JPH02103466A - 免疫学的活性物質の測定方法及びそのための試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は臨床検査の分野において広く応用されている抗
原抗体反応を利用した免疫学的活性物質の測定方法及び
それに用いる免疫学的測定用試薬に関するものである。

（従来の技術） 近年、病態と関連して生体液中に出現する蛋白等の免疫
学的活性物質を抗原抗体反応を利用して検出し、診断に
利用することが広く行なわれている。このような抗原抗
体反応を利用した測定法としては、放射免疫測定法（Ｒ
ＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素標識イムノソ
ルベント法（ＥＬＩＳＡ）、光散乱法、比濁法等の各種
の方法が開発されている。

ＲＩＡ、　ＥＩＡ、　ＥＬＩＳＡはいずれの場合も被検
液との反応後反応生成物を分離することが必要とされる
ため、その測定は一般に時間と手間が必要とされるが定
量性に優れている等の理由で広く利用されている。

近年は、免疫反応（抗原抗体反応）に伴って起きる光学
的な変化を測定する光散乱法、比濁法等が注目されてき
ている。これは抗原と抗体が液体中で反応すると、反応
の前後において、その反応板に応じて液体の濁度に変化
が生ずるため、これを光散乱法、吸光光度法等の適当な
手段で測定しようとするものであり、ＲＩＡ、　ＥＩＡ
、　ＥＬＩＳＡよりもその操作が簡便であるという特徴
を有している。

これらの抗原抗体反応を利用した免疫学的活性物質の測
定に当って、その反応を補助するために添加物を使うこ
とが研究されている。例えば、特公昭６０−４９３８号
には、ポリエチレングリコールと８０　（Ｃ１１２ＣＨ
，Ｏ）ａ　（ＣＨ，ＣＨＣ）Ｉ、　Ｏ）　ｂ　（Ｃ）Ｉ
、　Ｃ）ｌ、　０）ｃ）Ｉの構造式で表わされるブロッ
ク共重合体等の非イオン界面活性剤を用いることが記載
されている。特開昭５９−４３３６２号には、一般式 ％式％） で表わされる化合物を用いることが記載されている。

また、特開昭５８−４７２５６号には、抗原又は抗体を
不溶性微粒子に担持させて溶液中で抗原抗体反応を行わ
せる系において、ポリエチレングリコールを用いること
が記載されている。

しかし、これらの公知の添加物では必ずしも満足する結
果が得られない。例えば、溶液中で抗原と抗体を反応さ
せた反応混合物を比濁法、吸光度法等の光学的な方法で
測定する際に、前記した如き公知の添加物を用いると、
被検液中に共存する測定対象でない他の物質、例えば脂
肪あるいは蛋白による濁りを生ずるいわゆる非特異反応
が起きて誤差の原因となることがある。また高濃度の被
検物質が存在するにも拘わらず測定結果が低濃度に出る
いわゆるプロゾーン現象が起きたり、更には非常に低濃
度領域の測定結果が不正確であったりすることがある。

またＥＩＡやＨＡの場合にも、添加物が非特異反応の原
因となったり、プロゾーン現象が起きたりすることがあ
る。

（発明が解決しようとする課Ｍ） 本発明は、従来の抗原抗体反応を利用した免疫学的測定
方法に見られる上記の問題を解決し、抗原抗体反応に関
与する免疫学的活性物質を精度良く測定する方法及びそ
のための試薬を提供することをその課題とする。

（課題を解決するための手段） 本発明によれば、液体中での抗原抗体反応を利用した免
疫学的活性物質の測定方法において、該液体中に下記（
１）式で示される化合物を添加することを特徴とする免
疫学活性物質の測定方法が提供され、また下記式（１）
で表わされる化合物を含む免疫学的測定用試薬が提供さ
れる。

Ｒ１０｛（ＣＨ，ＣＨ，Ｏ）ｍ（ＡＯ）ｎ）−Ｒ”　　
　　（１）ここで、Ｒ１及びＲ２は水素原子又は炭素数
１〜５の炭化水素基、ＡＯは炭素数３−４のオキシアル
キレン基、璽及びｎはそれぞれオキシエチレン基及びオ
キシアルキレン基の数を示し、｛｝内のオキシエチレン
基とオキシアルキレン基はランダム共重合しており、そ
の分子量は１０００〜２００００で、ｍとｎの比率は６
０／４０〜９０／１０の範囲である。

［１）式において　ｎｌ、Ｒ２で示される炭素数１〜５
の炭化水素基としては、メチル基、エチル基、アリル基
、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基。

ターシャリブチル基、アミル基、イソアミルＪ＆等が挙
げられる。

炭素数３〜４のオキシアルキレン基としては、オキシプ
ロピレン基、オキシブチレン堪、オキシテトラメチレン
基等が挙げられる。

オキシエチレン基とオキシアルキレン基との共重合体に
おいて、その分子量が限定される理由は、１０００未満
では本発明の目的が達成できず、２００００を超えるよ
うになると合成が困難となるためである。また、閣とｎ
の比率が限定されるのは６０／４０〜９０／１０の範囲
外では本発明の目的が達成できないためである。

［１１式で示される化合物は、公知であり、その製造方
法等は特公昭３５−７５９４号、特公昭５７−１７００
８号公報等に記載されている。またその化合物のあるも
のは、日本油脂−からユニループシリーズとして市販さ
れ金属の加工油、化粧品の基剤として広く使用されてい
る。〔Ｉ〕式の化合物は、特公昭６０−４９３８号公報
に示されている １１０　（ＣＨ，ＣＨ２０）ａ　（ＣＨ，ＣＨＣＨ２０
）ｂ　（ＣＩ（２ＣＩ１．０）ｃＨなる式を有するブロ
ック共重合体とは異なるランダム共重合体であり、この
ため界面活性作用を持たない全く異った物性を示す。

（発明の具体的構成） 本発明で測定対象とする免疫学的活性物質（抗原又は抗
体）としては、例えば、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）、リュ
ーマチ因子（ＲＦ）、アンチストレプトリジン０（ＡＳ
Ｏ）、　　トランスフェリン等の血漿蛋白、甲状腺刺激
ホルモン（ＴＩＩＳ）、トリヨードサイロニン（Ｔ、）
、血清総サイロキシン（Ｔ４）、チロキシン結合性蛋白
（ＴＢＧ）、サイログロブリン、インスリン、トリプシ
ン、エラスターゼ、エストリオール（Ｅ、　）　。

絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトー
ゲン（ｒｌＰＬ）等のホルモン、癌胎児性抗原（ＣＩＥ
Ａ）、β２−マイクログロブリン、α−フェトプロティ
ン（ＡＦＰ）等の腫瘍関連物質、ｌｌＢｓ抗原、　ＨＢ
ｓ抗体、ＨＢｅ抗原、ｔｌＢｅ抗体等のウィルス肝炎の
抗原、抗体、ムンプス、ヘルペス、麻疹、風疹、サイト
メガロ等のウィルス、抗エイズ抗体｛｝ＩＩＶ）等の各
種生体成分が挙げられる。

本発明の免疫学的測定用試薬は前記（１１式の化合物を
含むもので、ラテックス粒子のような担体に担持されて
いない抗原及び抗体を用いる反応、ラテックス粒子のよ
うな担体に担持させた抗原及び抗体を用いる反応、チュ
ーブ、ビーズ、プレート等の担体に担持させた抗原及び
抗体を用いる反応のいずれにも用いることができる。ラ
テックス粒子担体に担持させないかもしくは担持させた
抗原又は抗体を用いる場合は、この抗原又は抗体を被検
液中の抗体又は抗原と反応させた後、光散乱法、分光光
度法等の光学的方法で反応生成物の濁度変化を測定する
。チューブ、ビーズ、プレート等の担体に担持させた抗
原又は抗体を用いる場合は、被検液中の抗体又は抗原と
反応させた後、被検液を除去し、ついで酵素もしくは放
射性元素で標識した２次抗体等を反応させて、結合され
た酵素量もしくは放射線凰を測定するか、結合されなか
った酵素量等を測定する０本発明の式（１３の化金物を
含む試薬は、被検液を反応させる際にも。

また標識された２次抗体等を反応させるときにも使用さ
れる０本発明の試薬を用いる場合の測定原理、測定手順
、測定のための装置は、従来のＥ！ＩＡ。

ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、光散乱法、分光光度法と全く変わ
らない、また被検液としては、通常血清が用いられるが
、他の体液成分例えばせきすい液や尿等も用いられる。

抗原抗体反応に使用される測定用試薬には、抗血清を含
む試薬、測定すべき抗原に対応する抗体を含む試薬、測
定すべき抗体に対応する抗原を含む試薬１反応緩衝試薬
、及び試料を希釈する為の希釈剤等があり、（１）式の
化合物はこれらのどの試薬に加えてもよい。どの試薬に
加えても抗原抗体反応を起こす際にはその効果を示す。

（１）式の化合物は、例えば生理食塩水、リン酸塩緩衝
化生理食塩水あるいは、トリス塩酸緩衝化生理食塩水の
ような緩衝化生理食塩水、もしくは、慣用の緩衝液に溶
解して用いることが望ましい。

この緩衝液は、抗血清を含む試薬等に添加することもで
きる。この緩衝液のｐＨは５〜１０、好ましくは２１１
６．５〜８．５を用いる。

式（１）の化合物の試薬中の濃度は分析方法によって異
なるが、抗血清、抗体又は抗原を含むあるいは、抗血清
、抗体又は抗原を含まない試薬に加える場合には、０．
０ｌ−１ｏ％（留／Ｖ）、好ましくは０．０５−５％で
ある。最終的な反応混合物中における式［１）の化合物
の濃度は０．０１〜２％、好ましくは０．０５〜１％で
ある。

式（１）の化合物を含む本発明の免疫学的測定試薬中に
は、場合によっては生体試料中に含まれる干渉物質の影
響を除去するために、牛血清アルブミン、ゼラチン、あ
るいはゼラチンの再重合体の蛋白質もしくは、グルコー
ス、ショ糖などの糖類を添加することができる。

（１）式で示される化合物は、従来使用されてきたポリ
エチレングリコールやポロキサマーのような化合物と併
用することもできる。

抗原抗体反応の結果を光学的に測定する測定法の一般的
な手段は以下の通りである。

先ず、測定しようとする抗原あるいは抗体に特異的に反
応する抗体あるいは抗原を含有する試薬、式（１）の化
合物を含有する緩衝液及び試料（試料中の測定しようと
する抗原あるいは抗体濃度によっては、式Ｃ１）の化合
物を含有する緩衝液あるいは慣用の緩衝液にて試料を希
釈して用いる）を−定量の割合にて混合後、一定温度下
（好ましくは２５℃〜３７℃）にて反応させ、次いで例
えば比濁分析の場合比濁計のごとき、適当な計装器上で
読む。

試料の結果を未知の濃度を定量する為に対照試料のもの
と比較する。本発明の式（１）の化合物を含有する緩衝
液は、あらかじめ抗原あるいは抗体を含有する試薬、も
しくは試料と混合することが可能である。

（発明の効果） 本発明の抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法にお
いては、検体中の夾雑蛋白、脂肪等による望ましくない
副反応であるいわゆる非特異反応が抑制される。また被
検物の高濃度域におけるプロゾーンの発生を抑えること
ができ、更には被検物の低濃度領域も精度良く測定でき
るという利点がある。

（実施例） 次に、本発明を実施例によりさらに詳述する。

実施例１ 免疫学的試薬としては、ｐＨ７，２のリン酸塩緩衝液に
０．０７５％（−／ν）の（ＩＩ）式の化合物を溶解し
て調製したものを用いた。

し■。

この化合物のｍは２４０．０は６０．　ｍ／ｎモル比は
８０／２０、分子量は１４０５８である。調製した免疫
学的試薬をＣＲＰ、トランスフェリン、アルファ１−酸
糖たんばく、ハプトグロビン、及びアルファ１−アンチ
トリプシンの別々の比濁アッセイに使用し、各アッセイ
を以下のごとく行なった。

上記蛋白質に対する抗血清に免疫学的試薬をそれぞれ１
：２の割合で混合希釈し、転倒混和して第二試薬とした
。調製した免疫学的試薬を反応緩衝液として第一試薬と
した。低濃度域及び高濃度域での直線性を確認する為に
、高濃度の試料と低濃度の試料をそれぞれ錦ヒトアルブ
ミン血清にて１０段階に希釈を行ない、試料とした。試
験管に希釈した試料を５μＱとり、第一試薬を３５０μ
党添加し、５分間反応させ、試料のブランクを主波長３
４０ｎｍ、副波長７００ｎｍの２波長で測定した。測定
は日立製作所製日立７０５型生化学自動分析装置によっ
て行った。試料のブランクを測定した試料に、最初に調
製した抗血清を１００μＱ添加し、混合後５分間反応さ
せ、同じ２波長にて測定し、その結果から試料のブラン
クを差し引いた値を反応変化量とした。

なお、検量線作成のための対照血清としてはベーリング
ベルケ社製Ｎ−ＣＲＰ標準血清を用いた。ＣＲＰに対す
る測定結果を第１図に示した。第１図において縦軸はＣ
ＲＰ′ａ度（ｍｇ／ｄΩ）であり、横軸は試料の希釈率
である。直線Ａは高濃度試料（希釈前濃度３６ｍｇ／ｄ
ｆｌ）に関するものであり、直線Ｂは低濃度試料（希釈
前濃度３ｍｇ／ｄρ）に関するものである。

この実施例で使用した本発明の免疫学的試薬は。

実質的に抗原抗体反応において広範囲にわたり、いっそ
うの直線性を示し、特に低濃度域における大いなる感度
を示すことが解る。

トランスフェリン（高濃度試料の希釈前濃度７５０ｍｇ
／ｄＱ、低濃度試料の希釈前濃度１０ｍｇ／ｄＵ、アル
ファ１−酸糖蛋白（２２０ｍｇ／ｄ４．７０ｍｇ／ｄＱ
）、ハプトグロビンＣ６５０ｍｇ／ｄＱ、５０ｍｇ／ｄ
Ｑ）及びアルファ１−アンチトリプシン（３４０ａ＋ｇ
／ｄＱ、４０ｍｇ／ｄＱ）を用いた場合もＣＲＰと全く
同様に広範囲にわたる直線性を示した。

実施例２ ｐＨ７，２のリン酸塩緩衝液に０．０７５ＺＣｗ／ｖ）
の［Ｉｆ］式の化合物を溶解して調製した免疫学的試薬
を用いて、反応緩衝液の検体中の脂肪に対する非特異反
応の有無を確認した。免疫的試薬１　、０ｖＱにイント
ラファツト（静注用脂肪乳剤）を２０μ℃添加して、よ
く混合した。

混合溶液について３７℃における１０分間の経時変化を
波長３４０ｎｍで確認した。

対象として、従来から用いられているポリエチレングリ
コール６０００を本化合物と置き換えて同様な試験をお
こなった。その結果を第２図に示した。

図中の縦軸は吸光度であり、横軸は時間（分）である、
ポリエチレングリコール６０００を用いた場合には、時
間の経過とともに吸光度が増加し、脂肪に対する非特異
反応がａ祭される。一方、本発明の免疫学的試薬の場合
には非特異反応がみられない。

したがって本発明の免疫学的試薬を用いて未知の試料を
測定する際は、試料のブランクを正確に差し引くことが
できる為に、通常本試薬の用いられる臨床検査で測定さ
れる検体について、しばしば見られる高脂血漿などでも
試料中に含有する蛋白濃度を正確に定量する事ができる
。

実施例３ 免疫学的試薬として用いられる化合物の範囲を調へる目
的で第１表に示される化合物について実施例１に記載さ
れた方法に用いたときの直線性をテストした。第１表に
おける化合物番号１〜６のものは（ｎ）式の化合物と同
様に良い直線性を示した。

−力比合物番号７〜９のものは、充分な直線性が得られ
なかった。この結果から、分子屋は１０００〜２０００
０の範囲とし、 ｍとｎの比率を６０／４０〜９０／１０の範囲とすべき
ことが結論づけられた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法によるＣＰＲのｇｐ＋定結果を示
し、直線Ａは高濃度試料、直線Ｂは低濃度試料に関する
。 第２図は検体中の脂肪による非特異反応の有無を測定し
た結果を示す。 出願人代理人　弁理士　池　浦　敏　明（ばか１名） 第 ■ ［辺 乍′ｇ−〒 第２図 時間（分）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）液体中での抗原抗体反応を利用した免疫学的活性
   物質の測定方法において、該液体中に下記〔 I 〕式で
   示される化合物を添加することを特徴とする免疫学的活
   性物質の測定方法。 Ｒ＾１Ｏ−｛（ＣＨ＿２ＣＨ＿２Ｏ）ｍ（ＡＯ）ｎ｝−
   Ｒ＾２〔 I 〕（式中、Ｒ＾１及びＲ＾２は水素原子又
   は炭素数１〜５の炭化水素基、ＡＯは炭素数３〜４のオ
   キシアルキレン基、ｍ及びｎはそれぞれオキシエチレン
   基及びオキシアルキレン基の数を示し、 ｛　｝内のオキシエチレン基とオキシアルキレン基はラ
   ンダム共重合しており、その分子量は１０００〜２００
   ００で、ｍとｎの比率は６０／４０〜９０／１０の範囲
   である）
2. （２）該免疫学的活性物質の測定を光学的に行う請求項
   １記載の測定方法。
3. （３）請求項１に記載した〔 I 〕式で示される化合物
   を含有する免疫学的測定用試薬。