DE68918286T2 - Verfahren zum testen einer immunologisch aktiven substanz und dafür geeignetes reagenz. - Google Patents
Verfahren zum testen einer immunologisch aktiven substanz und dafür geeignetes reagenz.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen einer immunologisch aktiven Substanz, wobei eine Antigen- Antikörper-Reaktion benützt wird, die auf dem Gebiet klinischer Tests in großem Umfang angewendet wird; und sie betrifft ein bei diesem Verfahren verwendbares Reagens. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Messen einer immunologisch aktiven Substanz, welches die Zugabe einer spezitischen Polyetherverbindung zu einer Flüssigkeit umfaßt, in welcher eine solche Antigen-Antikörper-Reaktion durchgeführt wird; und sie betrifft ein Reagens, welches aus der spezifischen Polyetherverbindung besteht, und welches befähigt ist, die Antigen-Antikörper-Reaktion in dem Verfahren zu fördern.
- In den letzten Jahren hat sich in großem Umfang die Praxis durchgesetzt, daß eine spezifische, immunologisch aktive Substanz, wie z. B. ein besonderes Protein usw., welches in der Körperflüssigkeit eines lebenden Körpers aufscheint, in Bezug auf Krankheitszustände unter Anwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion bestimmt wird und dabei ein Ergebnis erhalten wird, welches für die Diagnose benützt wird. Für biochemische Messungen unter Anwendung einer solchen Antigen-Antikörper-Reaktion sind bereits verschiedene Verfahren entwickelt worden. Solche Verfahren werden veranschaulicht z. B. durch den Radioimmunoassay (RIA), Enzymimmunoassay (EIA), Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), durch die Streulichtphotometrie und durch die Nephelometrie. Innerhalb dieser Tests ist bei einem RIA, EIA und ELISA jedenfalls die Abtrennung des Reaktionsproduktes nach der Umsetzung mit einer zu prüfenden Flüssigkeit erforderlich. Demgemäß erfordern diese Verfahren im allgemeinen tür die Messung viel Zeit und Mühe, sie werden aber nunmehr in großem Umfang aus dem Grunde angewendet, daß diese Verfahren in den quantitativen Bestimmungsergebnissen durchwegs ausgezeichnet sind.
- In der allerjüngsten Zeit haben ein photometrisches Bestimmungsverfahren, wie z. B. ein Streulichtverfahren, ein Nephelometrieverfahren oder dgl., welche Verfahren befähigt sind, optische Veränderungen in einer Testflüssigkeit zu messen, welche Veränderungen als Ergebnis einer Immunreaktion (einer Antigen-Antikörper-Reaktion) in einer Testflüssigkeit aufgetreten sind, als Verfahren zur Bestimmung von immunologisch aktiven Substanzen viel Aufmerksamkeit seitens der Öffentlichkeit auf sich gezogen. Diese Verfahren basieren auf dem Prinzip, daß die Bestimmung einer immunologisch aktiven Zielsubstanz durch Messen der Veränderung mit irgendeinem geeigneten photometrischen Mittel erfolgen kann, weil die Veränderung in der Trübung einer Flüssigkeit vor und nach der Umsetzung zwischen einem Antigen und einem Antikörper in der Flüssigkeit mehr oder weniger entsprechend dem Reaktionsgrad stattfindet. Demgemäß sind das Streulichtverfahren und die Nephelometrie dadurch ausgezeichnet, daß sie im Vergleich zu RIA, EIA und ELISA leicht und praktisch in der Ausführung der Messung sind.
- Bei der Messung von irnrnunologisch aktiven Substanzen unter Anwendung einer solchen Antigen-Antikörper Reaktion ist auch die Verwendung eines besonderen Additivs zur Förderung der Antigen-Antikörper-Reaktion untersucht worden. So ist beispielsweise in der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. Sho. 60-4938 die Verwendung eines nichtionischen grenzflächenaktiven Mittels beschrieben, welches auf Polyethylenglykol und einem Blockcopolykondensat mit der Strukturformel HO(CH&sub2;CH&sub2;O)a(CH&sub3;CHCH&sub2;O)b(CH&sub2;CH&sub2;O)cH und dgl. besteht. In der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. Sho. 59-43362 ist die Verwendung einer Verbindung mit der allgemeinen Formel
- als ein solches Additiv beschrieben. Weiterhin geht aus der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. Sho. 58-47256 hervor, daß als Additiv in einem System, worin ein Antigen oder Antikörper auf unlöslichen, feinen Teilchen als Träger vorliegt und einer Antigen-Antikörper-Reaktion in einer Lösung unterworfen wird, Polyethylenglykol verwendet werden kann.
- Unter Verwendung eines solchen bekannten Additivs ist jedoch nicht immer ein zufriedenstellendes Ergebnis erhalten worden. Beispielsweise ermöglichen im Falle der Anwendung eines solchen bekannten Additivs für eine photometrische Messung, z. B. durch Nephelometrie oder Trübungsmessung, eines Reaktionsgemisches, welches durch Umsetzen eines Antigens mit einem Antikörper in einer Lösung erhalten worden ist, Substanzen, welche nicht den Gegenstand der Messung darstellen und welche mit diesem gemeinsam in der Lösung vorhanden sind, wie z. B. Fett und Öl oder Protein, das Auftreten von Trübung, nämlich die sogenannte nicht-spezifische Reaktion, welche zu einem Fehler in der Messung führen kann. Weiterhin kann das sogenannte Prozon-Phänomen auftreten, bei welchem ein Meßergebnis eher eine niedrige Konzentration einer zu messenden Substanz anzeigt, und dies trotz der Tatsache, daß diese Substanz tatsächlich in hoher Konzentration vorliegt; oder bei welchem, alternativ, ein Meßergebnis bei sehr niedriger Konzentration ungenau sein kann. Die Additive können auch im Falle des EIA oder RIA eine nicht- spezifische Reaktion oder das Prozon-Phänomen verursachen. Die Verwendung eines solchen Additivs führt somit eher zu lästigen Problemen, obwohl sie die Reaktion bis zu einem gewissen Grad fördert.
- Unter den oben erwähnten Umständen besteht ein großer Bedarf nach der Entwicklung eines neuen Verfahrens zum Messen einer immunologisch aktiven Substanz mit hoher Genauigkeit unter Anwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion in einer Flüssigkeit, bei welchem Verfahren alle Nachteile überwunden sind, welche bei den zum Stand der Technik gehörenden Verfahren auftauchen; sowie ein Bedarf nach der Schaffung eines neuen Reagens, welches in einem solchen neuen Verfahren verwendbar ist.
- Demgemäß besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Schaffung eines neuen Verfahrens zum Messen einer immunologisch aktiven Substanz unter Anwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion, bei welchem Verfahren die Nachteile der zum Stand der Technik gehörenden Verfahren gänzlich überwunden worden sind.
- Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Schaffung eines neuen Verfahrens zum Messen einer immunologisch aktiven Substanz, welches Verfahren die Zugabe einer spezifischen Polyetherverbindung zu einer Flüssigkeit, in welcher eine solche Antigen-Antikörper-Reaktion durchgeführt wird, umfaßt, um dadurch die Messung auf leichte und einfache Art und Weise zu erreichen und ein Ergebnis von hoher Genauigkeit zu erhalten.
- Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Schaffung eines Reagens für die immunologische Messung in dem obigen Verfahren, welches Reagens eine spezifische Polyetherverbindung enthält.
- Andere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der nachsthenden Beschreibung noch eingehender hervor.
- Als Ergebnis ausgedehnter Forschungsarbeiten, welche von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführt worden sind, und welche auf die Überwindung der Nachteile gerichtet waren, welche bei den zum Stande der Technik gehörenden Verfahren ersichtlich sind, ist nunmehr überraschenderweise gefunden worden, daß die Messung einer immunologisch aktiven Substanz mit hoher Genauigkeit durch Nephelometrie, nach dem Streulichtverfahren oder nach einem ähnlichen optischen Meßverfahren erreicht werden kann, ohne daß dadurch eine nicht-spezifische Reaktion und das Prozon-Phänomen hervorgerufen würden und zwar durch Zugabe einer spezifischen Polyetherverbindung zu einer Flüssigkeit, in welcher eine Antigen-Antikörper-Reaktion für die Messung durchgeführt wird.
- Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Messen einer immunologisch aktiven Substanz geschaffen, bei welchem eine Antigen-Antikörper-Reaktion in einer Flüssigkeit angewendet wird und welches durch die Zugabe einer Verbindung mit der allgemeinen Formel:
- R¹O-[(CH&sub2;CH&sub2;O)m(AO)n]-R²
- gekennzeichnet ist, in welcher Formel R¹ und R² jeweils für ein Wasserstoffatom oder eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen stehen, AO eine Oxyalkylengruppe mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, m und n die Zahl der Oxyethylengruppen bzw. der Oxyalkylengruppen bedeuten, wobei die Oxyethylengruppen und die Oxyalkylengruppen statistisch zu einem Molekulargewicht von 1000-20.000 copolykondensiert worden sind und das Verhältnis m/n im Bereich von 60/40 bis 90/10 liegt.
- Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Reagens für die immunologische Messung einer immunologisch aktiven Substnz geschaffen, welches eine Verbindung mit der allgemeinen Formel:
- R¹O[(CH&sub2;CH&sub2;O)m(AO)n]-R² (I)
- umfaßt, worin R¹ und R² jeweils für ein Wasserstoffatom oder eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen stehen, AO eine Oxyalkylengruppe mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, m und n die Zahl der Oxyethylengruppen bzw. der Oxyalkylengruppen bedeuten, wobei die Oxyethylengruppen und die Oxyalkylengruppen statistisch zu einem Molekulargewicht von 1000-20.000 copolykondensiert worden sind und das Verhältnis m/n im Bereich von 60/40 bis 90/10 liegt.
- Die Fig. 1 zeigt eine graphische Darstellung, welche ein Ergebnis der Messung auf CRP nach dem erfindungsgemäßen Verfahren veranschaulicht, wobei sich die gerade Linie A auf eine Probe mit hoher Konzentration bezieht, während sich die gerade Linie B auf eine Probe mit niedriger Konzentration bezieht.
- Die Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung, welche ein Ergebnis einer Messung veranschaulicht, welche darauf gerichtet war, festzustellen, ob in Gegenwart von in der Probe enthaltenein Fett eine nicht-spezifische Reaktion stattfindet.
- In der allgemeinen Formel (I) ist die Verbindung dann, wenn von den Resten R¹ und R² entweder der eine oder der andere oder beide Wasserstoff ist/sind, Poly-(oxyethylenoxyalkylen)- ethanol oder -alkanol oder Poly-(oxyethylenoxyalkylen)-glykol. Sind beide Reste R¹ und R² Kohlenwasserstoffgruppen, dann kann R¹ mit R² identisch sein oder sich hievon unterscheiden, wobei R¹ normalerweise aus aliphatischen oder cycloaliphatischen Gruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist R¹ und R² werden vorzugsweise aus geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkylgruppen mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ausgewählt. Beispiele für die Kohlenwasserstoffgruppe sind Methyl, Ethyl, Allyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl, tert.Butyl, n-Amyl und Isoamyl. Beispiele für die Gruppierung -AO- als Oxyalkylengruppe mit 3 bis 4 Kohlenwasserstoffatomen sind Oxypropylen, Oxybutylen und Oxytetramethylen.
- Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Anzahl der Oxyethylengruppen -CH&sub2;-CH&sub2;O- und die Anzahl der Oxyalkylengruppen -AO- hinsichtlich des Verhältnisses von m/n spezifisch beschränkt auf einen Bereich von 60/40 bis 90/10. Das Molekulargewicht des Polykondensates der Oxyethylengruppen und der Oxyalkylengruppen ist ebenfalls spezifisch beschränkt auf 1000 bis 20.000. Liegt das Molekulargewicht unter 1000, dann kann das Ziel dieser Erfindung kaum erreicht werden. Ist das Molekulargewicht andererseits aber höher als 20.000, dann wird die Synthese des Copolykondensates schwierig. Liegt der Wert von m/n außerhalb des definierten Bereiches, dann wird das Ziel dieser Erfindung kaum erreicht werden.
- Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind auf dem Fachgebiet bekannt, und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen sind in den veröffentlichten japanischen Patentanmeldungen Nrn. 35-7594 und 57-17008 beschrieben. Ein Teil dieser Verbindungen ist im Handel bereits erhältlich, z. B. von der Nihon Yushi (Japan) unter der Handelsbezeichnung der UNILUB- Reihe; und sie werden in großem Umfang als Bearbeitungsöl für Metalle oder als Grundlagenmaterial für Kosmetika verwendet. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind statistische Copolykondensate, und sie sind von Block-Copolykondensaten der Formel:
- HO(CH&sub2;CH&sub2;O)a(CH&sub3;CHCH&sub2;O)b(CH&sub2;CH&sub2;O)cH
- verschieden, welche in der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Nr. 60-4938 beschrieben sind. So besitzen die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) keine Oberflächenaktivität, und sie zeigen physikalische Eigenschaften, welche von denjenigen der Verbindungen, welche in der obigen Veröffentlichung beschrieben sind, völlig verschieden sind.
- Beispiele für die immunologisch aktive Substanz (Antigen oder Antikörper), welche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen werden soll, sind z. B. Plasmaproteine, wie z. B. C- reaktives Protein (CRP), Rheumafaktor (RF), Antistreptolysin O (ASO) und Transferrin, Hormone, wie z. B. Thyreoidea-stimulierendes Hormon (THS), Trijodthyronin (T&sub3;), Serum-Gesamtthyroxin (T&sub4;), Thyroxin-bindendes Protein (TBG), Thyroglobulin, Insulin, Trypsin, Elastase, Östriol (E&sub3;). Human-Choriongonadotropin (HCG) und Human-Plazentalaktogen (HPL), onkologische Substanzen, wie z. B. Carzino-embryonales Antigen (CEA), β&sub2;-Mikroglobulin und α-Fetoprotein, Antigen und Antikörper von viraler Hepatitis, z. B. HBs-Antigen, HBs-Antikörper, HBe-Antigen und Hbe-Antikörper, Viren, wie z. B. Mumps-Virus, Herpes-Virus, Morbilli-Virus, Rubella-Virus und Zytomegalie-Virus, Anti-AIDS- Antikörper (HIV) und verschiedene andere Komponenten des lebenden Körpers.
- Das Reagens der vorliegenden Erfindung für immunologische Messungen umfaßt die Verbindung der allgemeinen Formel (I) und kann für irgendeine Art von Reaktionen verwendet werden, bei welchen (1) ein nicht auf einem Träger, wie z. B. Latexteilchen, vorliegendes Antigen bzw. ein ebensolcher Antikörper verwendet werden; (2) ein auf einem Träger, wie z. B. Latexteilchen, vorliegendes Antigen bzw. ein ebensolcher Antikörper verwendet werden; (3) ein auf einem Träger, wie z. B. einem Röhrchen, Perlen oder einer Platte, vorliegendes Antigen bzw. ein ebensolcher Antikörper verwendet werden. Im Falle der Verwendung eines Antigens oder eines Antikörpers, das bzw. der auf Latexteilchen als Trägern vorliegt, bzw. nicht auf einem solchen Träger vorliegt, wird das Antigen oder der Antikörper mit einem Antikörper oder einem Antigen in einer zu untersuchenden Flüssigkeit umgesetzt, wonach die Reaktionsflüssigkeit einer optischen Messung, wie z. B. dem Streulichtverfahren oder der Spektralphotometrie, unterworfen wird, um jegliche Veränderung in der Trübung in dem Reaktionsgemisch zu messen. Für den Fall, daß ein Antigen oder ein Antikörper verwendet wird, welches bzw. welcher auf einem Träger, wie z. B. einem Röhrchen, Perlen oder einer Platte, vorliegt, wird dasselbe bzw. derselbe mit einem Antikörper bzw. einem Antigen in einer zu messenden Flüssigkeit umgesetzt. Dann wird die zu messende Flüssigkeit entfernt, und ein sekundärer, mit einem Enzym oder einem Radioisotop markierter Antikörper oder dgl. wird dann zugesetzt, um eine sekundäre Antigen-Antikörper-Reaktion auszulösen. Schließlich wird die Menge des gebundenen Enzyms oder die Strahlungsdosis gemessen; oder es wird alternativ die Menge des nicht gebundenen Enzyms oder die Strahlungsdosis gemessen. Das erfindungsgemäße Reagens kann sowohl für die Reaktion mit einer zu messenden Flüssigkeit als auch für die Reaktion mit dem sekundären, mit einem Enzym oder einem Radioisotop markierten Antigen oder Antikörper verwendet werden. Das Prinzip, das Verfahren und die Vorrichtung für die Messung im Rahmen dieser Erfindung sind identisch mit jenen, die bei einem herkömmlichen EIA, RIA, ELISA, bei dem Streulichtverfahren und in der Spektralphotometrie angewendet werden. Im allgemeinen wird als eine zu messende Flüssigkeit ein Serum verwendet. Es kann jedoch auch in äquivalenter Weise eine andere Körperflüssigkeit wie z. B. Rückenmarkflüssigkeit, Urin oder dgl., verwendet werden.
- Das Reagens für die Messung einer Antigen-Antikörper-Reaktion umfaßt ein Reagens, welches ein Antiserum enthält; ein Reagens, welches einen Antikörper enthält, der spezifisch dem zu messenden Antigen entspricht; ein Reagens, welches ein Antigen enthält, das spezifisch dem zu messenden Antikörper entspricht; ein Puffer-Reagens für die Reaktion; und ein Verdünnungsmittel für die Probe. Die Verbindung der allgemeinen Formel (I) kann zur Erzielung ein und derselben Wirkung zu irgendeinem der obigen Reagenzien zugesetzt werden. Es ist jedoch wünschenswert, die Verbindung der allgemeinen Formel (I) in einer Kochsalzlösung, einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung, einer Tris-Puffer-Kochsalzlösung oder einer anderen Puffer- Kochsalzlösung oder in einer herkömmlichen Pufferlösung aufzulösen. Diese Pufferflüssigkeit kann zu einem Reagens zugesetzt werden, welches das Antiserum enthält. Der pH-Wert der Pufferlösung liegt in einem Bereich von 5 bis 10, vorzugsweise von 6,5 bis 8,5.
- Die Konzentration der Verbindung der allgemeinen Formel (I) in einem Reagens kann je nach dem Analysenverfahren variieren, doch fällt sie im allgemeinen in einen Bereich von 0,01 bis 10 % (Gew./Vol.), vorzugsweise von 0,05 bis 5 % (Gew./Vol.), wenn die Verbindung zu einem Reagens zugesetzt wird, welches das Antiserum, den Antikörper oder das Antigen enthält bzw. nicht enthält. Die Konzentration der Verbindung der allgemeinen Formel (I) in dem endgültigen Reaktionsgemisch fällt in einen Bereich von 0,01 bis 2 %, vorzugsweise von 0,05 bis 1 %.
- Das Reagens dieser Erfindung, welches die Verbindung der allgemeinen Formel (I) enthält, kann gemeinsam mit einem Protein, wie z. B. Kälberserumalbumin, Gelatine, oder einem Repolymer von Gelatine, oder mit einem Saccharid, wie z. B. Glukose oder Saccharose, beigemengt werden, um den Einfluß irgendeiner störenden Substanz zu eliminieren, welche in der Flüssigkeitsprobe aus einem lebenden Körper enthalten ist.
- Die Verbindung der allgemeinen Formel (I) kann gemeinsam mit Polyethylenglykol oder mit Poloxamer verwendet werden, welche bisher in den herkömmlichen Reagenzien eingesetzt worden sind.
- Das erfindungsgemäße Verfahren kann in der folgenden, allgemeinen Art und Weise durchgeführt werden: Ein Reagens, welches einen Antikörper oder ein Antigen enthält, welcher bzw. welches befähigt ist, spezifisch mit einem zu messenden Antigen oder einem zu messenden Antikörper zu reagieren, wird in einem gegebenen Mengenanteil mit einer Pufferlösung vermischt, welche die Verbindung der allgemeinen Formel (I) und eine Probe enthält. (Diese Probe kann - je nach der Konzentration eines zu messenden Antigens oder Antikörpers in der Probe - mit der Pufferlösung, welche die Verbindung der allgemeinen Formel (I) enthält, oder mit einer herkömmlichen Pufferlösung verdünnt werden.) Das Gemisch wird bei einer gegebenen Temperatur (vorzugsweise 25 bis 37ºC) reagieren gelassen und wird dann einer optischen Messung, wie z. B. durch Nephelometrie, unterworfen. Im Falle der Nephelometrie werden die mit einem Nephelometer erhaltenen Daten mit den Daten von Kontrollproben verglichen, um die Konzentration zu bestimmen. Eine die Verbindung der allgemeinen Formel (I) enthaltende Pufferlösung kann zuvor mit dem ein Antigen oder einen Antikörper enthaltenden Reagens oder mit einer zu messenden Probe vermischt werden.
- Bei dem immunologischen Verfahren dieser Erfindung mit Benützung einer solchen Antigen-Antikörper-Reaktion wird eine unerwünschte Nebenreaktion, nämlich die sogenannte unspezifische Reaktion, welche gewöhnlich durch ein als Verunreinigung vorliegendes Protein, Fett usw. verursacht wird, gehemmt. Weiterhin kann auch das Auftreten des sogenannten Prozon-Phänomens, bei einer hohen Konzentration der zu messenden Substanz, ebenfalls verhindert werden. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Erfindung ist darin gelegen, daß eine immunologische, immunologisch wirksame Substanz sogar bei niedrigen Konzentrationen mit hoher Genauigkeit gemessen werden kann.
- Die vorliegende Erfindung wird nunmehr mit Hilfe von Beispielen eingehender beschrieben.
- Als Immuntestreagens wurde eine Lösung (0,075 %ig, Gew./Vol) einer Verbindung der nachstehenden Formel (II) in einer Phosphatpufferlösung (pH 7,2) verwendet:
- Diese Verbindung hat ein m/n-Verhältnis von 80/20, weil in gleich 240 ist und n gleich 60 ist, und sie hat ein Molekulargewicht von 14.058. Dieses vorbereitete Immuntestreagens wurde zur Durchführung einer Trübungsanalyse auf CRP, Transferrin, ein α-1-Säure-Glykoprotein, ein Haptoglobin und ein α-1- Antitryprsin verwendet. Der Immuntest wurde in der folgenden Weise durchgeführt.
- Das Immuntestreagens wurde mit einem Antiserum gegen das obige Protein in einem Verhältnis des erstgenannten zu dem letztgenannten von 2:1 vermischt. Dieses Gemisch wurde ein zweites Reagens genannt. Das Immuntestreagens wurde, als erstes Reagens, als eine Reaktionspufferlösung verwendet.
- Um die Linearität sowohl in dem Bereich niedriger Konzentrationen als auch in dein Bereich hoher Konzentrationen zu bestätigen, wurden eine Probe von hoher Konzentration und eine Probe von niedriger Konzentration mit einem 5 %igen Humanserumalbumin zur Herstellung von 10 verschiedenen Konzentrationen von jeder Probe verdünnt.
- In ein Proberöhrchen wurden 5 ul einer verdünnten Probe eingebracht, und 350 ul des ersten Reagens wurden zugegeben. Das Gemisch wurde während 5 min umgesetzt, wonach die Absorption der Probe bei einer Hauptwellenlänge von 340 nm und bei einer sekundären Wellenlänge von 700 nm unter Verwendung einer automatischen biochemischen Analysiervorrichtung (Modell "705 Type"; Hitachi, Ltd.) gemessen wurde, um den Wert für die Blindprobe abzulesen. Zu der Probe wurden 100 ul des Antiserumgemisches zugegeben, und das so entstandene Gemisch wurde während 5 min uingesetzt, um ein Reaktionsgemisch zu ergeben, welches seinerseits bei den gleichen Wellenlängen wie oben angegeben gemessen wurde. Der Wert für die Blindprobe wurde von dem Wert für dieses Reaktionsgemisch abgezogen, um den der Reaktion entsprechenden Wert zu ermitteln. Als Kontrollserum zur Erstellung einer Kalibrierungskurve wurde ein Standard-N-CRP-Serum (Behring-Werke) verwendet. Die Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, welche die Meßergebnisse für CRP zeigt. In der Fig. 1 stellen die auf der Ordinate angeführten Zahlen die Konzentration an dem CRP (mg/dl) an, während die auf der Abszisse angeführten Zahlen die Verdünnungsrate der Probe angeben. Die gerade Linie A bezieht sich auf die Probe von hoher Konzentration (Konzentration vor der Verdünnung: 36 mg/dl), während sich die gerade Linie B auf die Probe von niedriger Konzentration bezieht (Konzentration vor dem Verdünnen: 3 mg/dl).
- Es wurde gefunden, daß das in diesem Beispiel verwendete Immuntestreagens gemäß der vorliegenden Erfindung eine höhere Linearität über einen im wesentlichen weiten Bereich in der Antigen-Antikörper-Reaktion ergab und daß dieses Reagens, insbesondere in einem Bereich niedriger Konzentration, eine hohe Empfindlichkeit zeigte.
- Transferrin (wobei die Konzentration vor dem Verdünnen 750 mg/dl für die Probe von hoher Konzentration betrug, während die Konzentration vor dem Verdünnen für die Probe von niedriger Konzentration 10 mg/dl ausmachte), α-1-Säure-Glykoprotein (220 mg/dl bzw. 70 mg/dl), Haptoglobin (650 mg/dl bzw. 50 mg/dl), und α-1-Antitrypsin (340 mg/dl bzw. 40 mg/dl) zeigten - im wesentlichen in gleicher Weise wie das CRP - eine Linearität über einen weiten Bereich.
- Es wurde geprüft, ob eine unspezifische Reaktion der Pufferlösung mit einem Fett in der Probe stattfand, wenn ein Immuntestreagens verwendet wurde, welches durch Auflösen der Verbindung der Formel (II) (0,075 %ig, Gew./Vol.) in einer Phosphatpufferlösung (vom pH 7,2) hergestellt worden war. Zu 1,0 ml des Immuntestreagens wurden 20 ul "Intrafat" (einer für die intravenöse Injektion eingesetzten Fettemulsion) zugegeben, und das Gemisch wurde gut umgerührt.
- Im Verlauf der Zeit wurde in dem Gemisch bei 38ºC während 10 min bei der Wellenlänge von 340 nm eine Veränderung beobachtet.
- Als Kontrolle wurde eine Phosphatpufferlösung verwendet, bei welcher die Verbindung der Formel (II) in dem obigen Test durch Polyethylenglykol 6000 ersetzt worden war. Die Ergebnisse sind in der Fig. 2 dargestellt. Bei dieser Zeichnung sind auf der Ordinate die Werte für die dekadische Extinktion aufgetragen worden, während die Abszisse die Zeit in Minuten angibt. Wurde Polyethylenglykol 6000 verwendet, dann nahm die dekadische Extinktion mit dem Zeitverlauf zu, wobei eine unspezifische Reaktion mit dem Fett beobachtet wurde. Demgegenüber zeigte das Immuntestreagens gemäß der vorliegenden Erfindung keine unspezifische Reaktion. Wird demgemäß eine unbekannte Probe unter Verwendung des Immuntestreagens gemäß der vorliegenden Erfindung gemessen, dann kann der Wert für eine Blindprobe mit Genauigkeit abgezogen werden, so daß in einem klinischen Test unter Verwendung des erfindungsgemäßen Reagens eine Konzentration der Proteine, selbst wenn dieselben im Blutplasma einer hyperlipämischen Person vorliegen, genau quantifiziert werden kann.
- Um den Bereich von Verbindungen zu untersuchen, welche als Immunreagenzien verwendet werden sollen, wurde auf die Linearität geprüft, wenn die in der Tabelle 1 angeführten Verbindungen in der gleichen Weise verwendet wurden, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Es wurde gefunden, daß die Verbindungen Nrn. 1 bis 6 in der Tabelle 1 eine ebenso gute Linearität wie die Verbindung der Formel (II) aufwiesen, während die Verbindungen Nrn. 7 bis 9 keine solche ausreichende Linearität zeigten. Aus diesem Ergebnis wird die Schlußfolgerung gezogen, daß der Molekulargewichtsbereich von 1000 bis 20.000 geht, und daß das Verhältnis von m/n in einen Bereich von 60/40 bis 90/10 fällt. Tabelle 1 Molekulargewicht Verbindung Nr. m/n (Molverhältnis) berechnet gefunden Vorliegende Erfindung Vergleichsbeispiele *) Die gefundenen Molekulargewichte wurden durch GPC (Gel-Permeationschromatographie) ermittelt.
Claims (3)
1. Verfahren zur Bestimmung einer immunologisch aktiven
Substanz unter Anwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion in
einer Flüssigkeit, gekennzeichnet durch Zusetzen einer
Verbindung mit der allgemeinen Formel:
R¹O-{(CH&sub2;CH&sub2;O)m(AO)n}-R²
zu der Flüssigkeit, in welcher Formel R¹ und R² jeweils für ein
Wasserstoffatom oder eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 5
Kohlenstoffatomen stehen, AO eine Oxyalkylengruppe mit 3 bis 4
Kohlenstoffatomen bedeutet, m und n die Zahl der
Oxyethylengruppen bzw. der Oxyalkylengruppen bedeuten, wobei
die Oxyethylengruppen und die Oxyalkylengruppen statistisch zu
einem Molekulargewicht von 1000-20.000 copolykondensiert worden
sind und das Verhältnis m/n im Bereich von 60/40 bis 90/10
liegt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Bestimmung auf
optischem Wege vorgenommen wird.
3. Reagens für die immunologische Bestimmung einer
iinmunologisch aktiven Substanz, welches eine Verbindung mit der
allgemeinen Formel:
R¹O-{(CH&sub2;CH&sub2;O)m(AO)n}-R² (I)
umfaßt, worin R¹ und R² jeweils für ein Wasserstoffatom oder
eine Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen
stehen, AO eine Oxyalkylengruppe mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen
bedeutet, m und n die Zahl der Oxyethylengruppen bzw. der
Oxyalkylengruppen bedeuten, wobei die Oxyethylengruppen und die
Oxyalkylengruppen statistisch zu einem Molekulargewicht von
1000-20.000 copolykondensiert worden sind und das Verhältnis
m/n im Bereich von 60/40 bis 90/10 liegt.
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