KR0160103B1 - 면역학적 활성 물질의 측정방법 및 이를 위한 시약 - Google Patents

면역학적 활성 물질의 측정방법 및 이를 위한 시약 Download PDF

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Abstract

내용 없음

Description

[발명의 명칭]
면역학적 활성 물질의 측정방법 및 이를 위한 시약
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 임상검사의 분야에서 널리 응용되고 있는 항원항체반응을 이용한 면역학적 활성 물질의 측정방법 및 이에 사용되는 면역학적 측정용 시약에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 이러한 항원항체반응이 실시되는 액체에 특정한 폴리에테르 화합물을 첨가하는 것으로 이루어지는 면역학적 활성 물질의 측정방법 및 이 방법에서 항원항체반응을 촉진시킬 수 있는 특정의 폴리에테르 화합물을 포함하는 시약에 관한 것이다.
[배경 기술]
근년, 병태와 관련하여 생체액 중에 출현하는 단백질 등의 면역학적 활성 물질을 항원항체반응을 이용하여 검출하고, 그 검출결과를 진단에 이용하는 것이 널리 실시되고 있다. 이러한 항원항체반응을 이용한 측정법으로서는, 예를 들면, 방사면역측정법(RIA), 효소면역측정법(EIA), 효소표지면역흡착법(ELISA), 광 산란법 및 비탁법 등의 각종 방법이 개발되어 있다. 이들중 RIA, EIA 및 ELISA는 어느 경우에도 피검액과의 반응 후, 반응 생성물을 분리하는 것이 필요하기 때문에, 그 측정은 일반적으로 시간과 노동력이 필요하지만, 정량성이 우수하다는 등의 이유로 널리 이용되고 있다.
근년에, 면역반응(항원항체반응)에 수반하여 일어나는 광학적인 변화를 측정하는 광 산란법, 비탁법 등이 주목되고 있다. 이것은 항원과 항체가 액체 중에서 반응하면, 반응 전후에서 그 반응량에 따라 액체의 탁도에 변화가 생기기 때문에, 이것을 광 산란법, 흡광광도법 등의 적당한 수단으로 측정하고자 하는 것으로, RIA, EIA, ELISA 보다도 그 조작이 간편하다는 특징이 있다.
이들의 항원항체반응을 이용한 면역학적 활성 물질의 측정에 있어서, 그 반응을 보조하기 위하여 첨가물을 사용하는 것이 연구되었다. 예를 들면, 일본국 특허공보 제(소)60-4938호에는 폴리에틸렌 글리콜과 일반식 HO(CH2CH2O)a(CH3CHCH2O)b(CH2CH2O)cH의 블럭 공중합체 등의 비이온성 계면활성제를 사용하는 것이 기재되어 있다. 일본국 공개특허공보 제(소)59-43362호에는 다음 일반식의 화합물을 사용하는 것이 기재되어 있다.
또한, 일본국 공개특허공보 제(소)58-47256호에는 항원 또는 항체를 불용성 미립자에 담지시키고 용액 중에서 항원항체반응을 실시하는 계에서 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 것이 기재되어 있다.
그러나, 이들 공지의 첨가물로는 반드시 만족스러운 결과를 얻을 수 없다. 예를 들면, 용액 중에서 항원과 항체를 반응시킨 반응 혼합물을 비탁법 또는 흡광도법 등의 광학적인 방법으로 측정할 때, 상기한 바와 같은 공지의 첨가물을 사용하면, 피검액 중에 공존하는 측정대상이 아닌 다른 물질, 예를 들면, 지방 또는 단백질에 의해 혼탁이 생기는, 소위 비특이반응이 일어나 오차의 원인이 되는 수가 있다. 또한, 고농도의 피검물질이 존재함에도 불구하고, 측정결과가 저농도로 나오는, 소위 프로존 현상이 생기거나, 또는 저농도 영역의 측정결과가 대단히 부정확할 수 있다. 또한, EIA 또는 RIA의 경우에도, 첨가물이 비특이반응의 원인이 되거나, 프로존 현상이 일어날 수 있다. 따라서, 이러한 첨가물의 반응을 다소 촉진시키더라도 오히려 성가신 문제를 포함한다.
상기와 같은 사정에서, 액체 중에서 항원항체반응을 이용하여 면역학적 활성 물질을 대단히 정확하게 측정하는데 있어서, 종래 방법에 존재하는 결점이 모두 극복된 새로운 방법과 이러한 새로운 방법에 이용되는 새로운 시약을 개발하는 것이 몹시 요망되고 있다.
[발명의 개시]
따라서, 종래 방법의 결점이 모두 극복된 항원항체반응을 이용하는 면역학적 활성 물질의 측정방법을 제공하는 것이 본 발명의 한가지 목적이다.
또한, 항원항체반응이 실시되는 액체 중에 특정의 폴리에테르 화합물을 첨가하여 간단한 방법으로 측정을 달성하고 결과를 극히 정확하게 얻을 수 있는, 면역학적으로 활성인 물질을 측정하는 새로운 방법을 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적이다.
또한, 특정한 폴리에테르 화합물을 포함하는, 상기의 면역학적 활성 물질의 측정방법을 위한 시약을 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적이다.
본 발명의 또다른 목적, 특징 및 이점은 다음의 기재로부터 명백해진다.
종래 방버에서 나타난 결점을 극복하기 위해, 본 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과, 의외에도 특정한 폴리에테르 화합물을 항원항체반응이 실시되는 액체중에 첨가함으로써 비특이반응이나 프로존 현상이 일어나지 않고 면역학적 활성 물질의 측정이 대단히 정확하게 비탁법, 광 산란법 등의 광학적 측정방법에 의해 달성될 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 한 태양에 의하면, 액체 중에서의 항원항체반응을 이용한 면역학적 활성 물질의 측정방법에 있어서, 액체 중에 일반식[Ⅰ]의 화합물을 첨가하는 것을 특징으로 하는 면역학적 활성 물질의 측정방법이 제공되고, 또한, 일반식[Ⅰ]의 화합물을 함유하는 면역학적 측정용 시약이 제공된다.
상기식에서, R1및 R2는 각각 수소원자 또는 탄소수 1 내지 5의 탄화수소기이고, AO는 탄소수 3 내지 4의 옥시알킬렌기이며, m 및 n은 각각 옥시에틸렌기 및 옥시알킬렌기의 수(옥시에틸렌기와 옥시알킬렌기는 랜덤 공중축합되어 있으며 분자량은 1,000 내지 20,000이다)이고, m과 n의 비율은 60/40 내지 90/10의 범위이다.
본 발명의 다른 태양에 의하면, 일반식[Ⅰ]의 화합물을 함유하는, 면역학적 활성 물질을 측정하기 위한 시약이 제공된다.
상기식에서, R1및 R2는 각각 수소원자 또는 탄소수 1 내지 5의 탄화수소기이고, AO는 탄소수 3 내지 4의 옥시알킬렌기이며, m 및 n은 각각 옥시에틸렌기 및 옥시알킬렌기의 수(옥시에틸렌기와 옥시알킬렌기는 랜덤 공중축합되어 있으며 분자량은 1,000 내지 20,000이다)이고, m과 n의 비율은 60/40 내지 90/10의 범위이다.
도면의 간단한 설명
제1도는 본 발명의 방법에 의한 CPR의 측정 결과를 나타내는 그래프이고, 직선 A는 고농도 시료, 직선 B는 저농도 시료에 관한 것이다.
제2도는 검체 중의 지방에 의한 비특이반응 유무를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
발명을 실시하기 위한 가장 좋은 형태
일반식[Ⅰ]에 있어서, R1및 R2중의 하나 또는 둘 다가 수소원자인 경우는, 당해 화합물은 폴리(옥시에틸렌옥시알킬렌)에탄올 또는 알칸올 또는 폴리(옥시에틸렌옥시알킬렌)글리콜이다. R1및 R2가 둘 다 탄화수소기인 경우는, R1및 R2는 서로 같거나 다를 수 있으며, 통상은 지방족 또는 환상 지방족으로 1 내지 5개의 탄소원자를 갖는 기로부터 선택된다. R1및 R2는 직쇄상 또는 측쇄상으로 1 내지 5개의 탄소원자를 갖는 알킬기로부터 선택하는 것이 바람직하다. 탄화수소기로서는 메틸기, 에틸기, 알릴기, 프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, t-부틸기, n-아밀기, 이소아밀기 등을 들 수 있다.
옥시알킬렌기 -OA-로서는, 옥시프로필렌기, 옥시부틸렌기 및 옥시테트라메틸렌기 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 옥시에틸렌기 -CH2-CH2-O-의 수와 옥시알킬렌기 -AO-의 수는 60/40 내지 90/10(m/n 비율로)으로 한정된다. 또한, 옥시에틸렌기와 옥시알킬렌기의 중축합체의 분자량도 1,000 내지 20,000으로 한정된다. 분자량이 1,000 미만에서는 본 발명의 목적이 달성되지 않으며, 20,000을 초과하면 합성이 곤란하기 때문이다. 또한, m과 n의 비율이 한정되는 것은 60/40 내지 90/10의 범위외에서는 본 발명의 목적이 달성될 수 없기 때문이다.
일반식[Ⅰ]의 화합물은 공지이며, 그 제조방법 등은 일본국 특허공보 제(소)35-7594호, 제(소)57-17008호 등에 기재되어 있다. 또한, 이 화합물의 어느 것은 닛뽄유지(주)로부터 유니루브시리즈로서 시판되어 금속의 가공유 및 화장품의 기제로서 널리 사용되고 있다. 일반식[Ⅰ]의 화합물은 일본국 특허공보 제(소)60-4938호에 표시되어 있는 다음 일반식의 블록 공중축합체와는 다른 랜덤 공중축합체이며, 이 때문에 계면활성작용을 갖지 않는 전혀 다른 물성을 나타낸다;
HO(CH2CH2O)a(CH3CHCH2O)b(CH2CH2O)cH
본 발명의 방법에서 측정대상으로 하는 면역학적 활성 물질(항원 또는 항체)로서는, 예를 들면, C 반응성 단백질(CRP), 류마티스성 인자(RF), 안티스트렙토리딘 O(ASO), 트란스페린 등의 혈장 단백질, 갑상선 자극 호르몬(THS), 트리요오드사일로닌(T3), 혈청 총 사일로키신(T4), 티로키신 결합성 단백질(TBG), 사일로글로불린, 인슐린, 트립신, 에라스타제, 에스트리올(E3), 융모성 고나도트로핀(HCG), 인간 태반성 락토겐(HPL) 등의 호르몬, 암태아성 항원(CEA), β2-마이크로글로불린, α-페토프로테인(AFP) 등의 종양 관련물질, HBs 하원, HBs 항체, HBe 항원, HBe 항체 등의 바리어스 간염의 항원, 항체, 멈프스, 헤르페스, 마진, 풍진, 사이토메가로 등의 바이러스, 항에이즈 항체(HIV) 등의 각종 생체성분을 들 수 있다.
본 발명의 면역학적 측정용 시약은 일반식[Ⅰ]의 화합물을 함유하는 것으로서, (1) 라텍스 입자와 같은 담체에 담지되어 있지 않은 항원 및 항체를 사용하는 반응, (2) 라텍스 입자와 같은 담체에 담지된 항원 및 항체를 사용하는 반응 및 (3) 튜브, 비드, 플레이트 등의 담체에 담지된 항원 및 항체를 사용하는 반응 어느것에도 사용할 수 있다. 라텍스 입자 담체에 담지되지 않거나, 또는 담지된 항원 또는 항체를 사용하는 경우는, 이 항원 또는 항체를 피검액 중의 항체 또는 항원과 반응시킨 후, 광 산란법 및 분광광도법 등의 광학적 방법으로 반응 생성물의 탁도 변화를 측정한다. 튜브, 비드, 플레이트 등의 담체에 담지된 항원 또는 항체를 사용하는 경우는, 피검액 중의 항체 또는 항원과 반응시킨 후, 피검액을 제거하고, 이어서 효소 또는 방사성 원소로 표지한 2차 항체 등을 반응시키고, 결합된 효소량 또는 방사선량을 측정하거나, 결합되지 않은 효소량을 측정한다. 본 발명의 시약은 피검액을 반응시킬 때 또는 표지된 2차 항체 등을 반응시킬 때에 사용된다. 본 발명의 시약을 사용하는 경우의 측정원리, 측정순서 및 측정을 위한 장치는 종래의 EIA, RIA, ELISA, 광 산란법 및 분광광도법과 전혀 다르지 않다. 또한, 피검액으로서는 통상 혈청이 사용되고 있지만, 다른 체액 성분, 예를 들면, 척수액 또는 뇨 등도 사용된다.
항원항체반응에 사용되는 측정용 시약에는, 항혈청을 함유하는 시약, 측정할 항원에 대응하는 항체를 함유하는 시약, 측정할 항체에 대응하는 항원을 함유하는 시약, 반응완충시약 및 시료를 희석하기 위한 희석제 등이 있으며, 일반식[Ⅰ]의 화합물은 이들 어느 시약에 가하여도 그 효과를 나타낸다. 그러나, 일반식[Ⅰ]의 화합물은, 예를 들면, 생리식염수, 인산염 완충화 생리식염수 또는 트리스염산 완충화 생리식염수와 같은 완충화 생리식염수 또는 관용의 완충액에 용해시켜 사용하는 것이 바람직하다. 완충액은 항혈청을 함유하는 시약 등에 첨가할 수 있다. 완충액의 pH는 5 내지 10, 바람직하게는 6.5 내지 8.5를 사용한다.
일반식[Ⅰ]의 화합물의 시약 중의 농도는 분석방법에 따라 다르지만, 항혈청, 항체 또는 항원을 함유하는, 또는 항혈청, 항체 또는 항원을 함유하지 않는 시약에 가할 경우에는 일반적으로 0.01 내지 10%(w/v), 바람직하게는 0.05 내지 5%이다. 최종적인 반응 혼합물 중에서 일반식[Ⅰ]의 화합물의 농도는 0.01 내지 2%, 바람직하게는 0.05 내지 1%이다.
일반식[Ⅰ]의 화합물을 함유하는 본 발명의 면역학적 측정시약 중에는, 경우에 따라서는, 생체 시료 중에 포함되는 간섭물질의 영향을 제거하기 위하여 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 젤라틴의 재중합체의 단백질 또는 글루코스, 슈크로스 등의 당류를 첨가할 수 있다.
일반식[Ⅰ]의 화합물은 종래 사용되어온 폴리에틸렌 글리콜 또는 포록사머와 같은 화합물과 병용할 수도 있다.
항원항체반응의 결과를 광학적으로 측정하는 측정법의 일반적인 순서는 다음과 같다.
먼저, 측정하고자 하는 항원 또는 항체에 특이적으로 반응하는 항체 또는 항원을 함유하는 시약, 일반식[Ⅰ]의 화합물을 함유하는 완충액 및 시료(시료 중의 측정하고자 하는 항원 또는 항체의 농도에 따라서는, 일반식[Ⅰ]의 화합물을 함유하는 완충액 또는 관용의 완충액으로 시료를 희석하여 사용한다)를 일정량의 비율로 혼합한 후, 일정 온도하(바람직하게는 25 내지 37℃)에서 반응시키고, 이어서, 예를 들면, 비탁분석의 경우 비탁계와 같은 적당한 계장기상에서 읽는다. 시료의 결과를 미지의 농도를 정량하기 위해 대조시료의 농도와 비교한다. 본 발명의 일반식[Ⅰ]의 화합물을 함유하는 완충액을 미리 항원 또는 항체를 함유하는 시약 또는 시료와 혼합하는 것이 가능하다.
본 발명의 항원항체반응을 이용한 면역학적 측정방법에 있어서는 검체 중의 협잡 단백질, 지방 등에 의한 바람직하지 않은 부반응인 소위 비특이반응이 억제된다. 또한, 피검물의 고농도 영역에서 프로존의 발생을 억제할 수 있고, 또한, 피검물의 저농도 영역에서 좋은 정밀도로 측정할 수 있다는 이점이 있다.
[실시예]
다음에, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 기술한다.
[실시예 1]
면역학적 측정시약으로서는 pH 7.2의 인산염 완충액에 0.075%(w/v)의 일반식[Ⅱ]의 화합물을 용해시킨 용액을 사용한다.
이 화합물의 m은 240이고 n은 60이며 m/n 몰비는 80/20이고 분자량은 14,058이다. 제조된 면역학적 측정시약을 CRP, 트란스페린, 알파 1-산 당단백질, 헵토글로빈 및 알파 1-안티트립신의 각각의 비탁 검정에사용하며, 각 검정을 다음과 같이 실시한다.
상기 단백질에 대한 항혈청에 면역학적 측정시약을 전도혼화하고, 각각 1:2의 비율로 혼합희석하여, 이 혼합물을 제2 시약으로 한다. 제조한 면역학적 시약을 반응 완충액으로서, 제1 시약으로 한다. 저농도 영역과 고농도 영역에서의 직선성을 확인하기 위하여, 고농도의 시료와 저농도의 시료를 각각 5% 인간 알부민 혈청으로 10단계로 희석을 실시하여 시료로 한다. 시험관에 희석된 시료를 5μl 취하고, 제1 시약을 350μl 첨가한 다음, 5분간 반응시키고, 시료 블랭크를 주파장 340㎚, 부파장 700㎚의 두파장에서 측정한다. 측정한 히다찌세아시쿠쇼제 히다찌 705형 생화학 자동분석장치로 실시한다. 시료 블랭크를 측정한 시료에, 최초에 제조한 항혈청을 100μl 첨가하고, 혼합한 후 5분간 반응시키고, 동일한 두 파장에서 측정하고, 그 결과로부터 시료 블랭크를 뺀 값을 반응변화량으로 한다. 또한, 검량선 작성을 위한 대조혈청으로서는 베링베르케사제 N-CRP 표준 혈청을 사용한다. CRP에 대한 측정결과를 제1도에 도시한다. 제1도에 있어서, 종축은 CRP 농도(㎎/dl)이고, 횡축은 시료의 희석률이다. 직선 A는 고농도 시료(희석 전 농도 36㎎/dl)에 관한 것이고, 직선 B는 저농도 시료(희석 전 농도 3㎎/dl)에 관한 것이다.
이 실시예에서 사용한 본 발명의 면역학적 시약은 실질적으로 항원항체반응에서 넓은 범위에 걸쳐 한쌍의 측정으로 직선성을 나타내며, 특히 저농도 영역에서 큰 감도를 나타냄을 알 수 있다.
트란스페린(고농도 시료의 희석 전 농도 750㎎/dl, 저농도 시료의 희석 전 농도 10㎎/dl), 알파 1-산 당단백질(220㎎/dl, 70㎎/dl), 헵토글로빈(650㎎/dl, 50㎎/dl) 및 알파 1-안티트립신(340㎎/dl, 40㎎/dl)을 사용한 경우도 CRP와 완전히 동일하게 측정결과는 넓은 범위에 걸쳐 직선성을 나타낸다.
[실시예 2]
pH 7.2의 인산염 완충액에 0.075%(w/v)의 일반식[Ⅱ]의 화합물을 용해시켜 제조한 면역학적 측정시약을 사용하여, 반응 완충액의 검체 중의 지방에 대한 비특이반응의 유무를 확인한다. 면역학적 측정시약 1.0ml에 인타라패트(정맥주사용 지방 유제)를 20μl 첨가하고, 잘 혼합한다.
이 혼합용액에 대해 37℃에서 10분 동안 시간의 경과에 따른 변화를 파장 340㎚에서 확인한다.
대상으로서, 종래부터 사용되고 있는 폴리에틸렌 글리콜 6000을 본 화합물과 치환하여 동일한 시험을 실시한다. 그 결과를 제2도에 도시한다. 도면에서 종축은 흡광도이고, 횡축은 시간(분)이다. 폴리에틸렌 글리콜 6000을 사용한 경우에는, 시간의 경과에 따라 흡광도가 증가하고, 지방에 대한 비특이반응이 관찰된다. 한편, 본 발명의 면역학적 시약의 경우에는 비특이반응을 볼 수 없다. 따라서, 본 발명의 면역학적 시약을 사용하여 미지의 시료를 측정할 때는, 시료의 측정결과에서 블랭크를 정확하게 뺄 수 있다. 따라서, 통상 본 시약이 사용되는 임상검사에서 측정되는 검체에서, 종종 나타나는 고지혈장 등에서도 시료 중에 함유된 단백질 농도를 정확하게 정량할 수 있다.
[실시예 3]
면역반응시약으로서 사용되는 화합물의 범위를 조사할 목적으로 제1표에 표시된 화합물에 대하여 실시예 1에 기재한 방법에 사용된 측정으로 직선성을 테스트한다. 제1표에서 화합물 번호 1 내지 6의 것은 일반식[Ⅱ]의 화합물과 동일하게 양호한 직선성을 나타낸다. 한편, 화합물 번호 7 내지 9의 것은 충분한 직선성이 수득되지 않는다. 이 결과로부터, 분자량은 1,000 내지 20,000의 범위로 하고, m과 n의 비율을 60/40 내지 90/10의 범위로 하는 것이 결론지어진다.
* 분자량 실측치는 GPC로부터 구한다.

Claims (2)

  1. (ⅰ) 일반식[Ⅰ]의 화합물을 함유하거나 당해 화합물이 첨가된 액체 중에서 면역학적 활성 물질과 항원 또는 항체를 접촉시켜 항원항체반응을 개시하고, (ⅱ) 반응 액체의 탁도 변화를 광 산란법 또는 비탁법으로 측정함을 포함하는, 액체 중에서의 항원항체반응을 이용한 면역학적 활성 물질의 측정방법.
    상기식에서, R1및 R2는 각각 수소원자 또는 탄소수 1 내지 5의 탄화수소기이고, AO는 탄소수 3 내지 4의 옥시알킬렌기이며, m 및 n은 각각 옥시에틸렌기 및 옥시알킬렌기의 수(옥시에틸렌기와 옥시알킬렌기는 랜덤 공중축합되어 있으며 분자량은 1,000 내지 20,000이다)이고, m과 n의 비율은 60/40 내지 90/10의 범위이다.
  2. (ⅰ) 일반식[Ⅰ]의 화합물을 함유하거나 당해 화합물이 첨가된 액체 중에서 면역학적 활성 물질과 항원 또는 항체를 접촉시켜 항원항체반응을 개시하고, (ⅱ) 반응 액체의 탁도 변화를 광 산란법 또는 비탁법으로 측정함을 포함하는, 면역학적 활성 물질의 측정방법에 사용되는 일반식[Ⅰ]의 화합물을 함유하는 시약.
    상기식에서, R1및 R2는 각각 수소원자 또는 탄소수 1 내지 5의 탄화수소기이고, AO는 탄소수 3 내지 4의 옥시알킬렌기이며, m 및 n은 각각 옥시에틸렌기 및 옥시알킬렌기의 수(옥시에틸렌기와 옥시알킬렌기는 랜덤 공중축합되어 있으며 분자량은 1,000 내지 20,000이다)이고, m과 n의 비율은 60/40 내지 90/10의 범위이다.
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