DE69004673T2

DE69004673T2 - Analytisches testverfahren.

Info

Publication number: DE69004673T2
Application number: DE90910067T
Authority: DE
Inventors: John Blackwood; Shai Inbar; Donna Maretsky
Original assignee: PB Diagnostic Sytems Inc
Current assignee: Behring Diagnostics Inc
Priority date: 1989-07-19
Filing date: 1990-06-19
Publication date: 1994-03-10
Anticipated expiration: 2010-06-20
Also published as: EP0434800A1; JPH0743382B2; DK0434800T3; CA2019980C; WO1991001490A1; ES2048495T3; EP0434800B1; DE69004673D1; US5166079A; JPH04500860A; CA2019980A1; ATE97487T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Analysen zur Bestimmung von Analyten in Flüssigkeiten.
Viele Arten von Analysenelementen zur schnellen Bestimmung von Analyten in biologischen Flüssigkeiten sind in der Technik bekannt. Von besonderem Interesse sind trockene Mehrschicht-Analysenelemente, auf die man die Probe, z.B. einen Tropfen Blut, Serum oder Plasma, aufträgt und zu einer Reagenzschicht oder -schichten wandern oder diffundieren läßt. Als Resultat der Wechselwirkung zwischen dem Analyten und dem(n) anwesendem(n) Reagenz(ien) wird eine detektierbare Veränderung in dem Element herbeigeführt, die der Anwesenheit des Analyten in der Probe entspricht. Die detektierbare Veränderung kann ein Farbwechsel sein, der visuell beurteilt oder spektrophotometrisch abgelesen werden kann, z. B. mit einem Densitometer. Nach einem anderen Schema, basierend auf der Anwesenheit von fluoreszenzmarkierten, biologisch aktiven Substanzen, kann ein Fluoreszenz- Auslesesignal erzeugt werden und spektrofluorometrisch abgelesen werden. Derartige Analysenelemente sind von sehr großem Interesse, da sie der Verwendung in automatisierten analytischen Instrumenten angepaßt werden können.
In den automatisierten analytischen Instrumenten wird eine Probe einer Testflüssigkeit typischerweise in einer Probenschale bereitgestellt, und alle Schritte des Analysenverfahrens, einschließlich des Pipettierens eines abgemessenen Volumens der Probe auf ein Analysenelement, der Inkubation und der Ablesung des Signals, das als Resultat der Wechselwirkung(en) zwischen den Reagenz(ien) und den Probenanalyten erhalten wird, werden automatisch ausgeführt. Das Analysenelement wird typischerweise von einer Station, z.B. der Pipettierstation, zu einer anderen, z.B. der optischen Meßstation, durch eine Transportvorrichtung, z.B. ein rotierendes Karussell, transportiert, um eine automatische Ausführung der Teststufen zu ermöglichen.
Solche automatischen Analyseninstrumente sind in der Lage, viele Analysenelemente schnell zu prozessieren, und es ist nötig, ein sehr hohes Maß an Genauigkeit für diese Analysen zu erreichen. Jedoch können Ungenauigkeiten in den erhaltenen Resultaten durch eine Reihe von Faktoren verursacht werden. Zum Beispiel bringt jede Variation von Element zu Element in der Distanz zwischen dem optischen Meßapparat und der signalerzeugenden Spezies, während das Signal gemessen wird, eine Ungenauigkeit in die Resultate ein, genauso wie jegliche Variation von Element zu Element in der Dicke der Schicht, in der sich die signalerzeugende Spezies befindet, wenn sie abgelesen wird.
Die Regenzschicht(en) in dünnen Film-Mehrschicht-Analysenelementen kann (können) extrem dünn sein, das heißt, in der Größenordnung von ungefähr 0,01 mm oder weniger. Dementsprechend existiert, obwohl solche Schichten mit einem sehr hohem Maß an Genauigkeit aufgetragen werden können, dennoch eine leichte Variation von Element zu Element in der Dicke der Reagenzschichten. In ähnlicher Weise bestehen, obwohl die Transportvorrichtung ( z.B. ein Karussell) für die Analysenelemente innerhalb sehr exakter Toleranzwerte hergestellt werden kann, trotzdem einige leichte Variationen in der Instrumenten-Positionsantwort, für die entsprechenden Analysenelement-Positionen auf der Transportvorrichtung.
Es ist deshalb wünschenswert, ein Verfahren zu haben, das Signalungenauigkeiten kompensiert, die durch Variationen von Element zu Element in der Reagenzmenge und Variationen in der Instruinenten-Positonsantwort hervorgerufen werden, genauso wie solche, die durch andere Faktoren verursacht werden.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Diese und andere Punkte und Vorteile werden im Rahmen der Erfindung durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung der Menge eines Analyten in einer Probeflüssigkeit z.B. komplettem Blut, Plasma, Serum, etc. erreicht. Das Analysenverfahren wird mit einem Analysenelement ausgeführt, das mindestens eine Reagenzschicht und eine das Licht ausschließende Schicht enthält.Die das Licht ausschließende Schicht bewirkt eine Trennung einer optisch gebundenen von einer freien signalerzeugenden Spezies als Funktion der Menge des Analyten in der Probeflüssigkeit. Die signalerzeugende Spezies in dem Analysenelement wird optisch ein erstes Mal vor dem Auftragen der Probeflüssigekeit auf das Element gemessen. Anschließend wird, nachdem die Probeflüssigkeit auf das Analysenelement aufgetragen worden ist und die Wechselwirkung zwischen dem Probenanalyten und dem/den Reagenz(ien) in dem Element stattgefunden hat, die signalerzeugende Spezies ein zweites Mal optisch gemessen. Die zweite optische Messung wird ausgeführt, indem dieselbe Schicht des Analysenelements bestrahlt wird, die in der ersten optischen Messung gemessen wurde, und das mit derselben Wellenlänge.Es wird das Verhältnis des zweiten Signals zu dem ersten Signal festgestellt und mit dem für bekannte Mengen des Analyten verglichen, um die Menge des Analyten in der Probeflüssigkeit zu bestimmen.
Indem man das bei der Untersuchung gewonnene Signal auf diese Weise normalisiert, kann man die Variationen in der Reagenzmenge infolge von Variationen in der Reagenzschichtdicke von Element zu Element und auch Variationen in der Positionsantwort des analytischen Instruments kompensieren. Die Kompensation dieser Variationen ermöglicht eine signifikant verbesserte Genauigkeit des Analysenverfahrens.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Zum besseren Verständnis der Erfindung genauso wie anderer Gegenstände und weiterer Merkmale davon, wird auf die folgende detaillierte Beschreibung verschiedener bevorzugter Ausführungsformen davon verwiesen, in Verbindung mit der begleitenden Zeichnung, wobei die Figur eine teilschematische Ansicht eines Analysenelementes im Schnitt darstellt, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Analysenelemente, die bei dem erfindungsgemäßen Analysenverfahren verwendet werden, können alle geeigneten signalerzeugenden Spezies enthalten. Es können alle Lichtstrahlung emittierenden oder absorbierenden Markierungssubstanzen, einschließlich einer Markierungssubstanz, die mit einem Reagenz unter Erzeugung eines detektierbaren Signals reagiert, als signalerzeugende Spezies verwendet werden. Die Markierungssubstanz kann ein Fluorophor,ein Phosphor oder ein lichtabsorbierendes Material sein.
Das erfindungsgemäße Analysenverfahren wird im Hinblick auf eine bevorzugte Ausführungsform eines Analysenelementes, das hierfür verwendet werden kann, im Detail beschrieben. Bezugnehmend auf die Figur erkennt man ein Analysenelement 10, das ein dünnes Film-Mehrschichtelement darstellt, typischerweise mit einer Dicke von ungefähr 0,1 mm; es enthält eine transparente Unterlage 12, die in der angegebenen Reihenfolge eine Reagenzschicht 14, eine das Licht ausschließende Schicht 16 und gegebenenfalls eine obere Deckschicht 18 trägt, die als Reagenzschicht, als Filterschicht z.B. für Proteine, als Schutzschicht gegen Abrieb, usw. dienen kann. Die Reagenzschicht 14 ist sehr dünn, typischerweise mit einer Dicke von ungefähr 0,025 mm, und enthält einen Immunkomplex eines Bindungspartners des Analyten von Interesse und ein Konjugat eines markierten Analyten (derselbe wie der Probenanalyt, ein Analoges davon oder ein strukturell ähnliches Material, das an den Bindungspartner bindet). Der Bindungspartner, ein Antikörper, falls der Probenanalyt ein Antigen ist, ist in der Reagenzschicht 14 immobilisiert, indem er kovalent an die Oberfläche der Trägerschicht 12, welche aus jeglichem geeigneten Material wie z. B. Polyester oder Polystyrol, sein kann, oder an ein Matrixmaterial gebunden ist, oder dadurch, daß er physikalisch durch das Matrixmaterial festgehalten wird. Das Matrixmaterial kann ein hydrophiles Gelmaterial, wie Gelatine, ein Polysaccharid, z. B. Agarose, ein derivatisiertes Polysaccharid, Mischungen davon und ähnliches sein. Die das Licht ausschließende Schicht 16 kann jegliches geeignetes Material, z.B. Eisenoxid, Titaniumdioxid oder ähnliches in Dispersion in einem Bindermaterial, z.B. einem Polysaccharid, enthalten. Die gegebenenfalls verwendete Deckschicht 18 kann eine Anti-Abriebschicht aus einem Material, wie Polysaccharid enthalten oder kann vorzugsweise Puffer, blockierende und verdrängende Agentien usw. enthalten.
Das Analysenelement 10 kann auch eine Schicht oder andere Mittel (nicht gezeigt) zur gleichmäßigen Verteilung der Probenflüssigkeit über die Oberfläche der Deckschicht des Elementes enthalten. Es kann jede geeignete Flüssigkeitsverteilungstechnik angewendet werden, einschließlich, zum Beispiel, teilchenhaltige Schichten, Polymerschichten, faserige Schichten, Gewebeschichten und Flüssigkeitstransportsysteme, die in der Literatur als zu diesem Zweck geeignet beschrieben worden sind. Viele dieser Flüssigkeitsverteilungssysteme und Materialien zur Erzeugung einer gleichmäßigen Verteilung einer Flüssigkeitsprobe über die Oberfläche eines Analysenelementes sind in der Technik bekannt, weshalb eine ausführliche Diskussion dieser Materialien und Systeme hier nicht erforderlich ist. Ein besonders bevorzugtes Flüssigkeitstransportsystem ist in der gemeinschaftlich übertragenen, anhängigen Anmeldung Nr. 210, 732 vom 23. Juni 1988 beschrieben. Die Verteilungseinrichtung, ob sie nun eine Schicht aus faserigem Material, usw. oder ein Flüssigkeitstransportsystem ist, ist vorzugsweise relativ dick im Vergleich zu der Reagenzschicht 14.
In der Praxis wird die Markierungssubstanz, die in der Reagenzschicht 14 vorhanden ist, vor dem Aufbringen der Probe auf das Analysenelement optisch gemessen, indem die Schicht 14 mit der geeigneten elektromagnetischen Strahlung durch die transparente Trägerschicht 12 bestrahlt wird, um ein erstes Auslesesignal zu erhalten. Die Probenflüssigkeit wird dann über die Oberfläche des Analysenelementes verteilt, und die Flüssigkeit diffundiert in die Schichten 14, 16 und 18,sowie in jede(s) vorhandene(s) Flüssigkeitsverteilungsschicht oder Flüssigkeitstransportsystem, wobei sich ein Gleichgewicht einstellt. Der in der Probe vorhandene Analyt tritt nun mit dem markierten Analyten in der Reagenzschicht 14 um die verfügbaren Bindungsstellen auf den Antikörpern, die in Schicht 14 immobilisiert sind, in Wettbewerb, wobei der markierte Analyt davon abgelöst wird und durch den Probenanalyten ersetzt wird, und zwar in einem entsprechend gleichen Verhältnis zu den relativen Mengen von Probenanalyten und markierten Analyten. Daher wird, in Abhängigkeit von der Menge des Analyten in der Probe ein gewisser Prozentsatz des markierten Analyten, der ursprünglich an die in der Schicht 14 immobilisierten Antikörper gebunden war,davon verdrängt und in dem Rest des Analysenelementes verteilt. Die Menge an markiertem Analyten, die an die in der Reagenzschicht 14 immobilisierten Antikörper gebunden ist, ist zu jedem Zeitpunkt umgekehrt proportional der Menge an Probenanalyt.
Ein zweites Auslesesignal wird erhalten, indem die Reagenzschicht 14 durch die Trägerschicht 12 wieder mit der gleichen elektromagnetischen Strahlung, die in dem ersten optischen Leseschritt verwendet worden ist, bestrahlt wird, um ein zweites Signal zu erhalten, das umgekehrt proportional der Menge des Probenanalyten ist, das heißt, das Signal nimmt ab,wenn die Menge an Probenanalyt zunimmt. Da die Reagenzschicht 14 im Vergleich zu der gemeinsamen Dicke von Schicht 16 und 18 zusammen mit der Dicke der vorhandenen Flüssigkeitsverteilungsschicht oder des vorhandenen Flüssigkeitstransportsystem relativ dünn ist und da die das Licht ausschließende Schicht 16 alle elektromagnetische Auslesestrahlung daran hindert in die Schicht 18 oder irgendetwas darüber einzudringen, ist das zweite erhaltene Signal eine Funktion des markierten Analyten, der an die immobilisierten Antikörper gebunden ist und eines geringen Prozentsatzes an freien markierten Analyt, der in dem restlichen Analysenelement verteilt ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Verhältnis der Dicke der Reagenzschicht 14 zu der gemeinsamen Dicke der das Licht ausschließenden Schicht und des restlichen Analysenelementes zwischen ungefähr 1:20 und ungefähr 1:100 oder höher.
Es wird das Verhältnis des zweiten Signals zu dem ersten Signal ermittelt und mit dem für bekannte Mengen des Analyten verglichen, um die Menge des Analyten in der Probenflüssigkeit zu bestimmen. Das Verhältnis kann in der erhaltenen Form verwendet werden, oder es kann mit einer Konstante multipliziert werden, um -in Abhängigkeit von der jeweiligen Analyse- ein Signal zu liefern, das in einen gewünschten Bereich fällt.
Bei der kommerziellen Anwendung wird die Analyse vorzugsweise in einem automatisierten Analyseninstrument ausgeführt, das die Analyse automatisch durchführt und das Resultat speichert. Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Analysenverfahrens können Variationen in der Instrumenten-Positionsantwort und Variationen von Element zu Element in der Dicke der Reagenzschicht kompensiert werden, und es kann eine signifikant bessere Genauigkeit erreicht werden.
Die Erfindung wird nun hinsichtlich spezifischer bevorzugter Ausführungs formen weiter im Detail anhand von Beispielen beschrieben, wobei darauf hingewiesen wird, daß diese nur zur Erläuterung gedacht sind und die Erfindung nicht auf die hierin angeführten Materialen, Verfahren, usw. beschränkt ist.

Beispiel I

Es wurde ein Analysenelement hergestellt, das einen transparenten Polyethylenterephthalat-Träger enthält, der in der angegebenen Reihenfolge beschichtet ist mit:
1. einer Reagenzschicht, enthaltend ungefähr 500 mg/m² einer 3:1 Mischung von Agarose und Glyoxylagarose; ungefähr 72 mg/m² Bis-tris-propan-Puffer; ungefähr 10 mg/m² Antikörper gegen Theophyllin; und ungefähr 0,07 mg/m² fluoreszenz-markiertes Theophyllinkonjugat, dargestellt durch die Formel:
2. einer das Licht ausschließenden Schicht, die ungefähr 6000 mg/m² Eisenoxid, ungefähr 2000 mg/m² Agarose und ungefähr 50,4 mg/m² 2-Morpholin-ethansulfonsäure (pH 5,7) enthält; und
3.einer Deckschicht, die ungefähr 2000 mg/m² Agarose enthält.
Es wurden Testproben hergestellt, die verschiedene Mengen Theophyllin in einer Pufferlösung enthielten. Die Pufferlösung wurde hergestellt aus 50 mM Hydroxyethylpiperazinethylsulfonat (HEPES)-Puffer, pH 7.2, 150 mM Natriumchlorid, 10 mM EDTA und 1% Polygelin. Von jeder Probe wurden Vierfachbestiinmungen durchgeführt.
Jedes Analysenelement wurde in ein analytisches Laborinstrument eingeführt und bei 37 ºC ungefähr 2 min konditioniert. Das Testelement wurde dann durch den transparenten Träger mit Licht von 550 nm bestrahlt, und die fluoreszierende Emission bei 580 nm gemessen. Die Testprobe, ungefähr 10 ul, wurde dann auf das Analysenelement aufgetragen, welches weitere sechs Minuten inkubiert und dann wieder abgelesen wurde. Die erhaltenen Meßwerte sind in Tabelle I aufgeführt. Jeder dargestellte Meßwert ist der Mittelwert aus vier Messungen der Vierfachbestimmungen, die für jede Testprobe durchgeführt wurden. Der normalisierte Signalwert wurde erhalten, indem die durch Teilen des Naß-Wertes durch den Trocken-Wert erhaltenen Meßwerte ermittelt und mit einer Konstanten multipliziert wurden, die in diesem Fall 1.166 betrug. Tabelle I Theophyllin (ug/dl) Trockensignal (V) Trocken CV (%) Naßsignal (V) Naß-CV (%) Normalisiertes Signal (V) Normalisiertes CV (V)
Es ist ersichtlich, daß die Normalisierung des Signals in Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren eine signifikant verbesserte Genauigkeit bringt. Die Daten zeigen auch, daß die verbesserte Genauigkeit bei Theophyllinmengen quer durch den Analysenbereich (2.5 bis 40.0 ug/dl) erzielt wurden.

Beispiel II

Es wurde Analysenelement - ähnlich dem in Beispiel I gezeig-ten - hergestellt, wobei die Reagenzschicht ungefähr 20 mg/m² eines Antikörpers gegen Phenytoin enthielt, und ungefähr 0.15 mg/m² eines Konjugats, bestehend aus Phenytoin, gebunden an die in Beispiel I dargestellte fluoreszierende Gruppe.
Testproben, die 0.5 und 40 ug/dl an Phenytoin enthielten, wurden in einer Pufferlösung hergestellt, die der in Beispiel I beschriebenen entspricht, mit der Ausnahme, daß sie ungefähr 2 % BSA, ungefähr 0.01 % NaN&sub3;, ungefähr 0.01 % PNS und kein Polygelin enthielt.
Das Analysenverfahren entsprach dem vorher beschriebenen. Achtzehn Analysen wurden für jede Konzentration durchgeführt.Die erhaltenen Meßwerte sind in Tabelle II dargestellt. Der normalisierte Signalwert wurde durch Multiplikation des Verhältnisses von Naß zu Trocken-Wert mit 3.836 erhalten. Tabelle II Phenytoin (ug/dl) Trockensignal (V) Trocken-CV (%) Naßsignal (V) Naß-CV (%) Normalisiertes Signal (V) Normalisiertes CV (%)
Es ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Normalisierung des Signals eine signifikant verbesserte Genauigkeit ergab.

Beispiel III

Es wurde ein Analysenelement, das dem in Beispiel I dargestellten entsprach, hergestellt, wobei die Reagenzschicht ungefähr 15 mg/m² eines Antikörpers gegen Phenobarbital und ungefähr 0.15 mg/m² einem Konjugats, bestehend aus Phenobarbital, gebunden an die in Beispiel I dargestellte fluoreszierende Gruppe, enthielt.
Es wurden Testproben, die 0 und 5 ug/dl Phenobarbital in gepooltem menschlichem Serum enthielten, hergestellt. Das Analysenverfahren entsprach dem vorher beschriebenen. Drei Analysen wurden für jede Konzentration durchgeführt. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle III gezeigt. Der normalisierte Signalwert wurde durch Multiplikation des Verhältnisses von Naß zu Trockenwert mit 3.0 erhalten. Tabelle III Phenobarbital (ug/dl) Trockensignal (V) Trocken-CV (%) Naßsignal (V) Naß-CV (%) Normalisiertes Signal (V) Normalisiertes CV (%)
Die Resultate zeigen, daß die erfindungsgemäße Normalesierung des Signals eine signifikant verbesserte Genauigkeit bringt.

Beispiel IV

Es wurde ein Analysenelement, das dem in Beispiel I dargestellten entsprach, hergestellt, wobei die Reagenzschicht ungefähr 0.5 mg/m² eines Antikörpers gegen T4 und ungefähr 0.01 mg/m² eines Konjugats, bestehend aus T4, gebunden an die in Beispiel I dargestellte fluoreszierende Gruppe, enthielt.
Es wurden Testproben, die 0.0, 2.5 und 10.0 ug/dl T4 in Plasma (T4 depletiert) enthielten, hergestellt. Das Analysenverfahren entsprach dem vorher geschriebenen. Zwölf Analysen wurden für jede Konzentration durchgeführt. Die Resultate sind in Tabelle IV gezeigt. Der normalisierte Signalwert wurde durch Multiplikation des Verhältnisses von Naß- zu Trocken-Wert mit 3.0 erhalten. Tabelle IV T4 (ug/dl) Trockensignal (V) Trocken CV (%) Naßsignal (V) Naß-CV (%) Normalisiertes Signal (V) Normalisiertes CV (%)
Die Meßwerte zeigen, daß eine signifikant verbesserte Genauigkeit durch die erfindungsgemäße Normalisierung des Signals erzielt wurde.
Obwohl die Erfindung im Hinblick auf spezifische vorgezogene Ausführungsformen beschrieben wurde, soll sie nicht hierauf beschränkt werden; vielmehr ist für den Fachmann ersichtlich, daß Väriationen und Modifikationen durchgeführt werden können, die im Sinne der Erfindung und im Rahmen der beigefügten Patentansprüche sind.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit eines Analyten in einer Probenflüssigkeit, welches (folgende Schritte) umfaßt:

(a) Verteilung einer Probe der Flüssigkeit über die Oberfläche eines Mehrschicht-Analysenelements, welches enthält:

i. eine das Licht ausschließende Schicht, die für die Flüssigkeit durchlässig ist; und

ii. eine Reagenzschicht, enthaltend eine signalerzeugende Spezies;

(b) Gewinnung eines Auslesesignals durch Bestrahlung der Reagenzschicht mit elektromagnetischer Strahlung, die im Absorptionsbereich der signalerzeugenden Spezies liegt;

(c) Bestimmung des Verhältnisses zwischen dem Auslesesignal aus Stufe (b) und einem Auslesesignal, das durch Bestrahlung der Reagenzschicht mit der gleichen elektromagnetischen Strahlung wie in Stufe (b) vor der Verteilung der flüssigen Probe in der Stufe (a) erhalten wurde; und

(d) Vergleichen dieses Verhältnisses mit dem Verhältnis, das von bekannten Mengen des Analyten erhalten wurde, um die Menge des Analyten in der Probe zu bestimmen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Analysenelement weiterhin einen Träger enthält, der für die elektromagnetische Strahlung durchlässig ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Reagenzschicht einen immobilisierten Bindungspartner für den Analyten enthält und die signalerzeugende Spezies ein Konjugat einer Markierungssubstanz darstellt, die mit einer Gruppierung verbunden ist, welche in der Lage ist, sich an den Bindungspartner zu binden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Gruppierung, die mit der Markierungssubstanz verbunden ist, den Analyten oder dessen Analoges darstellt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Markierungssubstanz fluoreszierend ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Analysenelement weiterhin eine Deckschicht enthält, die über der das Licht blockierenden Schicht angeordnet ist.

7. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Verhältnis zwischen der Dicke der Reagenzschicht und der des Restes des Analysenelements etwa 1:20 bis etwa 1:100 oder mehr beträgt.