JPS5977356A - 螢光アツセイ用多層分析要素およびそれを用いる螢光アツセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生化学的課程で重要な役割を演じる物質あな
いは生物体由来の種々の物伸（特定成分）を、これと特
異的に結合しりｂ蛋白を用いて、競争的結合反応により
、これら物質の存在濃度を螢光アッセイ法によって測定
するのＶζ適した乾式多層分析要素に関する。

臨床検査分野において、検体液に数種の反応試薬溶液を
加え、検体中の特定成分の＃＃を測定する各種の方法は
古くから知られている、これらの方法においては、測定
結果の再現性を高める上で反応試薬を正確に計量した上
で十分混合しなければならないし、またある場合１ハ遠
心分離によって汁澱と上澄液を厳密に分別しなければな
らず、高度の熟練を必要々する。

このような従来の方法に代わって、全ての操作を自動化
することにより、高度の熟練を要すること庁し十分高い
再現性をもたらす装置が開発されている。これらの自動
化された分析機器は、多量の検体を１ｌｌｌ定す）−に
は便利・であるが、装置が非常に高価であかことが大き
な欠点であるにのような自動化装置に代り、実°府上、
反応試薬溶液の供給を必要とせず、従って、熟練を要し
ない簡単な測定法とし、て、反応試薬を含有せしめた多
層分析要素が提案されている。

これらの多層分析要素は、前述の自動装置に比して極め
て安価であるという特色をもっている。

今寸でに、化学反応あるいは酵素反応を利用した多層分
析要素には種々の工夫がなされているが、このような多
層分析要素で微量の成分や構造特異性の高い成分を測定
することは困難であった。

このような成分を分析するために試薬溶液を用いる方法
では、例えば、免疫学的反応を応用することが知られて
いるが、このような免疫学的反応試薬を内蔵した多層分
析フィルムについては、近年ようやく二、三の提案がな
されたにすぎない。

従来公知の多層分析フィルムは、これに免疫学的反応を
適用しようとすると、免疫学的分析に固有の問題から満
足な分析結果を得ることが難しい。

免疫学的分析において高感度の分析結果ｆＫ得るために
最も重要なこさの一つは、免疫学的分析に必要な少量の
試薬液を、多層分析シート中にいかに短時間で吸収させ
、いかにして抗原−抗体反応を行うに十分な時間これを
保持できるかということであった。本発明者等はこのよ
うな観膚から従来公知の多層分析フィルム、例えば、特
公昭ｊ３−．２／Ａ７７（米国特許第３．９９．２．／
！８’号）、特開昭！ｌ−グ０／９／号（米国特許框グ
、Ｏグコ、３３ｊ号ン、同、ｔＡ−，２弘ｊ７Ｊ号、同
！！−９０１６９号（米国特許１１，２３１．０θ／号
）、同！；３−／３１０１９号（米国特許≠、７１ら３
０Ａ号）等に記載の多層分析フィルムについて検討した
が、いずれの場合も試料液の吸蔵保持に滴定すべき結果
が得られず、当然の結果として、ｄ（１１定梢度や検出
感度、分析の迅速度Ｖｃｔ、−いて問題があて）た。

そこで本発明者等は、特定成分（アナライ））をこれと
特異的に結会しうる蛋白と反応させる反ＬＦ、−、層と
物質の存在濃度に対応して変調された信号体を受容する
検出層を有す、る検出部材を積層一体化して’ｔ）−／
−多層分析要素を案出しく％願昭Ｊ４−に１１；に５５
号）、試料液の吸蔵保持の問題を解決した。この多層分
析要素に訃いては、反応層ｌ（おいて競争的抗原−抗体
反応が行われ、反応した標識複合体σ３）は反応層にと
どまるが、未反応の標識物（Ｆ）はその下に位置−する
検出層に拡散滲透して行きそこで光学的に検知される。

従来の′＄層分析フィルムに比べると、充分量の試料液
を競争的抗原−抗体反応に関与せしめることができおこ
の多層分析要素は、高感度でかつ高い再現性を確保する
ことズ１くできら。この方法は、免疫学的分析ＶＣオい
て分析の迅速化、簡素化を阻む一つであった反応した標
識複合体（Ｂ）と未反応の標識物（Ｆ′）との分離（い
わゆるＢ／１゛分離）を抗原−抗体反応の進行と同時に
多層分析要素内で完遂でき々という点でも、免疫学的分
析の問題点を解決するものであつ１ζ。

免疫学的分析においては、Ｂ／’Ｆ分離の必要性クツ・
ら、種々の困難があった。寸ず、Ｂ　／　Ｆ分離操作自
体これ全満足すべき程度に笑施することが困難であり、
かつ、和尚の時間を要ｆる。！り、連続自動操作［Ｂ　
／　ｌ”分離を組みこむことが難しいばかりでなく平衡
状態のま＼でＢ／Ｆ分＾［ｔを遂行することも回前であ
る。このようｌ　ｒｉ　／　Ｆ　分ＮｅｔＤ困難さけ分
析操作に熟練を要求り１、一方では分析結果の信頼性を
減じる結果となる。そこて゛特開昭ｊｔ３−７９０２４
１号及び特開昭６３−３ＦＦ’ＡＩ？ＴｌｃおいてはＢ
／Ｆ分離を行うことｉく、１−なわち、反応した標シＲ
複合体（Ｂ）と未反応の標識物（Ｆ）とを分離すること
な（ル応混合物のオま、標識としての螢光を４１１１定
する分析方法が提案された。この分析方法Ｃコ、抗原−
抗体反応一般に広く適用できるものではなく、反応した
標識複合体（１３）の螢光が未反応の標識物（０の螢光
よりも強い又は弱いという特殊な系に訃いて初めて実現
できたものである。しかしながら、この方法ＶＣ，１，
；−いては、同時に背景の螢）ｔをも測定するためにノ
イズが多く８７Ｎ比が低くなる欠点を免れない。加えて
、反応試薬の正確′ｆ：ｒｉ、１．Ｍを含む高度の熟練
を必要とするし、自動化装置にこの方法を組み込むこ、
Ｌ−に’よって操作を簡便化できるとしても、自動化装
置が非常に高価であるために新たな不都合を生じろ。

不発明者寺は、上記のような従来技術における欠点が、
前記８　／　Ｆ分離を多層分析要素内で実現すること、
そのためしでは多層分析要素を特定の層構成となるよう
に工夫することによって解消することを見出した。

本発明の目的幻、ノイズが少なく従ってＳ／Ｎ比の高い
多層分析要素を提供することである。

本発明の他の目的は、Ｂ／Ｆ分離をその内部で遂行し、
反応した標識複合体（］３）の信号を直接測定すみこと
ができる螢光アッセイ用の多重合分析要メ（を提供する
ことであろ２ 本発明の多層分析要素は、 （ａ）　　アナライト成分もり、　（ｆ’ｌその類縁体
の螢光標識物の一定量を含有させた繊維乃又は非繊維質
多孔性展開シート （ｂ）　　多孔η分配シート 及び （Ｃ）　　アナライトを′特異的に結合１°る蛋白の一
定量を固定化して含有させた多孔貿及応シート をこの順序に積層して構成さ′ｉ’を小「アナライト成
分とけ、分析対象物たるアナライトと同一種類の成分を
意味すす、たとえば、液体試料中のアナライトがチロキ
ノンであめ場合Ｃては、アナライト成分としてのチロキ
シ／を螢光標識したものの一定量が未知濃度のチロギシ
ント競争的抗原−抗体反応ＶＣ付される。アナライ！・
成分の類縁体も競争的抗原−抗体反応＆′Ｃｌ９Ａ４し
てアナライＩ・成分と同様に螢光イムノアッセイに使用
す々ことがで０るの−Ｃ１以下「アナライト成分」とい
うときｖトそい類縁体をも含むものと１７てこの術語♀
１史１’Ｆ＝　−ｒ　、’−０ 本所、明の分析動索１：Ｉ、水性ｊ＋Ｊｔ科液中のア六
ライトと、このアナライトに対して特異的に結合丁々ｉ
ｆｉ白の一定量及びこの蛋白に対して反応性を有し、か
つ、このアナライト成分の螢光標識物の一定量の共：（
Ｖト、ｒｌｉＪ　ｉｉ己アナライト成分の螢光標識物上
を競争的に結合反応させ、その結来得らｎ々該結合）１
２１ｇ市白と反応し、た螢光標識複合体の）を未反応の
螢光標識向（Ｆ）から分〜１ｔ−１次いで螢光標識複合
体（１勺の螢う′Ｌ強要分測定する螢光゛アッセイに用
いられ、上記反応した螢光標識複合体（Ｂ）と未反応の
螢光標識ｌ吻（↓・）との分離（以下「Ｉ：３　／　Ｆ
分離」と称することかあ／−）が、多孔質分配＞　−）
　（ｂ）　（以下「分配シート」と略記ンの存在によっ
て多層分析要素内で実現されることを特徴とする。

分配シートは、未反応螢光標識物（Ｆ）を、アナライト
と特異的ＶＣ結結合る蛋白の一定墓牙固定化して含有さ
せた多孔質反応シート（Ｃ）（以下「反応シート」と略
記）とけ異なった空１’＋ｔ−１に分配させる機能を有
する。

ここに「分配」とは、未反応の帯つ「の標識物（Ｆが反
応シート及び反応シートとは夕Ｉ＋、　？る空間に存在
する現象をいう。後に詳８Ｃすみように、未反応の螢元
標識物促）が分配シートへより多く分配されるように多
層分析層を設削゛することげより、未反応の螢光柳識物
口はヂ質上反応シートとは異なる空間に存在［２、反応
シートには反応した螢光標識複合体の）が存在すみ状態
とな々がら、実質上Ｈ／Ｉ・分離が寅現されて反応した
螢Ｍ：、椋識襟合体（１３）の螢光強度を知ることがで
きる。

従って、本発明に卦いて「分陣」とけ、試料液体が多層
分析要素の即位面積肖すｕ、ぼ一定の割合で分布する第
一段階（ここでは試料液体中のアテライトカ：多層分析
要素全体に均一分布さｎ、た状態となおときもｒ１展開
シートに含有されているアナライト成分の螢光標識物も
試料潜体のｕ体に溶出され、アナライトと共に多層分析
要素全体に均一分布された状態となる）を経て、反応シ
ート内でそこに到？したアナライトとアナライト成分の
螢−）Ｙ；標識物とが反応シートに予め固定されて含有
され々！Ｐ、ｌｒ異結合・件ボ白と競争的な結合反応を
生じて螢光標識複合体（Ｂ）　ｆＫ反応シート中に生成
する第二段階のり象が起り、螢光標識複合体（１３）が
未反応の＠光標蹄物（■）から分離される、結果として
の分離を指称す々。上記第、−及び第二段階の現象は段
階的に生じみのではなく、試料液体を多層分析要素の展
ｍＪシート上に滴下ま、たは点着−すると、上記の如き
現象がミクロ的ＶＣ″！！しり合って起るものと思われ
、一定時間（イ／キュベーション）の後に実’Ｓ（−ヒ
］３／Ｆ分離が達成されたと同じ状態を呈するのである
。

反応シートｖコ、そこに固定されている特異結合性蛋白
ｆ対し、螢光標識されたアナライト成分とアナライトと
′を競争的に結合反応させる空間を提（Ｂする機能を有
すみ。鐙争的結合反応が行われる結果、反応シートでは
光学的ＶＣ検知可能な螢光標識複合体（Ｆ３）が生成〔
２１、このΦ合体（Ｂ）は、上記の如く、反応シートと
は妥なつ／と’２　＋＝」である分配シートに分配され
た未反応の螢光標識物（１−）かｌコニ；％　ｔｙ上分
離さイア、た状態にある。ここＫい９「天辿上分＃Ｉ＃
　Ｊけ、螢光標識複合体（１３）！’Ｊ反応シーｉ・の
みに存在するが、未反応の螢光標識物ψ゛）４１反比・
シートと（７異なった空間に分配される結果、その大部
分は反応シートとは具なる空間（展開シート及び分配シ
ート）Ｋ存在するが、一部分は反応シートにも存在する
場合をも含む。反応シート中に存在すか未反応の螢光標
識物ω゛）は、僚台体回の螢元測光例おいて前者の螢光
強度のプラスアルファを土ｔａｒみしたものとして螢光
強度を実測丁なことＷなる。こうして得られた螢光強度
の実測値を・予め得られた検量線にブロンＩ−ｔ、でア
ナライトの量全知ることスハでき／−６ 分配の割＠を反応シートと龜異ｌり空間に対して高くな
；ｂ−ように分析姿素を殻「１°づ−れは、反尾、シー
ト中における未反応の螢光標識物０（゛）の１ｉｌｌｌ
ブ［及ぼ丁形１ｉ！４ケ無視し得；ｂ程度に低減するこ
とも可能であり、これは好ましい不発明の態様である。

未反応の螢光標識物Ｃ）の反応シート及びこれと異なる
空間への分配に、反応シート及びこれと異なる空間を提
供する各シートを構成する材料の種類、層厚及び相対厚
さ、アナライトや螢光標識されたアナ°・イト成分の各
シートの構成材料に対するアフィニティ等によって異な
るが簡便な方法として反応シートと分配シートそれぞれ
に保持される液体の悴、すなわち保液量によって調節す
ることができみ。

ここに「保液量」とは、イードの体積に空隙率を乗じた
ものであ々。本発明ＶＣおいてＨ１分分配シート中応シ
ートの保液ｉｋが１０：／がら。。ｊ：／の範囲にあれ
ば前記冥質上の分離の目的が達成される。反応シートの
保液−３ｆ−に対して分配シートのそれが大きくな／−
に従って、未反応の螢光標識物（Ｆ）はより多く分配シ
ートに分布さｎ、上記保液ｍ比がｊ二／がらｌ：／の範
囲にある場合は特に好１１−い。保液量比が／より小さ
くなると、Ｌ１／Ｆ分離の実効かあからなぐｌすＳ／Ｎ
比が小さくなる。逆に保液量比が／θを超えると、多層
分析要素を製造−ｊる場合ｖｃ種々の困難を伴うので好
ましくない。

保液量比を上記の範囲とするＶＣは、分配シート及び反
応シートが同じ素材の場合、保液量比は各シートの厚さ
によって決ま／−ｏ　しかしながら、たとえ分配シート
対反応シートの厚さが／：／であっても、分配シートの
厚さ当たりの保液量を反応シートのヤれよりも高めるこ
とにより、あるいは、分配シート中に反応シートに固定
されている蛋白とは異なる蛋白（結合定数が小さいもの
ンを含有せしめておくことにより、未反応の螢元標識物
任）がより多く分配シートの方に分布するように分配の
拡大を図ることもできる。

分配シートは展開シートと反応シートとの間に設けら扛
、繊維質多孔性材料からなる。

繊維質多孔性材料としては。パルプ綿、絹、羊毛のよう
な天然繊維、セルロースエステル、ビスコースレーヨン
のような半合成繊維、ポリアミド（例、６−ナイロン、
Ａ、７−ナイロン、ｔ、１０−ナイロン）ポリエステル
（例、ポリエチレンテレフタレート）ポリオレフィン（
例、ポリプロピレン）のような会成繊維、更に繊維質無
機材料。

例えば、ガラス繊維、着色・ガラス繊維１石綿等を織物
、フェルト、不織布などの形にして用いることができ、
あるいは、水透過性の紙などを用いることができるつ 分配シートに用いることができる織物としては。

植物、動物及び鉱物などの天然繊維、無機、再生。

半合成及び合成などの人造繊維から得らｎる広範囲の種
類の織物がラリ、織物組織のうちでは、たて糸とよこ糸
とで織った平織が好ましい。平織を構成するたて糸およ
びよこ糸としては、λＯ番手から／２０番手の範囲が好
ましい。平織織物のうちでは、細布、全血、ブロード、
ボブリンとよけれる種類の綿織物が好ましい。これらと
同じ織ｐ方をした天然繊維（カポック、亜麻、大麻、ラ
ミー、絹等）または化学繊維（ビスコースレーヨン。

銅アンモニアレーヨン、セルロースアセテート、セルロ
ーストリアセテート、ビニロン、ポリエチレンテレフタ
レート等）と綿との混紡織物、化学繊維糸を用いてこれ
らと同じ織り万全した織物も用いることができる。

分配シートに用いることができる紙としでは、水透過性
であれば広範囲の種類の紙が用いられる。

具体的には１例えば、Ｐ紙を用いることができ、厚手で
目の粗いｐ紙が特に好ましい。インディアン紙、こうぞ
、みつまたなどのオロ紙も用いることができる。天然セ
ルロースの紙ばかりでなく１合成高分子の繊維をすいて
紙状にした透過性を有する合成紙や１石綿、ガラス繊維
沢紙も分配シートの素材として用いることができる。

上記材料には更に微粒子を混入してと扛を分配シートと
することができるうと才り等の微粒子は。

繊維質多孔材料の空隙を埋め、液の浸透を等方的にする
働きを有する。このような微粒子としてはアガー、アガ
ロース、セファロース、セファテックス、デキストラン
などの多糖類、ポリアクリルアミド、セルロースパウダ
ー、又は重合可能なエチレン系モノモー、重合（又は共
重合）にょシ形成されたラテックスなどの非繊維質微粒
子を使用することができる。アガー、アガロース、セフ
ァロースのような非繊維質微粒子は、シートの厚さ轟た
シの保液ｔ’を増大させ、ることもでき１分配シートの
厚さを厚くすることなく分配拡大を実現できる。このよ
うな微粒子成分は分配シートの全重量に対して約り０重
量％まで使用することができる。

分配シートの厚さを厚くすることなく分配拡大を実現す
る他の態様として１分配シートに反応シートに固定され
ている蛋白よりも螢光標識物との結合１）が弱い（例え
ば／　ｏｌ、ｉ　ｏ７１／ｍｏｌ　　程度の結合定数を
有する）蛋白、例えば、血清アルブミンや血清グロブリ
ンを物理的又は化学的に固定しておき、これによって未
反応の螢光標識物（Ｆ）ｅ分配シートへより多く分配さ
せる方法も採用することができる。

分配シートへの蛋白の固定化は反応シートにおいて用い
らｎると同じ固冗化の技術を用いて行なうことができる
。

分配シートの厚さは、所望の分配の程度、すなわち、簡
便な方法としては、所望の保液量にょシ決定されるべき
ものであるが、一般には約／　００　ｔｔｒｎから約２
０００μｍ１好ましくは２００μｍがら１０００μｍの
範囲でるる。

展開シートは分配シートの上に設けらち、繊維質又は非
繊維質多孔性材料からなる。

展開シートはアナライト成分の螢光標識物ヲ一定量を含
ませておくことができる。この場合、展開シートはアナ
ライトを含む試料成体を均一に展開させると同時に試料
液体中にアナライト成分の螢光標識物を溶出してこれを
同じく均一に展開させる機能を有する。

溶出した螢光標識物を含む試料液体を隣接する分配シー
トおよび反応シートに均一に導くには、滴下または点着
された試料液体が先ず、展開シート上で面方向へ迅速に
拡がると共に、展開シート中に含まれている１種々の試
薬（たとえば螢光標識物、緩衝剤他）を俗解することが
必要である。

次いで、多孔質材料からなる分配シートおよび反応シー
トの毛細管現象によって、試料液体は除々に之等の隣接
するシートに導かれる。分配シートや反応シートの毛細
管現象による吸液性が強すきると重量した試薬は分配シ
ートおよび反応シート上で均一に分布しない。またこの
吸液性か弱すぎると１分配シートおよび１反応シートに
均一に展開しない。従って展開シートとして１分配シー
トや反応ノートに比べて、毛細管現象による吸液性がよ
り大きくなるような多孔質材料を用いることによって、
−ｈ記の展開シートの機能を実現することができる。

一定容敵の試料液体に予め、一定量の螢光標識物を俗解
混合した液ゲ滴下または点着する場合には、分配シート
および反応シート上で、該螢光標識物を均一に分布（展
開）させることが容易である。

展開シートは液体の均一展開を図るためのものであるか
ら１滴下または点着さｔ″Ｌ、た液体がぞの内部−保持
さｎることなく反応シートへ送シこま扛るのが望ましい
。特に試料液体が微量である場合には、展開シート中に
とどｌる液ｇ′を可及的に少くすることが整寸しい。そ
のためには、＠下または点着される試料液体全般の少く
とも７０　”；’ｏ以上が分配シート及び反応シートに
送りこ＝ｎることか望ましい。換言すγしは、展開シー
トにとどまる液量は全液量の３０％以下であることが望
ましい。

このような条件を満足する展開シート用材料として、非
繊維質等方性多孔質耐相及び繊維質多孔性材料、を用い
ることができる。

非繊維等方的多孔質材料としては、プラッシュポリマー
（一般名メンプランフィルター）、珪藻土または微結茜
材料（例えば微結晶セルロース）などの微多孔体を結合
剤中に均一に分散した材料。

ガラスや甘酸高分子物質の微小球形ビーズを相互に点接
触９゛せて結合剤で保持した多孔質材料。

ＴｌＯ２またはＢａＳＯ４等の微小粉末を均一に分散さ
せたプラッシュポリマーなどがある。

繊維質多孔性材料としては、分配シートの素材として例
示したと同じ材料を使用することができる。

展開シートの材料として殊に好ましいのは繊維質多孔性
材料のうちの織物である。特に水洗した織物または親水
化処理を施した織物は展開シート用材料として優ｎてい
る。、 このような親水化処理した織物としては、十分に洗浄水
洗して脱脂して乾燥した織物、洗浄水洗脱脂した後に界
面活性剤、湿潤剤、親水性ポリマー、またはＴ　ｉ　０
２またはＢａＳＯ４倣粉末を分散し／こ親水性ポリマー
全少を官浸させた織物がある。親水化処理した織物を展
開シートとして用いる技術および織物の詳細については
特開昭ｊｊ−／ｌ、１１３ｊｆ６号（未口特許第≠１２
タコ、２７．２号）明細臀に具体的に詳細に記載さＥて
おり、その記載に従って不発明に適用することができる
。

展開シートの厚さは一般に約！０１１ｍから約５００μ
ｍ１好ましくは杓子Ｏμｍから約３０θμｍの範囲でろ
るウ アナライト成分の螢光標識物の一定量を展開シートに含
有させることは、−足置（主としてアナライトの種類に
よって決定される）の螢光標識物の水溶液中に展開シー
トを浸漬（いわゆるパッシング処理）した後自然乾燥ま
たは凍結乾燥するか。

展開シートに一足濃度の螢ブＣ標識物を筒下し１−これ
をその内部へ浸透させた後、漕法によシ自然乾燥または
凍結乾燥全行なう等の方法によって笑現さｎる。このよ
うな方法で含有さｎるアナライト成分の螢光標識物は、
試料数体と接触し７たときに容易に遊離して試料液体中
に溶けこみ、展開シートの均一展開作用によってその中
のアプライドと共に分配シート及び反応シートに送りこ
捷才１．る。

こうして反応シートに到達したアナライト及びアナライ
ト成分の螢光標識物はそこに固定化ＩＴｈた特異結合性
蛋白との競争的納会反応に関与する。

アナライト成分の螢光標識物は常法艮よりアナライト成
分に螢光物質全直接あるいは二官能性化＠物（例えばア
ミノ酸、ジカルボン酸化合物類。

ジアミノ化合物類など）′ｆｔ、介して間接に反応させ
て合成することができる。この上うな合成法は種々のア
ナライト成分について種々報告されており。

当聚界では良く知ら２’しているが、たとえば、「臨床
検査技術全書ｔ　免疫血清検査」　（河合忠編集。

医学書院、ｌり７７年刊）り７頁ないし７０２頁記載の
万人、及び特開昭ｊ３−７り０２’１．％開昭ｊ３−／
１７２夕２．２　、　Ｂｉ、ｏｃｈｅｍＪ３ｉ　ｏｐｈ
ｙｓ　、１（ｅｓ　。

Ｃｏｍｍｕｎ　、　７　’ｌ　、　！　、３１　（／り
７７　）　Ｃｌ１ｎ、ｌ：ｈｉｍ。

Ａｃｔａｌ　３　、／乙／（／り７１ｒ）に詳しい。

いず才りの合成法によるにしろ、螢光標識さｎ′ｆｃア
犬ライトライト成分応シートに固定化されている蛋白に
対する反応性を失ってはならない。前記の二官能性化合
物を介するアナライト成分と螢光物質との間接的結合は
固定化蛋白との反応法全維持するためにしばしば適用さ
ｎるテクニックであシ１本発明においてはそのような螢
光標識物上アナライト成分の類縁体の螢光標識物という
。またさらに１反応シートに固定化さ扛り蛋白との結合
反応においてアナライトとの競合全効果的に行わせるた
めにあるいは醍解性を改善するために種々の官能基を結
合反応に関与しない部分に導入することもこの分野では
よく用いら扛るテクニックであシ、このようなものも類
縁体の螢光標識物と称する。

代表的な螢光物質としては、フルオレセインインチオシ
アン酸（ＦＩＴＣ）、メチルローダミ７／、ウンベリフ
ェロン、Ｎ−メチル−２−７ニリ／−６−ナフタレ／ス
ルホネート１、ε−Ｃｊ−（ジメチルアミノ）ナフタレ
／−／−スルホニル〕す／ン１等がある。

アナライト成分の螢光標識物は、競争的結合反応の過゛
程で反応シートに固定化されている特異結合性蛋白と結
合し螢光標識複合体（Ｂ）’に生成する。螢光イムノア
ッセイにおいては、この螢光標識複合体（Ｂ）又は未反
応の螢光標識物（Ｆ）の螢光強度が測定されるのである
が、特殊な場合として、抗原−抗体反応の前後における
螢光強度の変化を利用してアナライトの定量全行なうこ
とが知られている。すなわち、抗原−抗体反応後の螢光
標識複合体（Ｂ）の螢光・強度が増強される系（例えば
特開昭ｊ３−７りＯ−１号に記載の系）があシ、逆に抗
原−抗体反応後に螢光強度が弱くなる系（例えば特開昭
５３−３に６１り号）が知られている。

本発明においてに、上記いずれの反応系に対しても適用
できる０勿論、抗原−抗体反応の前後において螢光強度
が変化しない系（従来法ではＢ／１．１分離なしでに螢
光イムノアッセイは不可能であるとされている）をも適
用することができる。

アナライト成分の螢光標識物のほか、展開シートにはさ
らに以下に示す螢光アッセイに必要な及び／又は望まし
い公知の試薬成分その他を適宜含１せることができる。

（１）　　ブロッカ−試薬 分析されるべきアナライトが血清中の高分子成分（たと
えばアルブミン、プロプリン成分など）と相互作用し、
このま１では（たとえば特異結合反応）を生起し得ない
状態例えば、Ｔ４とアルブミンが結合した状態にある場
合がある。あるいｒ４、アナライト成分の螢光標識物が
血清成分と相互作用し、本来の特異結合反応性（たとえ
ば抗原−抗体反応性）が損われることがある。アナライ
ト又は螢光物質と血清成分とのこのような望ましくない
相互作用を解除したりあるいは弱めたりする作用をもつ
試薬（ブロッカ−試薬と呼ばれている）を含有させる。

典型的なものはｔ−アニリノ−／−ナフタレンスルホン
酸（ＡＮＳ）、チメロザール、サリチル酸である。

（２）緩衝剤 ブロッカ−試薬の作用を最大限に発揮できるｐ）Ｊ（４
〜／／）、結合反応及び螢光測定に適し７（ｐｉｆ（７
〜１０）、アナライト成分の螢光標識物をニジ助出よく
分配シートに集めるに適したｐ　Ｈ（７〜ｉｏ）等を達
成するため、種々の緩衝音りを含４Ｊさせる。

用いることができる緩衝剤として、日本化学会編１−化
学便覧　基礎編」（東京、丸善■、１７６６年発行）第
１３／２−／３２０ページ、１”Ｂｉｏｃｂｅｍｉｓｔ
ｒｙｌ　　ｊ（２）＋！ｉＧ７　　’１７７（／りＡ　
Ａ　）　（Ｎ、Ｅ、Ｇｏｏｄ　　ｅｔ　　ａｌ。

［１ｙ（ｌｒｎｇｅｎ　　Ｉｏｎ　　Ｂｕｆｆｅｒｓ　
　ｆｏｒＢ　ｉ　０１０　ｇ　ｉ　ｃ　ａ　Ｉ　　）も
ｅｓｅａｒｃｈＪ）、および「７〜＋＋ａｌｙｔｉｃａ
ｌ　　ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　　１０’１．３００−３
１０（／り１０　）（Ｗ、Ｊ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎｅｔ　
　ａｌ、　　　ロー１ｙｄｒｏｇｅｎ　　Ｉｏ’ｎ　　
Ｂｕｆｆｅｒｓｆｎｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈＪ）等の文献に記載の公知の緩衝剤があ
る。緩衝剤の具体例として、グリシン、ホウ酸塩、リン
酸塩、ノ（ルビツール等を挙げることができる。

（３）保恒剤 特異結合性蛋白の腐敗防止、吸湿防止、ＦＪ、′ｉＩＩ
Ｍ、的の目的で含有させる。例えば、アジ化プ゛トリウ
ノ・がある。

（４）溶解あるいは展開助剤 上記の如き各試薬成分の溶解を補助すると共に・これら
を迅速力・つ均一にシート内に展開させるだめ、易水溶
性の固形分（たとえは、サッカロース、アミノ酸、グリ
セリン等）あるいは種々の界面活性剤、、（ｉとえば、
アルキルベンゼンスルホンｍ＋トリウムなどの陰イオン
性界面活性剤、ポリエチレングリコール系の非イオン性
界面活性剤など）（５）その他色反応を防止して抗原−
抗体反応を安定に進行させ、精度ならびに再現性を向上
させる目的でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血
清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン等を含壕せるのが好
ましい。

上記の試薬その他の成分のうち、ブロッカ−試薬は展開
シートに含有させるのが望咬しいが緩衝剤、保恒剤、及
び展開助剤は目的に応じて分配シート及び／又は反応シ
ートにも含Ｍさせることができる。

分配シートの下に更に反応シートが設けられる。

反応シートハ、アナライトとアナライト成分の螢光標識
物とに対して競争的結合反応を生起する、特異結合性蛋
白の一定量を固定化して含有しておシ、分配シートにつ
いて例示したと同じ繊維質多孔性月利をその素材として
用いることができる。

特異結合性蛋白はアナライトとアナライト成分の螢光杼
識物との競争的結合反応に関与する蛋白であり、代表的
なものは抗１体である。この特異結合性蛋白は、アナラ
イトが決１ればこれに特異的に反応するものとして自動
的に決まるものであシ、常法によって反応シートを構成
する素材に物理的（吸着）又は化学的（共有結合あるい
は非共有結合）に固定される。

固定化によって特異結合性蛋白を反応シートに含有させ
る方法として、（１）繊維質多孔性材料に、物理的手段
（吸着等）又は化学的手段（共有納会等）により、イム
ノグロブリンアミノ基あるいはカルボ′キシル基を介し
て直接に結合させる〃・、あるいはリンク成分を介して
間接に結合させる方法、（２）微粒子成分を混入する場
合には、予め蛋白を微粒子（アガロース等、分配シート
を構成する繊維質多孔性月利に混合する微粒子として例
示したものと同じ）を微粒子成分に共有結合又は吸着に
よって、あるいはＦｃフラグメントを特異的に結合する
ようなリンク成分（例えば、第２抗体、プロティンＡな
ど片介して含有させる方法等がある。

このような固定化のＰ却１は特開昭ｔ／、７−／ざ５２
７号に記載されている。

反応シートに固定化される蛋白は、一般に１０７〜１０
　　ｍｏｌ／ｌの結合定数をもっておシ、アナライトに
特異的に結合するものとして、アナライトが決１れば自
動的に決貰るべきものである。

反応シートに固定化されている蛋白は、試料液体と接触
して始めてアナライトあるいＣまアナライト成分の螢光
標識物との特異的結合能力を発揮することができる。反
応シートの厚さは一般に約１１００ｆｉから１１０００
ｐ、好ましくは２０θ／ｌ　ｍ７５）らｊ００μ７ｎの
範囲である。

本発明の多層分析要素は、前記の基本的な三層構造のｐ
１刀・に、展開機能をさらに高め、あるいはこれを補助
するだめ、展開シートと分配シートとの間にディストリ
ビュータ−を設けることができる。ディストリビュータ
−は、水不浸透性フィルムであって、試料液体をより下
層の分配シート及び反応シートに実質的に均一に送りこ
むための試料液体導入イ［４を有する。導入孔の開口面
積は一般にθ、θｊｔ７〃２ｐ、ｌ下、り子まり、＜　
（ａｏ　、　ｏ　ｏ　Ｏ／　ｃｍ”〜０　、００１ｃｍ
２の範囲である。

水不浸透性のフイルノ、としては、セルロースニスデル
（セルｌ’ｍｌ−スジアセデート、セルローストリアセ
””’　　ｌ’　、セルロースアセテートプロピオネー
トなト）、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリ
エチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリメチルメ
タアクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン
−塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ポリアミド（例、６−ナイロン
）などのプラスブックフィルム仙や、金属はく、あるい
は金属にく又は紙などに上記プラスチックをラミネート
したもの、またはカラス板などを用いることができる。

ディス）　ＩＪビューターの厚さは通當約２０μ７７１
から約／ｍｍ、好ましくはとＯμｍカ・ら３００μｍの
範囲である。

本発明の多層分析要素にはさらに目的とする発光測光を
より正確にするためにブし遮へい物質を使用することが
できる。例えば、分配シートの素材である繊維質多孔性
月利を螢光の励起光及び／又は放射光をカットできる波
長に吸収帯を有する染料（例えば、反応性染料、建染染
料なと）で直接染色したものを用いる方法、白色、黒色
、又は着色の顔料粒子を分配シート中に含有させる方法
などを用いることができる。分配シートの素材として例
示した非繊維質の粒子に上記と同様の特性を有する染料
を結合させたり、粒子中に着色顔料を含ませたものを用
いる方法等により、測光に都合のよい光透へい機能を賦
与することができる。

光遮へい物質として使用できるものは、例えば、Ｔ　ｉ
　０２微粉末、ＺｎＯ微粉末寸たはＢａ８０４ｉｌｏ・
■）末等の白色微粉末、アルミニウム等の白色１ノこは
淡色の金Ｊ叫光沢をもつ微粉末的が代表的である。

十Ｍｌ、ｊの如く光透へい物質を使用すると、血清成分
由求のイ１５光（１ｌｉｌｌ定すべき螢光波長よシ短か
い）が吸収されるので、血清ブランク値を低減すること
ができる。　　。

つＣμ（！８へい物質に才だこれをゼラチン等のバイン
グーに分散（７たものを塗布して分配シートと反応シー
トの間に独立の塗膜層として設けることもできる。

この場合には１００μｎｔ〜３００μｍの厚さとするの
が好ましい。

本発明の多層分析要素は、枠体によってこれを束ね（ｉ
光イ１１ノアツセイ用スライドとして使用することがで
きる。枠体はその一面に試料液の注入口をイラし、〃・
つ他力の面に螢光強度測定のだめの開口を有する。枠体
は注入口を有する部材と測定用開口を有する部材とによ
って構成され、両部材は接着部材もしくは、直接的な融
着によって一体化されている。

さらに詳しくは、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ
エチレンテレフタレート、ポリスチレンなどの射出整形
可能なプラスチックを用い、枠体を複数の部品に分割し
て作成したのち、各ソートを挿入して枠体部品を接着剤
や粘着デーゾにＬシ接着するか、あるいは超音波に工り
溶融接着により枠体を組合せてスライドを完成してもよ
いし、あるいは全部又は一部を各層の断面に合わせてプ
ラスチック板、プラスチックをラミネートシた紙、金属
板（シート）などを打ちぬいた後に積層して接着し、枠
体を組み立ててもよい。

枠体は、試料液体注入口を４１する枠体と螢光強度の叶
１定用開口を有する枠体の一対からなる。注入口及び測
定用開口は３關〜／　ｊ’７７１稈１崖の直径をイ〕す
る。

多層分析要素が枠体に組みこ１れてスライドとして使用
される場合、展開シートに接する枠体部分と展開シート
との空間は／鴎以下であることが望ましい。滴下筒たは
点着された試料液体の少くとも７ｏａｔｙが展開浸透さ
れることが望せしいからである。

不発明の多層分析要素を用いて分析測定することができ
るアナライトとは、生化学成分含有液及び生体液、例え
ば、血液、血漿、血清、髄液、唾液などに存在する市分
子量あるいは低分子量の被分析成分をいう。以下に代表
的アナライトを例示する。

（１）　　ポリペプチド、タン・り質、多糖類、核酸１
あ・工びこれらの結合体二、 結合体は、すなわち細菌、ウィルス、細胞膜、遺伝子、
核等である。これらの分子量は、少くともタ、θ００．
通常１０，０００以上である。

ポリはプチド、タンノξり質では一般に、５，０００〜
夕、ｏｏθ、Ｏθ０１通常２０，０００〜／、θＯθ、
ｏｏｏである。

ばプチドホルモンの場合、その分子量は、通常ｊ、０θ
０−６ｏ、ｏｏθである。

（ａ）　　タンパク質 ■　ｒセー純タンパク質 プロタミン、アルブミン、グロブリン （α、β１％に免疫グロブリン、ＩｇＧ。

ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ）、硬タンノξり質（
コラーゲン、エラスチン。

アクチンなどの構造タン−ξり賀）； ■　複合タンパク質 ムコタンノξり賀、色素タンパク質、リポタンパク質、
核タン・ξり賀、糖タンパク質、リンクンノξり質； ■　その他のタンパク質（酵素、神体を含む） （ｂ）　　はプチドホルモン インシュリン、グルカゴン、ンマトトロビン、コルチコ
トロビン、ゴナドトロピン、ガストリン、セクレチン、
−ト垂体ホルモンなど、およびこれらの前駆体、体謝産
物；（ｃ）　　微生物由来の抗原性多糖類 球菌（連鋳球菌、ブドウ球菌など、桿菌（炭痕菌、枯草
菌、破傷風菌なと）、放線菌（アクチノマイセスなど）
、真菌（ノカルジア、アスＲルギルス、カンジグなとノ
、リクーツチア（発疹チフス、ツッガ虫、ローギー山紅
班熱、Ｑ熱など）、ウィルス（ヘルペス、庖疹、アデノ
、アルボ、肝炎など）、スピロヘータ（ｔｌｆｔ、レプ
トスピラ、トレボネーマなど八その他の病原菌； （２）抗原性低分子物質 一般に、／θθ〜２，０００．普通には／２夕〜／　、
０００の分子量を持つ。例えば、以下に示す薬物、農薬
、小ペプチッド、アミノ酸、低分子ホルモンおよびこれ
らの代謝産物。

（ａ）　　薬物 アルカロイド（モルヒネ、コディン、キニーネ、ジゴキ
シンなと）、ｊ〜６員環ラクうム（ハルピッレートなど
）、アミノアルキルベンゼン（アンフェタミン、エピネ
フリン、カテコールアミンなど）、ベンゾ複素中式化合
物（オキサゼパム、クロルプロマジンなど２、プリン（
テオフィリン、カフェインなど）、ビタミン（Ａ、１３
複合体、Ｃ，Ｄ、Ｅなど）、ゾＵスタク゛シンジン、抗
生物質（ｋニジリン、テトラサイクリン。

セノアロスボリンなと）、アミノグリコシド（ケンタマ
イシン、カナマイシンなと）、その他の薬物（メザドン
、メプロノにノート。

リドカイン、グリセオフルビンなト）、および以上の薬
物の代謝産物； （ｂＪ　　農薬 ハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル、チオホスフェ
ートなどおよびこれらの代謝産物。

（Ｃ）　　小Ａｅフチド、アミノ酸、低分子ボルモント
リョートサイロニン、チロキシン、エンケファリン、ブ
ラジキニン、アンキオテンシンエ、π、およびこれらの
代謝産物。

以下図面を参照して本発明の多層分析要素をさらに詳細
に説明する。

第１図は、不発明の多層分析要素の基本的な層構成を示
す断面図である。最上層に展開シート１０ｉ・その下に
分配シート／／／及び反応シート／、２／が設けられて
いる。反応シート／２／は一定体のアナライトに対する
抗体を含有しており、これは反工し、ノー１−　／　２
　／に物理的に吸着されている。展開シート１０／には
、アナライトである抗原と同し石ト類の抗原を螢光標識
したものの一定量が８丑れている。第１ａ図は第１図に
示す多層分析要素の斜視図である。

第４図は、本発明の螢光イムノアッセイ用スライドの一
態様を示す垂直断面図て′ある。符号コタ’Ｆｊ、Ｎ’
Ｃ料液体注入口Ｘをイｊｙる枠体、符号２！λは測定用
開口Ｙを有する枠体を示す。枠体２り／と２Ｓ、ｔに第
１図に示す多層分析要素が紹みこまれている。第２ａ図
は第２図に示すスライドの上Ｗｎ図、１．２　ｂ図は第
１ａ図のＩ−Ｉ線に沿う断面図、氾、２Ｃ図は第１図に
示すスライドの底面図、第、２ａ図は第２Ｃ図のＩ−Ｉ
線に沿う断面図である。

η）、３図Ｃよ、本発明の螢光イムノアッセイ用スライ
ドの他の態様を示す垂直断面図である。符号３ｓＨま液
体試料注入口ＸをＭする枠体、符号３ｊλは測定用開口
Ｙ奮有する枠体、符号３ｊ３及び３夕弘は接着剤シート
を示す。この枠体の中に展開シート３０／、分配シート
３／／、及び反応シー）Ｊ、２／が図示したように組み
こ捷れている。

符号３０．２は試料液体導入孔３０３を再するティスト
リビューターであり、その断面図及び平面図が第３Ｃ図
及び第３ｄ図にそれぞれ示されている。

第３ａ図及び第３ｂ図は二つの枠体の各断面図である。

第Ｖ図は、本発明の螢光イムノアッセイ用スライドのさ
らに他の態様を示す断面図である。符号ゲタ／は試料液
体導入口Ｘを■する枠体、符号Ｖ夕λは測定用開口Ｙを
竹する枠体、符号≠５３及びグタグは接着剤シートを示
す。この枠体に、展開シート≠Ｏ／、分配シートＩ／−
／／、反応シート弘λｌ及び通気孔弘ｊ夕を滑する透明
支持体１３１からなる多層分析要素が図示【〜だように
組みこまれている。第ｐａ図及び第４ｔｂ図１＃ｉ透明
支持休グゴ／のそれぞれ断面図及び平面図を示す。

第５図は本発明の螢光イムノアッセイ用スライト°のさ
らに他の態様を示す断面図である。符号り３゛／Ｃま試
料液体注入口Ｘを有する枠体、符号ＳＳλは測定用開口
Ｙを有する枠体、符号ｊ′５３及び５３゛弘は接着剤シ
ート金示す。この枠体に、展開シートｊＯ／、分配シー
トタ／／、反応シート！、２．／及び通気孔夕Ｑ３を石
する透明支持体夕３／力）らなる多層分析要素が組みこ
まれている。第り３図及び第５ｂ図はそれぞれ試料液体
導入孔５０３付デイストリビユータ−１０２の断面図及
び平面図であシ、展開シーｌ−夕０／と分配シート！／
／どの間に設けられる。第ＳＣ図及び第５６図はそれぞ
れｊｎＪ気孔タタｊ付シートタ３／の断面図及び平面図
を示す。

ｔＰ馬図は不発明の螢光イムノアッセイ用スライドのさ
らに他の伸様を示す断面図である。符号６タ／は試料液
体注入口Ｘを有する枠体６ｊ／、符号１，３．２は空気
孔を夕！を有する透明枠体符号を夕３、乙りＶは接着剤
シートを示す。この枠体に展開シー１−７ｉ；　０　／
、試料液体導入孔を有するティストリビューター、分配
シート６／／、及び反応シートｔ、２／からなる多層分
析要素が組み込１れている。

第６ａ図及び第＋ｂ図はそれぞれ試料液体注入口Ｘを有
する枠体ｔｊ／の断面図及び上面図であり、第６Ｃ図及
び第にｄ′図はそれぞれ通気孔１．ｊりを有する透明枠
体６５２の断面図及び底面図である。

第７図は本発明の螢光イムノアッセイ用スライドのさら
に他の態様を示す断面図である。符号７り／は試料液体
注入口Ｘｉ有する枠体、符＋４ｉ７５ノは測定相開ロＹ
−ｉ有する枠体、符号７タ３．７タグは接着剤シートを
示す。この枠体に展開シート７０／、ティストリビュー
ターフ０２、分配シート７／／、光遮蔽シート７３／、
反応シート７２／及び通気孔を有する透明支持体７３／
が糾みこ壕れている。

第５図に示すスライドを用いてアナライトを定量分析す
る操作を９下に説明する。

展開シートタＯ／は、パルプｆ−Ｉ紹°、をアナライト
成分のＦＩＴＣ標識物の級衝溶液に浸漬し凍結乾乾燥し
たもので厚さ、２００μｍである。

デイストリビュータータ０２は厚さ１０りμ７ｎのポリ
エヂレンデレフタレー）（ＰＥＴ）シートに、２　ｔ／
ｌＯ／１１７１φの試料液体導入孔りＱ３をり個有して
いる。

分配シートｓｉｉは、遮光性を賦与するために赤色アガ
ロースを加えたガラス繊維懸濁液を乾燥厚みグｊＯμｍ
となるように漉いたシートである。

反応シートタ、２／は抗つサギＩｇＧヤギ血清のＩｇＧ
フラクションを表面（で固定したアカロース粒子を加え
たガラス繊維懸濁液を乾燥厚みｉｒ。

μ７？１になるように漉いたもので、更にこのシートに
アナライトのウサギ抗血清の希釈液を滴下し、含浸させ
て倭、凍結乾燥させたものである。

支持体夕３／は厚さ／３３タｍの三酢酸セルロースシー
トに２グ０μｍ７！φの通気孔タタタを設ケたものであ
る。

了ナライト（抗原）含有血清／３０μｔを第５図に示す
スライドの注入口Ｘ　Ｋ　ｉＨ下し、３夕０Ｃで／５分
間インキュベートする。

試料液の滴下と同時に展開／−１・夕０／全体に試料液
がゆきわたる（１５０μｔのうち約λθμｔは展開ンー
トタＯ／に残留１−る）。次いでデづストリビュークー
ｊＯノの導入孔５０３な通って分配シートタ／／及び反
応シートタ２１に試料液が徐々に滲透し、遂には全体に
均一に分布する。これと併行して展開ソートタ０／中に
含１れていたＦＩＴＣ仲識物が血清中に溶出され、その
中の緩衝剤などと共に分配シートタ／／及び反応シート
タ、２／に送りこ１れる。こうして送りこ１れた成分ハ
インキュベーション中、反応シートの中で競争的抗原−
抗体反応を起し、一方未反応のＦ　］　’Ｉ”Ｃ標識物
は反応シーｌ−夕２／と分配シート、５′／／とに分配
され、約乙Ｏ壬が分配シート！−／　／に残留する。分
配シーｌ−夕／／と反応シーｌ−夕２／に分配される未
反応のＦＴ、ＴＣ＠識物の比は、最終的には両シートの
保液ｔの比となる。

測定用開口ｙＫｖ、ｔ°の入射角で≠９！；ｎｍの励起
光によシ支持体５３／を通して反応シー）Ｊ”２／は照
射し、この中に存在するＩ＝’　Ｉ　’Ｉ”　Ｃ標識物
（上記の如き分配に応じた未反応の１’　Ｉ　Ｔ　Ｃ標
識物子反応したＦ’　Ｉ　Ｔ　Ｃ標識物−抗体複合体白
米のもの）刀・ら発する螢光’（ｆりθ０の方向からキ
ャッチしてｆｌｌｌｌ−）Ｙ、、する。この場合、分配
シートｊ／／に存在するｌ”　Ｉ　Ｔ　Ｃ標識物は赤色
アガロースの励起光の吸収によって螢光を発しない。

予めアナライト成分の既知量を含有するキャリブレーシ
ョン用血清を用いて検量線を作成しておき、未知逍サン
プルの螢光からアナライト（抗原）の含イ：Ｊ’　：ｊ
’ｊを決定することができる。

上記の如く、本発明は、特開昭ｊ３−７りＯλ弘号にお
ける如く抗原−抗体反応混合物（Ｂ／Ｆ分離が行われて
おらず、従って反応系に存在する反応したすべての螢光
標識複合体及びすべての未反応螢光標識物を含む）全体
の螢光強度を測定するものでもなく、また、本発明者等
の先願に係る発明におけるように、Ｂ／Ｆ分陥後の未反
応の標識物（Ｆ）のみの螢光強度を測定するものでもな
い。本発明においては、分配電利用するＢ／Ｆ分離の後
、反応した螢光標識複合体（Ｂ）の螢光強度全測定する
ものである。複合体（Ｂ）會測足することは、ノイズ全
大幅に減少することができる点で、上記三方法、特に特
開昭５３−７２０２Ｑ号の方法よシも格段にすぐれてい
る。

また、特開昭５３−７７ＯＪ１号に記載された方法にお
いては螢光強度に関し前記特定の相関関係が要求され、
従ってこの要求を満了甲状腺ホルモンに関与する抗原−
抗体反応だけがこの方法に適用可能であるのに対し、 本発明において利用でさる競争的抗原−抗体反応に螢光
イムノアッセイが可能である限シ、螢光強度の相関には
何ら制約がない。

すなわち、未反応の螢光標識物（Ｆ）よシ反応した螢光
標識複合体ＣＢ）の螢光強度が逆に弱い系であっても、
あるいは両者の螢光強度が同じである系（特開昭５３−
７７０．２Ｊｔ号の方法では検定不可能である）であっ
ても、アナライトの斤量を行なうことができる。

以下実施例によジ本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１ （１）　　フルオレセイン標識チロキシン（Ｆ’　Ｉ　
ＴＣ−Ｔ４）の合成　　　゛ Ｆ　１１”　Ｃ−Ｔ　４は下記構造を有し、下記１）、
１１）及び１１１）の操作によって合成した。

１Ｊｔ−ブトキシカルボニルグリシルチロキシンｔ−フ
トキシカルボニルグリシンスクシニルエステル（Ｂｏｃ
−ＧＩＹ−Ｏ８ｕ）３２’？Ｗ（ｌ。

ｓｉｍｍｏｌ）ｔ−テトラヒドロフラン（’１’ＨＦ）
ｊｍｌに溶解する。一方、チロキシンメチルエステル塩
酸塩ｔ、、ｏｒ　（／　、ｘｉｍ　ｍｏ、ｄ　）２Ｔ１
−ＩＦ／ｊ−に溶解し、そこへＴ　Ｈ、Ｆ”　３　ｍｅ
に溶解したトリエブールアミン（Ｅｔ３Ｎ）／７０μＡ
（／、コ／　ｍ　ｍｏｌ）を加える。

前記Ｂ　ｏ　ｃ−（３１ｙ−Ｏ８ｕ溶液に、氷冷しなが
ら、チロキンンメチルエステル溶液を加え、室温にもと
しｉ、ｓ時間かくはんする。反応液ｆｆｉ　−夜、静置
した後、蒸留水、２３ｍ１．酢酸エチル、５′Ｏｍｌ盆
力１ｊえ、酢酸エチル抽出を行う。さらに酢酸エチル２
３　ｍｅで抽出を３回くり返し、酢酸エチルを合わせ、
無水硫酸マグネシウムで乾燥する。この・液をロータリ
ーエバポレーターで濃縮後、セファデックス１．）ｉ−
２０（ファルマシア社）全光てんし７こカラムでゲルク
ロマトグラフィーを行った。

このときの溶媒にアセトン弘に対しメタノール／の割合
で混合したものを用いたＴ　Ｌ　Ｃで確認しながら、目
的物の分画をと９、減圧濃縮して結晶化全行い、Ｆ　ｓ
　ｏ　ｍｙの目的物を得た（収率にコ、ｊ％）。

１）に４９いて合成しｙＣＢｏ　ｃ−（ｌ　ｙ−Ｔ　４
−０ＣＨ２！７ｊ（７ｍＶ（／ｍ　ｍａｉｌ　）ｆトリ
フルオル酢酸１０ｍｅに溶解し氷冷丁に１０分攪にん後
、ｔＯ°Ｃ以下の温度で減圧留去全行った。残渣金１）
と同様の条件でゲルクロマトグラフィーを行い、目的物
の分画をとｐ、結晶化を行って７００π７の目的物ケ得
た（収率ざ、２．４−％）。

１１ンにおいて得たＧ　Ｉ　Ｙ　−Ｔ　４−　ＯＣＩＪ
３トリフルオロ酢酸塩３．２０ｍｙ（０，３３ｍ　＋ｎ
ｏｌ）とトリエチルアミン弘７ｔＪ　　（０，３３ｎ１
ｍｏｌ　）をｊｍｌのメタノールに溶解し、それを１：
　ｌ　Ｔ　（、’　／ｊ　Ｏ〜（０、３３ｍ　ｍｏｂ　
）　ｆｌｔ　、ｆ、ｄのメタノールに溶解したものへ加
える。室温で１１、ｒ間反応後、４ｔＯ００以下の温度
で減圧留去全灯い、残蔽を１）と同様の条件でゲルクロ
マトグラフィーを行い、目的物の分画全と９、結晶化ケ
有っ１こ。得られた結晶は橙色でコ２０〜であった（収
率７０％）。

本品に元素分析値、ＮＭＲスペクトル及びマススペクト
ルにより確認した。

こりして得られたＦ　Ｉ　ＴＣ−Ｔ　４はチロキシン（
Ｔ　４　）と共に競争的抗原−抗体反応に関与するが、
このものＣＪ抗体と結合するとＦＩＴＣ標識抗ｐｉｊ−
抗１本初合体（１３）の螢光強度を未反応の標識物のそ
れに比べて約−倍増強する抗原−抗体反応糸を与えるイ
Ａｍ識！吻であった。

（２）多層分析要素の作製 ：　）　　　展開シー　ト　： イへ・峨ｊＣ（商品名、東洋Ｐ紙製）を直径１５ｍｍの
円に裁断した。上記（１）で合成したＴ４螢光標識物と
しての１１’　１　’１”　Ｃ−Ｔ　４をθ、ｓＮ水酸
化ナトリウム水溶液にｉｏｏμ？／ｌｎｌの濃度に溶解
し、ｌｏ分仮、ｐｌＩりの０１１Ｍグリシンノ・ツファ
−（θ、／％ＢＳＡ＠’Ｍ）’ｃ用いて／　、　２１　
ｔｔｆｌ／ｍｅのｓ　ｒＪｙに稀釈した。この稀釈液ｆ
　ｌ／、ＯｍＭのｒ−アニリノ−／−ナフタレンスルホ
ン酸水溶液とｌ：ｌ（体積比ンの割合で混合し、この混
合液２．０μｌ金上記濾紙５Ｃに簡−トした。混合液が
ｐ紙内部に浸透し１ζ後直ちに凍結し、當法にＪ、シ凍
結乾燥を行ない、乾燥厚２００μｍの展開シートラ得た
。

１１）デイストリビュータｍ： 透明なＰＥＴフィルム（厚さｉｏ８μｍ）を直径／３因
の円に裁断し、第３ｄ図に示すように直径、２ａＯμｍ
の試料液体導入孔をタケ周設け、ディストリビュータ−
とした。

１１１）分配シート： ガラス繊維濾紙Ｑ１４．１００（東洋濾紙製）之１０ｒ
ｒｒｍｘｓｗｎに裁断し、水を加えた後ミキサーで懸濁
分散させ、赤色アガロースを加え乾燥厚みＩＪＪ−ｏｐ
ｍになるよう再抄紙して、分配シート全作製した。

ｉｖ　＞反応シート： 反応シート（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）を下記に示
す方法で作成した。反応シート（Ｉ）及び（１１）は本
発明の多層分析要素全構成するシートであり、反応シー
）（１１７は比較用の多層分析要素全構成するシートで
ある。比較用の多層分析要素には分配シートが含まれな
いので、分配シートに相当する厚さだけ反応シー）（Ｉ
ｌｌ）の厚さ金さらに厚くした。

ガラス繊維濾紙Ｑｋｉｏｏ（東洋沖紙製）を水に懸濁分
散した。常法によυ抗Ｔ４ウサギ血清をその表面に固定
したアガロース粒子を上記分散液に加えて混合した。こ
の混合物を再抄紙、乾燥して乾燥厚み３３０μｍの反応
シー）（Ｉ）ｔ−作成した。

反応シー）　（１１）　： 常法により抗つサギＩｙ９ヤギ血清のＩＳ’Ｇフラクシ
ョンをその表面に固定したアガロース粒子全上記分散液
に加えて混合した。この混合物を再抄紙、乾燥し、更に
抗体Ｔ４ウサギ血清の希釈液を滴下、含浸させ凍結乾燥
し、乾燥厚み３ｊｔＯμｍの反応シー）（ｆｆ）全作成
した。

反応シート（ＩＩＩ　’ｚ　二 反応シート（Ｉ）と同じ材料を用い、同様にして単位面
積当りの抗体量に反応シート（Ｉ）と同じであるが、乾
燥厚みが１００μｍの反応シート（Ｉｌｌ）を作成した
。

■）上記反応シー）（１）及び（ＩＩ）、さらに上記展
開シート及び分配シートを用いて第５図に示すように積
層した多層分析要素（１）及び（ＩＩ）を作成した。

比較用として、反応シート（ＩＩＩ）ｋ使用し、分配シ
ートを使用しない外は同様にして多層分析要素（Ｉ［）
を作成した。

（３）チロキシン（Ｔ４）の測定： 種々の既知濃度のキャリブレーション用チロキシン（Ｔ
４）含有血清（血清を活性炭で処理してＴ４フリー血清
を得、これに既知量のチロキシンを添加して得ｆＣ）ｉ
ｊｏμｌｋ各多ノ慢分析要素の展開シートに滴下する。

ｓｓ　０ｃで７５分放置した後、反応シート側から反射
螢光全測定した。反射螢光の測定には日立製作所製螢光
光度計ｔＳＯ−ｉｏ＜ｓ）２用い、励起波長ゲタｊｎｍ
、螢光波長ｊ　、２　ｊ　ｎｍで測定を実施した。

得られた結果を反射螢光強度（ｍＶ）で下記第７表に示
す。

）　　　　　づ　　　　　珠 ３　　　８　　　　善 第１表から明らかなように、分配シートをイアする本発
明の多層分析要素（Ｉ）及び（］ＩＩ）　ＩｒＪ：　Ｔ
　４の濃度変化に伴なって螢光強度が変化している。

これに対し、分配シートを含１ない比較用の多層分析要
素（ＩＩＩ）についてはＴ４の濃度変化に伴なう螢光強
度の変化が観察されるものの、その変化量は、本発明の
多層分析要素（Ｉ）及び（ＩＩ）’（ｚ便用した場合に
くらべてより少ない変化量であり、このことは多層分析
要素（ＩＩｌ）ｋ用いる場合に測定レンジが２７よシ劣
っていることを意味する。

さらに測定の精度を調べるため、ｇμｆ／ｄｉのｔ４度
のＴ４について、同一条件で７０回繰り返−し測定を行
ない、変動係数（ＣＶｆ的）′？ｒ：求めて測定値のバ
ラツキを観察した。分析要素（Ｉ）を用いた場合、その
ＣＶ値は弘、５係、分析要素（Ｊｌ）ではグ、ｒ係を示
したのに対し、分析要素（川）を用いた場合、ｃＶ値は
２．３係にも達し、分析要素（Ｉ）及び（ＩＩ）のそれ
にくらべて著しい違いが確認された。

以上の実験結果から、分配シート’ｌ設けることにより
、１）Ｉｌｌ定レンジ及び精度において優れた結果が１
１）られることが明らかである。

実施例２ 実７１ｉｔｊ例１に記載した分析要素（Ｉ）及び（１０
）を用い、Ｔ４螢光標識物として下記構造を有する化合
物を使用した１１かは同様にしてＴ４の測定を行なった
。

Ｃ） なお、上記化合物は実施例１のｍ　ｉ　）において、ｔ
−ブトキシカルボニルグリシンスクーシニルエステルの
代りにｔ−ブトギシ力ルホニルグリシルグリシンスクシ
ニルエステル（Ｂｏｃ−Ｇｔｙ−Ｇｌｙ−０８ｕ）を使
用する以外は同様にして合成した。

このＴ４螢光標識物は実施例１において使用した標識物
とは異なり抗原−抗体反応後に螢光増強のない反応系で
あった。このため特開昭５３−７７０．２１１号に記載
の方法では検定不能とされている反応系を与える標識物
である。

分析要素（Ｉ）及び＜ｍ＞について得られた結果を反射
螢光強度（ｔｎ　Ｖ　）によ、！７第２表に示す。

第２表かられかるように、比較用の分析要素（川）を使
用した場合には、Ｔ４の濃度が変化してもこれに対応す
る螢光強度の変化が起らず、ただ単に測定値のバラツキ
が実測されるのみである（従って、検量ｌｌ１ｊ！を作
成することができすＴ４の定量は不可能である）。これ
に対し、分配シートを弔する本発明の分析要素（Ｉ）に
おいては、’ｌ’４の濃度変化に対応する螢光ｔ７Ｐｉ
度の゛変化が生じＴ４定ｆｋヲ可能にする検量１１１Ｉ
ｉｌを作成することができることがわかる。すなわち、
分配シートラ配して分配現象を利用することにより、否
発明においては抗体との結合による螢光標識複合体（Ｂ
）の螢光強度の変化いかんにかかわらす、１だ複雑な１
３／Ｆ分離を行うことなく相１々の競争的抗原−抗体反
応系についてノイズの少ない高精度かつ広い測だレンジ
の螢光イムノアッセイを行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の多層分析要素の基本的層構成を示す断
面図である。 第２図ない（−第７図は本発明の多層分析要素を枠体に
組みこんだ分析スライドの種々の態様を示づ゛ものであ
る。 ’；）（ｊ　−２ｎ図は、枠体、２りｌの上からみた平
面図であり、第Ｊ、　ｂ図は第、Ｚａ図のＩ−Ｉ線に２
ける垂面断面図て′ある。 ｊ：Ｊ”ｒ　、ｂ　ｃ　［！’ｌ　＆、Ｊ、枠体Ｊ！、
！５２（７）底部カラミ７’Ｃ平向図℃゛あり、９ｐ、
　、２　ｄ図は紀、２Ｃ図のＩ−Ｉ線における垂面１ｆ
’ｊｉ面図である。 ８＋！、　ｊ　ａ図及び第３ｂ図は、第３図に示すスラ
イドに１す、１用される各枠体の断面図、第３Ｃし１及
び第３（１図は、試料液体導入孔つきディストリヒユー
ターのそれぞれ断面図及び平面図である。 り１ジ４／ａ図及び群−＜ｚｂ図Ｃま、第１図に示−Ｔ
スライドの透明支持体のそれぞれ断面図及び平面図であ
る。 ｐ、’　Ｊ’　３図及び第ｓｂ図は、第５図に示すスラ
イドの試料液体導入孔つきディストリビュータ−のそれ
ぞれ断面図及び平面図、第ｔｃ図及び第りｄ図は通気孔
付シートのそれぞれ断面図及び平面図である。図中の主
な符号は次のとおりである。 ／夕／、＃２り／　、３！ｒ／　、グｓｉ、夕ｊ／、を
夕／　、７！／　：液体試料注入口を有する枠体／ター
、Ｊｊ、２　、ｊり、２．弘りλ、タタ１，６ｊ）、７
！λ：測定用開口な有する枠体１０／、３０／、１１０
／、３０／、ｔＯ／、７０／：展開シート ／／／、３／／、弘／／、！／、／、ｔ／／、７／／：
分配シート ／、２／、ｊノ／、４’、Ｚ／、ｔ、２／、Ａ、２／、
７．２／：反応シート　　　　　’Ａ 、２０２．３０２　　、　　弘０２，３０２．ｔＯ，２
，７０コニ液体試料導入孔付ディストリビュータ−７３
／：光通へい層 ３タ３１弘タｊ　、！３３　、６３３．７タ３３夕ｐ　
、　ｔｉ、ｓａ　、月４．７７４４．７タ弘：接着剤シ
ート １１１／、ｊ３／：通気孔付透明支持体Ｘ：液体試料導
入口 Ｙ：測定用開口 第　　Ｉ　し 平］ 第１０図 ／１０１ １１１ １２１ ０１ ．１１１ ．１２１ 区　　　　　　　　　　　　区 Ｏ Ｎ　　　　　　　　　　　　　　へ 肝　　　　　　　　　　　　荘 区　　　　区　　　　　区 ０　　　　　　　　　　　　　１フ ーΩ　　　　　　　　　　Ｎ　　　　　　　　　　　Ｎ
幕　　　　　肺　　　　　鵬 区 ｒ＜） 緩　　　　　　腿 区　　　　　区 滅　　　　　賊 Ｙ 第４ａ図　エ６ユ、４３１ 第７図 手続補正書 特許庁長官殿 １、　　ｉＪｔ件の表示　　　　昭和ｊ′７年特願第１
ｉｔｉ３ｔり号３、補正をする者 事件との関係　　　　　　　特許出願人生　補正の対象
　　明細書「発明の詳細な説明」の欄 ＆　補正の内容 （１）　　ＥＡａ書第１４を頁纂ｌグ行の行頭の「°［
」（かぎカッコ）を削除する。 （２）明組書第−ノ自第ｇ行の「クタレー）Ｊｈ「フタ
レートＪＫ訂正する。 （３）明細書第２３貢第を行の「モノモー、」ｒ「モノ
マーの」に訂正する。 （４）明細書記λり負第１１行のｒ７４ｊＪｉｒ７光」
に訂正する。 （５）明細書第３λ負第を行の「プロプリン」ｒ「グロ
ブリン」に訂正する。 （６）明細書第３ｊ貢第１２行の「イムノグロブリン」
と「アミノ基」の間にＩ’ｒＪ　’に挿入する。 （７）明細書第３６負第ｊ行の「を微粒子成分」を削除
する。 （８）明細書第３７負第　行の「ポリ塩化ビニリデン−
塩化ビニルＪｋｒポリ（塩化ビニリデン−塩化ビニル）
ＪＫ訂正する。 （９）明Ｉ（ｌ書第弘Ｏ貞第を行の「整形Ｊｗｒ成形」
に訂正する〇 ０Ｑ　　明細書記グク負第を行の「メゾロバメート」を
「メゾロバメート」に訂正する。 θＤ　８Ａ細■第４ｔグ負第１コ行の行末（「低分子ホ
ルモン」の次）Ｋ「、」（読点）會挿入する。 ０２）　　明細書記４を弘貞第１３行の「トリヨードサ
イロニンＪｋｒ）リョードチロニン」に訂正する。 ０３）明細９４　ｇＢ　ｊ　Ｊ’　Ｑ　第３行の「ｉｏ
ＳｔｔｍＪ’ｔ「ｌＯｊ！ｔｍ」に訂正する。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）水性試料中のアナライトと、 このアナライト成分対し６て特異的に結合する蛋白の一
   定用、 及び、 １咳蛋白Ｖｉｃ対して反応性を有し、かつ、アナライト
   １１す分もしぐはその類縁体の螢光標識物の一定量の共
   存下において、該°アナライト成分もしくけその類縁体
   の螢Ｘ標識物 と全競争的に結合反応させ、その結果得られる前記蛋白
   と反応した螢光標識複合体（Ｂ）を未汐応の螢プＣ標識
   物（Ｆ）から実η上分離し、次いで螢光標識複合体（Ｂ
   ）の螢光強度を測定フ″−ること力・らなるアナライト
   の螢光アッセイ用多層分析要素ＶＣおいて、 その多層分析要素が、 （ａ）　　前記アナライト成分もしく；その類縁体の螢
   光標識物の一定量を包有させた繊維質又は非繊維質多孔
   性展開シート （ｂ）　　多孔質分配シート 及び （Ｃ）　　アナライトと特異的に結合する蛋白の一定量
   を固定化して含有さゼた多孔質反応シート をこの順に積層してなり、前記実質上の分離が多孔・質
   分配シート（ｂ）の存在によって実現されることを特徴
   とする多層分析要素。 （２）前記アナライトが抗原、前記蛋白が抗体、前記ア
   ナライ）ｉ７ｔはその類縁体の螢光標識物がそれぞれ螢
   光標識抗原または螢光標識抗原翻縁体、および前記結合
   反応が抗原−抗体反応である特許請求の範囲（１）に記
   載の多層分析要素。 （３）前配笑質上の分離が、多孔質ル応シー）　（ｃ）
   とこれとＶ：１異なる空間とに未反応の螢光標識物（Ｆ
   ′）を分配させることによって結果的に実現されること
   を特徴とする特許請求の範囲（１）又は（２）の多層分
   析要素。 （ｚｌ）　　ｉｓｉ＋記分配が、多孔質分配シー１−　
   （ｂ）対多孔質反応シート（Ｃ）の保液量比をｌＯ：／
   から０゜ｊ：／の範囲に保つことによって行われること
   を特徴とする特許請求の範囲（３）の多層分析要素。 （５）多孔質反応シート（Ｃ）において、螢光標識複合
   体（Ｂｌの螢光強度と、さ磨に、前記分配に対応して反
   応シート（Ｑに存在する未反応の螢光標識物（乃の螢光
   強度との和分測定することを特徴とする特許請求の範囲
   （４）の多層分析要素。 （６）展開シート（ａ）が分配シート（ｂ）あるいけ反
   応シー）　（ｃ）よりも面方向への試料液の展開が速い
   多孔質材料よりなおことを特徴とする特許請求の範囲（
   １）又は（２）の多層分析要素。 （７）分配シー）　（ｂ）が繊維状多孔質材料からなる
   ことを特徴とする特許請求の範囲（１）、（２）、（３
   ）、（４）父は（５）の多層分析要素。 （８）分配シート（ｂ）が、繊維状多孔質材料と個々に
   は独立した微粒子成分との混合物からなることを特徴と
   する特許請求の範囲（７）の多層分析要素。 （９）分配シート（ｂ）が水不溶性の九遅蔽物質分會有
   することｆ特徴とする特許請求の範囲（７）又は（８）
   の多層分析要素。 α１　前記光遮蔽物質が、螢光標識複合体（Ｂ）に対す
   る励起光あるいは、螢５１；標識複合体（１３）から発
   する放射光の少くともいづれか一方の光♀吸収可能な物
   質であることを特徴とする特許請求の対する光散乱性物
   質であることを特徴とする′１′１許潤求の範囲（９）
   の多層分析要素。 αの　反応シート（ｃ）が繊維状多孔質材料からなる特
   許請求の範囲（１）又は（２）の多層分析要素。 （１（ト）反応シート（ｃ）がｆＲ維状多孔俤材料と、
   個々には独立した微粒子成分との混合物からなる勃許梢
   求の範囲α２の多層分析要素。 α（イ）前記繊維状多孔質材料が少くともｔｏ容量パー
   セントの空隙率を有する特許請求の範囲（１渇又はα濠
   の多層分析要素。 αつ　前記微粒子成分が水不溶性のボ１１−？ｌツカラ
   イド又はその誘導体からなる特許請求の範囲０４の多層
   分析要素、 （Ｉ　ｆｉｌ　　前記微粒子成分の表面が物理吸着ある
   いは化学結合によって水性試料液中のアナライトと結０
   よる蛋白によって、部分的に覆われている特許請求の範
   囲（１５）の多層分析要素。 （１η　分配シート（ｂ）と反応シート（Ｃ）との間に
   螢光標識複合体（Ｂ）に対すお励起光あるいけ螢光標識
   複合体（Ｂ）から発する放射、光の少くとも一方の光を
   吸収あるいは散乱させる物質を含有する多孔質遮光シー
   トが挿入されていることを特徴とする特許８青木の範囲
   （１）ないしく８）のいずれかの多層分析要素。 （１）ζ）　展開シート（ａ）と分配シート（ｂ）との
   間に均一な１１（開を補助すらために、開口面積０．０
   ０θθ／〜０　、　Ｏ３ｃｍ２の試料液の導入孔を有す
   るシートが挿入されでいることを特徴とする特許請求の
   範囲（１）又は（２）の多層分析要素。 翰　反応シート（Ｃ）の外側に透明支持体が設けられで
   いることを特徴とする特許請求の範囲（１）〜０榎のい
   ずれかの多層分析要素。 （２０）　　前記透明支持体が少くとも一箇ｒ′ｇｒに
   通気孔を有−ｒる特許請求の範１；＋４　（１９）の多
   層分析要素。 （２１１ （ａ）　　繊維質又は非繊維質多孔性展開シート（ｂｌ
   　　多孔質分配シート 及び （Ｃ）　　アナライトと％ｌ＆−的に結合す／−蛋白の
   一定量を固定化して含有させた多孔質反応シート をこの順に積層してなる多層分析要素を、−面に試料液
   の注入口を准シ７、かつ、他方の而に螢光強度測定のた
   めの開口を有する枠体によって束ねり螢光アッセイ用ス
   ライド。 （２２）該枠体が注入口を有丁々部材と測定用開口ｆ肩
   する部材とによって構成さ扛、両部材は、接着部材もし
   くけ、直接的な融Ｈによって一体化されていることを特
   徴とする特許請求の範囲（２１１のスライド。 （２３１ｉＵ紀枠体部材が励起光を反射しない着色材料
   を含む特許請求の範囲にのスライド。 （２４）水性試料中のアナライト七、 このアナライトに対して特異的に結＠−ｊる蛋白の一定
   ｍ１ 及び、 該（Ｒｅに対して反応性を有（２、がっ、アリライト成
   分もしくはその類縁体の螢光標識物（Ｆ）の一定惜との
   共存下ＶＣ卦いて、該アナライト成分もＬ（けその類縁
   体の螢光標識物 とを競争的に結合反応させ、その結果得られる前記結合
   性缶口と反応した螢光標識複合体（Ｂ）を未反応の螢光
   標識物促）から実質正分離し１、次て （ａ）　　前記アナライト成分もしくはその類縁体の螢
   光標識物の一定量を含有させた繊維質又は非繊維質多孔
   性展開シート ０））　　多孔質分配シート 及び （Ｃ）　　アナライトと特異的に結合子お蛋白の一定ｉ
   ？固定化して含有させた多孔質反応シート をこの順に積層してなる多層分析要素を用いて前記競争
   的反応を行なう°ことにより、未反応の螢光標識物（月
   が多孔質反応シート（ｃ）　ｌは異なったＺｉＪ’ｌに
   分配されることによって前記実質上の分離が行われるこ
   とを特徴とする螢光アッセイ法。