫グロ
ブリンに特異的に結合する抗体であればいずれでもよい
が、それ自身が古典的経路の補体活性化能を有しない抗
体が望ましく、例えば、マウスIgG1、マウスIgA、ラッ
トIgG1、ラットIgA等のそれ自体が古典的経路の補体価
活性化能を有しない抗体や、古典的経路の補体活性化能
を有する抗体を、常法、例えば「免疫生化学研究法、第
１版第１刷、（株）東京化学同人,1986」等に記載の方
法に準じて、ペプシン消化やパパイン消化等を行い、補
体の結合部位であるFc部分を除いた、F(ab')₂フラグメ
ントやFab'フラグメント等が挙げられる。中でもマウス
IgG1が好ましい。

【００１１】これらの抗体は、血清中或は腹水中に含有
された状態で使用してもよいが、例えば「免疫生化学研
究法，第１版第１刷，（株）東京化学同人,1986」等に
記載の方法に準じて、硫安分画、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の方法により、精製して用いる
ことが望ましい。また、Fc部分の除去操作を行う場合
は、当該操作後、精製して用いることが望ましい。

【００１２】また、本発明に係る抗体は、例えば「免疫
実験学入門、第２刷、松橋直ら、（株）学会出版センタ
ー、1981」等に記載の方法に準じて、馬、牛、羊、兎、
山羊、ラット、マウス等の動物にヒト免疫グロブリンあ
るいはそのフラグメントを免疫して作製されるポリクロ
ーナル抗体でも、或は、ケラーとミルスタイン（Natur
e,256巻,495頁,1975）により確立された細胞融合法に従
い、マウスの腫瘍ラインからの細胞と、ヒト免疫グロブ
リンあるいはそのフラグメントで予め免疫されたマウス
の脾細胞とを融合させて得られるハイブリドーマが産生
するモノクローナル抗体の何れでもよいが、モノクロー
ナル抗体が好ましい。これらは単独で用いてもよく、或
は適宜組み合わせて用いてもよい。

【００１３】本発明に係る抗体が特異的に結合するヒト
免疫グロブリンとしては、特に限定されないが、ヒトIg
A、ヒトIgM、ヒトIgG等が挙げられる。

【００１４】本発明の補体価測定方法は、上記した如き
本発明に係る抗体を測定時に存在させる以外は、リポソ
ームや赤血球を用いる自体公知の測定法、例えば、YAMA
MOTO.S Clin.Chem.41/4,586-590,1994、特開平7-110331
号公報、特開平7-140147号公報や、臨床検査，32(12)，
1537-1540，1998に準じて実施すればよく、使用される
その他の試薬類もこれら自体公知の測定法に準じて適宜
選択すればよい。

【００１５】即ち、測定試料を、本発明に係る抗体の存
在下で上記した如きリポソームや赤血球を用いる自体公
知の測定法に準じて測定することにより、試料中の補体
価を簡便に且つ精度よく測定することができる。

【００１６】また、本発明に係る抗体は、測定時に、例
えば、血清、血漿等の測定試料１μｌに対する抗体蛋白
量が、通常１×10^-6〜10ｍｇ、好ましくは５×10^-5〜１
×10 ^-2ｍｇとなるように使用される。

【００１７】本発明の測定方法に於いては、リポソーム
又は赤血球と、試料とを反応させる際に、最終的に本発
明に係る抗体を上記した如き濃度範囲で共存させればよ
く、その方法については特に限定されない。

【００１８】具体的には、例えば、上記した如き自体公
知の補体価測定用試薬中に、本発明に係る抗体を含有さ
せ、これと試料とを混合する方法、例えば本発明に係る
抗体を含有する緩衝液等の溶液で試料を希釈し、該希釈
試料と上記した如き補体価測定用試薬とを混合する方法
等が挙げられる。

【００１９】本発明に係る抗体を測定系に添加する時期
は補体価の測定を開始する前であればいつでもよいが、
補体が活性化される以前に添加することが望ましい。即
ち、本発明に係る抗体を測定系に添加する時期として
は、リポソームを用いた方法に於いては、リポソーム表
面に形成された抗原抗体複合物によって試料中の補体が
活性化される以前が、また、赤血球を用いた方法に於い
ては、赤血球膜上の免疫複合体によって試料中の補体が
活性化される以前が、夫々望ましい。また、上記した如
き自体公知の補体価測定用試薬に用いられるリポソー
ム、当該リポソーム内に内包される標識物質、当該リポ
ソームに固定される抗原及び当該抗原に対する抗体或い
は溶血素で感作させた赤血球は、通常用いられるもので
あれば何れにてもよく、特に限定されない。

【００２０】即ち、本発明に用いられるリポソームとし
ては、通常この分野で使用されているものは全て使用可
能であるが、例えば、ジステアロイルホスファチジルコ
リン，ジミリストイルホスファチジルグリセロール（Ｄ
ＭＰＧ），卵黄ホスファチジルグリセロール等を原料と
して、自体公知の調製方法、例えば、J.liposome Res.,
1(3),339〜377(1989-90)、「ライフサイエンスにおける
リポソーム実験マニュアル」,寺田弘,吉村哲郎編著,シ
ュプリンガー・フェアラーク東京(株),1992年やClin.Ch
em.41/4.586〜590(1995)等に記載された方法等を用いて
調製されたもの等が望ましい。中でも、Clin.Chem.41/
4.586〜590(1995)の方法により調製されたものが好まし
い。

【００２１】また、リポソーム内に内包される標識物質
としては、通常この分野で使用されているものは全て使
用可能であるが、例えば、酵素、補酵素、色素、水溶性
の蛍光物質、糖類、イオン性化合物、キレート指示薬、
色素、スピンラベル化合物等、リポソームの膜傷害によ
って膜外に放出されて検出され得るもの等が好ましく、
中でも、酵素を標識物質に用いることが望ましい。ま
た、その内包方法も、従来公知の調製方法、例えば、
「ライフサイエンスにおけるリポソーム実験マニュア
ル」,寺田弘,吉村哲郎編著，60〜89頁,シュプリンガー
・フェアラーク東京(株),1992年、特開平7-110331号公
報、特開平7-140147号公報等に記載されている方法に準
じて行えばよい。

【００２２】リポソーム膜表面に固定させる抗原として
は、リポソーム膜に組み込むことができる抗原であれば
何れにてもよいが、例えば、フォルスマン抗原、ＧＭ₁
等の糖脂質抗原、ジニトロベンゼン、トリニトロベンゼ
ン等の芳香族有機化合物、サイロキシン等のホルモン、
テオフィリン、フェニトイン等の薬物等が挙げられる。
また、これらをリポソーム膜に組み込む方法としては、
フォルスマン抗原については、例えばBiochemistry,8,4
149(1969)に記載の方法、糖脂質抗原については、例え
ばJ.Immunol.Methods,85,53〜63(1985)に記載の方法、
ジニトロベンゼンやトリニトロベンゼンについては、例
えばBiochemistry,Vol.11,No.22,4085(1972)やJ.Immuno
l.Methods,123,19〜24(1989)に記載の方法、サイロキシ
ンについては、例えばBio.Technology,April,349(1984)
に記載の方法、テオフィリンやフェニトインについて
は、例えばJ.Chem.Pharm.Bull.,36,1086(1988)やClin.C
hem.,38,808(1992)に記載の方法等が挙げられる。

【００２３】また、リポソーム膜表面に抗原を固定させ
る方法としては、通常この分野で使用される方法であ
る、例えば、架橋法［「続生化学実験講座５」,免疫生
化学実験法,第1版第1刷,(社)日本生化学会編,(株)東京
化学同人,144〜148頁,1986年3月14日；Biochemistry,2
0,4229〜4238(1981)；J.Biol.Biochem.,257,286〜288(1
982)］も挙げられる。

【００２４】本発明に於て使用されるリポソーム膜表面
上の抗原に対する抗体としては、リポソームに感作して
いる抗原に対する抗体であれば何れでもよく、その由来
に特に制限はない。例えばヤギ、ウサギ、ウマ、ヒツ
ジ、マウス由来のもの等が挙げられる。

【００２５】一方、赤血球としては、ヒツジ、ウサギ、
ウマ、ウシ、ヤギ、ラット、マウス等の動物から得られ
る赤血球が使用可能であり、また、感作させる溶血素
（抗体）としては、用いられる赤血球に対する抗体が挙
げられ、これらは常法により得られるモノクローナル抗
体でも、例えば、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、
ラット、マウス等の動物から得られるポリクローナル抗
体でも良いが、ヒツジの赤血球と抗ヒツジ赤血球ウサギ
抗体から調製された感作ヒツジ赤血球が望ましい。

【００２６】リポソームを用いた本発明の補体価測定方
法は、例えば下記のごとく行えばよい。

【００２７】即ち、先ず、標識物質を内包し、その膜上
に抗原が固定化されたリポソームと、試料（例えば補体
を含むヒト血清等）とリポソーム膜上に固定された抗原
に対する抗体及び標識物質の検出に必要な物質ならびに
抗ヒト免疫グロブリン抗体とを適当な緩衝液中で混合
し、37℃で５〜10分間反応させる。次いで、リポソーム
膜上に形成された免疫複合体で活性化された補体により
リポソーム膜が損傷を受けた結果リポソーム外に流出し
た標識物質量をその性質に基づいて測定し、得られた値
を、例えば、あらかじめ補体価既知の血清を用い同様の
操作をおこなって得た、補体価と標識物質量との関係を
表す検量線に当てはめることにより、試料中の補体価を
求めることができる。

【００２８】また、感作ヒツジ赤血球を用いた本発明の
補体価測定方法は例えば下記のごとく行えばよい。

【００２９】即ち、試料（例えば補体を含むヒト血清
等）と、感作血球適当量と、抗ヒト免疫グロブリン抗体
とを適当な緩衝液中で混合し、37℃で５〜10分間反応さ
せると、赤血球膜上の免疫複合体で活性化された補体に
より、感作赤血球膜が溶血するので、感作血球懸濁液の
濁度が減少する。この濁度の減少量を測定し、この値
を、例えば、あらかじめ補体価既知の血清を用い同様の
操作をおこなって得た、補体価と濁度の減少量との関係
を表す検量線に当てはめることにより試料中の補体価を
求めることができる。また、用手法で行う場合は、反応
液を冷却後遠心し、その上清のヘモグロビン量を測定
し、この値を用いることよっても、補体価を測定するこ
とができる。

【００３０】なお、ヒト補体価の単位は、例えば、前述
のMayerの方法ではCH50値として表現されているが、CH5
0に限定されるものではない。

【００３１】本発明の補体価測定用試薬は、リポソーム
や赤血球を用いる補体価測定用試薬に本発明に係る抗体
を含有させた点に特徴を有するものであり、当該抗体の
好ましい実施態様や使用濃度等は上記で述べたとおりで
ある。

【００３２】本発明の補体価測定用試薬は、緩衝剤を含
んでいてもよく、これに用いられる緩衝剤としては、例
えばリン酸及びその塩、ホウ酸及びその塩、トリス(ヒ
ドロキシメチル)アミノメタン（Tris），グッド緩衝剤
(Good's Buffer)，ベロナール緩衝剤等が挙げられる
が、これらに限定されるものではなく、通常用いられる
緩衝剤であれば何れも使用可能である。

【００３３】また、本発明の測定用試薬には、牛血清ア
ルブミン、ゼラチン等の蛋白質、糖、キレート剤、還元
剤、防腐剤等の、通常この分野に於いて使用される添加
物等や、リポソームを用いる場合であって内包された標
識物質が酵素である場合は、更にその基質等を、必要に
応じて適宜添加してもよい。

【００３４】本発明に於いて用いられる各種試薬類や、
標識物質が酵素である場合に用いられる基質等は、自体
公知の酵素測定法に於いて通常用いられる濃度範囲から
適宜選択して用いればよい。

【００３５】本発明の測定法に用いられる試薬キット
は、自体公知の補体価測定のための試薬キットに本発明
に係る抗体を加えたものである。即ち、例えば、リポソ
ームを用いる補体価測定用試薬キットとしては、標識物
質を内包し且つこの膜表面に抗原が固定化されたリポソ
ーム含有試薬、当該抗原に対する抗体含有試薬及び本発
明に係る抗体等を含有させた試薬等を含んでなるものが
挙げられ、又、赤血球を用いる補体価測定用試薬キット
としては、赤血球と抗赤血球抗体とから調製された感作
血球を含有する試薬と本発明に係る抗体等を含有させた
試薬等を含有してなるものが挙げられる。

【００３６】本発明のキットには、補体標準液を添付し
てもよく、補体標準液としては、ヒト、ラット、ヤギ又
はヒツジ由来の血清が挙げられる。これら動物種の系統
は特に限定されない。また、これらの動物種由来の補体
標準液としては、各種新鮮血清の凍結乾燥品を水又は適
当な溶解液で溶解させたものでもよく、また、これを更
に適当な溶液で希釈したもの、限外濾過法等で濃縮した
もの、補体反応に関与しない成分を除いたもの等も使用
可能である。また、これに必要に応じて通常この分野で
用いられる糖、蛋白質、防腐剤、安定化剤、緩衝剤等を
添加してもよい。

【００３７】以下に実施例をあげて本発明を更に具体的
に説明するが、これらの実施例は本発明を何ら制限する
ものではない。

【実施例】実施例１．（１）補体価測定用リポソームの調製グルコース-６-リン酸脱水素酵素(G6PDH)を内包し、ジ
ニトロベンゼンが膜上に固定化されたリポソームを、ラ
イフサイエンスにおけるリポソーム実験マニュアル（寺
田弘、吉村哲郎編著:シュプリンガー・フェアラーク東
京株式会社,60-89 1992年）に記載されたボルテックス
イング法によるリポソーム調製法に準じて以下のように
調製した。

【００３８】即ち、ジミリストイルホスファチジルコリ
ン(DMPC)71μmol、ジミリストイルホスファチジルグリ
セロール(DMPG)8μmol、コレステロール82μmol、及び
ジニトロベンゼンのホスファチジルエタノールアミン誘
導体（AVANTI社製）0.8μmolとをナスフラスコに計りこ
み５mlのクロロホルムを加えて溶解した後、ロータリー
エバポレーターを用いて減圧乾燥させた。これに G6PDH
水溶液 7.5ml[ 2500U/ml、in 10mM トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン(Tris/HCl)緩衝液(pH7.8)]を加
えボルテックスミキサーで混和した。このようにして得
られた脂質水和液をポアサイズ0.2μmのフィルターを通
して整粒した。得られたリポソーム懸濁液を遠心チュー
ブに移し、４℃、36000rpmで遠心してリポソームに内包
されなかった酵素を除き、最後に 100mM Tris/HCl緩衝
液(pH7.8)に懸濁して、補体価測定用リポソームを得
た。

【００３９】（２）補体価測定用リポソーム試薬の調製上記（１）で調製した補体価測定用リポソームを脂質濃
度が５nmol/mlとなるように、145mmol/L NaCl含有60mM
Tris/HCl緩衝液(pH8.0）で希釈し、補体価測定用試液１
を調製した。また、十分量のヤギ抗ＤＮＰ抗体、酵素基
質［24mM グルコース-6-リン酸（Ｇ６Ｐ）、９mM ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）］、145
mmol/L NaCl、1.5mmol/L MgCl₂及び0.45mmol/L CaCl₂
を含む、10mMマレイン酸／NaOH緩衝液（pH5.5）を調製
し、補体価測定用試液２とした。

【００４０】（３）抗ヒトIgMモノクローナル抗体の作
製精製ヒトIgM（オリエンタル酵母社製）をフロイント完
全アジュバントとともにBALB/cマウス（♀）に免疫（２
回）後、摘出した脾臓細胞とミエローマ細胞（F0）とを
ポリエチレングリコールを用いる常法（例えば特開平５
−244983号に記載された方法等）により融合させた。そ
の後、常法により抗ヒトIgＭモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを選別し、これを培養して抗ヒトIgＭモノ
クローナル抗体IgG1（クローンNo.101及び102）を得
た。

【００４１】（４）F(ab')₂化抗体の作製ヤギの抗ヒトIgM抗体（ＩＩＣ社製）をイオン交換クロ
マトグラフィーを用いる常法により精製して得た、ヤギ
の抗ヒトIgM抗体IgG分画を、ペプシン消化後、ゲルろ過
を行う常法（例えば「免疫生化学研究法、第１版第１
刷、（株）東京化学同人,1986」に記載された方法）に
より精製してそのF(ab')₂を得た。

【００４２】（５）干渉作用回避効果の比較上記（２）で調製した補体価測定用試液２に種々の抗体
を添加し、補体価への干渉作用回避効果の比較を行っ
た。なお、補体価測定用試液２への添加量は抗体蛋白量
として各々０.１mg/mlとした。

【００４３】尚、干渉作用回避効果は、以下に示す方法
で調べた。

【００４４】補体価への干渉作用があることが確認され
ている血清試料10μlと補体価測定用試薬１ 250μlとを
混合し、37℃で５分間インキュベーションした後、所
定の抗体を添加した補体価測定用試薬２を125μlを加
え、更に37℃で５分間反応させ４〜５分間放置後、G6PD
H の活性値を、１分間あたりの340nmの吸光度変化（△
Ａ１）として測定した。さらに、先に用いた干渉作用が
ある血清試料と同等の補体価を有し、干渉作用が無いこ
とが確認されている血清についても、各々の試薬を用い
て同様の操作を行い△Ａ２を得た。これらの値を下記式
に当てはめ、干渉作用回避率を求めた。

【００４５】

【００４６】得られた値を表１に示す。また、抗体無添
加の補体価測定用試薬２を用い、干渉作用のない血清試
料を測定して求めた△Ａ２を100とし、各種抗体を添加
した補体価測定用試薬２を用いて求めた△Ａ２のこれに
対する比率を、補体活性維持率として表２に示す。

【００４７】

【表１】

【００４８】表１

【００４９】表１の結果から、抗ヒトIgMモノクローナ
ル抗体・クローンNo.101、抗ヒトIgMモノクローナル抗
体・クローンNo.102及びＦ(ab')₂化抗ヒトIgMヤギ抗体
等のヒト免疫グロブリンを認識する抗体に、試料の補体
価への干渉作用を回避する効果があることがわかった。
特に、抗ヒトIgMモノクローナル抗体・クローンNo.101
でその効果が最も大きかった。

【００５０】

【表２】

【００５１】表２

【００５２】表２の結果から、抗ヒトIgMモノクローナ
ル抗体・クローンNo.101、抗ヒトIgMモノクローナル抗
体・クローンNo.102及びＦ(ab')₂化抗ヒトIgMヤギ抗体
の、補体活性維持率はほぼ100％であり、これらの抗体
は補体活性を阻害しないことがわかった。

【００５３】実施例２．（１）補体価測定用赤血球試薬の調製 1mmol/L MgCl₂、0.15mmol/L CaCl₂及び0.1%ゼラチンを
含む、イオン強度0.147のベロナール緩衝液（pH7.4）を
調製し、補体価測定用試液３とした。また、この一部に
実施例１で用いた抗ヒトIgMモノクローナル抗体（クロ
ーンNo.101）を0.014mg/mlとなるように添加し、補体価
測定用試液４とした。

【００５４】ヒツジ赤血球に溶血素［抗ヒツジ赤血球抗
体（ウサギ）］を常法（例えば「補体学」稲井ら著、12
2-126頁,第2刷,昭和58年,医歯薬出版株式会社、）によ
り感作し、感作ヒツジ赤血球を得た。これを3.3×10⁸個
／ｍｌとなるように補体価測定用試液３で希釈し、補体
価測定用試液５を調製した。

【００５５】（２）干渉作用回避効果の比較上記（１）で調製した補体価測定用試薬を用い、以下に
示す方法で測定を行って干渉作用回避効果を調べた。

【００５６】補体価への干渉作用があることが確認され
ている血清試料3μlと、補体価測定用試薬３又は４ 260
μlとを混合し、37℃で５分間インキュベーションした
後、補体価測定用試薬５を60μlを加え、更に37℃で５
分間反応させ、その５分間に減少した濁度を660nmで測
定した（△Ａ３）。さらに、先に用いた干渉作用がある
ことが確認されている血清試料と同等の補体価を有し、
干渉作用が無いことが確認されている血清についても、
それぞれの試薬で同様の操作を行い△Ａ４を得た。これ
らの値を下記式に当てはめ、干渉作用回避率を求めた。

【００５７】

【００５８】得られた値を表３に示す。また、補体価測
定用試薬３を用い、干渉作用のない血清試料を測定して
求めた△Ａ４を100とし、補体価測定用試薬４で求めた
△Ａ４の比率を、補体活性維持率として表４に示す。

【００５９】

【表３】

【００６０】表３

【００６１】

【表４】

【００６２】表４

【００６３】表３及び４の結果から、抗ヒトIgMモノク
ローナル抗体・クローンNo.101は血清試料の補体活性を
阻害せず、しかも測定試料による補体価への干渉作用を
回避できることがわかった。

【００６４】

【発明の効果】本発明は、測定用試薬にヒト免疫グロブ
リンを認識する抗体を添加することを特徴とする補体価
測定方法及びその試薬を提供するものであり、本発明を
使用することによって、測定試料中のリウマチ因子等か
ら受ける補体価への干渉作用を軽減し、良好な再現性で
高精度に補体価が測定できるという顕著な効果を奏す
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト免疫グロブリンに特異的に結合する抗
体の存在下で補体価を測定することを特徴とする、補体
価測定方法。
【請求項２】補体価測定方法が、標識物質を内包しその
膜上に抗原を固定化したリポソームと当該抗原に対する
抗体を用い、当該抗原固定化部位における抗原抗体反応
によって活性化された補体が当該リポソームを破壊する
ことにより当該リポソーム内から放出される標識物質の
量から補体活性値を求めるものである、請求項１に記載
の測定方法。
【請求項３】補体価測定方法が、溶血素で感作した赤血
球膜上の免疫複合体により活性化された補体によって生
じる感作血球懸濁液の濁度の変化に基づいて補体活性値
を求めるものである、請求項１に記載の測定方法。
【請求項４】抗体がモノクローナル抗体である、請求項
１、２、又は３に記載の測定方法。
【請求項５】ヒト免疫グロブリンに特異的に結合する抗
体を含有する、補体価測定用試薬。
【請求項６】抗体がモノクローナル抗体である、請求項
５に記載の測定用試薬。
【請求項７】ヒト免疫グロブリンに特異的に結合する抗
体を含有する試薬と、膜上に抗原が固定化された標識物
質内包リポソームを含有する試薬と、膜上に固定化され
た抗原に対する抗体を含有する試薬とを含んでなる補体
価測定用試薬キット。
【請求項８】ヒト免疫グロブリンに特異的に結合する抗
体を含有する試薬と、溶血素感作血球を含有する試薬と
を含んでなる補体価測定用試薬キット。