JP3041382B2

JP3041382B2 - 免疫学的測定法

Info

Publication number: JP3041382B2
Application number: JP1286429A
Authority: JP
Inventors: 繁男木村; 陽一橋口
Original assignee: 国際試薬株式会社
Priority date: 1989-11-02
Filing date: 1989-11-02
Publication date: 2000-05-15
Anticipated expiration: 2015-05-15
Also published as: JPH03148065A

Description

【発明の詳細な説明】＜産業上の利用分野＞本発明は免疫学的測定法に関する。より詳細には、主
として臨床検査の分野での利用を目的とした免疫比濁法
又は免疫比朧法による試料中の物質の免疫学的測定法に
関する。

＜従来の技術及び発明が解決しようとする課題＞臨床検査等の分野では、試料中の測定対象物質（例え
ば、抗原、ハプテン、抗体、薬物等）の測定（定量）法
として、測定対象物質と当該対象物質と抗原抗体反応可
能な物質（例えば、測定対象物質が抗原又はハプテンの
場合には抗体、測定対象物質が抗体の場合には抗原等）
との抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法が汎用され
ている。このような抗原抗体反応による免疫学的測定法
としては、例えば、免疫拡散法（SRID法）、免疫比濁
法、免疫比朧法、担体を用いた赤血球凝集法やラテック
ス法、放射免疫測定法（RIA法）、酵素免疫測定法（EIA
法）等が挙げられる。これらの方法のうち、SRID法は測
定時間が長い上測定精度があまりよくなく、担体を用い
る方法は試薬の調製が複雑であり、RIA法やEIA法は操作
が繁雑で、専用の測定器が必要であり、特に放射性物質
を用いるRIE法では、放射性廃棄物の処理や特定の設備
が必要となる等の問題があった。

測定対象物質と、測定対象物質と抗原抗体反応可能な
物質を反応させて生ずる抗原抗体複合物の濁度を光学的
に測定することにより、試料中の測定対象物質量を測定
する免疫学的測定法として、入射光に対する透過光の強
度を測定する免疫比濁法（イムノタービジメトリー）及
び入射光に対する散乱光の強度を測定する免疫比朧法
（イムノネフェロメトリー）が知られている（以下、本
明細書においては、便宜上、免疫比濁法と免疫比朧法を
合わせて、単に「免疫比濁法」と称する）。免疫比濁法
は上述のような欠点がなく、汎用タイプの自動分析装置
で多検体の測定が容易にできるため、最近臨床検査の分
野でもよく用いられるようになった。

しかし、免疫比濁法は抗原抗体反応により生じた抗原
抗体複合物を濁度として定量するという反応原理そのも
のが簡略で、測定操作が簡便であるという利点を有する
が、他の従来法に比べると測定感度が比較的低いため
得、測定項目（特に微量物質などにおいて）によっては
低値レベルでの測定において十分な精度を得ることが難
しいという問題があった。かかる問題を解決するため、
例えば、Ｃ反応性蛋白（以下、CRPという）の測定にお
いて、加熱変性等の変性処理により高分子化された抗CR
P抗体を用いる方法（特開平１−213573号公報参照）が
知られているが、この方法では変性処理のわずかな誤差
が測定の再現性に影響する問題がある。また、測定対象
物質と抗原抗体反応可能な物質として、水性媒体に不溶
性な物質（例えば、抗原又は抗体で感作したポリスチレ
ンラテックスや無機担体）を用いると、測定セルにラテ
ックスや担体が付着（吸着）し易く、測定後にセルを洗
浄してもセルの汚染を防止することが困難であり、連続
的に測定を行う自動測定では誤差を生じ易いという問題
があった。

更に、免疫比濁法では、目的とする抗原抗体反応のほ
かに試料中の補体成分等との非特異的反応による凝集が
生じ易く、測定精度及び信頼性に欠けるという点でも問
題があった。

本発明は、このような従来技術の欠点を解消するため
になされたもので、本発明者らが鋭意研究した結果、従
来の免疫比濁法の問題点を改良して測定感度を上昇さ
せ、かつ非特異的反応を除去できる方法を見出して完成
したものである。即ち、本発明は測定精度及び感度に優
れ、臨床検査の分野等で有用に利用できる免疫学的測定
法を提供することを目的とする。

＜課題を解決するための手段及び作用＞上記の課題を解決すべくなされた本発明の免疫学的測
定法は、免疫比濁法において、測定対象物質と抗原抗体
反応可能な物質として、測定対象物質と免疫学的に反応
し得る物質と蛋白が化学的に結合しており且つ水溶性で
ある物質を用いることを特徴とするものであり、更に上
記の測定法において、反応系にアミノ酸又はその塩を添
加することを特徴とするものである。

本発明は上記の構成よりなり、本発明においては、試
料中の測定対象物質と免疫学的に反応し得る物質に、予
め化学的結合法で蛋白を結合させて分子量を増大させた
物質が用いられ、この物質と測定対象物質との抗原抗体
反応により生じた抗原抗体複合物の濁度を測定すると、
このように蛋白を結合させていない従来の免疫比濁法に
比べて感度を著しく上昇させることができる。更に当該
反応系にアミノ酸又はその塩を添加することにより、試
料中の補体成分等に起因する非特異的反応が抑制され、
測定精度及び感度が改善される。

本発明の方法における測定対象物質としては、抗原、
抗体、ホルモンなどのような臨床検査等で測定対象とさ
れている種々の蛋白質性物質が挙げられる。より具体的
には、例えば、CRP、フィブリン及びフィブリノーゲン
分解産物、IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、抗ストレプトリ
ジンＯ、リウマチ因子、トランスフェリン、ハプトグロ
ビン、α_１−アンチトリプシン、α_１−アシドグリコプ
ロテイン、α_２−マクログロブリン、ヘモペキシン、ア
ンチトロンビン−III、α−フェトプロテイン、CEA（カ
ルシノエンブリオニック抗原）、フェリチン、HBs−Ag
（Ｂ型肝炎外被抗原）、Anti−HBs（抗Ｂ型肝炎外
被）、HBe−Ag（Ｂ型肝炎ｅ抗原）、Anti−HBe（抗Ｂ型
肝炎ｅ）、Anti−HBc（抗Ｂ型肝炎コア）等を挙げるこ
とができる。これらの物質を含む試料（検体）としては
例えば、血清、血漿、尿、髄液、リンパ液等を挙げるこ
とができる。

上記測定対象物質と免疫学的に反応し得る物質（以
下、免疫反応性物質という）としては、測定対象物質が
抗原等の場合にはその抗体が、測定対象物質が抗体の場
合にはその抗原が用いられる。これら免疫反応性物質と
しての抗原及び抗体は慣用の方法にて調製することがで
き、また抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗
体の何れであってもよく、更にＦ（ab）_２画分、Ｆ（a
b′）_２画分等であってもよい。

免疫反応性物質と化学的に結合される蛋白としては特
に限定されず、免疫反応性物質と結合して分子量の大き
な複合体となり得るものであれば種々の蛋白を用いるこ
とができる。その一例を示すと、IgG、Fab′画分、ウシ
血清アルブミン（BSA）等が挙げられる。

免疫反応性物質と上記の蛋白を結合させる化学的結合
法としては、免疫反応性物質及び蛋白中のアミノ基、チ
オール基、カルボキシ基等の反応性官能基を直接又は結
合基を介して間接的に結合させる種々の方法を用いるこ
とができる。その例としては、チオール基とチオール基
（又はアミノ基）とをN,N′−ｏ−フェニレンジマレイ
ミド、N,N′−ｍ−フェニレンジマレイミド等のジマレ
イミド類又は４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボン酸・１−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル、３−マレイミド安息香酸・１−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル等のマレイミド誘導体を用いるマレイ
ミド法；アミノ基とアミノ基とをグルタルアルデヒド、
マロンジアルデヒド、スクシンジアルデヒド等のジアル
デヒド類を用いて結合するジアルデヒド法；アミノ基と
アミノ基とをヘキサメチレンジイソシアネート等のジイ
ソシアネート類で結合するジイソシアネート法；カルボ
キシ基とアミノ基とをN,N′−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ′−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド等のカルボジイミド類で結合す
るカルボジイミド法；チオール基とチオール基とをピリ
ジンジスルフィドを用いて直接的に結合させるピリジン
ジスルフィド法などが挙げられる。

免疫反応性物質と蛋白との反応方法は、上記の化学的
結合法の種類に応じて適宜の方法を用いることができる
が、通常、水又は適当な緩衝液（リン酸緩衝液、ホウ酸
緩衝液等）中、室温乃至冷却下に行われる。より具体的
な実施方法は、例えば、千畑編「固定化酵素」（1975年
講談社発行）等に詳述されている。なお、本発明では、
免疫反応性物質と蛋白とか化学的に結合した物質は水溶
性であるものが使用される。

本発明の免疫学的測定法は、測定対象物質と抗原抗体
反応可能な物質として、免疫反応性物質と蛋白とが化学
的に結合しており且つ水溶性である物質を用いる以外
は、従来の免疫比濁法（即ち、イムノタービジメトリー
及びイムノネフェロメトリー）と実質的に同様な方法で
行うことができる。この際、反応系にアミノ酸又はその
塩を添加すると、試料中の補体成分等に起因する非特異
的反応が抑制され、測定精度及び感度を改善できる。ア
ミノ酸としては各種のアミノ酸が使用し得るが、好まし
くはアスパラギン酸、アルギニンが用いられる。また、
アミノ酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウ
ム塩、アンモニウム塩等の塩基性塩、塩酸塩、酢酸塩、
クエン酸塩等の酸性塩が挙げられる。アミノ酸及びその
塩の使用量としては、反応系における濃度が10〜1000mM
程度、好ましくは30〜500mM程度となるように調製され
て使用される。

更に、反応系には、必要に応じて、ポリエチレングリ
コール、デキストラン、ゼラチン、塩化ナトリウム等の
慣用の添加剤を加えてもよい。

次に、本発明の測定法をより具体的に説明する。ま
ず、その一例として、試料中のCRPを測定対象物質とし
て、タービジメトリーにて測定（定量）する例をもって
説明すると、慣用の方法により調製された抗CRP抗体
に、例えばマレイミド法により、蛋白として例えばFa
b′を結合させておき、これを適切な緩衝液（例えばリ
ン酸緩衝液10〜200mM、pH6.0〜7.4、好ましくはpH6.0）
を用いて力価を調整し、第二試薬とする。次に、適切な
緩衝液（例えばグッド緩衝液のHEPES緩衝液10〜200mM、
pH6.0〜9.0、好ましくはpH7.8）に、場合によっては、
ポリエチレングリコール（１〜５％）及び／又は塩化ナ
トリウム（50〜300mM）を添加したものを第一試薬とす
る。

次いで、まずCRPを含む試料に第一試薬を添加して、
試料中のCPR濃度に応じて20〜80倍に希釈する。この希
釈液を２〜10分間、20〜40℃に加温後、これに第二試薬
を加えて３〜10分間、20〜40℃に加温する。そして抗原
抗体反応により生じた抗原抗体複合物の濁度を波長300
〜800nmでの吸光度として測定し、CRP濃度既知の標準試
料を用いて予め作成された検量線の吸光度と対比するこ
とにより、試料中のCRP含量を測定する。なお、吸光度
の測定は、エンドポイント法及びレートアッセイ法の何
れの方法で行ってもよい。

更に、反応系にアミノ酸又はその塩を添加する場合に
は、上述の第一試薬に添加するのが好ましく、例えば、
アスパラギン酸ナトリウムの場合は40〜200mM程度を添
加しておき、上述と同様にして測定すれば、補体成分等
に起因する非特異的反応を抑制することができ、測定精
度及び感度を一層向上させることができる。

なお、本発明の測定法により、CRP以外の測定対象物
質を測定する場合、緩衝液、反応時間等を適宜調整し、
上記と実質的に同様な方法で行うことができる。又、上
記の例では、抗原抗体複合物の濁度測定を、吸光度を測
定するタービジメトリーにて行っているが、散乱光を測
定するネフェロメトリーにて行ってもよい。

＜発明の効果＞本発明の測定法によれば、次の効果を奏する。

従来の免疫比濁法における測定に比べ感度を３〜20倍
上昇させることができるため、特に微量物質の測定にお
いて低値の測定レベルを上昇させ、精度よく測定するこ
とが可能である。

自動分析装置を用いた場合、あまり感度が高すぎる
と、逆に高値ではスケールオーバーとなり測定が不可能
になる場合があるが、本発明では試薬濃度や蛋白と免疫
反応性物質との混合比等を調節することにより最適な感
度に設定することができる。

免疫反応性物質と蛋白とが化学的結合法により結合し
ているので、均一性及び再現性に優れた免疫反応性物質
−蛋白複合体が得られ、測定精度が向上する。また、本
発明で使用される、免疫反応性物質と蛋白とが化学的に
結合した物質は水溶性であるので、セルの洗浄が容易で
あり、連続的に測定を行う自動測定でも測定セルの汚染
に起因する誤差の発生を防止することができる。

アミノ酸類の添加により補体成分等の非特異的反応を
抑制できるため、従来の方法に比べ正確に測定対象物質
を定量できる。

＜実施例＞以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

実施例１ヒト血清中のCRPを測定するため、まず抗ヒトCRP血清
を既知の方法でIgG画分とし、次いで４−（マレイミド
メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸・１−ヒドロ
キシスクシンイミドエステルを用いた公知のマレイミド
法で、これをマレイミド化IgGとした。一方、ウサギγ
−グロブリンを既知の方法でIgG画分とした後、公知の
ペプシン消化法でＦ（ab′）_２とし、更に公知の方法に
よりメルカプトエチルアミンを加えてFab′−SHとし
た。これらマレイミド化IgGとFab′−SHとを混合し、結
合させて抗ヒトCRP・IgG−Fab′結合体を作製した。こ
の方法では、反応試薬（例えば、マレイミド化剤、マレ
イミド化IgG、Fab′−SH等）の使用量を適宜変更するこ
とにより、IgG1分子当り１〜13分子のFab′を結合させ
ることができる。そして得られた抗ヒトCRP・IgG−Fa
b′結合体をリン酸緩衝液（100mM、pH6.0）で0.5mg/ml
力価とし、これを第二試薬とした。

実施例２ HEPES緩衝液（10mM、pH7.8）にポリエチレングリコー
ル３％及び塩化ナトリウム100mMを添加し、これを第一
試薬とした。次に、所定量のCRPを含む検体を希釈し
て、CRP濃度が原液の4/5、3/5、2/5、1/5である希釈液
を調製し、試料液とした。この試料液を各15μをと
り、これに第一試薬400μを加え５分間37℃で加温
後、混合比（IgGとFab′とを結合させる際のIgG1モル当
りに対するFab′の仕込みモル数を意味する）の異なる
抗ヒトCRP・IgG−Fab′結合体を含む上述の第二試薬100
μを加えて５分間37℃で加温した後、波長340nmでの
吸光度を測定した。測定結果を第１図に示す。なお、コ
ントロールとして、Fab′の結合していない抗ヒトCRP・
IgGを用いた場合も併せて示した。

第１図中、■−■はコントロール、△−△は混合比
１、▲−▲は混合比５、○−○は混合比10、●−●は混
合比20をそれぞれ示す。

第１図に示されるように、本発明の方法によれば、蛋
白を結合しない従来の方法に比べ高感度にCRPを測定す
ることができると共に、IgGとFab′の混合比を変化さ
せ、結合量を調整することにより、感度を適宜設定でき
ることが明らかとなった。

実施例３試料としてヒト血清10例をとり、それぞれ15μに前
述の第一試薬400μを加え37℃で５分間加温後、更に
前述の第二試薬（混合比５）100μを加え37℃で５分
間加温したあと、波長340nmでの吸光度を測定し、CRP濃
度既知の標準試料を用いて同様な操作により予め作成し
た検量線からCRPの値に換算した（測定Ａという）。

一方、実施例２で作製した第一試薬に、アスパラギン
酸ナトリウム80mMを加えたものを第三試薬として調製す
る。次に、測定Ａにおける第一試薬の代わりに第三試薬
を用いて、同じヒト血清試料を測定Ａと同様に測定し、
CRPの値に換算した（測定Ｂという）。

更に、測定Ａで用いた同じヒト血清試料を予め56℃で
30分間加温して非動化し、補体成分を不活性化したもの
について測定Ａと同様に測定し、CRPの値に換算した
（測定Ｃという）。

これらＡ〜Ｃの測定法により得られた結果を第１表に
示す。

第１表に示されるように、測定Ｂの測定値は測定Ａよ
りも低く、また測定Ｂ及びＣの測定値はほぼ一致してい
ることから、反応系にアミノ酸を添加する本発明の方法
（測定Ｂ）は非特異的な反応を著しく抑制できることが
明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２におけるCRP濃度と吸光度との関係
を示す図である。同図中、■−■はコントロール、△−
△は混合比１、▲−▲は混合比５、○−○は混合比10、
●−●は混合比20をそれぞれ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭62−259063（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−200064（ＪＰ，Ａ) 特開平１−213573（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−207959（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−272157（ＪＰ，Ａ) 特開昭55−44903（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−2554（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/536

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の蛋白質性測定対象物質と当該測定
対象物質と抗原抗体反応可能な物質とを反応させ、生ず
る抗原抗体複合物の濁度を光学的に測定することにより
試料中の測定対象物質量を測定する免疫学的測定法にお
いて、上記の測定対象物質と抗原抗体反応可能な物質と
して、測定対象物質と免疫学的に反応し得る物質と蛋白
とが化学的に結合しており且つ水溶性である物質を用い
ることを特徴とする免疫学的測定法。
【請求項２】請求項１記載の免疫学的測定法において、
反応系にアミノ酸又はその塩を添加することを特徴とす
る免疫学的測定法。