JP4278123B2

JP4278123B2 - 免疫学的測定方法、免疫反応干渉物質の除去方法および測定試薬

Info

Publication number: JP4278123B2
Application number: JP25178799A
Authority: JP
Inventors: 勝紀渡辺; 英俊辛島; 一彦佐藤
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1999-09-06
Filing date: 1999-09-06
Publication date: 2009-06-10
Anticipated expiration: 2019-09-06
Also published as: JP2001074739A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、被測定物質を免疫学的方法で測定するに際して、異好性抗体やリウマチ因子などの干渉作用の影響を回避し、正確な抗原または抗体濃度を測定することのできる免疫学的測定方法、免疫反応干渉物質の除去方法、および測定試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種疾患と関連して生体中に出現する蛋白質等の免疫学的活性物質を抗原抗体反応を利用して検出し、診断に利用することが広く行われている。このような抗原抗体反応を利用した測定方法としては、放射免疫測定法（ＲＩＡ)、酵素免疫測定法(ＥＩＡ)、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス凝集法（ＬＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）等の種々の方法が実用化されている。
【０００３】
しかしながら、免疫測定法の測定対象となる検体中には、個体特性や採取条件等により、生体成分である異好性抗体やリウマチ因子が混在している場合がある。これらの干渉作用を与える物質が多く含まれると、測定結果に誤差が生じ、特に臨床検査の分野では、誤診を起こすので、これらの干渉物質の影響を解消したり、軽減する方法が検討されている。
【０００４】
例えば、異種抗体分子のFc部分を酵素反応で取り除いたF(ab')2分子を抗体として用いる免疫測定法が提案されている（特開昭５４−１１９２９２号公報）。
しかしながら、この免疫測定法では、抗原を測定する際にしか利用できず、しかも酵素反応や精製等の原料調製のための煩雑な工程が必要となり、コストアップや製造ロット間差につながるという問題があった。
【０００５】
また、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｄ等の２価金属イオンの存在下で、リポプロテインやフィブリノーゲンなどの干渉物質の影響を除去する凝集試験用水性溶媒が提案されている（特開昭５６−２５５５号公報）が、異好性抗体やリウマチ因子の影響の回避については、全く示唆されていない。
【０００６】
また、干渉物質である異好性抗体の影響を除去するため、重合化または凝集した抗体分子を利用しているが、大量の検体を処理する自動分析装置による測定には、大量の試薬が必要となるため、コストが高くなり、不向きである（特開平４−２２１７６２号公報）。
【０００７】
リウマチ因子が混在する問題を解決するため、予め検体をヒトリウマチ因子の反応部位に結合能を有する動物由来抗体で前処理して、検体中のヒトリウマチ因子に起因する非特異的反応を減少させる免疫測定法が提案されている（特開平７−１２８１８号公報）。
【０００８】
さらに、反応液のｐＨを４．０〜６．０に維持することにより、リウマチ因子の測定への影響を回避する免疫測定法（特開平８−１４６０００号公報、特開平９−４９８３９号公報）、ムコ多糖を共存させて生体試料中に含まれる免疫反応干渉物質の影響を除去する免疫反応干渉作用の除去方法（特開平８−２９４２０号公報）、α−グロブリンを干渉抑制剤として配合された免疫測定法（特開平９−４９８４０号公報）等が提案されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら公報に記載された方法では、確かに干渉物質に対する影響は改善されるものの、測定すべき検体中に干渉物質が高濃度に含まれる場合には、その抑制効果は未だ不十分であり、更に改善された方法が強く望まれていた。
【００１０】
従って本発明は、このような従来の課題に着目してなされたものであって、測定すべき検体中に干渉物質が高濃度に含まれる場合であっても、干渉作用を十分に抑制することのできる免疫学的測定方法およびこれに用いた測定試薬を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、従来の免疫学的測定試薬に、低級酸素酸塩または遷移金属を含有させることにより、干渉物質の高い抑制効果が得られることを見い出し、本発明に到達した。
【００１２】
本発明の上記の課題は、低級酸素酸塩の存在下で、抗原抗体反応を行うことを特徴とする免疫学的測定方法および測定試薬により達成された。
【００１３】
また、本発明の上記の課題は、遷移金属の存在下で、生体試料中に含まれるリウマチ因子および／または異好性抗体の影響を除去することを特徴とする免疫反応干渉物質の除去方法により達成された。
【００１４】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
【００１５】
本発明に使用する低級酸素酸塩は、公知の低級酸素酸塩の中から適宜選択して使用することができる。これら低級酸素酸塩としては、亜硫酸塩、次亜硫酸塩、亜燐酸塩、および次亜燐酸塩から成る群から選択される少なくとも１種が挙げられるが、中でも特に亜硫酸ナトリウムが好ましい。
【００１６】
本発明においては、低級酸素酸塩を１〜１０００ｍＭ、好ましくは１５０〜２５０ｍＭ、より好ましくは２００ｍＭとなるように含有させる。低級酸素酸塩の濃度が１ｍＭ未満になると、免疫反応に影響を与える干渉物質を効果的に抑制できず、逆に１０００ｍＭを超えると、溶液の粘度が高くなり、測定値に悪影響を与える。
【００１７】
また、本発明に使用する遷移金属も、公知のものの中から適宜選択して使用することができる。その具体例としては、銅、ニッケル、およびコバルトから成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類が挙げられるが、特に酢酸ニッケルが好ましい。
【００１８】
本発明においては、遷移金属を０．１〜１００ｍＭ、好ましくは１２〜２０ｍＭ、より好ましくは１６ｍＭとなるように含有させる。遷移金属の濃度が０．１ｍＭ未満となると、リウマチ因子や異好性抗体を効果的に抑制できず、逆に１００ｍｍを超えると、測定値に悪影響を与え、正確な測定ができなくなる。
【００１９】
本発明においては、特に必要とされないが、公知のたんぱく質保護剤を必要に応じて加えることによって被測定物質の安定化効果をより高めることができる。このようなたんぱく保護剤としては、アルブミンやゼラチンに代表される不活性たんぱく質等を挙げることができる。
【００２０】
本発明によって干渉物質の影響を回避した検体は、そのまま公知の免疫学的測定方法に基づく測定用試料となる。測定方法の具体例としては、サンドイッチ法、競合法の原理に基づくＲＩＡ法やＥＬＩＳＡ法、ラテックス凝集反応法などの免疫学的粒子凝集反応法および免疫比濁法から成る群から選択されるものが挙げられる。
【００２１】
これらの免疫学的測定法の中でも、特に生体試料中の被測定物質である抗原（または抗体）と、測定試薬中の抗体（または抗原）と反応させ、その結果生じる免疫凝集物を光学的手段によって検出することを測定原理とする、免疫比濁法やラテックス凝集法が好ましい。
【００２２】
検体試料は、用いる試薬の測定可能範囲に応じて適宜希釈して測定用のサンプルとする。希釈には、免疫学的な反応に好適なｐＨや塩濃度を与える希釈溶液を用いても良い。
【００２３】
本発明においては、固相担体に感作させる抗原または抗体としては、特に限定されず、公知のものの中から適宜選択して使用することができる。その具体例としては、例えば、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、トランスフェリン等の血漿蛋白に対する抗体、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、トリヨードサイロニン、サイロキシン、サイロキシン結合性蛋白、サイログロブリン、インスリン、エストリオール、ヒト胎盤性ラクトーゲン等のホルモンに対する抗体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β2−マクログロブリン、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）等の腫瘍関連物質に対する抗体、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体等のウイルス肝炎の抗原に対する抗体および抗体に対する抗原、ムンプス、ヘルペス、麻疹、風疹等のウイルス、各種生体成分に対する抗体または抗原、フェノバルビタール、アセトアミノフェノン、サリチル酸、シクロスポリン等の各種薬剤に対する抗体が挙げられる。
【００２４】
本発明に使用しうる上記抗体としては、由来する動物種やクローンに特に制限されず、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ウマ、ヒツジ等に由来する抗体が挙げられ、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でも良い。
【００２５】
本発明では、異好性抗体やリウマチ因子などの干渉物質の抑制因子として作用する低級酸素酸塩および／または遷移金属を含有させた免疫学的測定試薬を提供することができる。この場合、低級酸素酸塩および／または遷移金属は、上述したように公知のものの中から適宜選択して使用することができる。
【００２６】
【発明の効果】
本発明は、測定すべき検体中に異好性抗体やリウマチ因子などの干渉物質が高濃度に含まれる場合であっても、高い精度で免疫測定を行うことを可能とする。従って本発明によれば、測定検体の前処理や測定試薬原料の加工といった煩雑な操作が不要となる。
【００２７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００２８】
実施例１．亜硫酸ナトリウムを用いたリウマチ因子の干渉作用回避の確認試験
４７１６IU/mlのリウマチ因子を含むリウマチ因子陽性ヒト血清検体を生理食塩水で６４倍まで倍々希釈した試料３μlに、それぞれ０、５０、１００、１５０、２００、２５０ｍＭの亜硫酸ナトリウムを含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７．４)１５０μlを反応セル内に加えて混合した。
混合後、５分後に抗ヒトＣＲＰ抗体（動物名：ヤギ）を感作したラテックス粒子を含有するラテックス液１５０μlを混合物に加え、３７℃で反応させ、０．５〜２分後にかけて全自動分析装置日立７１７０（日立製作所製）を用いて波長５７０ｎｍで吸光度を測定し、各測定点の間の吸光度変化量を求めた。
ＣＲＰの濃度を定量するため、ＣＲＰ既知濃度の標準物質を測定して得られた検量線を基にして検体中のＣＲＰ濃度を算出した。その結果を図１に示す。
【００２９】
対照例１．亜硫酸ナトリウムが免疫反応に与える影響
リウマチ因子陰性検体を用いた以外は、実施例１と全く同様にしてＣＲＰの濃度を算出した。その結果を図２に示す。
図２に示すように、亜硫酸ナトリウムの免疫反応に及ぼす影響は殆どないことが判る。
従って、図１および図２を勘案すると、１５０、２００、２５０ｍＭの亜硫酸ナトリウムを添加した場合には、リウマチ因子に起因した測定誤差が著しく改善し、免疫学的測定法における干渉作用を十分に回避できたことが理解される。
これに対し、５０、１００ｍＭの亜硫酸ナトリウムを添加した場合には、干渉作用の抑制効果は認められるものの、未だ不十分であり、さらに亜硫酸ナトリウムを含まない場合には、干渉作用が生じていることが判る。
【００３０】
実施例２．酢酸ニッケル(II)を用いたリウマチ因子の干渉作用回避の確認試験
実施例１で用いた亜硫酸ナトリウムの代わりに、０、４、８、１２、１６、２０ｍＭの酢酸ニッケル(II)を用いた以外は、実施例１と全く同様にしてリウマチ因子の干渉作用回避の確認試験を行った。その結果を図３に示す。
【００３１】
対照例２．酢酸ニッケル(II)が免疫反応に与える影響
リウマチ因子陰性検体を用いた以外は、実施例２と全く同様にしてＣＲＰの濃度を算出した。その結果を図４に示す。
図４に示すように、酢酸ニッケル(II)の免疫反応に及ぼす影響は殆どないことが判る。
従って、図３および図４を勘案すると、１２、１６、２０ｍＭの酢酸ニッケル(II)を添加した場合には、リウマチ因子に起因した測定誤差が著しく改善し、免疫学的測定法における干渉作用を十分に回避できたことが理解される。
これに対し、４、８ｍＭの酢酸ニッケル(II)を添加した場合には、干渉作用の抑制効果は認められるものの、未だ不十分であり、さらに酢酸ニッケル(II)を含まない場合には、干渉作用が生じていることが判る。
【図面の簡単な説明】
【図１】リウマチ因子陽性検体の希釈系列における実施例１のＣＲＰ濃度の測定結果を示すグラフである。
【図２】リウマチ因子陰性検体の希釈系列における対照例１のＣＲＰ濃度の測定結果を示すグラフである。
【図３】リウマチ因子陽性検体の希釈系列における実施例２のＣＲＰ濃度の測定結果を示すグラフである。
【図４】リウマチ因子陰性検体の希釈系列における対照例２のＣＲＰ濃度の測定結果を示すグラフである。

Claims

１５０〜２５０ｍＭの亜硫酸ナトリウムの存在下で、リウマチ因子の干渉作用を抑制させて抗原抗体反応を行うことを特徴とする免疫学的測定方法。
反応試薬中で１５０〜２５０ｍＭの亜硫酸ナトリウムを含有することを特徴とするリウマチ因子の干渉作用を抑制するための免疫学的測定試薬。