JP6857939B2 - 免疫学的測定方法および測定試薬 - Google Patents
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Description
本発明は、被測定物質の免疫学的方法での測定において、異好性抗体やリウマトイド因子等の干渉物質（以下、干渉物質）による干渉作用を抑制し、抗原または抗体濃度を正確に測定することができる免疫学的測定方法、および免疫学的測定試薬に関するものである。
抗原と抗体との間の抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法は、生体中の蛋白質等の免疫学的活性物質を簡便、迅速に測定できることから、近年、各種疾患の診断に広く利用されている。このような免疫学的測定法としては、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス凝集法（ＬＡ）、イムノクロマトグラフィー法等の種々の方法が実用化されている。
しかしながら、免疫学測定法の測定対象となる検体の中には、抗原抗体反応に対して干渉する干渉物質等が含まれている場合がある。これら抗原抗体反応に干渉物質が含まれると、測定結果に影響するため正確な測定ができなくなり、特に臨床検査の分野では、正確な診断ができなくなるため、これまで、干渉物質の影響を軽減、あるいは抑制する方法が提案されている。
例えば、リウマトイド因子の混在による干渉作用の問題を解決するため、検体を予めヒトリウマトイド因子の結合部位に結合する動物由来抗体で前処理して、リウマトイド因子による干渉作用を低減させる免疫学的測定法（特許文献１）や、反応液のｐＨを４．０から６．０に保つことにより、リウマトイド因子の干渉作用を抑制する免疫学的測定法（特許文献２）等が提案されている。
また、干渉物質による干渉作用を軽減あるいは抑制するため、免疫学的測定に使用する抗体のＦｃ部分を酵素反応で除去したＦ（ａｂ’）２を使用する方法が提案されている（特許文献３）。しかしながら、この免疫学的測定法では、抗原を測定する場合にしか利用できず、しかもＦ（ａｂ’）２作製のための酵素反応や精製等の煩雑な工程が必要であり、コストアップや製造ロット間差という問題があった。
さらに、重合化または凝集した抗体分子を利用する、異好性抗体による干渉作用を抑制する方法も提案されている（特許文献４）が、異好性抗体による干渉作用を完全に抑制するためには大量の重合化または凝集した抗体分子が必要であり、コストが高くなるという問題がある。
これらの文献に記載された、干渉物質による干渉作用を抑制する方法では、確かに干渉物質による影響は改善されるものの、測定すべき試料中に干渉物質が高濃度で含まれる場合には、その干渉作用を抑制する効果は不十分であった。
測定すべき試料中に干渉物質が高濃度で含まれる場合であっても、干渉物質による干渉作用を抑制することができる、亜硫酸塩を利用するする方法（特許文献５）が提案されている。亜硫酸塩は非常に安価であり、高濃度の干渉物質の影響を十分に抑制できるような濃度で使用してもコストを上げることがなく、また、抗原抗体反応に影響を与えにくいという利点がある。
しかしながら、亜硫酸塩は測定試薬中の溶存酸素または空気中の酸素により徐々に硫酸塩に酸化されるため、干渉物質による干渉作用の抑制効果が経時的に低下する。すなわち、自動分析装置等で使用するために、開封状態で試薬庫等に保存することにより経時的に亜硫酸塩濃度が減少し、干渉物質の影響を十分に抑制できなくなるという問題があった。また、干渉物質が高濃度の場合は、その干渉作用を十分に抑制できないこともあるという問題もあった。
従って本発明は、上記の現状に着目してなされたものであって、測定する試料中に干渉物質が高濃度に含まれる場合であっても、これらによる干渉作用を長期間にわたって抑制することができる安定性の高い疫学的測定方法およびこれを用いた測定試薬を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、亜硫酸塩を含む測定試薬のｐＨを７．０以下にすることにより、長期間にわたり高い干渉物質に対する抑制効果がえられることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の構成よりなる。
（１）免疫学的測定試薬を用いて、亜硫酸塩の存在下で、抗原抗体反応を行う免疫学的測定法において、亜硫酸を含有する免疫学的測定試薬のｐＨが７．０以下であることを特徴とする前記免疫学的測定方法。
（２）前記亜硫酸塩を含有する免疫学的測定試薬のｐＨが５．６から７．０の範囲である（１）に記載の免疫学的測定方法。
（３）前記亜硫酸塩が５０ｍＭ以上である（１）または（２）に記載の免疫学低測定方法。
（４）前記亜硫酸塩が５０ｍＭから６００ｍＭである（１）から（３）のいずれか１項に記載の免疫学的測定方法。
（５） 前記免疫学的測定試薬を含む第１試薬と、測定対象物と反応する抗体または抗原、もしくは測定対象物と反応する抗体または抗原を担持した担体を含む第２試薬とを混合する工程を含む、測定対象物を定量または定性測定する（１）から（４）のいずれか１項に記載の免疫学的測定方法。
（６）免疫学的測定方法が、ラテックス凝集法である（１）から（５）のいずれか１項に記載の免疫学的測定方法。
（１）免疫学的測定試薬を用いて、亜硫酸塩の存在下で、抗原抗体反応を行う免疫学的測定法において、亜硫酸を含有する免疫学的測定試薬のｐＨが７．０以下であることを特徴とする前記免疫学的測定方法。
（２）前記亜硫酸塩を含有する免疫学的測定試薬のｐＨが５．６から７．０の範囲である（１）に記載の免疫学的測定方法。
（３）前記亜硫酸塩が５０ｍＭ以上である（１）または（２）に記載の免疫学低測定方法。
（４）前記亜硫酸塩が５０ｍＭから６００ｍＭである（１）から（３）のいずれか１項に記載の免疫学的測定方法。
（５） 前記免疫学的測定試薬を含む第１試薬と、測定対象物と反応する抗体または抗原、もしくは測定対象物と反応する抗体または抗原を担持した担体を含む第２試薬とを混合する工程を含む、測定対象物を定量または定性測定する（１）から（４）のいずれか１項に記載の免疫学的測定方法。
（６）免疫学的測定方法が、ラテックス凝集法である（１）から（５）のいずれか１項に記載の免疫学的測定方法。
（７）亜硫酸塩の存在下で、抗原抗体反応を行う免疫学的測定試薬であって、亜硫酸塩を含有する免疫学的測定試薬のｐＨが７．０以下であることを特徴とする前記免疫学的測定試薬。
（８）前記亜硫酸塩を含有する試薬のｐＨが５．６から７．０の範囲である（７）に記載の免疫学的測定試薬。
（９）前記亜硫酸塩が５０ｍＭ以上である（７）または（８）記載の免疫学低測定試薬。
（１０）前記亜硫酸塩が５０ｍＭから６００ｍＭである（７）から（９）のいずれか１項に記載の免疫学的測定試薬。
（１１）免疫学的測定方法が、ラテックス凝集法である（７）から（１０）のいずれか１項に記載の免疫学的測定試薬。
（１２）（７）から（１１）のいずれか１項に記載の免疫学的測定試薬と、測定対象物と反応する抗体または抗原、もしくは測定対象物と反応する抗体または抗原を担持した担体とを含む免疫学的測定試薬キット。
（８）前記亜硫酸塩を含有する試薬のｐＨが５．６から７．０の範囲である（７）に記載の免疫学的測定試薬。
（９）前記亜硫酸塩が５０ｍＭ以上である（７）または（８）記載の免疫学低測定試薬。
（１０）前記亜硫酸塩が５０ｍＭから６００ｍＭである（７）から（９）のいずれか１項に記載の免疫学的測定試薬。
（１１）免疫学的測定方法が、ラテックス凝集法である（７）から（１０）のいずれか１項に記載の免疫学的測定試薬。
（１２）（７）から（１１）のいずれか１項に記載の免疫学的測定試薬と、測定対象物と反応する抗体または抗原、もしくは測定対象物と反応する抗体または抗原を担持した担体とを含む免疫学的測定試薬キット。
本発明は、亜硫酸塩を含む免疫学的測定試薬のｐＨを７．０以下にすることにより、測定対象である試料中に、抗原抗体反応に対する干渉物質が高濃度で含まれる場合においても、干渉物質の影響を受けることなく免疫学的測定を行うことができる、安定性にすぐれた免疫学的測定試薬を提供する。
そして、この免疫学的測定により得られる結果についても、信頼性の高いものとなることが期待される。
驚くべきことに、亜硫酸塩を含有する試薬のｐＨを、特許文献５実施例に記載されているｐＨ７．４から、わずかに低下させるだけで、亜硫酸塩による干渉物質の抑制効果だけでなく、亜硫酸塩を含有する、免疫学的測定試薬や前処理試薬の安定性も向上させることができる。
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
本発明の一実施形態は、亜硫酸塩の存在下で、免疫学的測定試薬を用いて抗原抗体反応を行う免疫学的測定法において、亜硫酸塩を含有する免疫学的測定試薬のｐＨを７．０以下にした免疫学的測定方法である 。
本発明の一実施形態は、亜硫酸塩の存在下で、免疫学的測定試薬を用いて抗原抗体反応を行う免疫学的測定法において、亜硫酸塩を含有する免疫学的測定試薬のｐＨを７．０以下にした免疫学的測定方法である 。
本発明において、「免疫学的測定法」とは、測定対象である測定対象物と特異的に結合する物質（例えば、抗体または抗原）を用いて、測定対象物の存在の有無の判定（検出）や、測定対象物が存在する場合にはその存在量の測定（定量）を行う方法であり、例えば、サンドイッチ法、競合法の原理に基づくＲＩＡ法やＥＬＩＳＡ法、免疫凝集反応法に基づく免疫比濁法（ＴＩＡ法）やラテックス凝集法（ＬＩＡ法）等が挙げられる。
本発明の「免疫学的測定試薬」とは抗原抗体反応を行う免疫学的測定方法に用いる試薬であり、亜硫酸塩を含む。さらに、本発明の免疫学的測定方法は測定対象物質を含む測定試料の前処理試薬として用いることができる。
本発明の「前処理試薬」とは、免疫学的測定方法を用いて測定対象物質を含む測定試料を測定する前に、測定試料を処理するために用いる試薬であり、亜硫酸塩を含む。前処理試薬によって処理した測定試料は、そのまま公知の免疫学的測定方法の測定試料とすることができる。
本発明に使用する亜硫酸塩は公知のものから適宜選択することができる。亜硫酸塩としては、例えば、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸カルシウム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素アンモニウム等が挙げられる。
本発明において、亜硫酸塩が免疫学的測定試薬または前処理試薬に含まれる場合、免疫学的測定試薬または前処理試薬中の亜硫酸塩濃度は、５０ｍＭ以上、好ましくは５０ｍＭから６００ｍＭ、より好ましくは１００ｍＭから６００ｍＭ、さらに好ましくは２５０ｍＭから５００ｍＭである。硫酸塩の濃度が５０ｍＭ未満になると免疫反応に影響を与える干渉物質の影響を十分に抑制しにくく、６００ｍＭを超えても干渉物質の影響を効果的に抑制できなくなり、また、溶液の粘度上昇により測定に悪影響を与えうる。
本発明の亜硫酸塩を含有する免疫学的測定試薬または前処理試薬のｐＨは、７．０以下が好ましく、ｐＨ５．６からｐＨ７．０がより好ましい。ｐＨ５．６を下回ると蛋白質等の変性が起こりやすく正確な測定に影響を与えることとなり、ｐＨ７．０を超えると干渉物質の影響の抑制効果が経時的に低下しやすくなる。
本発明においては、必要に応じて公知の蛋白質保護剤を加えて測定対象物質の安定性を高めることができる。このような蛋白質保護剤としては、アルブミンやゼラチン等の蛋白質や合成ポリマー素材、界面活性剤等を挙げることができる。
本発明の亜硫酸塩を含有する免疫学的測定試薬または前処理試薬によって干渉物質の影響を抑制した試料は、そのまま公知の免疫学的測定方法により測定することができる。免疫学的測定方法としては、例えば、サンドイッチ法、競合法の原理に基づくＲＩＡ法やＥＬＩＳＡ法、免疫凝集反応法に基づく免疫比濁法（ＴＩＡ法）やラテックス凝集法（ＬＩＡ法）等が挙げられる。
これらの免疫学的測定方法の中でも、特に測定試料中の被測定物質である抗原（または抗体）と測定試薬中の抗体（または抗原）とを反応させ、その結果生じる免疫凝集物を検出することを測定原理とする、免疫比濁法やラテックス凝集法が好ましい。
本発明の免疫学的測定試薬は、免疫比濁法やラテックス凝集法に用いることができ、緩衝液を含む第１試薬、および緩衝液に抗体または抗原、もしくは抗体または抗原を担持させた担体（好ましくはラテックス粒子）を含有させた第２試薬の２つの試薬から構成することができる。
免疫比濁法やラテックス凝集法による免疫学的測定試薬に用いることができる緩衝液としては、ｐＨを一定に保てるものであれば特に限定されず、公知のものから適宜選択することができる。例えば、りん酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
本発明の亜硫酸塩を含有する免疫学的測定試薬を、前記２つの試薬から構成される免疫比濁法やラテックス凝集法等の免疫学的測定試薬の第１試薬とすることもできる。すなわち、本発明の干渉物質の影響の抑制方法を用いた第１試薬に、測定試料を混合した後に、この混合液に抗体（または抗原）、あるいは抗体（または抗原）を担持させたラテックス粒子等を含む第２試薬を混和して測定してもよい。
また、本発明の干渉物質の影響の抑制方法を用いた前処理試薬と測定試料を混合した後、この混合液を、ＥＬＩＳＡ法やラテックス凝集法等の免疫学的測定方法の測定試料として測定してもよい。
本発明においては、担体に担持させる抗体または抗原としては、特に限定されず、公知のものから適宜選択することができる。担体に担持させる抗体または抗原としては、例えば、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、トランスフェリン等の血漿蛋白質に対する抗体、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、サイロキシン、インスリン、ヒト胎盤性ラクトーゲン等のホルモンに対する抗体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β２−マイクログロブリン、α―フェトプロテイン（ＡＦＰ）等の腫瘍関連物質に対する抗体、ＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原等のウイルス性肝炎の抗原に対する抗体およびＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗体等のウイルス性肝炎の抗体に対する抗原、ヘルペス、麻疹、風疹等のウイルス、各種生体成分に対する抗体または抗原、フェノバルビタール、アセトアミノフェン、サイクロスポリン等の各種薬剤に対する抗体等が挙げられる。
本発明において、抗体または抗原を担持させる担体としては、特に制限されず、公知のものから適宜選択することができる。抗体または抗原を担持させる担体としては、ポリスチレンプレート、ポリスチレンビーズ、ラテックス粒子、金属コロイド粒子、シリカコロイド粒子等が挙げられる。
本発明で使用できる上記抗体としては、由来する動物種は特に限定されず、例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ウマ、ヒツジ等の動物に由来する抗体が挙げられ、測定対象物を免疫した動物の血清から得られるポリクローナル、測定対象物を免疫した動物の脾臓をミエローマ細胞と細胞融合して得られるモノクローナル抗体のいずれを用いてもよい。
本発明において、測定試料は特に限定されず、例えば、血液、血清、血漿、尿、リンパ液、 刺液、髄液、汗、唾液、胃液、肺洗浄液、糞便等が挙げられる。これらのうち、血清、血漿が特に好ましい。
また、本発明において、測定対象物質についても特に限定されず、例えば、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、トランスフェリン等の血漿蛋白質、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、サイロキシン、インスリン、ヒト胎盤性ラクトーゲン等のホルモン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β２−マイクログロブリン、α―フェトプロテイン（ＡＦＰ）等の腫瘍関連物質、ＨＢｓ抗原、ＨＢｅ抗原等のウイルス性肝炎の抗原およびＨＢｓ抗体、ＨＢｅ抗体等のウイルス性肝炎の抗体、ヘルペス、麻疹、風疹等のウイルス、各種生体成分に対する抗体または抗原、フェノバルビタール、アセトアミノフェン、サイクロスポリン等の各種薬剤等が挙げられる。
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ 干渉反応抑制効果に対する亜硫酸塩濃度の影響
硫酸ナトリウム添加による干渉反応の抑制に対する亜硫酸塩濃度の影響を評価した。また、亜硫酸塩の酸化を促進する条件（試薬容器に半分充填し４℃で３週間振とう）で保存して安定性を評価した。
硫酸ナトリウム添加による干渉反応の抑制に対する亜硫酸塩濃度の影響を評価した。また、亜硫酸塩の酸化を促進する条件（試薬容器に半分充填し４℃で３週間振とう）で保存して安定性を評価した。
（１）試薬
第１試薬：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＮａＮ３、０．１％ ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル、０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、３５０ｍＭ、５００ｍＭまたは６００ｍＭの亜硫酸ナトリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を調製した。また、調製した第１試薬を試薬容器に半分充填し、４℃で３週間振とうして、亜硫酸塩の空気中の酸素による酸化を促進させた。
第２試薬：抗ＫＬ−６抗体担持ポリスチレンラテックス液、４００ｍＭ アルギニン塩酸塩、０．１％ ＮａＮ３を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を調製した。
第１試薬：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＮａＮ３、０．１％ ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル、０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、３５０ｍＭ、５００ｍＭまたは６００ｍＭの亜硫酸ナトリウムを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を調製した。また、調製した第１試薬を試薬容器に半分充填し、４℃で３週間振とうして、亜硫酸塩の空気中の酸素による酸化を促進させた。
第２試薬：抗ＫＬ−６抗体担持ポリスチレンラテックス液、４００ｍＭ アルギニン塩酸塩、０．１％ ＮａＮ３を含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を調製した。
上記の抗ＫＬ−６担持ラテックス液は、公知の方法により調製した。すなわち、抗ＫＬ−６抗体とポリスチレンラテックスを混合して、ポリスチレンラテックス表面に抗ＫＬ−６抗体を担持することにより調製した。
（２）測定試料
プール血清に干渉チェックＲＦプラス（シスメックス株式会社）をリウマトイド因子濃度が、０、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００ＩＵ／ｍＬとなるように添加してＲＦ試料を調製した。
プール血清に干渉チェックＲＦプラス（シスメックス株式会社）をリウマトイド因子濃度が、０、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００ＩＵ／ｍＬとなるように添加してＲＦ試料を調製した。
（３）評価方法
前記ＲＦ試料２．０μＬに第１試薬１２０μＬを混合し３７℃で５分間インキュベーションした後、この混合液に第２試薬を４０μＬ混合し３７℃で反応させ、第２試薬混合後約５分間の６６０ｎｍの吸光度変化を測定した。なお、一連の測定は日立７１８０形自動分析装置（株式会社日立ハイテクノロジーズ）を用いて行った。
ＫＬ−６の濃度を定量するため、ＫＬ−６の標準物質を測定して得られた検量線から、血清検体中のＫＬ−６濃度を算出した。調製直後の結果を表１に、亜硫酸塩の酸化を促進させた場合の結果を表２に示す。
前記ＲＦ試料２．０μＬに第１試薬１２０μＬを混合し３７℃で５分間インキュベーションした後、この混合液に第２試薬を４０μＬ混合し３７℃で反応させ、第２試薬混合後約５分間の６６０ｎｍの吸光度変化を測定した。なお、一連の測定は日立７１８０形自動分析装置（株式会社日立ハイテクノロジーズ）を用いて行った。
ＫＬ−６の濃度を定量するため、ＫＬ−６の標準物質を測定して得られた検量線から、血清検体中のＫＬ−６濃度を算出した。調製直後の結果を表１に、亜硫酸塩の酸化を促進させた場合の結果を表２に示す。
表１より、亜硫酸塩濃度５０ｍＭ以上でＲＦによる干渉反応の抑制効果がみられ、亜硫酸塩濃度５０ｍＭにおいても、ＲＦによる干渉反応を亜硫酸塩無添加時（０ｍＭ）の約１／２に抑制できることがわかった。また、干渉反応の抑制効果は、亜硫酸塩濃度に依存して向上し亜硫酸塩濃度２５０ｍＭから５００ｍＭで抑制効果は最大となり、亜硫酸塩濃度６００ｍＭでは低下することがわかった。亜硫酸塩濃度は５０ｍＭ以上が好ましく、５０ｍＭから６００ｍＭがより好ましく、１００ｍＭから６００ｍＭがさらに好ましく、２５０ｍＭから５００ｍＭが最も好ましい。
また、表１と表２より、亜硫酸塩濃度が５０ｍＭの場合には、亜硫酸塩の酸化により干渉反応の抑制効果が低下している。干渉反応の抑制効果に対する亜硫酸塩の酸化の影響は、亜硫酸塩濃度に依存して軽減され、亜硫酸塩濃度２５０ｍＭから５００ｍＭで最も影響が小さくなり安定性が向上したが、亜硫酸濃度が６００ｍＭの場合には、亜硫酸塩の酸化により干渉反応の抑制効果が低下することがわかった。
実施例２ 亜硫酸塩の干渉反応の抑制に対するｐＨの影響
亜硫酸ナトリウムを２５０ｍＭとして、干渉物質の干渉反応の抑制に対するｐＨの影響を評価した。
亜硫酸ナトリウムを２５０ｍＭとして、干渉物質の干渉反応の抑制に対するｐＨの影響を評価した。
（１）試薬
第１試薬：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＮａＮ３、０．１％ ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル、２５０ｍＭ 亜硫酸ナトリウムを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．４または６．８）または５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４または７．８）を調製した。
第２試薬：実施例１と同様である。
（２）測定試料
プール血清に干渉チェックＲＦプラス（シスメックス株式会社）をリウマトイド因子濃度が、０、１００、２００、３００、４００、または５００ＩＵ／ｍＬとなるように添加してＲＦ試料を調製したＲＦ試料に加え、正常検体（異好性抗体およびＲＦ陰性のヒト血清試料）および異常検体（異好性抗体およびＲＦ陽性のヒト血清試料）を試料とした。
（３）評価方法
実施例１と同様に試料を測定した。ＲＦ試料の結果を表３に、ヒト血清試料の結果を表４に示す。
第１試薬：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＮａＮ３、０．１％ ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル、２５０ｍＭ 亜硫酸ナトリウムを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．４または６．８）または５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４または７．８）を調製した。
第２試薬：実施例１と同様である。
（２）測定試料
プール血清に干渉チェックＲＦプラス（シスメックス株式会社）をリウマトイド因子濃度が、０、１００、２００、３００、４００、または５００ＩＵ／ｍＬとなるように添加してＲＦ試料を調製したＲＦ試料に加え、正常検体（異好性抗体およびＲＦ陰性のヒト血清試料）および異常検体（異好性抗体およびＲＦ陽性のヒト血清試料）を試料とした。
（３）評価方法
実施例１と同様に試料を測定した。ＲＦ試料の結果を表３に、ヒト血清試料の結果を表４に示す。
表３より明らかなように、亜硫酸塩によるＲＦの干渉反応の抑制効果は、ｐＨ７．８以上では高ｐＨほど顕著に低下し、測定値の正誤差が拡大する。しかし、ｐＨ７．４以下での亜硫酸塩によるＲＦの干渉反応の抑制効果には大きな差異は見られない。
また、表４より、正常検体では亜硫酸塩による干渉反応の抑制に対するｐＨの影響は、ほとんど見られない。これに対し、干渉物質が存在する異常検体では、ｐＨ７．８以上では亜硫酸塩の干渉反応の抑制効果が顕著に低下し測定値が高値化したが、ｐＨ６．４および６．８での測定値の変動は小さく、効果的に干渉反応が抑制されていることがわかる。
実施例３ 亜硫酸塩の干渉反応の抑制に対するｐＨの影響（詳細評価）
亜硫酸ナトリウムを２５０ｍＭとして、干渉物質の干渉反応の抑制に対するｐＨの影響をさらに詳細に評価した。また、亜硫酸塩の酸化を促進する条件（試薬容器に半分充填し４℃で３週間振とう）で保存して安定性を評価した。
亜硫酸ナトリウムを２５０ｍＭとして、干渉物質の干渉反応の抑制に対するｐＨの影響をさらに詳細に評価した。また、亜硫酸塩の酸化を促進する条件（試薬容器に半分充填し４℃で３週間振とう）で保存して安定性を評価した。
（１）試薬
第１試薬：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＮａＮ３、０．１％ ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル、２５０ｍＭ 亜硫酸ナトリウムを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．６、６．０、６．２、６．４、６．６、６．７、６．８または７．０）または５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を調製した。また、調製した第１試薬を試薬容器に半分充填し、４℃で３週間振とうして亜硫酸塩の空気中の酸素による酸化を促進させた。
第２試薬：実施例１と同様である。
（２）測定試料
実施例１と同様にＲＦ試料を調製した。
（３）評価方法
実施例１と同様に試料を測定した。調製直後の結果を表５に、亜硫酸塩の酸化を促進させた場合の結果を表６に示す。
第１試薬：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＮａＮ３、０．１％ ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル、２５０ｍＭ 亜硫酸ナトリウムを含む５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．６、６．０、６．２、６．４、６．６、６．７、６．８または７．０）または５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を調製した。また、調製した第１試薬を試薬容器に半分充填し、４℃で３週間振とうして亜硫酸塩の空気中の酸素による酸化を促進させた。
第２試薬：実施例１と同様である。
（２）測定試料
実施例１と同様にＲＦ試料を調製した。
（３）評価方法
実施例１と同様に試料を測定した。調製直後の結果を表５に、亜硫酸塩の酸化を促進させた場合の結果を表６に示す。
表５から明らかなように、ｐＨ７．４の場合は、高濃度のＲＦ（１０００ＩＵ／ｍＬ）の干渉反応の抑制効果が不十分であるのに対し、ｐＨが７．０以下の場合はＲＦの干渉反応の抑制効果に対するｐＨによる差異はなく、高濃度のＲＦに対しても高い抑制効果を持つことがわかった。
また、表５および表６より、ｐＨが７．４の場合には、亜硫酸塩の酸化による干渉反応の抑制効果の低下が認められるのに対し、ｐＨが７．０以下の場合は、ＲＦ干渉反応の抑制効果に対する亜硫酸塩の酸化の影響は認められず、亜硫酸塩を含有する試薬の安定性が向上することがわかった。前記結果および本結果から、亜硫酸塩を含有する免疫学的測定試薬または前処理試薬のｐＨは７．０以下が好ましく、ｐＨ５．６からｐＨ７．０の範囲がより好ましい。
以上のように、本発明によれば、測定する試料中に異好性抗体やリウマトイド因子等の干渉物質が高濃度に含まれる場合であっても、これらによる干渉作用を長期間十分に抑制することができ、測定対象物を正確に測定ができる安定性の高い免疫学的測定方法および免疫学的測定試薬の提供が可能となる。
Claims (11)
- 免疫学的測定試薬（ヒトヘモグロビンの安定化溶液を除く）を用いて、亜硫酸塩の存在下で、抗原抗体反応を行う免疫学的測定法において、亜硫酸塩を含有する免疫学的測定試薬のｐＨが５．６から７．０の範囲で、かつ、前記亜硫酸塩が５０ｍＭ以上であることを特徴とする前記免疫学的測定方法。
- 前記亜硫酸塩を含有する免疫学的測定試薬のｐＨが６．０から７．０の範囲である請求項１に記載の免疫学的測定方法。
- 前記亜硫酸塩が５０ｍＭから６００ｍＭである請求項１または請求項２に記載の免疫学低測定方法。
- 前記免疫学的測定試薬を含む第１試薬と、測定対象物と反応する抗体または抗原、もしくは測定対象物と反応する抗体または抗原を担持した担体を含む第２試薬とを混合する工程を含む、測定対象物を定量または定性測定する請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の免疫学的測定方法。
- 免疫学的測定方法が、ラテックス凝集法である請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の免疫学的測定方法。
- 亜硫酸塩の存在下で、抗原抗体反応を行う免疫学的測定試薬（ヒトヘモグロビンの安定化溶液を除く）であって、亜硫酸塩を含有する免疫学的測定試薬のｐＨが５．６から７．０の範囲で、かつ、前記亜硫酸塩が５０ｍＭ以上であることを特徴とする前記免疫学的測定試薬。
- 前記亜硫酸塩を含有する試薬のｐＨが６．０から７．０の範囲である請求項６に記載の免疫学的測定試薬。
- 前記亜硫酸塩が５０ｍＭから６００ｍＭである請求項６または請求項７に記載の免疫学的測定試薬。
- 前記免疫学的測定試薬が免疫学的測定方法に用いるための試薬であり、免疫学的測定方法が、ラテックス凝集法である請求項６から請求項８のいずれか１項に記載の免疫学的測定試薬。
- 請求項６から請求項９のいずれか１項に記載の免疫学的測定試薬と、測定対象物と反応する抗体または抗原、もしくは測定対象物と反応する抗体または抗原を担持した担体とを含む免疫学的測定試薬キット。
- ｐＨが５．６から７．０の範囲で、かつ、亜硫酸塩が５０ｍＭ以上である免疫学的測定試薬を用いて、亜硫酸塩の存在下で、抗原抗体反応を行う免疫学的測定法を行うことを特徴とする干渉物質による干渉作用を抑制する方法。
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