WO2023157950A1 - 非特異反応抑制剤 - Google Patents

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WO2023157950A1
WO2023157950A1 PCT/JP2023/005758 JP2023005758W WO2023157950A1 WO 2023157950 A1 WO2023157950 A1 WO 2023157950A1 JP 2023005758 W JP2023005758 W JP 2023005758W WO 2023157950 A1 WO2023157950 A1 WO 2023157950A1
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peptide
antibody
specific
peg
reaction
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小島 佳奈子 山口
竜也 吉田
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株式会社Ｌｓｉメディエンス
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials

Definitions

  • the present invention relates to a non-specific reaction inhibitor for suppressing non-specific reactions that hinder accurate detection and quantification of trace substances in immunoassay methods.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-287801 discloses that as a method for suppressing non-specific reactions, antibodies against non-specific reactive substances are allowed to coexist in measurement reagents to reduce non-specific reactions caused by non-specific reactive substances in the sample.
  • IgG or IgM is used as an antibody against a non-specific reaction substance
  • immune complex formation with the non-specific reaction substance causes an immune nephelometric reaction
  • latex immunonephelometry is used for accurate measurement.
  • the value may not be indicated.
  • As a countermeasure against this problem if the amount of IgG or IgM added to the non-specific reaction substance is reduced, there are cases where a sufficient non-specific suppression effect cannot be obtained.
  • IgG is fragmented into F(ab′) 2 to reduce the hydrophobicity, allowing a large amount to be added to the reagent and making the immunological nephelometric reaction less likely to occur. can.
  • the cause was presumed to be the attenuation of the non-specific inhibitory effect due to the decomposition of F(ab') 2 into Fab'.
  • the low non-specific inhibitory effect of Fab' indicates the possibility that the molecular size is insufficient.
  • the inventors discovered that even a very small peptide of about 1 kDa can be efficiently inhibited against non-specificity by binding a PEG of about 5 kDa to a peptide of about 5 kDa, even though the molecular weight is smaller than that of Fab'. effect.
  • a nonspecific reaction inhibitor for immunoassay comprising a complex of a peptide or nucleic acid molecule that specifically binds to a nonspecific reaction substance and a polymer compound.
  • the nonspecific reaction inhibitor of [1] wherein the substance that specifically binds to the nonspecific reaction substance is a substance that can be chemically synthesized.
  • the nonspecific reaction inhibitor according to [1] or [2], wherein the complex is 50 kDa or less.
  • the nonspecific reaction inhibitor according to any one of [1] to [4], wherein the nonspecific reaction substance is immunoglobulin.
  • An immunoassay method characterized by using a complex of a peptide or nucleic acid molecule that specifically binds to a non-specific reactant and a polymer compound.
  • the immunoassay is latex agglutination optical assay, immunonephelometry, immunoturbidimetry, chemiluminescence immunoassay, enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, or radioimmunoassay , the immunological assay method of [6].
  • the cost is lower than that of biological raw materials, and because chemical synthesis is possible, lot differences can be reduced.
  • the present invention since it has a lower molecular weight, it has high solubility, and it is possible to secure a sufficient amount to be added.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram explaining each step of measurement by Octet (trademark) R2.
  • the nonspecific reaction inhibitor of the present invention includes a complex of a peptide or nucleic acid molecule (hereinafter sometimes referred to as a binding partner) that specifically binds to a nonspecific reaction substance and a polymer compound.
  • a binding partner a peptide or nucleic acid molecule
  • non-specific reactive substance refers to a substance that induces a non-specific reaction in an immunoassay method that utilizes an antigen-antibody reaction.
  • Specific factors include human IgM, human IgG, human IgA, human IgE, human IgD, and factors that bind to the antibody, such as complement, rheumatoid factor, Fc receptor, etc., when human body fluid is used as a sample. Examples include IgM, IgG, IgA, and IgE of the animal, and factors that bind to the antibody when the body fluid of an animal other than human is used as the sample.
  • immunoassay examples include latex agglutination optical assay, immunonephelometry, immunoturbidimetry, chemiluminescence immunoassay, enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, radioimmunoassay, and the like. mentioned. Assays without a B/F separation step, such as latex agglutination optical assays, immunonephelometry, and immunoturbidimetric assays, are particularly susceptible to non-specific reactants. In such a measurement method, the concentration of the test sample during the antigen-antibody reaction is often about several percent.
  • the nonspecific reaction inhibitor of the present invention ensures a sufficient amount to be added. be able to. All of them utilize an antigen-antibody reaction, but antibodies that detect target antigens include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. In any measurement method, the nonspecific reaction inhibitor of the present invention may be added to the test sample before or during the antigen-antibody reaction, preferably before the antigen-antibody reaction. should be.
  • Binding partners that specifically bind to non-specific reactive substances used in the present invention include peptides or nucleic acid molecules (e.g., aptamers).
  • antibodies or Fab' or higher antibody fragments are used. It is characterized by not doing it.
  • the molecular weight of said binding partner is typically 0.5-47 kDa, preferably 0.8-15 kDa, more preferably 1-8 kDa.
  • the solubility is high and a sufficient addition amount can be ensured. According to the present invention, it is possible to increase the amount of the non-specific reaction inhibitor added in the reaction system in which immune complexes are formed. It is possible, and it is also possible to increase the concentration of the test sample in the reaction system.
  • the binding partner used in the present invention is preferably a substance that can be chemically synthesized. Since the present invention does not use an antibody or an antibody fragment, it is possible to provide a non-specific reaction inhibitor that is inexpensive and has little lot variation.
  • the binding partner can appropriately contain functional groups for polymer compound modification, biotin, spacers, and the like.
  • the nonspecific reaction inhibitor of the present invention (that is, a complex of a binding partner of a nonspecific reaction substance and a polymer compound) includes, for example, a chemically modified peptide or nucleic acid molecule chemically modified with a polymer compound, or , a complex of a peptide or nucleic acid molecule and a macromolecular compound bound by a biotin-avidin bond.
  • a thiol group, an amino group, a hydroxyl group, or a carboxyl group can be targeted and bound via a "reactive derivative.”
  • "Reactive derivatives" used in thiol-targeted modifications include, for example, thiol-selective reactive groups such as maleimides and vinyl sulfones.
  • a polymer in which a reactive derivative is directly bound may be used, or a cross-linking agent containing a reactive derivative may be used.
  • Reactive derivatives used in modification targeting amino groups include, for example, N-hydroxysuccinimide (NHS) esters, N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) esters, and the like. Further, there are compounds containing an aldehyde group (for example, glutaraldehyde) and polymers that contain an aldehyde group in advance. Carboxyl-targeted modifications include, for example, conjugates obtained by catalyzed reaction of carbodiimide (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride) with amino groups.
  • target hydroxyl groups can be prepared, for example, using compounds containing isocyanate derivatives.
  • the polymer into which the reactive derivative has been introduced may be obtained as a commercial product (for example, NOF CORPORATION), or may be prepared using an ordinary chemical method.
  • the present invention also includes a method that utilizes a binding mode with high affinity, such as biotin and avidin, where the binding mode between the binding partner and the polymer is not a covalent bond.
  • polysaccharides include dextran, dextrin, agarose, carboxymethyl (CM)-cellulose, heparin, soluble starch, and the like.
  • Polysaccharides may be linear or branched.
  • For modification with polysaccharides conventionally known periodate oxidation method, cyanogen bromide method, carbodiimide method, cyanuric chloride method, epichlorohydrin method, SPDP (N-Succinimidyle 3-[2-pyridyldithio]propionate ) reagent method, active ester method, etc. can be used.
  • Polysaccharides into which reactive derivatives have been introduced may be obtained as commercial products, or may be prepared using ordinary chemical methods.
  • the above protein is a complex in which a plurality of amino acids are bound by peptide bonds, and may be purified from animals, artificially prepared by genetic engineering, or synthetic peptides. It may be prepared by chemical synthesis such as Proteins include, for example, casein, milk casein, gelatin, recombinant albumin, and the like. Polyamino acids include homopolymers such as arginine, lysine and glutamic acid, and random polymers such as lysine and glycine and lysine and serine.
  • a protein binding method there is a method in which amino groups, carboxyl groups, sulfide groups, or the like of a protein are targeted to be bound with a cross-linking agent, and the protein is bound to a binding partner via the cross-linking agent. There is also a method of binding a binding partner to a protein using carbodiimide as a catalyst.
  • the amino group of the protein is reacted with a cross-linking agent such as EMCS [N-(6-Maleimidocaproyloxy) succinimide; Dojin] or SMCC [succinimdyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane carbonate;
  • EMCS N-(6-Maleimidocaproyloxy) succinimide
  • Dojin or SMCC
  • a method of binding the cross-linking agent to a binding partner into which a sulfide group has been introduced is preferred.
  • the protein into which a reactive derivative has been introduced, which is used for preparing the product of the present invention may be obtained as a commercial product, or may be prepared using a conventional chemical method.
  • organic polymers examples include polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyacrylic alcohol, polyethyleneimine, polymethyl methacrylate, polyacrylic acid, polyallylamine, and polysaccharide.
  • the organic high molecular weight polymer may be linear or branched, or may be a random copolymer of multiple types.
  • a synthetic polymer having a spherical structure such as a dendrimer may be used.
  • the polymer may be synthetic or naturally derived.
  • Polyethylene glycol is a polymer compound based on a structure in which ethylene glycol is polymerized. Another functional group can be introduced into the hydroxyl group of polyethylene glycol, and the functional group can be used to bind to the antibody. Activation performed when binding polyethylene glycol to an antibody includes, for example, a method using cyanuric chloride, carbodiimidazole, N-hydroxysuccinimide, carbodiimide, and the like. A commercially available product can be used as polyethylene glycol into which a functional group has been introduced. Efficient preparation can be achieved by using commercially available products in which a maleimide group, a succimido group, an amino group, a sulfide group, or the like is introduced into polyethylene glycol.
  • Polyethylene glycol into which a maleimide group or a succimido group has been introduced is more preferable because it has good binding efficiency with a binding partner having a terminal sulfide group or amino group.
  • polyethylene glycol may be straight chain or branched chain, polyethylene glycol partially substituted with other chemical structure, or polyethylene glycol modified with other polymer or compound. including those that were
  • a method of chemical modification with an organic high molecular weight polymer other than polyethylene glycol there is a method of introducing a functional group into an organic high molecular weight polymer and binding it to an antibody, similar to the above method of chemical modification of polyethylene glycol.
  • an organic high molecular weight polymer that already contains a reactive derivative it may not be necessary to introduce a new functional group into the organic high molecular weight polymer in the preparation stage.
  • the organic high molecular weight polymer into which a reactive derivative has been introduced may be obtained as a commercial product, or may be prepared using a normal chemical method.
  • the molecular size of the polymer compound is not particularly limited, but generally the average molecular weight is about 200Da to 1000kDa, for example 1kDa to 1000kDa, preferably 10kDa to 100kDa.
  • polyethylene glycol it is preferably between 3 kDa and 49.5 kDa.
  • the molecular size can be appropriately selected in consideration of hydrophilicity, steric structure, non-specific suppression effect, and the like.
  • the non-specific reaction inhibitor of the present invention can be used by adding a complex of its active ingredient, a binding partner and a polymer compound, to an immunoassay system. Specifically, before preparing a solution of a binding partner modified with a polymer compound and reacting an antibody against an antigen to be measured with the antigen, the solution is added to the sample in advance to obtain a non-specific reaction substance. By reacting with a binding partner against it, a non-specific reaction by a non-specific reaction substance may be suppressed, or a binding property modified with a polymer compound may be added to a solution of an antibody against the antigen to be measured. A non-specific reaction due to a non-specific reaction substance may be suppressed by adding a partner and adding this solution to the sample to allow the non-specific reaction substance and its binding partner to react.
  • the immunological measurement reagent of the present invention may be a conventional immunological measurement reagent that utilizes an antigen-antibody reaction and further contains the non-specific reaction inhibitor of the present invention. It consists of the above. When it consists of one liquid, it consists of a reaction reagent containing at least a support carrying an antigen or an antibody for forming an immunological complex. A sample is reacted with the reagent and a signal is detected according to known methods.
  • the non-specific reaction inhibitor of the present invention is preferably added to the reagent before the reaction between the sample and the reagent, but is preferably supplied in the state of being added to the reagent.
  • the stabilizing reagent is a reagent that dilutes the sample to an appropriate concentration or performs pretreatment, and can be prepared according to a known method.
  • the sample is reacted with a stabilizing reagent, followed by a reaction reagent, and the signal is detected according to known methods.
  • the non-specific reaction inhibitor of the present invention is preferably added to the stabilizing reagent and/or the reaction reagent before the reaction between the sample and the reaction reagent, but preferably the stabilizing reagent and/or Alternatively, it may be supplied in a state of being added to the reaction reagent. Particularly preferably, it is supplied in a state of being added to the stabilizing reagent.
  • Measurement items of immunological measurement reagents include elastase, cystatin C, sEs (soluble E selectin), SF (soluble fibrin), PC (protein C), PPI (plasmin plasmin inhibitor), cTn (thrombomodulin), myoglobin.
  • CK-MB BNP (B-type natriuretic peptide), NT-proBNP (N-terminal proBNP), cTnI (cardiac troponin I), AFP ( ⁇ -fetoprotein), ⁇ 2m ( ⁇ -2-microglobulin), CEA ( carcinoembryonic antigen), ferritin, CA19-9 (carbohydrate antigen 19-9), PAP (prostatic acid phosphatase), PSA (prostate specific antigen), CRP (C-reactive protein), Mb (myoglobin), PCT (procalcitonin), preseptin, IL-2R (interleukin-2 receptor), RF (rheumatoid factor), ASO (antistreptolysin-O), FDP (fibrin degradation product), ATIII (antithrombin III), TAT (thrombin antithrombin III complex), plasminogen, ⁇ 2PI ( ⁇ -2-plasmin inhibitor), D-dimer (fibrin degradation product
  • a chemically synthesized peptide or nucleic acid aptamer was used as a small molecule that binds to a non-specific reaction substance, and polyethylene glycol (hereinafter referred to as PEG) was used as a polymer compound that modifies it.
  • PEG polyethylene glycol
  • peptides include a known human IgG-binding peptide of about 1.5 kDa (amino acid sequence: DCAWHLGELVWCT: SEQ ID NO: 1) for the purpose of purifying human IgG, and a reported about 1.5 kDa peptide for the purpose of purifying human IgA.
  • a .8 kDa human IgA-binding peptide (amino acid sequence: HMVCLSYRGRPVCFSL: SEQ ID NO: 2) was used, and PEG having a succinimide group at one end (molecular weight: 20 kDa; manufactured by NOF CORPORATION) was used.
  • Example 2 Confirmation of the effect of suppressing reaction to human IgG or human IgA with or without PEG modification>>
  • As a model system to confirm the non-specific inhibitory effect using anti-human IgG antibody and human IgG, or anti-human IgA antibody and human IgA, IgG-binding peptide or IgA-binding peptide having a smaller molecular weight than the antibody fragment, depending on the presence or absence of PEG modification A reaction suppression effect was confirmed.
  • an anti-human IgG polyclonal rabbit antibody (manufactured by Dako) was diluted with PBS( ⁇ ) to 25 ⁇ g/mL to prepare an anti-human IgG antibody solution.
  • the sample solution was human IgG adjusted to 1 mg/mL in PBS(-), and 20 ⁇ L of this test sample was added with an IgG-binding peptide or a 20 kDa PEG-modified IgG-binding peptide at a final concentration of 25 ⁇ g/mL or 50 ⁇ g.
  • a sample solution and an anti-human IgG antibody solution were added to predetermined wells in a 96-well black plate (manufactured by Greiner Bio-One) at 200 ⁇ L/well. 200 ⁇ L/well of PBS(-) was added to the baseline, dissociation and washing wells.
  • This plate and a biosensor (Biosensor/ProL: manufactured by SARTRIUS) were placed at predetermined positions of OctetR2. After acquiring data by operating OctetR2 under the conditions shown in Table 1 below, the value of change in wavelength shift (Response) was calculated using analysis software attached to OctetR2. In addition, the measurement was implemented at the temperature of 30 degreeC.
  • an anti-human IgA polyclonal rabbit antibody (manufactured by Dako) was diluted with PBS( ⁇ ) to 25 ⁇ g/mL to prepare an anti-human IgA antibody solution.
  • the sample solution is human IgA adjusted to 250 ⁇ g / mL with PBS (-) as a test sample, and 20 ⁇ L of this test sample is added with an IgA-binding peptide or an IgA-binding peptide modified with 20 kDa PEG at a final concentration of 25 ⁇ g / mL or 50 ⁇ g. /mL, and prepared so that the total amount of R1 was 200 ⁇ L was used.
  • Measurement with OctetR2 was performed in the same manner as confirmation of the effect of suppressing the response to human IgG.
  • Table 2 shows the inhibitory effect on human IgG
  • Table 3 shows the inhibitory effect on human IgA.
  • the reason why the measured value increased by adding a peptide not modified with PEG was that the peptide bound to human IgG or human IgA, but the binding of anti-human IgG antibody and human IgG or anti-human IgA antibody and human IgA increased.
  • human IgG bound with IgG-binding peptide binds to anti-human IgG antibody
  • human IgA bound with IgA-binding peptide binds to anti-human IgA antibody, non-specific reaction inhibitor It was considered that the thickness of the layer at the tip of the sensor increased and the wavelength shift changed more than when only human IgG or human IgA was bound to anti-human IgG antibody or anti-human IgA antibody when not added.
  • Example 3 Confirmation of non-specific reaction suppression effect with or without PEG modification>> Using human plasma exhibiting non-specific reactions, the effect of suppressing non-specific reactions with or without PEG modification was confirmed for IgG-binding peptides with molecular weights smaller than those of antibody fragments.
  • a sample A which is human plasma exhibiting a non-specific reaction in LPIA Genesis TAT (manufactured by LSI Rulece) and whose specific reactant is IgG, was used. Measurements were performed under the same assay conditions as described in Example 2. In this example, the sample A and the non-specific reaction inhibitor coexist in the measurement sample, and the non-specific reaction substance is absorbed in the sample solution.
  • the antibody solution used in the second reagent of LPIA genesis TAT (hereinafter referred to as R2) is characterized by containing latex particles on which a monoclonal antibody having a specific binding ability to TAT is immobilized.
  • An anti-TAT antibody solution prepared by diluting the anti-TAT antibody described in the above with PBS( ⁇ ) to a concentration of 25 ⁇ g/mL was used.
  • 20 ⁇ L of a test sample diluted 10-fold with PBS( ⁇ ) is added with an IgG-binding peptide or a 20-kDa PEG-modified IgG-binding peptide as a non-specific reaction inhibitor at a final concentration of 25 ⁇ g/mL or 50 ⁇ g/mL.
  • the total amount was adjusted to 200 ⁇ L with R1 and used.
  • Table 4 shows the results.
  • the PEG-modified IgG-binding peptide exhibited a greater effect of suppressing non-specific reactions than the non-modified IgG-binding peptide.
  • the PEG-modified IgG-binding peptide although having a smaller molecular weight than the antibody fragment, exhibited a non-specific reaction suppressing effect.
  • the reason why the measured value increased by adding the peptide not modified with PEG is that the IgG-binding peptide binds to the non-specific reaction substance, but the stericity of the IgG-binding peptide is such that it prevents the binding of the non-specific reaction substance and the anti-TAT antibody. No damage occurs, and the IgG-binding peptide-bound non-specific reaction substance binds to the anti-TAT antibody, so that only the non-specific reaction substance binds to the anti-TAT antibody when the non-specific reaction inhibitor is not added. , it was thought that the thickness of the layer at the tip of the sensor increased and the change in the wavelength shift increased.
  • Example 4 Comparison of effects of PEG-modified peptide and antibody fragment>> From the results of Examples 2 and 3, it was clarified that the PEG-modified peptide exhibits an effect of suppressing non-specific reaction even if the molecular weight is smaller than that of the antibody fragment. This overturns the report in Japanese Patent No. 5189098 that the antibody fragment has a small non-specific reaction suppressing effect due to its small molecular weight, and that the non-specific reaction suppressing effect is exhibited by modifying and enlarging it with PEG. It can be said that it is a great discovery. Therefore, the effect of suppressing the non-specific reaction was compared between the case of modifying the peptide that binds to the non-specific reaction substance with PEG and the case of modifying the antibody fragment that binds to the non-specific reaction substance with PEG.
  • Fab' that reacts with human IgG
  • a PEG-modified antibody fragment was prepared by chemically modifying a 20 kDa PEG containing a maleimide group at the end.
  • Goat anti-human IgG polyclonal IgG purified from antiserum manufactured by International Immunology Corporation
  • F(ab') was pepsin-digested to prepare F(ab')
  • TCEP-HCL at 37°C for 210 minutes.
  • Fab' were prepared.
  • 20 kDa PEG (manufactured by NOF CORPORATION) having a maleimide group attached thereto was added to a 5 mg/mL Fab' solution, and reacted at 37° C. for 30 minutes.
  • the reaction solution was concentrated to about 5 mg/mL by ultrafiltration and buffer-substituted with 0.2 mol/L TBS to obtain PEG-modified anti-human IgG Fab'.
  • the PEG-modified peptides described in Examples 2-3 and the prepared PEG-modified antibody fragments were compared for their non-specific reaction inhibitory effects.
  • the amount of the non-specific reaction inhibitor added was 25 ⁇ g/mL, 50 ⁇ g/mL, 100 ⁇ g/mL, 200 ⁇ g/mL or 400 ⁇ g/mL, and the same sample A as in Example 3 was used as the test sample.
  • PEG-modified IgG-binding peptides were prepared by the method described in Example 1, chemically modified with 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa, and 30 kDa PEGs containing succinimide groups at their ends.
  • Table 7 shows the results. The effect of suppressing non-specific reaction was exhibited even when modified with PEG of any molecular weight. Moreover, it was confirmed that the effect increases depending on the molecular weight of PEG.
  • TAT or non-specific reaction substances in the non-specimen were quantified.
  • a non-specific reaction inhibitor was added to R1 so that the concentration after addition of the sample was 0.05 mg / mL or 0.1 mg / mL, and the non-specific reaction substance was absorbed during the first operation. It was decided to.
  • the same volume of PBS(-) was added to R1 to which the non-specific reaction inhibitor was not added to avoid the influence of dilution due to the additive.
  • the mixing ratio of the measurement sample, R1 and R2 was 20 ⁇ L:90 ⁇ L:90 ⁇ L. Latex aggregation was detected at a wavelength of 700 nm. The measured value was calculated by comparing the absorbance from a calibration curve obtained by measuring TAT with a known concentration.
  • the same sample A as in Examples 3-5 was used as the test sample.
  • Table 8 shows the results.
  • the non-specific inhibitory effect of the PEG-modified IgG-binding peptide could also be confirmed in the latex agglutination method.
  • the reason why the measured value increased by adding peptides not modified with PEG is that the IgG-binding peptide binds to a non-specific reaction substance, but steric hindrance is enough to prevent the binding of the non-specific reaction substance and the anti-TAT antibody.
  • Example 7 Confirmation of reaction suppression effect on anti-human IgG antibody and human IgG with or without PEG modification of IgG-binding nucleic acid aptamer>>
  • the nucleic acid aptamer the reaction inhibitory effect depending on the presence or absence of PEG modification was confirmed using a model system for confirming the non-specific inhibitory effect in the same manner as in Example 2.
  • nucleic acid aptamer is an approximately 7.5 kDa human IgG-binding nucleic acid aptamer (nucleic acid sequence: N(6)_ggAGGU(F)GcU(F)ccgaaaGGA(L)aC(F)U) that has been reported for the purpose of purifying human IgG.
  • Test samples and measurements were performed under the same assay conditions as in Example 2.
  • a test sample and a non-specific reaction inhibitor were allowed to coexist in a measurement sample, and human IgG was absorbed in the sample solution.
  • the measurement was performed according to the operation manual attached to OctetR2.
  • an antibody solution an anti-human IgG polyclonal rabbit antibody (manufactured by Dako) was diluted with PBS( ⁇ ) to 25 ⁇ g/mL to prepare an anti-human IgG antibody solution.
  • Table 9 shows the results.
  • the IgG-binding nucleic acid aptamer had a greater effect of suppressing the reaction between the anti-human IgG antibody and human IgG than when not modified.
  • the IgG-binding nucleic acid aptamer has a molecular weight of about 7.5 kDa, and even when modified with 20 kDa PEG, the molecular weight is 27.5 kDa, which is smaller than that of the antibody fragment, but showed the effect of suppressing the reaction.
  • the nonspecific reaction inhibitor of the present invention can be applied to immunoassays.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing are human IgG-binding peptide and human IgA-binding peptide, respectively.

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Abstract

溶解性が高く、十分な添加量を確保することが可能であり、かつ安価でロット差の少ない非特異反応抑制剤を提供する。本発明の非特異反応抑制剤は、非特異反応物質に特異的に結合するペプチドまたは核酸分子と高分子化合物との複合体を含む。

Description

非特異反応抑制剤
　本発明は、免疫測定方法において、微量物質を正確に検出、定量する際の障害となる非特異反応を抑制するための非特異反応抑制剤に関する。
　特開平１１－２８７８０１号公報では、非特異反応を抑制する方法として、非特異反応物質に対する抗体を測定試薬に共存させ、検体中の非特異反応物質による非特異反応を低減させることが開示されている。しかし、この技術には、非特異反応物質に対する抗体としてＩｇＧやＩｇＭを用いると、非特異反応物質との免疫複合体形成により免疫比ろう反応を生じ、ラテックス免疫比濁法による測定で正確な測定値を示さない場合がある、という問題があった。この問題への対処として、非特異反応物質に対するＩｇＧ、ＩｇＭの添加量を減らすと、非特異抑制効果が十分に得られない場合があった。
　免疫比ろう反応の解消のため、ＩｇＧをＦ（ａｂ´）２に断片化し、疎水性を減少させることで、試薬への多量の添加が可能となり、かつ免疫比ろう反応を生じにくくさせることができる。しかし、試薬中での非特異抑制効果の持続性に課題があり、その原因はＦ（ａｂ´）２からＦａｂ´への分解による非特異抑制効果の減弱であると予想された。特許第５１８９０９８号公報では、Ｆａｂ´の非特異抑制効果の低さは、分子サイズの大きさが足りていない可能性を示し、その課題解決のために、Ｆａｂ´などの抗体断片に高分子化合物を修飾し、巨大化することで非特異抑制効果を増強させる方法が開示されている。
特開平１１－２８７８０１号公報 特許第５１８９０９８号公報
　しかし、近年より高感度な免疫測定法が求められており、試薬の高感度化を目指して使用するサンプル量が増えると、非特異反応物質の反応系中の存在量が非常に多くなり、それに伴い試薬中に非特異反応抑制剤を大量に共存させる必要が出てきた。また、サンプル中に非特異物質が多量に存在する場合も同様に、試薬中に非特異反応抑制剤を大量に共存させる必要があった。このような状況下において、特許第５１８９０９８号公報の技術は抗体や抗体断片などの比較的高価な生物原料を用いることから、コスト面や原料のロット差の面で課題があるとともに、分子サイズの巨大化が技術の本質であることから、試薬への溶解性の改善効果が不十分であり、高感度化を目指してサンプル量を増大した時に、非特異抑制効果を十分に得るだけの添加量を確保するには、満足できるものではなかった。
　このような状況に鑑み、溶解性が高く、十分な添加量を確保することが可能であり、かつ安価でロット差の少ない非特異反応抑制剤を提供することが本発明の課題である。
　上記課題を達成するために鋭意検討したところ、Ｆａｂ´よりもさらに低分子である非特異反応物質に結合性を持つペプチドに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子を修飾することで、効率的に非特異抑制効果を示すことが分かった。Ｆａｂ´は分子量５５ｋＤａ程度の分子であるが、特許第５１８９０９８号公報の記載によれば、その程度の分子量があっても非特異抑制効果は失われる。ところが、１ｋＤａ程度のごく小さなペプチドでも５ｋＤａ程度のＰＥＧを結合させることで、Ｆａｂ´よりも分子量が小さいにもかかわらず、効率的な非特異抑制効果が得られることは、発明者が見出した意外な効果である。
　本発明の前記課題は、以下の本発明により解決することができる：
［１］非特異反応物質に特異的に結合するペプチドまたは核酸分子と高分子化合物との複合体を含む、免疫学的測定用の非特異反応抑制剤。
［２］前記非特異反応物質に特異的に結合する物質が、化学合成可能な物質である、［１］の非特異反応抑制剤。
［３］前記複合体が５０ｋＤａ以下である、［１］又は［２］に記載の非特異反応抑制剤。
［４］高分子化合物がポリエチレングリコールである、［１］～［３］のいずれかの非特異反応抑制剤。
［５］前記非特異反応物質が、免疫グロブリンである、［１］～［４］のいずれかの非特異反応抑制剤。
［６］非特異反応物質に特異的に結合するペプチドまたは核酸分子と高分子化合物との複合体を用いることを特徴とする、免疫学的測定方法。
［７］免疫学的測定法が、ラテックス凝集光学的測定法、免疫比ろう法、免疫比濁法、化学発光免疫測定法、酵素免疫測定方法、蛍光免疫測定法、又は放射免疫測定法である、［６］の免疫学的測定方法。
［８］非特異反応物質に特異的に結合するペプチドまたは核酸分子と高分子化合物との複合体を含む、免疫学的測定試薬。
［９］非特異反応物質に特異的に結合するペプチドまたは核酸分子と高分子化合物との複合体が安定化試薬に含まれることを特徴とする、［８］の免疫学的測定方法。
　本発明によれば、生物原料と比較してコストが安価であり、化学合成が可能なためにロット差を少なくすることができる。また、本発明によれば、より低分子であるため、溶解性が高く、十分な添加量を確保することが可能となる。
Ｏｃｔｅｔ（商標）Ｒ２による測定の各ステップを説明する説明図である。
　本発明の非特異反応抑制剤は、非特異反応物質に特異的に結合するペプチドまたは核酸分子（以下、結合性パートナーと称することがある）と高分子化合物との複合体を含む。
　本明細書における「非特異反応物質」とは、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法において非特異的な反応を惹起する物質である。具体的な因子としては、ヒト体液を試料とする場合、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＥ、ヒトＩｇＤおよび当該抗体に結合する因子、例えば、補体、リウマチ因子、Ｆｃ受容体等が挙げられ、ヒト以外の動物の体液を試料とする場合は、当該動物のＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、および当該抗体に結合する因子等が挙げられる。
　上記免疫学的測定法としては、例えば、ラテックス凝集光学的測定法、免疫比ろう法、免疫比濁法、化学発光免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法等が挙げられる。ラテックス凝集光学的測定法や免疫比ろう法、免疫比濁法など、Ｂ／Ｆ分離工程のない測定法では、特に非特異反応物質による影響を受けやすい。このような測定法では抗原抗体反応中の被験試料の濃度は数％程度であることが多く、被検試料の濃度が高くなるほど、より多量の非特異反応抑制剤を添加する必要がある。反応液中の被検試料の濃度が従来よりも高濃度（４％以上、５％以上、あるいは８％以上）であっても、本発明の非特異反応抑制剤は十分な添加量を確保することができる。何れも抗原抗体反応を利用するが、標的抗原を検出する抗体には、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体がある。何れの測定方法においても、本発明の非特異反応抑制剤は、抗原抗体反応が行われる前あるいは行われる際に被検試料に添加されればよく、好ましくは抗原抗体反応が行われる前に添加されるとよい。
　本発明で用いる非特異反応物質に特異的に結合する結合性パートナーとしては、ペプチドまたは核酸分子（例えば、アプタマー）を挙げることができるが、本発明では、抗体またはＦａｂ’以上の抗体断片を使用しないことに特徴がある。前記結合性パートナーの分子量は、典型的には、０．５～４７ｋＤａであり、好ましくは０．８～１５ｋＤａであり、より好ましくは１～８ｋＤａである。本発明では、Ｆａｂ’よりも分子量が小さい結合性パートナーを使用することにより、溶解性が高く、充分な添加量を確保することができる。本発明によれば、免疫複合体の形成が行われる反応系中の非特異反応抑制剤の添加量を上げることができるため、その結果、非特異反応物質濃度の高い被検試料にも対応が可能であり、反応系中の被検試料の濃度を上げることも可能である。
　本発明で用いる前記結合性パートナーとしては、化学合成可能な物質であることが好ましい。本発明では、抗体または抗体断片を使用しないため、安価でロット差の少ない非特異反応抑制剤を提供することができる。結合性パートナーには、適宜、高分子化合物修飾用の官能基やビオチン、スペーサー等を含めることができる。
　本発明の非特異反応抑制剤（すなわち、非特異反応物質の結合性パートナーと高分子化合物との複合体）としては、例えば、ペプチドまたは核酸分子を高分子化合物で化学修飾した化学修飾体、あるいは、ビオチン－アビジン結合で結合された、ペプチドまたは核酸分子と高分子化合物との複合体を挙げることができる。
　上記化学修飾では、例えば、チオール基、アミノ基、ヒドロキシル基、あるいはカルボキシル基を標的として、「反応性誘導体」を介して結合させることができる。
　チオール基を標的とする修飾で使用される「反応性誘導体」とは、例えば、マレイミド類やビニルスルホン類などのチオール基選択的な反応基を含む。また、ポリマーに直接反応性誘導体が結合したものを利用してもよいし、反応性誘導体を含む架橋剤を利用してもよい。
　アミノ基を標的とする修飾で使用される「反応性誘導体」とは、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）エステルやＮ－ヒドロキシスルフォスクシミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）エステル等を含む。また、アルデヒド基を含有する化合物（例えば、グルタルアルデヒド）や、ポリマーであって予めアルデヒド基を含有するポリマー等がある。
　カルボキシル基を標的とする修飾では、例えば、カルボジイミド（1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimidehydrochloride）を触媒としてアミノ基と反応させる方法で得られる複合体を含む。
　ヒドロキシル基を標的とする修飾では、例えば、イソシアン酸誘導体を含有する化合物を用いて調製することができる。
　なお、反応性誘導体が導入されたポリマーは、市販品（例えば、日油株式会社）として取得してもよいし、通常の化学的手法を用いて調製してもよい。
　また、ビオチンとアビジンの様に、結合性パートナーとポリマーの結合様式が共有結合による結合ではないが、高い親和性を有する結合様式を利用する方法も本発明に含む。
　本発明で用いることのできる高分子化合物としては、例えば、多糖類、タンパク質、有機高分子重合体を挙げることができる。
　上記多糖類には、例えば、デキストラン、デキストリン、アガロース、カルボキシメチル（ＣＭ）－セルロース、ヘパリン、可溶性澱粉等を含む。多糖類は直鎖であっても分技鎖を有するものであっても構わない。多糖類を用いて修飾するには、従来から知られている過ヨウ素酸酸化法、臭化シアン法、カルボジイミド法、塩化シアヌル法、エピクロルヒドリン法、ＳＰＤＰ（N-Succinimidyle 3-[2-pyridyldithio]propionate）試薬法、活性エステル法などを使用することができる。なお、反応性誘導体が導入された多糖類は市販品として取得してもよいし、通常の化学的手法を用いて調製してもよい。
　上記タンパク質は、複数のアミノ酸がペプチド結合で結合した複合体であって、動物から精製したものであってもよいし、遺伝子工学で人工的に調製されたものであってもよいし、合成ペプチドのように化学合成により調製されたものでもよい。タンパク質には、例えば、カゼイン、ミルクカゼイン、ゼラチン、リコンビナントのアルブミンなどが含まれる。ポリアミノ酸としては、アルギニン、リジン、グルタミン酸などのホモポリマー、リジンとグリシン、リジンとセリンなどのランダムポリマーを含む。タンパク質の結合方法の例として、タンパク質のアミノ基、カルボキシル基、スルフィド基等を標的として架橋剤を結合させ、当該架橋剤を介して結合性パートナーへ結合させる方法がある。また、カルボジイミドを触媒として用い、結合性パートナーとタンパク質を結合させる方法もある。本発明では、タンパク質のアミノ基にＥＭＣＳ［N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide；dojin社］やＳＭＣＣ［succinimdyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane carbonate；dojin社］などの架橋剤を反応させ、末端にスルフィド基を導入した結合性パートナーへ当該架橋剤を結合させる方法が好ましい。なお、本発明品を調製する際に用いる、反応性誘導体が導入されたタンパク質は市販品として取得してもよいし、通常の化学的手法を用いて調製してもよい。
　上記有機高分子重合体の例としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリアリルアミン、ポリサッカライドを挙げることができる。有機高分子重合体は直鎖であっても分技鎖を有してもよいし、複数種類のランダム共重合体であってもよい。また、デンドリマーのような球状構造の合成高分子でもよい。高分子は合成品であっても天然由来であってもよい。
　ポリエチレングリコールは、エチレングリコールが重合した構造を基本とする高分子化合物である。ポリエチレングリコールの水酸基に他の官能基を導入し、その官能基を利用して抗体へ結合させることができる。ポリエチレングリコールと抗体を結合させる際に行う活性化には、例えば、塩化シアヌル、カルボジイミダゾール、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド、カルボジイミドなどを用いる方法が挙げられる。官能基の導入されたポリエチレングリコールとして、市販品を利用することができる。ポリエチレングリコールにマレイミド基、スクシミド基、アミノ基、スルフィド基等を導入された市販品を利用すると、効率よく調製することができる。マレイミド基、スクシミド基が導入されたポリエチレングリコールはスルフィド基、アミノ基を末端に持つ結合性パートナーとの結合効率もよく、より好ましい。なお、ポリエチレングリコールは直鎖であっても分技鎖を含むものであってもよいし、ポリエチレングリコールの一部が他の化学構造で置換されたものやポリエチレングリコールに他のポリマーや化合物が修飾されたものも含む。
　ポリエチレングリコール以外の有機高分子重合体による化学修飾の方法として、上記ポリエチレングリコールの化学修飾の方法と同様に、有機高分子重合体に官能基を導入して抗体へ結合させる方法がある。なお、既に反応性誘導体を含有する有機高分子重合体であっては、調製段階で有機高分子重合体への新たな官能基の導入を要しない場合もある。本発明においては、マレイミド基、スクシミド基、アミノ基、カルボキシル基を導入したポリマーを用いることが好ましい。なお、反応性誘導体が導入された有機高分子重合体は、市販品として取得してもよいし、通常の化学的手法を用いて調製してもよい。
　上記の高分子化合物の分子サイズは、特に限定されるものではないが、一般には平均分子量が約２００Ｄａ～１０００ｋＤａ、例えば、１ｋＤａ～１０００ｋＤａ、好ましくは１０ｋＤａ～１００ｋＤａである。ポリエチレングリコールの場合は、好ましくは３ｋＤａ～４９．５ｋＤａである。用いるポリマーの種類に応じて、親水性、立体構造、非特異抑制効果などを考慮して、分子サイズを適宜選択することができる。
　本発明の非特異反応抑制剤は、その有効成分である結合性パートナーと高分子化合物との複合体を免疫測定系に添加することにより使用することができる。具体的には、高分子化合物で修飾した結合性パートナーの溶液を用意し、測定しようとする抗原に対する抗体を抗原と反応させる前に、予め試料に前記の溶液を添加して、非特異反応物質とそれに対する結合性パートナーを反応させることにより、非特異反応物質による非特異反応を抑制してもよいし、あるいは、測定しようとする抗原に対する抗体の溶液中に、高分子化合物で修飾した結合性パートナーを含ませ、この溶液を試料に添加して、非特異反応物質とそれに対する結合性パートナーを反応させることにより、非特異反応物質による非特異反応を抑制してもよい。
　本発明の免疫学的測定試薬としては、従来の抗原抗体反応を利用する免疫学的測定試薬に、本発明の非特異反応抑制剤をさらに含ませたものであればよく、１液もしくは２液以上から構成される。
　１液から構成される場合、少なくとも免疫学的複合体を形成するための抗原あるいは抗体を担持させた支持体を含む反応試薬からなる。公知の方法に従い、試料を該試薬と反応させ、シグナルを検出する。本発明の非特異反応抑制剤は、試料と該試薬とが反応する前に、該試薬に添加されているとよいが、好ましくは該試薬に添加された状態で供給されるとよい。２液以上から構成される場合、安定化試薬と少なくとも免疫学的複合体を形成するための抗体あるいは抗原を担持させた支持体を含む反応試薬からなる。安定化試薬は、試料を適当な濃度に希釈したり、前処理を行ったりする試薬で、公知の方法に従って調製することができる。公知の方法に従い、試料を安定化試薬と反応させ、その後、反応試薬と反応させ、シグナルを検出する。本発明の非特異反応抑制剤は、試料と該反応試薬とが反応する前に、該安定化試薬及び／又は該反応試薬に添加されているとよいが、好ましくは、該安定化試薬及び／又は該反応試薬に添加された状態で供給されるとよい。特に好ましくは、該安定化試薬に添加された状態で供給されるとよい。
　免疫学的測定試薬の測定項目としては、例えば、エラスターゼ、シスタチンＣ、ｓＥｓ（可溶性Ｅセレクチン）、ＳＦ（可溶性フィブリン）、ＰＣ（プロテインＣ）、ＰＰＩ（プラスミンプラスミンインヒビター）、ｃＴｎ（トロンボモジュリン）、ミオグロビン、ＣＫ－ＭＢ、ＢＮＰ（Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド）、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ（Ｎ末端プロＢＮＰ）、ｃＴｎＩ（心筋トロポニンI）、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、β２ｍ（β－２－ミクログロブリン）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、フェリチン、ＣＡ１９－９（糖質抗原１９－９）、ＰＡＰ（前立腺酸性フォスファターゼ）、ＰＳＡ（前立腺特異性抗原）、ＣＲＰ（Ｃ－反応性タンパク質）、Ｍｂ（ミオグロビン）、ＰＣＴ（プロカルシトニン）、プレセプシン、ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン２レセプター）、ＲＦ（リウマチ因子）、ＡＳＯ（抗ストレプトリジン－Ｏ）、ＦＤＰ（フィブリン分解生成物）、ＡＴIII（抗トロンビンIII）、ＴＡＴ（トロンビン・アンチトロンビンIII複合体）、プラスミノーゲン、α２ＰＩ（α－２－プラスミンインヒビター）、Ｄ－ダイマー（フィブリン分解生成物Ｄ－フラグメント二量体）、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）、ＩｇＡ（免疫グロブリンＡ）、ＩｇＭ（免疫グロブリンＭ）、ＩｇＥ（免疫グロブリンＥ）、Ｃ３（補体第３成分）、Ｃ４（補体第４成分）、尿アルブミン、ｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン）、ｈＰＬ（ヒト胎盤性ラクトゲン）、インスリン、ＨＢｓ抗原（Ｂ型肝炎表面抗原）、ＨＢｓ抗体（抗Ｂ型肝炎表面抗原抗体）、ＨＢｃ抗体（抗Ｂ型肝炎コア抗原抗体）、ＨＣＶ抗体（抗Ｃ型肝炎ウィルス抗体）、トレポネーマ（抗梅毒トレポネーマ抗体）、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）、ＬＨ（黄体形成ホルモン）、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、プロラクチン、テストステロン、エストラジオール、プロゲステロン、ジゴキシン、ジギトキシン、キニジン、プロカインアミド、ＮＡＰＡ（Ｎ－アセチルプロカインアミド）、テオフィリン、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロン酸、エトスクシイミド、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ジンコマイシン、シクロスポリンＡ、Ｂ１２（ビタミンＢ１２）、葉酸、Ｔ３（トリヨードチロニン）、Ｔ４（チロキシン）、エストロゲンが含まれる。
　非特異反応物質に結合する小分子としては化学合成したペプチドまたは核酸アプタマーを、それに修飾する高分子化合物としてはポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと記す）を用いた。以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：ＰＥＧを修飾したペプチドの調製》
　１分子のペプチドに、Ｎ末端のアミノ基を介して１分子のＰＥＧを結合させた。ペプチドには、ヒトＩｇＧの精製を目的として公知となっている約１．５ｋＤａのヒトＩｇＧ結合ペプチド（アミノ酸配列：ＤＣＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣＴ：配列番号１）と、ヒトＩｇＡの精製を目的として報告されている約１．８ｋＤａのヒトＩｇＡ結合ペプチド（アミノ酸配列：ＨＭＶＣＬＳＹＲＧＲＰＶＣＦＳＬ：配列番号２）を用い、ＰＥＧは片側末端にスクシミド基を有するもの（分子量２０ｋＤａ；日油社製）を用いた。
［ＰＥＧ修飾ＩｇＧ結合ペプチドの調製］
　ヒトＩｇＧ結合ペプチドを１．０ｍｇ／ｍＬとなるように０．２ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）に溶解後、片側末端にスクシミド基を有するＰＥＧをペプチドと等モル添加し、ローテーターで攪拌しながら４℃で一晩反応させた。反応後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をランニングバッファーとしてヒトＩｇＧアフィニティーカラムに通し、未反応のＰＥＧを除去した。０．２ｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファー（ｐＨ３．０）で溶出し、限外濾過で濃縮および未反応のペプチドを除去し、ＰＢＳにバッファー置換した。濃度測定はQuantitative Colorimetric Peptide Assay（Thermo Fisher社製）にて実施し、４℃で保管した。
［ＰＥＧ修飾ＩｇＡ結合ペプチドの調製］
　ヒトＩｇＡ結合ペプチドを１．０ｍｇ／ｍＬとなるように４０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解後、片側末端にスクシミド基を有するＰＥＧをペプチドと等モル添加し、ローテーターで攪拌しながら４℃で一晩反応させた。反応後、ＰＢＳをランニングバッファーとしてヒトＩｇＡアフィニティーカラムに通し、未反応のＰＥＧを除去した。０．２ｍｏｌ／Ｌクエン酸バッファー（ｐＨ３．０）で溶出し、限外濾過で濃縮および未反応のペプチドを除去し、ＰＢＳにバッファー置換した。濃度測定はQuantitative Colorimetric Peptide Assay（Thermo Fisher社製）にて実施し、４℃で保管した。
《実施例２：ＰＥＧ修飾の有無によるヒトＩｇＧまたはヒトＩｇＡへの反応抑制効果の確認》
　非特異抑制効果を確認するモデル系として、抗ヒトＩｇＧ抗体とヒトＩｇＧ、または抗ヒトＩｇＡ抗体とヒトＩｇＡを用い、抗体断片より分子量の小さいＩｇＧ結合ペプチドまたはＩｇＡ結合ペプチドについて、ＰＥＧ修飾の有無による反応抑制効果を確認した。
［方法］
　測定は生体分子相互作用解析システムであるＯｃｔｅｔ（商標）Ｒ２（SARTORIUS社製）を用いて、バイオレイヤー干渉法（Bio-Layer Interferometry: BLI）により実施した。バイオレイヤー干渉法の基本原理について、簡単に説明する。センサーチップ表面に固定された生体分子の層（レイヤー）に特定波長の光を投射したとき、生体分子のレイヤーと内部の参照となるレイヤーの二つの表面から光が反射され、光の干渉波が生じる。測定試料中の分子がセンサーチップ表面の生体分子に結合すると、センサー先端のレイヤーの厚みが増加し，干渉波に波長シフトが生じる。この波長シフトの変化を測定することにより、センサーチップ表面に固定された生体分子に結合する分子数の定量及び速度論的解析をリアルタイムで行うことができる。本実施例においては、測定試料中に被検試料と非特異反応抑制剤を共存させ、サンプル溶液中でヒトＩｇＧまたはヒトＩｇＡを吸収することとした。測定はＯｃｔｅｔＲ２に添付の操作マニュアルに従って実施した。
［ヒトＩｇＧへの反応抑制効果の確認］
　抗体溶液として、抗ヒトＩｇＧポリクロ―ナルウサギ抗体（Dako社製）を２５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（－）で希釈し、抗ヒトＩｇＧ抗体溶液とした。サンプル溶液は、ＰＢＳ（－）で１ｍｇ／ｍＬとしたヒトＩｇＧを被検試料とし、この被検試料２０μＬに、ＩｇＧ結合ペプチドまたは２０ｋＤａのＰＥＧを修飾したＩｇＧ結合ペプチドを終濃度２５μｇ／ｍＬまたは５０μｇ／ｍＬとなるように添加して、トロンビン・アンチトロンビンIII複合体（以下、ＴＡＴと記す）測定試薬であるＬＰＩＡジェネシス　ＴＡＴ（ＬＳＩメディエンス社製）の第一試薬（以下、Ｒ１と記す）で総量２００μＬとなるように調製したものを用いた。
　９６ウェル黒色プレート（Greiner Bio-One社製）に、サンプル溶液、および抗ヒトＩｇＧ抗体溶液を、所定のウェルにそれぞれ２００μＬ／ウェルずつ添加した。ベースライン、解離用及び洗浄用のウェルには、ＰＢＳ（－）を２００μＬ／ウェルずつ添加した。このプレートと、バイオセンサー（Biosensor/ProL: SARTRIUS社製）を、ＯｃｔｅｔＲ２の所定の位置に設置した。ＯｃｔｅｔＲ２を下記の表１に示す条件で作動させてデータを取得後、ＯｃｔｅｔＲ２付属の解析ソフトウェアを用いて、波長シフトの変化（Response）の値を算出した。なお、測定は３０℃の温度下で実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［ヒトＩｇＡへの反応抑制効果の確認］
　抗体溶液として、抗ヒトＩｇＡポリクロ―ナルウサギ抗体（Dako社製）を２５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（－）で希釈し、抗ヒトＩｇＡ抗体溶液とした。サンプル溶液は、ＰＢＳ（－）で２５０μｇ／ｍＬとしたヒトＩｇＡを被検試料とし、この被検試料２０μＬに、ＩｇＡ結合ペプチドまたは２０ｋＤａのＰＥＧを修飾したＩｇＡ結合ペプチドを終濃度２５μｇ／ｍＬまたは５０μｇ／ｍＬとなるように添加して、Ｒ１で総量２００μＬとなるように調製したものを用いた。
　ＯｃｔｅｔＲ２での測定は、ヒトＩｇＧへの反応抑制効果の確認と同様に行った。
［結果］
　ヒトＩｇＧへの反応抑制効果を表２、ヒトＩｇＡへの反応抑制効果を表３に示す。ＩｇＧ結合ペプチドまたはＩｇＡ結合ペプチドは、ＰＥＧを修飾することにより、修飾しない場合より抗ヒトＩｇＧ抗体とヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＡ抗体とヒトＩｇＡの反応抑制効果が増した。また、ＩｇＧ結合ペプチドまたはＩｇＡ結合ペプチドは１～２ｋＤａであり、２０ｋＤａのＰＥＧを修飾した場合でも分子量は２１～２２ｋＤａと抗体断片より分子量が小さいが、反応抑制効果を示すことが分かった。
　ＰＥＧを修飾していないペプチドの添加により、測定値が上昇した理由としては、ペプチドはヒトＩｇＧまたはヒトＩｇＡと結合しているが、抗ヒトＩｇＧ抗体とヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＡ抗体とヒトＩｇＡの結合を妨げるほどの立体障害が生じず、ＩｇＧ結合ペプチドが結合したヒトＩｇＧが抗ヒトＩｇＧ抗体に、ＩｇＡ結合ペプチドが結合したヒトＩｇＡが抗ヒトＩｇＡ抗体に結合したことにより、非特異反応抑制剤未添加のときにヒトＩｇＧまたはヒトＩｇＡのみが抗ヒトＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＡ抗体に結合する場合よりも、センサー先端のレイヤーの厚みが増加して波長シフトの変化が大きくなったと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
《実施例３：ＰＥＧ修飾の有無による非特異反応抑制効果の確認》
　非特異反応を呈するヒト血漿を用いて、抗体断片より分子量の小さいＩｇＧ結合ペプチドについて、ＰＥＧ修飾の有無による非特異反応抑制効果を確認した。
［方法］
　被検試料として、ＬＰＩＡジェネシス　ＴＡＴ（ＬＳＩメディエンス社製）において、非特異反応を呈するヒト血漿であって、特異反応物質がＩｇＧであることを特徴とする試料Ａを用いた。
　測定は実施例２に記載のアッセイ条件と同様の方法で実施した。本実施例においては、測定試料中に試料Ａと非特異反応抑制剤を共存させ、サンプル溶液中で非特異反応物質を吸収することとした。
　抗体溶液としては、ＴＡＴに対し特異的な結合能を有するモノクローナル抗体が固相化されたラテックス粒子を含有することを特徴とする、ＬＰＩＡジェネシス　ＴＡＴの第二試薬（以下、Ｒ２と記す）で使用されている抗ＴＡＴ抗体を、２５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（－）で希釈した、抗ＴＡＴ抗体溶液を用いた。サンプル溶液は、ＰＢＳ（－）で１０倍希釈した被検試料２０μＬに、非特異反応抑制剤としてＩｇＧ結合ペプチドまたは２０ｋＤａのＰＥＧを修飾したＩｇＧ結合ペプチドを終濃度２５μｇ／ｍＬまたは５０μｇ／ｍＬとなるように添加して、Ｒ１で総量が２００μＬとなるように調製したものを用いた。
［結果］
　結果を表４に示す。実施例２の結果と同様に、ＩｇＧ結合ペプチドは、ＰＥＧを修飾することにより、修飾しない場合より非特異反応の抑制効果が増した。また、ＰＥＧを修飾したＩｇＧ結合ペプチドは、抗体断片より分子量が小さいが、非特異反応抑制効果を示した。
　ＰＥＧを修飾していないペプチドの添加により、測定値が上昇した理由としては、ＩｇＧ結合ペプチドは非特異反応物質と結合しているが、非特異反応物質と抗ＴＡＴ抗体の結合を妨げるほどの立体障害が生じず、ＩｇＧ結合ペプチドが結合した非特異反応物質が抗ＴＡＴ抗体に結合したことにより、非特異反応抑制剤未添加のときに非特異反応物質のみが抗ＴＡＴ抗体に結合する場合よりも、センサー先端のレイヤーの厚みが増加して波長シフトの変化が大きくなったと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
《実施例４：ＰＥＧを修飾したペプチドと抗体断片の効果比較》
　実施例２および実施例３の結果から、ＰＥＧを修飾したペプチドは抗体断片より分子量が小さくても非特異反応抑制効果を示すことが明らかとなった。これは、特許第５１８９０９８号公報における、抗体断片では分子量が小さいために非特異反応抑制効果が小さく、ＰＥＧを修飾して巨大化させることで非特異反応抑制効果を発揮させるという報告を覆す、新たな発見といえる。そこで、非特異反応物質に結合するペプチドをＰＥＧ修飾した場合と、非特異反応物質に結合する抗体断片をＰＥＧ修飾した場合の非特異反応抑制効果を比較した。
［方法］
　ヒトＩｇＧに反応するＦａｂ´を用い、マレイミド基を末端に含有する２０ｋＤａのＰＥＧを化学修飾したＰＥＧ修飾抗体断片を調製した。ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナルＩｇＧ（International Immunology Corporation製の抗血清から精製）をペプシン消化し、Ｆ（ａｂ´）を調製した後、さらに０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＴＣＥＰ－ＨＣＬにて３７℃で２１０分間還元し、Ｆａｂ´を調製した。５ｍｇ／ｍＬ　Ｆａｂ´溶液にマレイミド基が結合した２０ｋＤａのＰＥＧ（日油社製）を加え、３７℃で３０分間反応させた。反応液は限外濾過にて５ｍｇ／ｍＬ程度に濃縮し、０．２ｍｏｌ／Ｌ　ＴＢＳにバッファー置換し、ＰＥＧ修飾抗ヒトＩｇＧ　Ｆａｂ´を得た。
　実施例３に記載のアッセイ条件と同様の方法にて、実施例２～３に記載のＰＥＧ修飾ペプチドと調製したＰＥＧ修飾抗体断片との非特異反応抑制効果を比較した。非特異反応抑制剤の添加量は２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬまたは４００μｇ／ｍＬとし、被検試料は、実施例３と同じ試料Ａを使用した。
［結果］
　結果を表５、６に示す。添加量を等しくした場合、ＰＥＧ修飾ペプチドのほうがＰＥＧ修飾抗体断片よりも非特異反応抑制効果が高かった。このことから、ＰＥＧ修飾ペプチドは少量でも十分な非特異反応抑制効果を持つことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
《実施例５：修飾するＰＥＧの分子量を増やした場合の非特異反応抑制効果の確認》
　特許第５１８９０９８号公報では、抗体断片に修飾するＰＥＧの分子量が大きい程、非特異反応抑制効果の増強が確認されている。そこで、修飾するＰＥＧの分子量を変えた場合のＰＥＧ修飾ペプチドの非特異反応抑制効果を確認した。
［方法］
　スクシミド基を末端に含有する５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａのＰＥＧを化学修飾した、ＰＥＧ修飾ＩｇＧ結合ペプチドを実施例１に記載の方法で調製した。
［非特異反応抑制剤の効果を評価するアッセイ条件］
　実施例３に記載のアッセイ条件と同様の方法にて実施した。非特異反応抑制剤として、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａのＰＥＧを化学修飾したＰＥＧ修飾ペプチドを添加したサンプル溶液を調製し、それぞれの非特異反応抑制効果を確認した。非特異反応抑制剤の添加量は５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、または２０μｇ／ｍＬとし、被検試料は、実施例３および４と同じ試料Ａを使用した。
［結果］
　結果を表７に示す。何れの分子量のＰＥＧを修飾した場合でも、非特異反応抑制効果を示した。また、その効果はＰＥＧの分子量の大きさに依存して高くなることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
《実施例６：自動分析装置を使用した場合の非特異抑制効果の確認》
　実際に自動分析装置を用いて、ラテックス凝集法で測定する際の非特異抑制効果を確認した。
［方法］
　実施例２で用いたＩｇＧ結合ペプチドおよびＰＥＧ修飾ＩｇＧ結合ペプチドによる非特異抑制効果をラテックス凝集法により確認した。
　測定は自動分析装置ＳＴＡＣＩＡ（ＬＳＩメディエンス社製）のオートメーション操作で実施した。ＳＴＡＣＩＡによる測定においては、主に２つの操作を実施させた。第一操作では、測定対象の試料をＲ１により希釈させ、３７℃で３．５分間加温した。第二操作では、Ｒ２を前記反応液に添加させ、３７℃で６分間加温しながらラテックス凝集反応を生じさせた。当該凝集反応を光学的にモニターすることで、非検体中のＴＡＴあるいは非特異反応物質を定量することとした。本実施例においては、Ｒ１に非特異反応抑制剤をサンプル添加後の濃度が０．０５ｍｇ／ｍＬ、または０．１ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、第一操作中に非特異反応物質を吸収することとした。非特異反応抑制剤未添加のＲ１には同液量のＰＢＳ（－）を添加し、添加物による希釈の影響を回避した。測定試料、Ｒ１、Ｒ２の混合比は、２０μＬ：９０μＬ：９０μＬとした。ラテックスの凝集は７００ｎｍの波長で検出した。測定値は濃度既知のＴＡＴを測定して得られた検量線から、吸光度の比較により測定値を算出した。被検試料は、実施例３～５と同じ試料Ａを使用した。
［結果］
　結果を表８に示す。ラテックス凝集法においてもＰＥＧ修飾ＩｇＧ結合ペプチドによる非特異抑制効果を確認できた。ＰＥＧを修飾していないペプチドの添加により、測定値が上昇した理由は、ＩｇＧ結合ペプチドは非特異反応物質と結合しているが、非特異反応物質と抗ＴＡＴ抗体の結合を妨げるほどの立体障害が生じず、ＩｇＧ結合ペプチドが結合した非特異反応物質が抗ＴＡＴ抗体に結合したことにより、非特異反応抑制剤未添加のときに非特異反応物質のみが抗ＴＡＴ抗体に結合する場合よりも、凝集塊が大きくなった、または複雑性が増したことにより吸光度が変化したと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
《実施例７：ＩｇＧ結合核酸アプタマーのＰＥＧ修飾の有無による抗ヒトＩｇＧ抗体とヒトＩｇＧへの反応抑制効果の確認》
　核酸アプタマーについても、実施例２同様に非特異抑制効果を確認するモデル系を用いて、ＰＥＧ修飾の有無による反応抑制効果を確認した。
［ＰＥＧ修飾ＩｇＧ結合核酸アプタマー］
　核酸アプタマーは、ヒトＩｇＧの精製を目的として報告されている約７．５ｋＤａのヒトＩｇＧ結合核酸アプタマー（核酸配列：Ｎ（６）＿ｇｇＡＧＧＵ（Ｆ）ＧｃＵ（Ｆ）ｃｃｇａａａＧＧＡ（Ｌ）ａＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃｃ（大文字＝ＲＮＡ、小文字＝ＤＮＡ、Ｎ（Ｆ）＝２’－Ｆｌｕｏｒｏ　ＲＮＡ、Ｎ（Ｌ）＝ＬＮＡ、Ｎ（６）＝Ａｍｉｎｏ　Ｃ６　ｌｉｎｋｅｒ）を用いた。ＰＥＧ修飾核酸アプタマーは、１分子の核酸アプタマーにＮ末端のアミノ基を介して１分子のＰＥＧを結合させたもの（核酸配列：Ｐ＿Ｎ（６）＿ｇｇＡＧＧＵ（Ｆ）ＧｃＵ（Ｆ）ｃｃｇａａａＧＧＡ（Ｌ）ａＣ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ｃｃ（大文字＝ＲＮＡ、小文字＝ＤＮＡ、Ｎ（Ｆ）＝２’－Ｆｌｕｏｒｏ　ＲＮＡ、Ｎ（Ｌ）＝ＬＮＡ、Ｎ（６）＝Ａｍｉｎｏ　Ｃ６　ｌｉｎｋｅｒ、Ｐ＝ＰＥＧ（Ｊｅｎｋｅｍ　ＭＥ　２０ｋＤａ））を用いた。
［方法］
　被検試料および測定は実施例２と同様のアッセイ条件とした。本実施例においては、測定試料中に被検試料と非特異反応抑制剤を共存させ、サンプル溶液中でヒトＩｇＧを吸収することとした。測定はＯｃｔｅｔＲ２に添付の操作マニュアルに従って実施した。
　抗体溶液として、抗ヒトＩｇＧポリクロ―ナルウサギ抗体（Dako社製）を２５μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（－）で希釈し、抗ヒトＩｇＧ抗体溶液とした。サンプル溶液は、ＰＢＳ（－）で１ｍｇ／ｍＬとしたヒトＩｇＧを被検試料とし、この被検試料２０μＬと、ＩｇＧ結合核酸アプタマー、または２０ｋＤａのＰＥＧを修飾したＩｇＧ結合核酸アプタマーを終濃度０．３ｍｇ／ｍＬとなるように添加して、反応バッファー（１４５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ　ＣａＣｌ２、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で総量２００μＬとなるように調製したものを用いた。
［結果］
　結果を表９に示す。ＩｇＧ結合核酸アプタマーは、ＰＥＧを修飾することにより、修飾しない場合より抗ヒトＩｇＧ抗体とヒトＩｇＧの反応抑制効果が増した。また、ＩｇＧ結合核酸アプタマーは約７．５ｋＤａであり、これに２０ｋＤａのＰＥＧを修飾した場合でも分子量は２７．５ｋＤａと抗体断片より分子量が小さいが、反応抑制効果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　本発明の非特異反応抑制剤は、免疫学的測定の用途に適用することができる。
　配列表の配列番号１、２の配列で表される各アミノ酸配列は、それぞれ、ヒトＩｇＧ結合ペプチド、ヒトＩｇＡ結合ペプチドである。

Claims (9)

  1. 　非特異反応物質に特異的に結合するペプチドまたは核酸分子と高分子化合物との複合体を含む、免疫学的測定用の非特異反応抑制剤。
  2. 　前記非特異反応物質に特異的に結合する物質が、化学合成可能な物質である、請求項１に記載の非特異反応抑制剤。
  3. 　前記複合体が５０ｋＤａ以下である、請求項１又は２に記載の非特異反応抑制剤。
  4. 　高分子化合物がポリエチレングリコールである、請求項１～３のいずれか一項に記載の非特異反応抑制剤。
  5. 　前記非特異反応物質が、免疫グロブリンである、請求項１～４のいずれか一項に記載の非特異反応抑制剤。
  6. 　非特異反応物質に特異的に結合するペプチドまたは核酸分子と高分子化合物との複合体を用いることを特徴とする、免疫学的測定方法。
  7. 　免疫学的測定法が、ラテックス凝集光学的測定法、免疫比ろう法、免疫比濁法、化学発光免疫測定法、酵素免疫測定方法、蛍光免疫測定法、又は放射免疫測定法である、請求項６に記載の免疫学的測定方法。
  8. 　非特異反応物質に特異的に結合するペプチドまたは核酸分子と高分子化合物との複合体を含む、免疫学的測定試薬。
  9. 　非特異反応物質に特異的に結合するペプチドまたは核酸分子と高分子化合物との複合体が安定化試薬に含まれることを特徴とする、請求項８に記載の免疫学的測定試薬。
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