JPH04506117A - 生物学的検定装置及びそれを用いた検定方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 非吸収性の凹凸模様のある毛細管表面を有する生物検定装置発明の分野 本発明は、流体試料中の選択された被分析物質の検出のために使用されるリガン ド−レセプター法のための装置を含む検定装置の分野に属するものである。より 詳細には、本発明は、結合した標識されている試薬を結合していないそれから分 離するのに必要な固相検定を実施するための装置に関するものである。本明細書 に記載されるこの発明装置は、単一の試験形態内で１またはそれ以上の被分析物 質の定性的、半定量的または定量的測定値を得る検定の実施に使用することがで きる。

発明の背景 本明細書中使用される「リガンド−レセプター」検定という語は、リガンド、及 び、そのリガンドと特異的相互作用の可能な他の物質、即ちリガンドレセプター の間の錯体形成によって検出され得る被分析物質のための検定をさす。リガンド は被分析物質自身、または、もし検出される場合、試料中の被分析物質の存在を 推定するために使用され得る物質であり得る。本発明の状況において、「リガン ド」という語は、ハブテン、ホルモン、抗原、抗体、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ ）　、リボ核酸（ＲＮＡ）　、上記物質の代謝物質、並びにその他の、診断学的 重要性を有し、且つそのための特異的結合相手、即ちリガンド−レセプター検定 におけるリガンドレセプターを有する天然または合成物質を包含する。「リガン ドレセプター」という語は、そのための特異的結合相手（即ちリガンド−レセプ ター検定のりガントンのある物質を包含する。当業者には、目的の被分析物質、 特異的結合対の構成員は、検定の設計により、リガンドまたはりガントレセプタ ーのいずれかであることが認識できるであろう。

一般にリガンド−レセプター検定は、インビトロにおける、体液、食品及び環境 からの試料中のりガントの存在及び／または濃度の決定に有用である。例えば、 ヒトの体液中の特定のホルモン、蛋白、治療薬、及び毒物の測定は、ヒトの病態 を診断し、これに貢献する医療の能力を著しく改善した。試料中のこのようなリ ガンドの定性的及び半定量的測定のための、単純で迅速な器械を用いない検定に 対しては、不断の必要性がある。この単純且つ迅速な方法の需要は、同時に、係 る検定法を完全なものとする検定装置の必要性を派生させる。さらに、多（の状 況において、このような検定法は、極めて熟練した人間によって研究所の設備内 でのみ使用されるのに適した高価且つ複雑な装置を必要とすることなく、技術者 でない使用者によって実施及び解釈されるに充分な程簡単でなくてはならない。

リガンド−レセプター検定は、レセプターによるリガンドの結合に拠って試料中 のりガントの濃度を測定する。リガンド−レセプター検定は、競合的または非競 合的のいずれかに性格付けることができる。一般に非競合的検定は、測定される べきリガンドの量の実質的過剰量のレセプターを用いる。リガンドが、検出を可 能にするために標識された一つのレセプター、及び、典型的には結合した試薬の 結合していない試薬（例えば結合していない標識された第一のレセプター）から の分離を促進する固相に結合した第二のレセプター、という二つのレセプターに 結合することによって検出される、サンドイッチ検定は、非競合的リガンド−レ セプター検定の例である。

蛋白、ホルモン及びデオキシリポ核酸（ＤＮＡ）が、通常非競合的検定を用いて 検出されるリガンドの例である。競合的検定は、一般に、試料由来のリガンド、 検出を可能にするために標識されたりガント類似体、及び限られた数のりガント レセプター結合サイトに対するこれらの種の競合を含む。通常競合的リガンド− レセプター検定によって測定されるリガンドの例は、ハプテン、ホルモン及び蛋 白を包含する。これらの種類のリガンドを結合することのできる抗体は、しばし ばリガンドレセプターとして非競合的および競合的検定の両方に用いられる。

リガンド−レセプター検定は、さらに、ホモジニアスまたはへテロンニアスのい ずれかであるとして記述することができる。ホモジニアス検定においては、反応 に参加する全反応体を混合し、リガンドの量を標識された種を含む結合事象に及 ぼすその効果によって決定する。観察される信号は、この結合の程度によって推 移し、試料中のリガンドの量に関連付けることができる。米国特許第３８１７８ ３７号は、標識されたリガンド類似体がリガンド−酵素複合体であり、リガンド レセプターがリガンドまたはリガンド類似体のいずれかと結合できる抗体である 、このようなホモジニアスな競合的免疫検定を記載している。リガンド−酵素複 合体に対する抗体の結合は、リガンド−酵素複合体が非結合状態にある時に観察 される活性に比較して、この酵素の活性を減少させる。抗体結合サイトに対する 非結合リガンドとりガント−酵素複合体の間の競合のため、リガンド濃度が増す につれて遊離のりガント−酵素複合体の量が増し、故に観察される信号が増す。

したがって、この酵素反応の生成物を分光光度計を用いて動力学的に測定するこ とができる。

ヘテロジニアスなりガント−レセプター検定は、遊離の標識されたりガントレセ プターまたは標識されたリガンド類似体からの、結合した標識されたりガントレ セプターまたは標識されたリガンド類似体の分離、そしてこれに続く結合したま たは遊離の分画のいずれかの測定を必要とする。このようなヘテロジニアスな競 合的検定を実施する方法は、米国特許第３６５４０９０．４２９８６８５及び４ ５０６００９号に記載されており、このような非競合的検定は米国特許第４３７ ６１１０号に記載されている。

器械設備を使用せずに実施できるリガンド−レセプター検定の必要性は、視覚的 解釈のできる検定装置の開発へとつながった。米国特許第４１２５３７２．４２ ００６９０．４２４６３３９．４３６６２４１．４４４６２３２．４４７７５７ ６．４４９６６５４．４６３２９０１．４７２７０１９、及び４７４０４６８号 は、結果の視覚的解釈を可能にする発色反応のできるヘテロジニアスなりガント −レセプター検定のための装置及び方法を記載している。

リガンド−レセプター検定用に開発された最初の装置の中に、膜のような多孔性 材料を、適当な試薬のインキュベーションを起こさせるような浸漬を介して、試 料及び標識された試薬の両者と接触させ、次いで洗浄工程を用いて遊離標識を結 合標識から分離するよう設計された、単純な計量棒型の装置があった。このよう な装置は米国特許第３　’／　１５１９２．４２００６９０．及び４１６８１４ ６号、並びに欧州特許出願第０　０３２　２８６及び０　０６３　８１０号に記 載されている。計量棒の形態に組み立てられた装置に共通の顕著な特徴は、試料 及び試薬のインキュベーション並びに結合標識からの遊離標識の分離を行なった 後、試料、液体試薬及び洗浄溶液を入れておくための流体受容領域が装置の中に 無いことである。使用された試料、結合していない標識された試薬及び使用済み 洗液を捕捉するために外部から流体受容器が供給されねばならないとすると、こ うした流体受容領域の欠如は、このような計量棒型装置が自己完結的であるとの 性格付けを阻むものである。

単なる計量棒型構造物への改善を施した装置の種類が免疫クロマトグラフィー試 験紙である。この種の装置は、固定されたりガントレセプター領域を通過するリ ガンドを含む試料の流れによって達成されるリガンド濃縮作用の効により、一般 に、単純な計量棒装置に比べてリガンド検出の感度の改善を示す。さらにこのよ うな装置は、検定の実施の際に使用される流体のための限られた流体受容領域苓 も提供する。流体受容領域は、適当な量の合計中空容積を提供すＺように多孔性 要素の長さを増すことによって作り出す。このよった装置は、米国特許第４０９ ４６４７．４２３５６０１．４３６１５３７．４３６６２４１．４４３５５０４ ．４６２４９２９．４７４０４６８．４７５６８２８、及び４７５７００４号： 欧州特許臼ｉｔ第０　２６７　００６．０　２７１　２０４、及び０　２９９　 ４２８号；並びにＰＣＴ出願第１Ｊ　Ｓ　８６１０６６８号に記載されて（゛る 。このような免疫クロマトグラフィー装置は確かに限られた流体受容領域を含む ものではあるが、分離速度が遅く、且つこの速度（謔流体が多孔性要素の長方向 を移動する速度によって制約を受けるため、この装置は効率的な遊離／結合標識 の分離を可能にするものてはない。幾つかの免疫クロマトグラフィー装置はその 流体部分の容積により非常に限定を受けるので、遊離／結合標識の分離が全く達 成されない。このような装置は、結合標識を遊離標識から識別するために、固定 化したりガントレセプタ一部分における標識の濃度のを　増加に依存している。

検定の中で遊離標識の結合標識からの分離をる　効率的且つ迅速に実施するため の装置の必要性が存在する。

ｔ　放射状分割免疫検定の方法には、免疫クロマトグラフィー装置の５　特殊化 された形を使用する。この検定方法においては、試料及び標４　識された試薬を 、多孔性材料の中央の固定化レセプタ一部分に注意類　深く適用する。次いで洗 浄流体をこの固定化レセプタ一部分にやは４　つ注意深く適用すると、結合して いない標識が、中心の固定化レセプタ一部分から放射状に流出する。上記の免疫 クロマトグラフィ一本　装置のような放射状分割免疫検定装置は、洗浄流体の容 量かりガンま　ドレセブターを含む多孔性要素の合計の中空容積より小さいこと が二　要求される。何故なら、必要な余分の流体容量を提供するのは試料Ｃの容 量を超過した多孔性材料の中空容量であるからである。このよ；　うな放射状分 割免疫検定装置は、米国特許第４５１７２８８．４６室　７０３８１，４７５２ ５６２．４７７４１７４、及び４７８６６０５　６号に記載されている。放射状 分割免疫検定に使用される装置は、つ　多様なリガンドの検出に普遍的に適して いる訳ではない。遊離及び結合した標識種の物理的分離は、装置の寸法及び多孔 性要素の総流体収容量によって厳しい制約を受けるため、使用できるリガンド検 出領域は必然的に、比較的小さくかつ無理な物とせねばならない。

免疫クロマトグラフィー装置及び放射状分割免疫検定装置は、遊離の標識された 試薬の、結合した標識された試薬からの良好な物理的分離を達成するため、主と して遊離及び結合した標識種の水平的分離、即ち、多孔性要素の面に沿ってまた はこの内部での分離に依存するものである。別の種類の装置は、主として多孔性 要素の面を横断する方向の流体の流れを利用する。この方式で作動する装置は一 般に「フロースルー」装置と呼ぶことができる。これらの装置において流体受容 領域を構成する吸収性材料は、米国特許第３８８８６２９及び４２４６３３９号 に記載のような固定化レセプターを含む多孔性要素と非連続的接触の状態であり 得るか、または、米国特許第４３６６２４１．４４４６２３２．４６３２９０１ 及び４７２７０１９号、並びに欧州特許出願第０２８１２０１号に記載のような 多孔性要素と連続的接触の状態であり得る。米国特許第３８８８６２９及び４２ ４６３３９号に記載されるように、吸収体が多孔性要素と連続的接触状態にない 装置は、標識された試薬溶液を流体吸収剤中に流れ込ませる前に、試料及び／ま たはａｍされた試薬を含む溶液の多孔性要素との接触を起こさせる。この接触は 吸収体と多孔性要素との間で連続的ではないので、多孔性要素が完全に飽和して いることを保証するのに必要な流体の容量は、多孔性要素の中空容積のみである 。このような非連続的接触装置は、本質的に試料及び標識された試薬の利用に際 し、より効率的であり、したがってこの方法によると、米国特許第４４４６２３ ２．４６３２９０１及び４７２７０１９号に記載のごとき連続的接触フロースル ー装置よりも費用効率が良い。しかしながら、この非連続的接触フロースルー装 置は、分離された吸収体を多孔性要素と接触させ、それにより、遊離の標識を結 合標識から分離するのに要する流体の流れを提供するために、検定者の物理的動 作を必要とするという不都合がある。

直接の機械による介入の必要性は、これが失敗し易い工程を導入するため、訓練 されていない使用者による使用の容易性を展望した場合望ましくない。連続的接 触フロースルー装置は、吸収体と多孔性要素との間の流体接触を完全にするため の、使用者による積極的介入の必要性を排除するが、これは、高価な標識された 試薬の利用という点で、より効率的でない。このような装置の流性は、多孔性要 素の面を横断する方向の流体の流れが選択されるように効率化される。したがっ て、多孔性要素全体が試薬含有溶液と接触するのを保証するために、多孔性要素 の中空容積より実質的に大きな試薬容量が要求される。先行文献に記載された非 連続的または連続的接触フロースルー装置のいずれもが、標識された試薬の効率 的な使用及び余分の機械的介入工程の必要性の回避という両特性を示す装置を提 供できないことから、このような特性を有する装置に対する必要性が存在し続け ている。

本明細書に記載の発明装置は、フロースルーまたは免疫クロマトグラフィー法に 限定されず、例えば試料の配置または多孔性及び非吸収性要素の設計並びに配置 を調節することにより、両者の利点を達成するよう修飾することができる。好ま しい態様において、試薬の流れは主として多孔性要素に対し接線方向であり、一 方洗浄試薬の流れは主として膜を横断する方向、次いで毛細管流路のネットワー クに入る。これらの特徴は、本発明を、先行技術のフロースルー及び免疫クロマ トグラフィー装置と識別するものである。

検定装置中の流体の流速及び流路の制御は最も重要であり得る。

この目的を成就するために、流体の流路及び流速を制御するための特別に配列さ れた幾何学的要素を有する表面を使用する多くの装置が先行文献に記載されてい る。米国特許第３６９０８３６及び４４２６４５１号並びに欧州特許出願第０　 ０３４　０４９号に記載のような装置は、流体を多孔性材料の中に入れるため、 非吸収性材料のなめらかな表面の平面シートの間に多孔性材料を位置させる配置 を使用している。米国特許第４２３３０２９及び４３１０３９９号に記載のよう な装置は、流体が規則的な幾何学的パターンに従い、制御された速度で流れるよ うに流体の流れを調節するための幾何学的配置の毛細管流路を使用している。表 面毛細管ネットワークを有する凹凸模様のある表面を用いて流体を多孔性要素に 送ることを制御する装置が、欧州特許出願第０　２３９　１７４号に記載されて いる。記載された装置は流体の流れの制御に適当ではあるが、これらは、検定装 置が試料及び標識された試薬を効率的に使用するために、そして、検定において 遊離種から結合標識種の迅速かつ効率的分離を達成する際の使用のための適当な 流体受容領域を含むよう、検定装置が組み立てられているといったように、多孔 性要素への流体の流れを制御することはできない。従って、上記いずれの構造に より流れを制御する装置によっても満たされていない需要が存在している。

リガンド−レセプター検定を実施する好ましい装置は、操作者の失敗を導き得る ことから、検定操作上に機械の介在の必要性を課するものであってはならない。

本明細書中に記載且つ特許請求される発明装置は、試料及び高価な試薬の使用の 上で効率的であり、そして、全ての液体試薬について適切な流体受容領域、とり わけ検定中の遊離／結合分離工程の流体受容領域を提供するものである。この装 置は、多様な標的リガンドの同時検出を目的とするりガント−レセプター検定を 支持することができ、また、フロースルー検定及び免疫クロマトグラフィー検定 のいずれにも類似のりガント−レセプター検定の形式に使用することができる。

本明細書に記載の装置の一つの利点は、検定プロトコルにおいて最小の工程数で あるにもかかわらず、試薬が効率的に使用される点である。この装置は、大きな 多孔性膜を使用し、これを多数のりガントレセプター領域で覆う。何故ならそれ により試料が膜全体に流れ、これを覆うからである。これは、大容量の試料また は機械的操作のいずれの必要もなく達成される。本発明のもう一つの利点は非吸 収性要素である。過剰容量の流体が添加されると、多孔性要素と非吸収性要素と の接触により形成される毛細管流路のネットワークが、流れを多孔性要素から流 し去ることによる洗浄効率を保証し、これによって遊離複合体の結合標識複合体 からの良好な分離を確保する。成る態様においては、本発明装置はフロースルー 法を用いる検定に使用できる。別の態様においては、記載の装置は免疫クロマト ゲラフイー法を用いる検定を実施できる。さらに本発明装置は、遊離の標識され た種を結合した標識種から分離する仕事、ヘテロシニアスリガンドーレセブター 検定法への中心的必須用件を効率的に実施する。

発明の要約 本発明は、遊離の標識された試薬を結合した標識された試薬から分離するのに必 要な、リガンド−レセプター検定の実施に特に有用な装置を目的とするものであ る。一般に本装置は、固定化された結合試薬と複合体形成していない標識を、結 合試薬と複合体形成した標識から除去することが望ましい状況において有用であ る。本発明に係る装置は、多数の結合試薬、例えば抗体、好ましくは標的リガン ドに対するモノクローナル抗体が結合している、膜またはフィルターのような多 孔性要素を含む（第１図及び第２図）。この装置はさらに、多孔性要素の下表面 と連絡している凹凸模様のある表面を持つ非吸収性要素を含む。非吸収性要素の 凹凸模様のある表面は、レコード表面のような溝付きの表面であってよく、また は、多孔性及び非吸収性要素が互いに接触する時、毛細管流路のネットワークが 形成されるような、流路を構成していてもよい。この毛細管ネットワークは、多 孔性要素と非吸収性要素の凹凸模様のある表面との接触から形成され、多孔性要 素と流体との最初の接触の前または後のいずれかにおいて組み立てられる。幾つ かの態様においては、多孔性要素と非吸収性要素との間の毛細管連絡は、添加さ れた流体の容量が多孔性要素の中空容積を実質的に超えるまで、多孔性要素から 多孔性要素及び非吸収性要素の凹凸模様のある表面により作られる毛細管ネット ワークへの流体の移動を遅らせるのに好都合である。

多孔性要素から多孔性要素と非吸収性要素の凹凸模様のある表面との接触により 形成される毛細管流路のネットワークへの流体の移動は、外部からの陽圧、真空 、または吸収性材料との接触を含む、しかしこれらに限定されない、流体？移動 を誘導する外的手段を使用することなく起こる。本発明に係る装置はさらに、多 孔性要素の上表面に接触するよう配置され、装置の上表面を分割して独立した開 口部を作るのに使用され得る要素を所望により含み得る。係る開口部は、多孔性 要素、または非吸収性の第二の要素の凹凸模様のある表面のいずれかにアクセス することができる。所望による要素は、非吸収性要素と一緒に、介在する多孔性 要素のない流体受容領域を構成する。非吸収性要素及び所望による要素から組み 立てられる流体受容領域は、多孔性要素と非吸収性要素の接触により作り出され た毛細管流路のネットワークによって提供される容量に加えた流体容量を提供す る。所望による要素中の開口部は、第一の流体開口部、そしてさらに余分の流体 開口部を含み得る。第一の流体開口部は、装置に加えられる最初の流体の導入の ための入口として機能する。

さらなる流体開口部は、ここからさらなる流体が本発明装置に加えられる余分の 入口としての働きをする。

この装置に加えられる最初の流体は、試料である。検定プロトコルの構造にもよ るが、試料は、試料由来の標的リガンド、標識されたりガント類似体複合体、標 識されたりガントレセプター複合体、リガンドレセプター、結合試薬、遊離／結 合標識分離試薬及び／または信号発展系の要素を含み得るが、これらに限定され ない。装置に添加されるさらなる流体は、検定操作を完結させるのに要する残り の試薬を含み得る。さらなる流体試薬は、検定プロトコルにもよるが、標本由来 の標的、リガンド、標識されたリガンド類似体複合体、標識されたりガントレセ プター複合体、リガンドレセプター、結合試薬、遊離／結合分離試薬及び／また は信号発−系の要素を含み得るが、これらに限定されない。検定プロトコルの構 造にもよるが、幾つかのさらなる流体試薬が、その検定プロトコルに応じて変わ る連続的なさらなる流体試薬の構成を有する検定操作を完結させるために必要と なり得る。

本発明に係る装置を使用する検定は、成る容量の試料を多孔性要素に加え、ここ で該試料が多孔性要素の中空部分に浸透し、これにより試料が多孔性要素上に固 定されたりガントレセプターに接触する工程を一部に含む。非競合的リガンドレ セプター検定においては、標的リガンドを含む試料が多孔性要素に適用され、こ の標的リガンドが、多孔性要素上に非拡散的に固定されたりカントレセプターに 結合する。次いで標識された第二のりガントレセプターがさらなる流体として加 えられ、これが、リガンド及び固定化された第一のリガンドレセプターの複合体 に結合する。別法として、標識された第二リガンドレセプターの標的リガンドへ の結合が、多孔性要素上に固定された第一リガントレセプターに標的リガンドが 結合する前に起こるよう、試料を多孔性要素に適用する前に、標識された第二リ ガンドレセプターを標的リガンドと合して試料を形成させることもできる。別法 として、標的リガンド、標識された第二リガンドレセプター及び第一リガントレ セプターを合し、この第一リガントレセプター／標的リガンド／標識された第二 リガンドレセプターの複合体を、これらの試薬と合しである、または多孔性要素 上に固定しである結合試薬に結合させることもできる。必要とあらば、遊離試薬 を結合標識試薬から分離するための試薬を含むさらなる流体を加えて、過剰のリ ガンド及び過剰の標識された第二リガンドレセプターを除去することができる。

本装置は、大量の試料を用い、測標的リガンド及び標識された第二リガンドレセ プターのいずれかの過剰量を効率的に除くことができるため、低濃度の標的リガ ンドを測定する充分な感度を提供するよう設計されている。事実、本装置の毛細 管流路のネットワークにより達成される遊離標識の結合標識からの効率的分離は 、非特異的基底信号からの特異的リガンド関連信号の識別を改善する。必要とあ らば、次に、標識された第二リガンドレセプターの標識を検出可能な信号に発展 させることのできる、信号発展溶液を添加する。次いで、発展させた信号を、試 料内の標的リガンドの濃度に関連付けることができる。好ましい態様において、 この装置の多孔性第一要素及び、多孔性要素と装置の非吸収性第二要素の凹凸模 様のある表面との接触により形成される毛細管流路のネットワークの間の流体の 移動は、一般に、装置に添加された流体の総容量が多孔性要素の中空容積を超え た時点で自ら始まり、かくして被分析物質の検出領域から過剰の流体を除去する ための使用者による積極的相互作用の必要性を回避する。流体の移動が開始する 時点は、検出の目的物に依存する。通常、追加流体の適用が、非結合標識の、多 孔性要素に結合した標識からの分離をもたらすよう、試料を、固定されたレセプ ターを含む多孔性要素上の領域の全てと接触させることが望ましい。

競合的リガンドレセプター検定は、標的リガンドと、多孔性要素上に固定された りガントレセプターに対する標識されたリガンド類似体複合体とを含む試料を添 加することによって、本発明装置を用いて実施できる。標識されたリガンド類似 体複合体および標的リガンドは、リガンドレセプターの結合サイトについて競合 する。別法として、リガンドレセプターを標的リガンド及び標識されたリガンド 類似体と合し、引続き、リガンドレセプターを、結合試薬との接触により多孔性 要素上に固定することもできる。遊離標識を結合標識から分離するための追加の 流体を装置に加え、次いで必要ならば、信号発展溶液を加えて、多孔性要素上に 固定されたりガントレセプターと複合体を作っている標識されたリガンド類似体 複合体の標識を検出できるようにすることができる。多孔性要素に結合する標識 されたリガンド類似体複合体の量は、試料中の標的リガンドの濃度に関係する。

多孔性要素及び、多孔性要素と非吸収性第二要素の凹凸模様のある表面との接触 により形成される毛細管流路のネットワークの間の流体の移動は、一般に、多孔 性要素の実質上全ての中空容積が流体で満たされた時に自ら開始する。これによ り本発明方法は、単純、迅速、簡便、高感受性、そして標識された試薬の使用の 点で効率的なやり方で、被分析物質の検出を可能にする。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明に従う免疫検定を実施するための装置の拡大平面図である。

第２図は、第１図に示される装置の拡大した断面図である。

第３図は、線状流路の一組を有する凹凸模様のある表面の拡大斜視図である。

第４図は、流路の幅が等しい２組の流路よりなる凹凸模様のある表面の拡大斜視 図である。

第５図は、流路の幅が異なる２組の流路よりなる凹凸模様のある表面の拡大斜視 図である。

第６図は、凹凸模様のある表面の非吸収性要素の上に多孔性要素を有する装置の 拡大平面図である。

第７図は、第６図に示される装置の拡大した断面図である。

第８図は、凹凸模様のある表面の非吸収性要素及び所望による要素の間に多孔性 要素を有する装置の拡大平面図であって、この装置において、試料は、第一の流 体開口部によって露出している多孔性要素が、非吸収性第二要素の凹凸模様のあ る表面との流路ネットワークを形成することができない第一の流体開口部、及び 、さらなる流体開口部によって露出している多孔性要素が、非吸収性要素の凹凸 模様のある表面との毛細管流路のネットワークを形成する、さらなる流体開口部 を介して装置に添加される。

第９図は、第８図に示される装置の拡大した断面図である。

第１０図は、凹凸模様のある表面の非吸収性要素及び所望による要素の間に多孔 性要素を有する装置の拡大平面図であって、この装置において、試料は、第一の 流体開口部によって露出している多口凸模様のある表面が、多孔性第一要素との 流路ネットワークを形成することができないような第一の流体開口部、及び、さ らなる流体開口部によって露出している多孔性要素が、非吸収性要素の凹凸模様 のある表面との毛細管流路のネットワークを形成する、さらなる流体開口部を介 して添加される。

第１１図は、第１０図に示される装置の拡大した断面図である。

定義 全明細書を通じて以下の用語を定義する。

結合試薬：化学的、物理的または免疫学的手段によって診断学的に興味深いリガ ンドまたはそのためのりガントレセプターに結合することのできる物質。

多孔性要素：結合試薬のための固相支持体を提供するために使用される多孔性材 料からなる、当該装置の要素。

中空容積二流体によって占められ得る多孔性要素内の空間の容積。

流体保時カニ流体を多孔性要素の中空容積内に保持する力、例えば表面張力。

流路：毛細管の大きさく一般に０．０２０インチより小さい）の開口した溝。

毛細管流路：毛細管の大きさく一般に０．２０インチより小さい）の閉じた流路 。

流路の組ニー組の共通した性格（例えば装置の共通の軸に沿って整列している） によって同定できる流路の群。

毛細管流路のネットワーク：多孔性要素と、非吸収性要素の凹凸模様のある表面 の流路との接触により形成される毛細管流路の形態であって、ネットワークは１ またはそれ以上の組の流路から組み立てられ得る。

凹凸模様のある（７ｅｘｔｕｒｅｄ）表面：多孔性膜がその上に配置された時に 毛細管流路のネットワークを形成することのできる非吸収性表面。凹凸模様のあ る表面は、不規則的または規則的な形態であり得る。

凹凸模様のある表面の非吸収性要素：流体を吸収せず、その表面の一部に凹凸模 様のある表面を含む要素。非吸収性要素の凹凸模様のある表面と多孔性要素との 間の接触は、毛細管流路のネットワークを形成する。

所望による要素二当該装置に含まれる時、装置の上表面が分割されて独立した開 口部を形成する、追加の要素。

第一の流体開口部：試料を装置中に導入させるための、所望による要素中の開口 部。

さらなる流体開口部：追加の流体を装置中に導入させるための、所望による要素 中のさらなる開口部。

試料：装置に添加される最初の容量の流体であって、標本由来の標的リガンド、 標識されたリガンド類似体複合体、標識されたりガントレセプター複合体、リガ ンドレセプター、結合試薬、遊離／結合標識分離試薬及び／または信号発展系の 要素を含み得るがこれらに限定されない。

追加の流体：検定プロトコルを完結させるために装置に添加されねばならない任 意の追加の流体であって、標本由来の標的リガンド、標識されたリガンド類似体 複合体、標識されたりガントレセプター複合体、リガンドレセプター、結合試薬 、遊離／結合標識分離試薬及び／または信号発展系の要素を含むがこれらに限定 されない。

本明細書に記載の発明装置は、米国特許出願第２９５，１６０号（１９８９年１ 月１０日出願。これは引用して本明細書の一部としである。）に記載の形態を含 む様々な検定形態に使用できる。特に本出願の方法の請求項における「リガンド 」、「リガンドレセプター」、「リガンドレセプター複合体」及び「リガンド類 似体」の定義は、出願第２９５５６０号から引用しである。

好ましい態様の詳細な説明 本発明に係る装置は、膜またはフィルターのような多孔性材料からなる多孔性要 素を使用する。多孔性要素としての使用が好ましいものは、流体をその多孔性材 料の中空容積内に入れることのできる材質を部分的に含む、フィルターまたは膜 である。多孔性材料の中空容積は、流体によって占められ得る、その材料の大き さの限界内に入る容積である。これらの発明装置は、液体及び気体を含む様々な 流体と共に使用できることに留意すべきである。

この装置の好ましい態様において、実質上全ての試料が、多孔性要素の中空容積 を完全に満たす前に、多孔性要素の領域内に保持される。多孔性膜の中空容積が 実質上湯たされるまで、装置に添加された試料を多孔性膜内に保持することによ って、最小容量の試料しか必要でなくなり、その結果、結合試薬で活性化された 膜の全体が、添加される試料に暴露されることが保証される。この事は結果とし て、膜上の多様な標的リガンド検出反応を同時に実行するために加えられる試料 の最も効率的な使用につながる。したがって、多孔性要素として使用できる材料 は、流体をその材料の内部に保持する効力のある力、即ち流体保持力のある材料 を含む。多孔性要素としての使用が特に好ましいのは、多孔性要素によって保持 される流体上に働く流体保持力が、多孔性要素と、多孔性要素及び凹凸模様のあ る表面の非吸収性要素の接触により作られる毛細管流路のネットワークとの間の 実質的な流体移動に先立って、多孔性要素の実質上全ての中空容積が満たされる ような力である材料である。使用できる膜またはフィルターは、グラスファイバ ー及び種々の合成及び天然材料からなるものを含む。

多孔性要素の内部に適当な流体保持性を達成する好ましい方法は、膜によって働 く流体保持力が、膜内の流体に働く外力より大きいような、小孔のサイズにより 特性付けられる膜を選択することである。

このような外力の例は、膜の上方の流体の圧力（流体の水頭圧力）、膜内の流体 にかかる重力、当該材料が親水性として性格付けられる相対的度合、及び、外部 毛細管または膜と接触している毛細管のネットワークに付随する毛細管力がある 。多孔性要素としての使用が好ましい、ナイロン膜のような膜の孔径は、０．工 ないし３０μｍ１使用が特に好ましいのは、０．２ないし５μｍの範囲の孔径を 有する膜である。検定の工程が、流体の移動前に多孔性要素の実質上全ての中空 容積を飽和することを要しない場合、多孔性要素内の流体に働く外力より小さい 、またはこれと等しい流体保持力を示す多孔性材料を使用できる。このような状 況の下では、５ないし５０μｍの範囲の孔径を有する膜のような多孔性要素が好 ましい。

標的リガンドは多孔性要素上に捕捉される。この捕捉工程は、例えば標的リガン ドが、多孔性要素を特性付ける孔径より大きなサイズを有する場合、濾過の間に 起こるであろうような、または、標的リガンドまたはそのためのりガントレセプ ターと結合することのできる試薬、即ち結合試薬の相互作用から起こり得るよう な、物理的捕捉を利用することができる。リガンドレセプターのような結合試薬 は直接または間接的に多孔性要素と結合し得る。リガンドレセプター、例えば抗 体は、多孔性要素上に非拡散的に固定され得る。好ましい態様において、多孔性 要素は、そこにリガンドレセプターが固定されるナイロン膜のような膜であり、 好ましいりガントレセプターは抗体である。好ましい抗体はネズミのモノクロー ナル抗体であるが、抗体はポリクローナル抗体調整物からの物であってよい。

このような適当なネズミのモノクローナル抗体の製造及びスクリーニング方法は 当業者に良く知られており、例えばすニー・Ｄｌ、パーセル・Ｒ１およびレビー ・Ｊ、　Ｇ、　、クリニカル・トキシコロシー第２５巻５２７−５３８頁（１９ ８７）を参照されたい。ネズミのモノクローナル抗体は、膜上に共有結合または 非共有結合法により非拡散的に固定され、このような方法もまた当業者には良く 知られている。例えばプラスカル・Ｍ、　Ｇ、　、プルツエコップ・Ｍ、　Ｂ。

、カボニアン・Ｍ、　Ｒ，、ベコーリ・Ｄｏ、ヒックス・Ｄ、Ａ、、バイオテク ニークス第４巻２７２−２８３頁（１９８６）を参照されたい。好ましい態様に おいて、このネズミモノクローナル抗体は、非共有結合的にナイロン膜に結合し ている。特に好ましい態様において、このモノクローナル抗体は、ナイロン膜上 の独立した領域に非共有結合的に固定されている。多孔性要素を構成する膜上の 独立した領域にモノクローナル抗体を固定することは、これによって膜表面が固 定化抗体の係る多様な独立領域に分割され、異なった領域が同一のまたは異なっ た抗体を含む事が可能になるため、特に好ましい。各々の独立した抗体領域が、 別々の免疫化学的反応を完結させるために使用され、したがって、数多くのこの ような免疫化学的反応が同時に実施できる。

本発明の好ましい態様において、結合試薬、リガンドレセプターは、多孔性要素 の全体を含む単一の領域に実質上一様に固定される。

さらに好ましい態様において、リガンドレセプターは多孔性要素上の少な（とも １つの独立した領域に固定され、その結果任意のこのような独立領域は、多孔性 要素の全体より小さいことになる。特に好ましい態様において、リガンドレセプ ターは、１またはそれ以上の独立領域内に一様に固定される。さらなる特に好ま しい態様において、多数のりガントレセプターが多数の独立領域に固定され、各 々の領域が少なくとも１つのりガントレセプターを含む。さらなる特に好ましい 態様において、独立した領域の数は、少なくとも測定されるべき標的リガンドの 数と同じ位多い。そこで、多数の独立したりガントレセプター領域が存在する時 、多数のりガントの測定が可能となる。

本発明の第二の要素は、多孔性要素と接触する時部分的に毛細管流路のネットワ ークを含む、表面の凹凸模様を有する非吸収性構成物である。表面の凹凸模様は 、流路を提供するような方式で配置された規則的または不規則的な幾何学的要素 で構成することができる。

一群の流路が、単一の軸に沿って整列しているといった共通の特徴により性格付 けられる場合、流路の組が形成される。非吸収性要素が多孔性要素と接触してい る場合、流路は毛細管流路のネットワークを形成する。この毛細管流路のネット ワークは多孔性膜の下部または周囲にあってよい。多孔性及び非吸収性要素の間 の連絡は、多孔性要素に加えられた流体容量が多孔性要素の中空容積より大きい 時に、流体が、多孔性要素から、多孔性及び非吸収性要素の接触により作られる 毛細管流路のネットワークへと移動するような連絡である。幾つかの状況におい ては、多孔性要素の流体保持性は、多孔性要素の中空容積が実質上飽和する前に 、係る流体を移動させる。

多孔性要素は、２つの要素が接触し、且つ２つの要素の隣接する面がほぼ平行で ある所に毛細管流路のネットワークが形成されるように、非吸収性要素に対して 配置することができる。多孔性要素と非吸収性要素の凹凸模様のある表面とを分 かつ距離は、第二の要素の凹凸模様のある表面に隣接する多孔性要素の表面が、 ２つの要素間の毛細管流路のネットワークの形成を完成させるような距離である 。

事実、追加の流体が導入される検定プロトコルにおいては、使用される流体の容 量が多孔性要素の中空容積を実質上湯たすならば、そして、多孔性及び非吸収性 要素が、相手に関して、非吸収性要素の流路が、意図された流体受容領域の機能 を内湯たし得るように距離をおいているならば、多孔性及び非吸収性要素が緊密 な接触をもたらさねばならないことはない。多孔性要素及び非吸収性要素の凹凸 模様のある表面を分かつ距離として好ましいのは、０．２インチより小さい距離 である。毛細管流路のネットワークを形成する２つの要素の間の分離距離として 特に好ましいのは、０．１インチより小さい距離である。

非吸収性要素の好ましい態様において、凹凸模様のある表面は、規則的な幾何学 的パターンを形成する流路の組からなり、この流路は一般に単一の軸に沿って整 列し、且つ隣接する流路はほぼ平行である（第３図）。凹凸模様のある表面の好 ましい態様の中で、一般に流体は、本明細書に引用されその記載の一部となって いる米国特許第４２３３０２９号に記載の流れと類似の、流路に沿った流れとな る。第二要素の特に好ましい態様においては、凹凸模様のある表面は規則的な幾 何学的パターンを含み、ここで２組の流路は該要素の表面上に成る角度をなして 並び、流路の各組は一般にその各々の単一の軸に沿って整列し、単一の軸に沿っ た隣接する流路は一般に平行である。この並び方の好ましい角度は、２組の流路 が同一線上に無いような角度である。２組の流路の並び方の角度として特に好ま しいのは、実質上直角（即ち９０°）に等しい角度である。流路が直角に並んで いる凹凸模様のある表面の好ましい態様において、該流路は一般に等しい幅を有 し、その結果２組の流路により作られる幾何学的パターンは正方形の形である（ 第４図）。２組の流路が互いに直角である凹凸模様のある表面の特に好ましい態 様においては、該流路は一般に異なった幅を有し、その結果２組の流路は長方形 の形を形成する（第５図）。非等方性長方形の配列における好ましい流れの方向 は、一般に、第一に、より広い流路により規定される軸に平行な軸に沿っており 、第二に、より狭い流路により規定される軸に平行な軸に沿っている。本発明者 等の研究は、互いに直角に並んでいる２組の流路からなる１つの平板に対する流 体の流れのパターンは、２枚のほぼ平行な平板であってその各々が１組の流路を 含み、該平板が、それにより二次元的配置の流路を形作るような距離をおいて相 対している系に対して記載される流体の流れのパターンに類似することを示して いる。このような二次元的配置の流路の流れのパターンは、前記米国特許第４２ ３３０２９号に記載されており、これは引用して本明細書の一部とした。

本発明装置の第三の要素は、非吸収性の所望による要素を含む。

非吸収性の所望による要素は、多孔性要素の上表面の上方に位置する。非吸収性 の所望による要素は、そこから流体が多孔性要素に添加される開口部を有し得る 。所望による要素中の開口部は、多孔性要素の上面を、流体が特異的検定プロト コルに適合するよう選択的に導入される領域に分割する役割を有する。第一の流 体開口部は、試料を多孔性要素上へ導入するために用いられる。フロースルー型 検定におけるように、検定プロトコルにとって適当であるならば、遊離／結合標 識分離試薬のような、追加の流体の添加を第一の流体開口部から行なってもよい 。免疫クロマトグラフィー検定におけるように、その検定プロトコルが必要とす るならば、例えば信号発展系の要素を含む流体のようなさらなる流体を、試料の 導入された位置から離れた多孔性要素の部分に導入可能とするために、第二の流 体開口部が所望による要素中に含まれてよい。非吸収性の所望による要素は、所 望により、凹凸模様のある表面の非吸収性要素と性質の上で類似する、凹凸模様 のある表面を含んでいてよい。非吸収性要素と組合わさる第３の要素もまた多孔 性要素を含む小室を形成することができる。試料が気体である場合、試料が多孔 性要素を横切りこれを通過して小室から出て行くように、この気体を多孔性要素 を含む小室中に注射することができる。

多孔性要素と凹凸模様のある表面の非吸収性要素の凹凸模様のある表面との接触 により形成される毛細管流路のネットワークは、本発明装置の主要な流体貯蔵所 としての役割を有する。さらなる流体貯蔵収容力が、凹凸模様のある表面の非吸 収性要素及び非吸収性の所望による要素の組合せによって囲まれる本発明装置内 の空間によって提供され得る。本発明装置の好ましい態様において、さらなる流 体貯蔵収容力が、凹凸模様のある表面の非吸収性要素及び非吸収性の所望による 要素によって囲まれる空間によって提供されるが、係る閉じた空間の中には、２ つの非吸収性要素の間に介在する多孔性要素は無い。

本発明装置の好ましい態様において、この装置は、一部長孔性要素及び凹凸模様 のある表面の非吸収性要素を含む（第６図及び第７図）。本発明装置の特に好ま しい態様において、この装置は一部に、多孔性要素、凹凸模様のある表面の非吸 収性要素及び、多孔性要素の中央部上方に第一の流体開口部を有する非吸収性の 所望による要素を含む。試料は、非吸収性の所望による要素にある第一の流体開 口部により露出される多孔性要素の部分に導入される。いったん導入されると、 試料は多孔性要素上、またはこの中に広がり、または毛管作用で運ばれ、それに より、多孔性要素上に非拡散的に固定されたりガントレセプターとの相互作用が 誘発される。本発明装置の非吸収性要素は、流路の組を含む凹凸模様のある表面 を含む。非吸収性要素が多孔性要素と接触に至る時、この流路の組は毛細管流路 のネットワークを形成する。係る接触は、最初の試料導入工程の前または後に始 まり得る。多孔性要素と非吸収性要素との接触により形成される毛細管流路のネ ットワークは、流体が多孔性要素からその中へと移動する流体受容領域を提供す る。多孔性要素及び非吸収真空といったような、流体の移動を誘発する余分の外 的手段を適用する必要なく、多孔性要素及び非吸収性要素の間の流体移動を開始 させることができる。

さらなる特に好ましい態様において、本発明に係る装置は、一部に、凹凸模様の ある表面の非吸収性要素、多孔性要素、及び、第一の流体開口部およびさらなる 流体開口部を持つ非吸収性の所望による要素を含む。第一の流体開口部は、多孔 性要素の先端に位置する。

さらなる流体開口部は、多孔性要素の中心部の上方に位置する。試料は第一の流 体開口部から装置に添加され、多孔性要素上、及びその中に広がり、または毛管 作用で運ばれ、それにより、多孔性要素上に非拡散的に固定されたりガントレセ プターとの相互作用が誘発される。検定プロトコルに必要な追加の流体は、さら なる流体開口部を介して装置に添加され、次いで多孔性要素上、及びその中に広 がり、それにより検定を完結させる。

さらに好ましい態様において、本発明に係る装置は、一部に、凹凸模様のある表 面の非吸収性要素並びに、非吸収性要素の凹凸模様のある表面との接触の間、非 吸収性要素の凹凸模様のある表面の外辺部を超えて広がる多孔性要素の先端を含 む、多孔性要素を含んでいる。さらなる特に好ましい態様において、本発明に係 る装置は、一部に、凹凸模様のある表面の非吸収性要素、第一の流体開口部およ びさらなる流体開口部を有する非吸収性の所望による要素、並びに、非吸収性要 素の凹凸模様のある表面との接触の間、非吸収性要素の凹凸模様のある表面の外 辺部を超えて広がる多孔性要素の先端を含む、多孔性要素を含んでいる（第８図 及び第９図）。第一の流体開口部は、非吸収性要素の凹凸模様のある表面の外辺 部から突き出ている多孔性要素の先端の上方に位置している。非吸収性要素の凹 凸模様のある表面の外辺部から突き出ている多孔性要素の部分は、多孔性要素と 凹凸模様のある非吸収要素との接触の産物である、毛細管流路のネットワークの 形成には参加しない。第一の流体開口部は、試料と添加された追加の流体の合計 容量が実質上多孔性要素の中空容積を超えない限り、第一の流体開口部から加え られた試料を強制的に多孔性要素を横切らせ、且つ多孔性要素の内部に実質上と どまらせるよう、組み立てられる。本装置の特に好ましい態様において、凹凸模 様のある表面から突き出ている多孔性要素の下面は、流体がその面を通り抜けら れないように密閉されている。多孔性要素内の流体の流れに対するこのような強 制によって、第一の流体開口部に加えられた試料は、第一の流体開口部の下の多 孔性要素から始まって、第一の流体開口部から遠い多孔性要素領域まで進む、連 続的方式で、多孔性要素内を移動するよう誘導される。さらなる流体開口部は多 孔性要素の中央部分の上方に位置し、追加の流体を、検定プロトコルが要求する ように装置に添加させる。さらなる流体開口部から導入される追加の流体は、さ らなる流体開口部から装置に加えられた係る流体の流れが、単に多孔性要素内に 流れ込ませられるだけでなく、多孔性要素の外表面に沿った流体の流れを含むよ う、多孔性要素上を覆わせられる。本装置のさらなる特に好ましい態様において は、本装置の総流体受容能は、非吸収性要素及び多孔性要素が突き出ていない所 望による要素によって囲まれる空間に付随する容量によって増加する。

さらなる態様において、Ｉ発明に係る装置は、一部、多孔性要素、及び、多孔性 要素の外辺部を越えて伸長する一部の凹凸模様のある表面を有する凹凸模様のあ る表面の非吸収性要素を含む。好ましい態様において、この装置は、一部、多孔 性要素、多孔性要素の外辺部を越えて伸長する凹凸模様のある表面の先端を有す る凹凸模様のある表面の非吸収性要素、及び、多孔性要素の外辺部を越えて伸長 する非吸収性要素の凹凸模様のある表面の部分の上方に位置する第一の流体導入 開口部を有する所望による要素を含む。試料は所望による要素の第一流体開口部 からこの装置に添加され、そして第一流体開口部の下にある凹凸模様のある表面 に沿って且つこれ全体に広がるようにされる。非吸収性要素の凹凸模様のある表 面の先端は、多孔性要素を覆ってはいない。その結果、多孔性要素及び非吸収性 要素の凹凸模様のある表面が接触し、それにより２つの要素が重なる領域に毛細 管流路のネットワークが作られる時、凹凸模様のある表面の先端は係るネットワ ークの一部とはならない。加えられた試料は、第一液体開口部に始まる、非吸収 性要素の凹凸模様のある表面の先端を横切って、非吸収性要素が多孔性第一要素 と接触している毛細管流路のネットワークの領域に進む。非吸収性要素の凹凸模 様のある表面が多孔性要素との接触により共同して毛細管流路のネットワークを 形成する接合点において始まり、毛細管流路のネットワークに沿った、または多 孔性要素を通る試料の流れは、試料により、毛細管流路のネットワークにより、 そして多孔性要素により働く流体保持力の相対強度に影響を受ける。例えば水性 試料の場合、もし多孔性要素が毛細管流路のネットワークより流体保持性が相対 的に高ければ、試料は多孔性要素内部に流れる方を選ぶであろうし、逆に、もし 多孔性要素が毛細管流路のネットワークより流体保持性が相対的に低ければ、試 料の流れは主として毛細管流路のネットワーク内部に起こるであろう。流体保持 力が、毛細管流路のネットワーク内への試料の流れ、続いて多孔性要素内におけ る試料の保持に対して有利であったとすると、最初毛細管流路のネットワーク内 に入っていた試料は、毛細管流路のネットワークから多孔性要素へと、自然に移 動する。毛細管流路のネットワークから多孔性要素への係る試料の移動容量は、 多孔性要素の中空容積によって限定される。

さらに好ましい態様において、本装置は、一部に、多孔性要素、多孔性要素の外 辺部を越えて伸長する凹凸模様のある表面の先端を有する凹凸模様のある表面の 非吸収性要素、並びに、多孔性要素の外辺部を越えて伸長する非吸収性要素の凹 凸模様のある表面の部分の上方に位置する第一流体導入開口部、及び、多孔性要 素の中央部上方に位置するさらなる流体開口部を有する、さらなる要素、を含む （第１０図及び第１１図）。試料は、多孔性要素の境界を越えて伸長している凹 凸模様のある表面の部分の上の第一流体開口部から、装置に導入される。次いで 試料は凹凸模様のある表面の流路に沿つて移動し、凹凸模様のある表面と多孔性 要素との接触により毛細管流路のネットワークを形成している凹凸模様のある表 面の部分に到達する。次いで、各々の装置の構成要素の流体保持力の相対的強さ に従って、試料は毛細管流路のネットワーク内に、または多孔性要素内に流れ、 流体保持力が多孔性要素への試料の移動に有利であったとすると、最初毛細管流 路のネットワーク内に入っていた試料は、毛細管流路のネットワークから自然に 多孔性要素へと移動する。検定プロトコルが要求するならば、追加の流体を、さ らなる流体開口部より装置に導入するが、装置に加えられた流体の総容量が、多 孔性要素の中空容積を実質上超える時は、多孔性要素の中空容積を超える流体が 毛細管流路のネットワークに移動するよう、流体の移動が自然に始まる。さらな る特に好ましい態様において、装置の合計の流体受容能は、非吸収性要素と多孔 性要素が突き出ていない所望による要素とによって囲まれる空間に付随する容積 によって、毛細管流路のネットワークの受容能を上回る。

本発明に係る方法において、試料は本発明装置に最初に添加される流体である。

検定方法の組み立てによるが、試料は一部に以下の物、即ち、リガンドレセプタ ー、結合試薬、標本由来の標的リガンド、標識されたリガンド類似体複合体、標 識されたりガントレセプター複合体、遊離／結合標識分離試薬及び／または信号 発展系の要素、の幾つかまたは全てを含む。装置に加えられる追加の流体は、検 定操作を完結させるために必要な残りの試薬を含み得る。検定方法のプロトコル によるが、追加の流体試薬は、リガンドレセプター、標本由来の標的リガンド、 標識されたりガント類似体複合体、標識されたりガントレセプター複合体、リガ ンドレセプター、結合試薬、遊離／結合分離試薬及び／または信号発展系の要素 を含み得るがこれらに限定される訳ではない。検定プロトコルの組み立てによる が、検定プロトコルによって適宜変わる連続的な追加の流体試薬の構成内容を有 する検定操作を完結させるために、幾つかの追加の流体試薬が必要となることが ある。例えば競合的リガンド−レセプター検定において、試料は一部に標本由来 の標的リガンド及び標識されたりガント類似体複合体を含む。これとは異なり、 多孔性要素が、リガンド類似体複合体と既に複合体形成している固定されたりガ ントレセプターを含んでいる、置換競合的リガンドレセプター検定においては、 試料は一部に標本由来の標的リガンドを含み、一方、連続的置換競合的リガンド レセプター検定においては、試料は一部にリガンド類似体複合体を含み、標本由 来の標的リガンドを、試料としてではなく追加の流体として装置に加えることが できる。

例えば連続的非競合的検定方法においては、試料は一部に標本由来め標的リガン ドを含む。追加の流体は、一部に標識されたりガントレセプター複合体を含むこ とができる。さらなる追加の流体は、個別にまたは合して、遊離／結合標識分離 試薬及び信号発展系の要素を一部に含み得る。もし検定が同時非競合法であるな らば、試料は一部に標本由来の標的リガンド及び標識されたりガントレセプター 複合体を含むことができる。別法として、試料は標本由来の標的リガンド、第一 のリガンドレセプター、及び標識された第二のリガンドレセプター複合体を組み 合わせた物であってもよい。標識リガンドまたは第一のリガンドレセプターの固 定化、並びに、多孔性要素上へのそれらの複合を促進させるため、結合試薬が含 まれていてもよい。ここでさらに、検定方法の要求Ｔるさらなる追加の流体は、 例えば遊離／結合標識分離試薬及び／または信号発展系の要素を含むことができ る。

さらに好ましい本発明装置の態様において、本発明に係る競合的リガンド−レセ プター法は、多孔性要素の中央部上方に位置する第一の流体開口部から試料を多 孔性要素に添加することを含む。標本由来の標的リガンド及び標識されたリガン ド類似体を含有する試料は、広がって多孔性要素の露出した表面に入り、これに より、多孔性要素上に非拡散的に固定されたりガントレセプターとの相互作用が 誘発される。本発明装置の好ましい態様において、リガンドレセプターは、多孔 性要素の全体を含む一つの領域に実質上均等に固定される。特に好ましい態様に おいて、リガンドレセプターは、少なくとも一つの独立した多孔性要素上の領域 に固定されている。さらなる特に好ましい態様においては、多数のりガントレセ プターが、各領域が少なくとも一つのりガントレセプターを含む多数の独立した 領域に固定されている。さらなる特に好ましい態様においては、リガンドレセプ ターの独立した領域の数は、少なくとも、測定されるべき独立したリガンドの数 と同等に多い。標的リガンド及び標識されたリガンド類似体複合体の間で、固定 されたりガントレセプターの限られた結合サイトについての競合が可能となる。

装置に添加された流体の総容量が、少なくとも多孔性要素の中空容積を実質上溝 たすに充分である時、その量を超える流体は、多孔性要素、及び、多孔性要素と 非吸収性要素の凹凸模様のある表面との接触によって作られる毛細管流路のネッ トワークの間に自然に移動する。多孔性及び非吸収性要素の間の流体の移動は、 多孔性要素上に固定されたりガントレセプターと複合体形成した標識されたリガ ンド類似体複合体が、多孔性要素上に固定されたりガントレセプターと複合体形 成しなかった標識されたリガンド類似体複合体から分離することを促進する。次 いで、この検定の結果を、固定されたりガントレセプター領域内部における標識 されたリガンド類似体複合体の存在または不在の決定によって判断する。このよ うな独立したりガンドレセブター領域が多数存在する場合は、１以上の目的とす る標的リガンドを同時に検出または定量する装置を使用することができる。さら に好ましい態様においては、検定プロトコルが要求するならば、一部に遊離／結 合分離溶液または信号発展系の要素のいずれかまたは両者を含み得る、追加の流 体を、流体開口部から装置に添加する。

本発明装置の別の好ましい態様においては、本発明に係る検定方法は、連続的置 換競合的リガンド−レセプタープロトコルとして遂行できる。一部に標識された リガンド類似体複合体を含む試料を、第一流体開口部より添加し、多孔性要素上 に固定されたりガントレセプターと相互作用させる。一部に標本由来の標的リガ ンドを含む追加の流体を、さらなる流体開口部より装置に添加し、多孔性要素上 に固定されたりガントレセプターと複合体形成した標識されたリガンド類似体複 合体を置換させる。装置に添加された流体の総容量が、少なくとも多孔性要素の 中空容積を実質上溝たすに充分である時、その量を超える流体は、多孔性要素、 及び、多孔性要素と非吸収性要素の凹凸模様のある表面との接触によって作られ る毛細管流路のネットワークの間に自然に移動する。次いで、この検定の結果を 、標本由来の標的リガンドによって置換されなかったりガントレセプター領域内 の標識されたリガンド類似体複合体の量を判断することにより決定する。このよ うな独立したりガントレセプター領域が多数存在する場合は、１またはそれ以上 の標的リガンドを検出または定量することが可能である。

本発明のさらなる態様において、本発明に係る免疫クロマトグラフィー法は、開 口部が多孔性要素の先端上部に位置する第一流体開口部を経て、本発明装置に試 料を添加することを含む。多孔性要素の先端は、本発明装置の非吸収性要素の凹 凸模様のある表面の外辺部を越えてこれが伸長するように位置する。試料は、多 孔性要素上に固定されたりガントレセプターに付随する限られた数の結合サイト についての競合を受ける、標本由来の標的リガンド及び標識されたリガンド類似 体複合体を一部に含む。本方法の特に好ましい態様において、凹凸模様のある表 面を越えて伸長している多孔性要素の下面は、試料がこの表面を通り抜けられな いように、密閉されている。試料は、最初の試料導入点に隣接する領域に始まっ て、試料の導入点から遠い多孔性要素の領域へと進んで、実質的に多孔性構造の 中に制限されている多孔性要素を横切る。試料内の標識されたリガンド類似体複 合体および標本由来のリガンドは、多孔性要素の横断の間に、多孔性要素上に非 拡散的に固定されたりガントレセプターを競合する。本発明の好ましい態様にお いて、リガンドレセプターは、第一の要素の全体を通じて実質上均一に固定され ている。特に好ましい態様において、リガンドレセプターは、試料の横断経路に 沿った１またはそれ以上の独立した領域内に均一に固定されている。さらなる特 に好ましい態様において、多数のりガントレセプターが、各々の領域が少なくと も一つのりガントレセプターを含んでいる、多数の独立した領域に固定される。

さらなる特に好ましい態様においては、リガンドレセプターの独立した領域の数 は、少なくとも、測定されるべき独立したリガンドの数と同等に多い。試料によ る多孔性要素の横断の結果、成る容量の遊離／結合標識分離溶液が、さらなる流 体開口部を経て多孔性要素の中央部に加えられ、結合していない標識されたリガ ンド類似体複合体が、多孔性要素上に固定されたりガントレセプターに結合した 標識されたリガンド類似体複合体から分離される。さらなる流体開口部の下の多 孔性要素の部分もまた非吸収性要素の凹凸模様のある表面と接触しており、故に 毛細管流路のネットワークを形成する。充分量の流体が装置内に導入しである時 は、多孔性要素及び毛細管流路のネットワークの間で流体の移動が自然に始まる 。リガンドレセプターが多孔性要素の全体にわたって均一に固定されている、本 発明装置の好ましい態様において、検定結果は、多孔性要素上に固定されたりガ ントレセプターに結合することにより固定された、標識されたリガンド類似体複 合体の存在または不在を決定することによって判断する。リガンドレセプターが 多孔性要素の全体にわたって均一に結合している、さらに好ましい態様において 、標本中に存在するリガンドの量は、標識されたリガンド類似体複合体と複合体 形成している多孔性要素の長さに関係する。リガンドレセプターが多数の独立し た領域内で固定されている、本発明装置の特に好ましい態様においては、標本の 中のリガンドの量は、標識されたリガンド類似体複合体がその中に検出される独 立した領域の数に関係し、係る領域は、流体試料の横断する経路に沿って並んで いる。したがって、試料の中に含まれるリガンドの量は、リガンドレセプターが 多孔性要素全体に実質上均一に固定されている場合は、試料の導入に近接した領 域とこの位置から遠い領域とを連結する弦に沿った標識されたリガンド類似体複 合体と複合体形成している合計の直線距離に関係し得るか、または、リガンドレ セプターが多数のこのような独立したりガントレセプター領域に固定されている 場合は、リガンドレセプターと複合体形成している標識されたリガンド類似体複 合体がその中に検出される独立領域の数に関係し得る。多数のりガントレセプタ ーが多数の独立したレセプター領域内に固定されている態様においては、特定の リガンド特異的レセプター領域内の信号の存在または不在を決定することによっ て、多数の標的リガンドを検出することができる。

本発明に係るさらなる態様において、本発明に係る競合的リガンド−レセプター 法は、第一の流体開口部から装置の多孔性要素に試料を加えることを含むが、こ こで係る試料は、一部にリガンドレセプター、標本由来の標的リガンド及び標識 されたりガント類似体複合体を含む。装置に試料を添加する前に、標本由来の標 的リガンド及び標識されたリガンド類似体複合体は、試料の中にあるリガンドレ セプター上の限られた数の結合サイトについて競合している。装置に加えられる 試料は、多孔性要素上にまたはこれを通って広がり、または毛管作用で運ばれる 。試料の中のりガントレセプターに結合しなかった標的リガンド及び標識された リガンド類似体複合体は、多孔性要素上に固定されたりガントレセプターと結合 することができる。本発明の好ましい態様において、このリガンドレセプターは 多孔性要素の全体にわたって実質上均一に固定されている。特に好ましい態様に おいて、リガンドレセプターは、多孔性要素上の１またはそれ以上の独立した領 域内に均一に固定されている。さらなる特に好ましい態様においては、多数のり ガントレセプターが、各々少なくとも一つのりガントレセプターを含んでいる多 数の独立した領域に固定されている。さらなる特に好ましい態様においては、リ ガンドレセプターの独立領域の数は、少なくとも測定されるべき独立領域の数と 同等に多い。多孔性要素と試料とのインキュベーションの結果、成る容量の遊離 ／結合標識分離溶液が、流体開口部を経て多孔性要素に加えられ、多孔性要素上 に固定されたりガントレセプターに結合した標識されたリガンド類似体複合体を 、多孔性要素上に固定されたりガントレセプターに結合しなかった標識されたリ ガンド類似体複合体から分離させる。多孔性要素から毛細管流路のネットワーク への流体の移動は、多孔性要素に加えられた流体の総容量が多孔性要素の中空容 積を実質上製たす時、開始する。リガンドレセプターが多孔性要素全体にわたっ て均一に固定されている、本発明装置の好ましい態様においては、次いで、多孔 性要素上の固定されたりガントレセプターと複合体形成した、標識されたリガン ド類似体複合体の存在または不在について、多孔性要素を調べることにより、こ の検定の結果を決定する。多数のりガントレセプターが多数の独立領域内に固定 されている、本発明装置の特に好ましい態様においては、どの独立領域が標識さ れたリガンド類似体を固定しているかの決定を行なう。

さらに好ましい態様において、本発明に係る非競合的方法は、試料を第一の流体 開口部から装置の多孔性要素に加えることを含み、このような試料は、一部に、 標本由来の標的リガンドを含む。この試料は、第一の流体開口部によって露出さ れている多孔性要素の上及び中に広がり、次いで多孔性要素の中に入る。試料に 含まれている標的リガンドは、多孔性要素上に固定された第一のリガンドレセプ ターと結合する。好ましい態様において、第一のりガントレセプターは、多孔性 要素全体にわたり実質上均一に固定される。特に好ましい態様において、第一の リガンドレセプターは、第一の要素上の少なくとも一つの独立した領域に固定さ れる。さらなる特に好ましい態様において、多数の第一リガントレセプターは、 各領域が少なくとも一つのりガントレセプターを含んでいる、多数の独立した領 域に固定される。さらなる特に好ましい態様において、独立領域の数は、少なく とも測定されるべき標的リガンドの数と同等に多い。

標的リガンドを、固定された第一のリガンドレセプターと結合させた後、標識さ れた第二のレセプター複合体を含む追加の流体を、さらなる流体開口部から、装 置に添加する。標識された第二のレセプター複合体は、固定された第一リガント レセプターと複合体形成することにより多孔性要素上に固定された標的リガンド と結合する。

遊離／結合標識分離溶液をさらなる流体開口部から装置に加えることにより、多 孔性要素上に固定された標的リガンドと結合しなかった標識された第二のレセプ ター複合体を除去する。流体の移動は、多孔性要素と、多孔性要素及び非吸収性 要素の凹凸模様のある表面の接触によって形成された毛細管流路のネットワーク との間で起こり、多孔性要素に結合した第二のレセプター複合体を、結合してい ない第二のレセプター複合体から分離する役割を有する。必要ならば、結合した 標識された第二レセプター複合体の標識からの信号を検出可能とするために、信 号発展系の要素を含む追加の流体を装置に加える。

試料が一部に、細胞材料から誘導され得る、または恐らく粒子状の結合試薬に吸 着されている、標的リガンドを含む、本発明装置のさらに好ましい非競合的方法 においては、多孔性要素による粒子（例えばラテックス粒子）の物理的捕捉によ ってリガンドの検出を達成する。この方法は、試料を第一の流体開口部から装置 の多孔性要素れている多孔性要素の表面の上に広がり、次いで多孔性要素の中に 入る。試料の中に含まれている標的の被分析物質は、多孔性要素の表面上及び小 孔の中に捕捉されることによって物理的に保持される。

多孔性要素上への標的リガンドの物理的固定の後、標識されたレセプター複合体 を含有する追加の流体を、さらなる流体開口部から装置に添加する。標識された レセプター複合体は、多孔性要素により捕捉された標的リガンドに結合する。多 孔性要素上に固定された標的リガンドに結合しなかった標識されたレセプター複 合体は、遊離／結合標識分離溶液を、さらなる流体開口部より装置に添加するこ とによって除去する。多孔性要素と、多孔性要素及び非吸収性要素の凹凸模様の ある表面の接触によって形成された毛細管流路のネットワークとの間の流体の移 動は、結合している標識されたレセプター複合体を結合していないレセプター複 合体から分離する働きをする。必要ならば、多孔性要素に固定された標識された レセプター複合体の標識からの信号を検出可能とするために、信号発展系の要素 を含む追加の流体を装置に加える。

特に上記態様に言及して本発明を詳細に記述してきた。しかしながら、本発明の 精神及び範囲の中で変化及び修飾を施し得ることは理解できるであろう。

実施例１　エストロン−３−グルクロン−（２−アミノ−Ａ−チオールブタン酸 　チオラクトンツーアミド［Ｅ３Ｇ−ＨＣＴＬ］の製造 エストロン−３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）７７ｍｇ　（１，７ｘｌＯ”ｍｏ　１ ）　、ホモシスティンチオラクトンヒドロクロリド２９ｍｇ　（１，９ｘｌＯ” ｍｏ　ｌ）　、及びピリジン０．０１５ｍ１　（１゜９ｘｌＯ”ｍｏｌ）を、ジ メチルホルムアミド０．４７ｍ１に溶解した。この混合物を、ジメチルホルムア ミド０．２３ｍ１中ジシクロヘキシル力ルボジイミド３０ｍｇ　（１，９ｘｌＯ −’ｍｏ　１）を含有する溶液に加えた。このフラスコをアルゴンで一掃し、密 閉し、２５℃で３時間撹拌した。不溶性の沈澱を濾過し、溶媒を減圧で除いた。

残留物をエタノール／水（１５：　１２ｖ／ｖ）溶液０．４ｍｌに再懸濁し、不 溶性の沈澱を濾過によって除去した。

次に粗反応混合物をエタノール／水（１５・１２ｖ／ｖ）溶液０゜５ｍｌに溶解 し、メタノール／水の１：９混合液で平衡化したＣ１８　ＨＰＬＣカラム（１ｃ ｍ　ｘ　２５ｃｍ）に、流速２．Ｑｍ］／分で適用した。化合物を、メタノール ／水の１：９混合液からメタノール／水の１＝１混合液に至る傾斜をもつ勾配で ８分間溶出し、次いで１００％メタノールまでの勾配でさらに２０分間溶出した 。

Ｅ３Ｇ−ＨＣＴＬは２５分及び２７分の間に溶出した。生成物を含む画分を合し 、溶媒を減圧で除いた。Ｅ３Ｇ−ＨＣＴＬ６３ｍｇを回収した。

モルフィン−牛血清アルブミン複合体の製造アセトニトリル１ｍｌ中ＳＭＣＣ（ ピアス）２０ｍｇを含有する溶液７５μｍを、０．１Ｍホウ酸カリウム、Ｏ，１ Ｍ燐酸カリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７，５）中の２０ｍｇ／ｍｌ 牛血清アルブミン１．９ｍｌに加えた。この溶液を２５℃で１時間撹拌し、次い で０，１Ｍ燐酸カリウム、０．０２Ｍホウ酸カリウム、領１５Ｍ塩化ナトリウム （ｐＨ７，０）中で平衡化したＧＨ２５（アミコン・コーポレーション）を入れ たカラム上のゲル濾過クロマトグラフィーによって、未反応の試薬から蛋白を分 離した。蛋白画分を集めた。容量１．０５ｍ１の０．１２Ｍ水酸化カリウム、３ ０％エタノール中の鉤　６ｍＭ　ＥＤＴＡを、メタノール中の２１０ｍＭ　Ｅ３ Ｇ−ＨＣＴＬ１００μｍに加えた。５分後、この溶液１゜１ｍｌを、ＳＭＣＣで 誘導体化した牛血清アルブミン（６，５ｍｇ／ｍ１）９．２ｍｌに加えた。溶液 を２５℃で２時間撹拌し、次いで１０ｍＭ（２−（Ｎ−モルホリノ））エタンス ルホン酸（ｐＨ５゜０）１１で２回透析した。

Ｅ３Ｇ−コロイド金複合体の製造 フレンス、ネイチャー、フィジカル・サイエンシズ第２４１巻２０頁（１９７３ ）の方法に従って、平均直径４５ｎｍのコロイド金を製造した。Ｏ，ＬＭ　（２ −（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５，８）５．６ｍｌを 、コロイド金５０ｍ１に、すばやく撹拌しながら滴下することにより、Ｅ３Ｇ− コロイド金複合体を製造した。Ｅ３Ｇ−ＢＳＡ複合体（１０ｍＭ　ＭＥＳ中３ｍ ｇ／ｍｌ、０．０２％アジドナトリウム、ｐＨ５，８）を、すばやく撹拌しなが ら一度にコロイド金に加えた。完全に混合された後、撹拌を停止し、溶液を室温 で３０分間インキュベートした。続いてさらに１ｍｌのＢＳＡ　（１０ｍＭ　Ｍ ＥＳ中３ｍｇ／ｍｌ、０．０２％アジドナトリウム、ｐＨ５，８）を混合しなが ら加え、５分間インキュベートした。ポリエチレングリコール（平均分子量＝２ ００００）を１％溶液（０，５９ｍ１）として加え、混合した。このコロイド金 を４℃で２７０００ｇの遠沈に１２分間付し、ペレット化した。上清を除き、ペ レットを、再懸濁し上記のごとく遠沈に付すことにより、３５ｍ１の１０ｍＭ燐 酸カリウム、０．０１％ポリエチレングリコール、０．０２％アジドナトリウム （ｐＨ７，０）で２回洗浄した。最後の遠沈後、ペレットを緩衝液０．５ｍｌに 再懸濁し、４℃で保存した。

装置の組み立て及び遊離／結合複合体の分離の証明ナイロン膜（ポール・イムノ ダイン、０．６５μｍ）を、小さな０．１０インチＸ１，１インチの長方形の第 一流体開口部を中央に型で切り抜いである０、０２０インチのスチレンシートの 下面に重ねた。Ｅ３Ｇに対するモノクローナル抗体を、蛋白結合法；ＩＭＰＯ， ，１００ｍｇ／ｍｌテトラゾール、５ＱｍＭホウ酸塩、１５０ｍＭ　ＮａＣ１， １，５ｍｇ／ｍｌ抗体、ｐＨ７，４、を用いて、第一流体開口部の中に等しい間 隔をとった３個の０．　６μｌの点の連続として、活性化ナイロン膜に共有結合 させた。この膜を１％Ｗ／Ｖカゼインの溶液でブロックし、デシケータ−中で一 夜乾燥した。

乾燥後、この積層した組み立て品を、一連の、幅０．０１４インチ、深さ０．０ ０フインチの縦の９０°のＶ形流路を有するスチレン共重合体の射出成型部品上 に配置した。次いでこの積層物を、射出成型部品に超音波でスポット溶接した。

抗Ｅ３Ｇ抗体に結合していないＥ３Ｇコロイド金複合体の試料６０μｍを、第一 流体開口部の中央に露出している膜に加え、この膜に吸収させた。抗Ｅ３Ｇ抗体 と１００％結合しているＥ３Ｇコロイド金複合体の等分試料６０μｌを、別の装 置の第一流体開口部の中央に加えた。両装置において、複合体が吸収された後、 界面活性剤として０．０５％ルブロールを含有する水性洗浄溶液１００μＩを、 第一流体開口部の中央に露出している膜に加え、膜を通って流れさせた。洗浄工 程の直後に、抗Ｅ３Ｇ抗体の結合していないＥ３Ｇコロイド金複合体を適用した 、第一の装置の膜は、３個の明瞭な赤色のスポットの連続を形成し、残りの膜は 白色に戻った。１００％結合しているＥ３Ｇコロイド金複合体を使用した第二の 装置の膜の場合、膜全体が白色に戻った。これにより、リガンド類似体複合体は 多孔性要素に固定されたりガントレセプターと特異的に結合し、多孔性要素と凹 凸模様のある表面の非吸収性要素との間で形成された毛細管流路のネットワーク は、結合していない試薬を多孔性要素から効率的に洗い去る機能を有することが 証明された。

実施例２　モルフイン−アルカリホスファターゼ複合体の製造スルホ−ＳＭＣＣ （ピアス）３ｍｇ　（６，９ｘｌＯ−’ｍｏ　Ｉ）　を、０．１Ｍ燐酸カリウム 、０．０２Ｍホウ酸カリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（１）Ｈ７，、ｌ）に 入れた４、９ｍｇ／ｍｌアルカリホスファターゼ２．２ｍｌに加えた。この蛋白 溶液を２５℃で１時間撹拌し、次いで、０．１Ｍ燐酸カリウム、０．０２Ｍホウ 酸カリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７，０）で平衡化したＧＨ２５（ アミコン・コーポレーション）４０ｍｌを入れたカラム上のゲル濾過クロマトグ ラフィーにより、未反応のスルホ−ＳＭＣＣから蛋白を分離した。カラムから溶 出する蛋白画分を集めた。４０％メタノール中の０．１２Ｍ炭酸カリウム、０． ６ｍＭ　ＥＤＴＡ２０μＩを、メタノール中の４８．５ｍＭ　Ｅ３Ｇ−ＨＣＴＬ 　１３μｍに添加することにより、Ｅ３Ｇ−ＨＣＴＬを加水分解した。この溶液 を２５℃で１０分間保ち、次いでこの溶液３０μｍを、０．１Ｍ燐酸カリウム、 ０．０２Ｍホウ酸カリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．４ｍＭ塩化マグネ シウム（ｐＨ７，０）中のスルホ−ＳＭＣＣ（３，６ｍｇ／ｍｌ）で誘導体とし たアルカリホスファターゼ２５０μｍに加えた。溶液をｌＮ　ＨＣＩでｐＨ７， ０に調節し、次いで２５℃で３０分間撹拌した。蛋白を、前記のようなゲル濾過 クロマトグラフィーによって未反応の試薬から分離した。蛋白画分を集め、この 複合体を、検定に使用するために、１％牛血清アルブミン、１ｍＭ塩化マグネシ ウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、０．１％アジドナトリウム、及び１０ｍＭ３−（４ −モルホリノ）プロパンスルホン酸（ｐＨ７，−０）を含有する溶液中に希釈し た。

装置の組み立て及び試料添加後の毛細管流路のネットワークの生成 ナイロン膜（ボール・イムノダイン、０．６５μｍ）を、小さな０．１０インチ ｘ１．１インチの長方形の第一流体開口部を中央に型で切り抜いである０、０２ ０インチのスチレンシートの下面に重ねた。Ｅ３Ｇに対するモノクローナル抗体 を、蛋白結合法；１ＭＰＯ４，１００ｍｇ／ｍＩテトラゾール、５０ｍＭホウ酸 塩、１５０ｍＭ　ＮａＣ］、１．５ｍｇ／ｍｌ抗体、ｐＨ７，４、に従って、第 一流体開口部の中に等しい間隔をとった３個の０．６μｍの点の連続として、活 性化ナイロン膜に共有結合させ、次にこの溶液を１％Ｗ／Ｖカゼインの溶液でブ ロックし、デシケータ−中で一夜乾燥した。乾燥後、この積層した組み立て品を 、膜の下面が宙に懸垂するように位置させた。抗Ｅ３Ｇ抗体と結合していない、 Ｅ３Ｇ及びアルカリホスファターゼの複合体の等分試料６０μｍを、第一流体開 口部の中央に露出している膜に加え、膜の中に吸収させた。もう一つの膜積層物 においては、抗Ｅ３Ｇ抗体と１００％結合したＥ３Ｇ−アルカリホスファターゼ 複合体６０μ】を、第一流体開口部の中央に加えた。

次いで、写真エツチングを施したマグネシウム合金板に積層物を個別に乗せた。

この平板は、幅０．０１４インチ、深さ領　００フインチの縦の９０°のＵ形流 路の連続を有した。幅０．０２８インチ、深さ０．００フインチの１２７°のＵ 形流路の連続は、縦の流路に垂直であった。次いで、界面活性剤として０．０５ ％ルブロールを含有する水性洗浄溶液の等分試料１００μｍを、第一流体開口部 の中央に露出した膜に加え、膜を通って流れさせた。この後、可視的な色を生成 することのできるアルカリホスファターゼの基質である、燐酸インドキシル１０ ｍＭを含有する溶液６０μｍを添加した。２分後、抗Ｅ３Ｇ抗体と結合していな いＥ３Ｇ−アルカリホスファターゼ複合体を使用した、第一の装置の膜は、３個 の明瞭な青色のスポットのパターンを形成し、一方予め完全に抗Ｅ３Ｇ抗体と結 合させたＥ３Ｇ−アルカリホスファターゼ複合体を使用した、第二の膜の露出さ れた膜は、白色のままであった。この事により、多孔性要素と凹凸模様のある表 面の非吸収性要素との接触の結果生成する毛細管流路のネットワークは、多孔性 要素への試料の最初の添加の後に形成され得る事が証明された。

実施例３　３−０＝［２−（２−アミノ−４−千オールブタン酸チオラクトン） −アセトアミド］−モルフイン　ヒドロクロリド（モルフイン−ＨＣＴＬ）の製 造 ホモシスティンチオラクトンヒドロクロリド（１２０ｍｇ、７゜８　ｘ　１０− ’ｍｏ　］）　、ピリジン６２ｍｇ　（７，８ｘｌＯ−’ｍｏｌ）、及び３−０ −カルボキシメチルモルフインヒドロクロリド２９６ｍｇ　（７，８ｘｌＯ”ｍ ｏ　１）を、ジメチルホルムアミド５ｍｌに溶解した。次いでジシクロへキシル カルボジイミド１７７ｍｇ　（８゜６ｘｌＯ”ｍｏｌ）を含有するジメチルホル ムアミド溶液１ｍｌを加えた。このフラスコをアルゴンで一掃し、溶液を２５℃ で３時間撹拌した。溶媒を減圧で蒸発させ、水２０ｍ１を残留物に加えた。

溶液を５分間撹拌し、次いで不溶のジシクロへキシルウレアを濾過した。濾液を 塩化メチレン１０ｍ１で洗浄した。水層のｐＨを炭酸カリウムの飽和水溶液で７ に調節した。水性溶液を塩化メチレン１０ｍ１で６回抽出した。合した有機抽出 物を硫酸マグネシウム２ｇで乾燥し、濾過し、溶媒を減圧で除いた。残留物にエ タノール（２０ｍｌ）を加え、減圧下に蒸発させてピリジンを除去した。酢酸エ チル（１０ｍｌ）を加え、不溶の沈澱を濾過した。この溶液に、ｐＨがリドマス 紙に対し赤色を示すまでエーテル性塩酸（ＩＭ）を撹拌しながら加えた。白色固 体を濾過し、酢酸エチルで洗浄した。生成物を減圧乾燥すると収量は３１６ｍｇ であった。

モルフイン−牛血清アルブミン複合体の製造アセトニトリル１ｍｌ中にＳＭＣＣ （ピアス）２０ｍｇを含有する溶液７５μｍを、Ｏ，ＩＭホウ酸カリウム、０． １Ｍ燐酸カリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７，５）に入れた２０ｍｇ ／ｍｌの牛血清アルブミン１．９ｍｌに加えた。この溶液を２５℃で１時間撹拌 し、次いで０．１Ｍ燐酸カリウム、０．０２Ｍホウ酸カリウム、０．１５Ｍ塩化 ナトリウム（ｐＨ７，０）で平衡化したＧＨ２５（アミコン・コーポレーション ）を入れたカラム上のゲル濾過クロマトグラフィーにより、未反応の試薬から蛋 白を分離した。

蛋白画分を集めた。４０％メタノール中の０．１２Ｍ炭酸カリウム、０．６ｍＭ 　ＥＤＴＡｏ、４２ｍ１容量をモルフイン−ＨＴＣＬ４ｍｇに加えた。１０分後 、この溶液１４０μｌを、ＳＭＣＣで誘導体化した牛血清アルブミン（４，６ｍ ｇ／ｍ１）８．２ｒｎｌに加えた。溶液を２５℃で２時間撹拌し、次いで１０ｍ Ｍ（２−（Ｎ−モルホリノ））エタンスルホン酸（ｐＨ５，０）２１で透析した 。透析緩衝液は、モルフイン−ＢＳＡ複合体を集める前に２回交換した。

モルフイン−コロイド金複合体の製造 フレンス、ネイチャー、フィジカル・サイエンシズ第２４１巻２０頁（１９７３ ）の方法に従って、平均直径４５ｎｍのコロイド金を製造した。Ｏ，ＩＭ　（２ −（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５，８）５．６ｍｌを 、コロイド金５０ｍ１ｌ：、すばやく撹拌しながら滴下することにより、モルフ イン−コロイド金複合体を製造した。モルフイン−ＢＳＡ複合体（１０ｍＭ　Ｍ ＥＳ中３ｍｇ／ｍｌ、１０２％アジドナトリウム、ｐＨ５，８）を、すばやく撹 拌しながら一度にコロイド金に加えた。完全に混合された後、撹拌を停止し、溶 液を室温で３０分間インキュベートした。

続いてさらに１ｍｌのＢＳＡ　（１０ｍＭ　ＭＥＳ中３ｍｇ／ｍＬ０．０２％ア ンドナトリウム、ｐＨ５，８）を混合しながら加え、５分間インキュベートした 。ポリエチレングリコール（平均分子量＝２００００）を１％溶液（０，５９ｍ １）として加え、混合した。

このコロイド金を４℃で２７０００ｇの遠沈に１２分間付し、ペレット化した。

上清を除き、ペレットを、再懸濁し上記のごとく遠沈に付すことにより、１０ｍ Ｍ燐酸カリウム３５ｍ１．０．０１％ポリエチレングリコール、０．０２％アジ ドナトリウム（ｐＨ７，０）３５ｍｌで２回洗浄した。最後の遠沈後、ベレット を緩衝液０．５ｍｌに再懸濁し、４℃で保存した。

免疫クロマトグラフィー装置の組み立て及び免疫クロマトグラフィー効果の立証 ナイロン膜（ポール・バイオダイン　Ｃ５，０μｍ）を、小さな０．１０インチ ｘ１．１０インチのさらなる流体開口部及び０゜１０インチｘＯ，１０インチの 第一流体開口部を型で切り抜いである０、０２０インチのスチレンシートの下面 に重ねた。１％ポリビニルアルコール（２０００ＭＷ）　、５０ｍＭクエン酸、 １．１７ｍｇ／ｍｌ抗体（ｐＨ３，０）を含有する溶液からの吸着によって、モ ルフインに対するモノクローナル抗体を、膜上に固定し、次いでこの膜を０．　 １％Ｗ／Ｖカゼイン及び１％ポリビニルアルコール（２０００ＭＷ）の溶液でブ ロックし、次にデシケータ−中で一夜乾燥した。乾燥後、この積層した組み立て 品を、一連の、幅０．０１４インチ、深さ０．００フインチの縦の９０°の■形 流路を有するスチレン共重合体の射出成型部品上に配！した。次いでこの積層物 を、第一流体開口部の下の膜が非吸収性感染成型部品の凹凸模様のある表面と接 触しないように、射出成型部品に超音波でスポット溶接した。

次に、一連のモルフイン−コロイド金複合体（相対的濃度２．１゜３及び１）の 等分試料６０μｌを、上記３つの装置の各々の第一流体開口部に加えた。複合体 が開口部の長さ全体を移動した後、界面活性剤として０，０５％ルブロールを含 有する水性洗浄溶液１００μｍを、さらなる流体開口部の中央に加え、膜を通っ て流れさせた。

洗浄工程の完了後直ちに、さらなる流体開口部内の膜上に赤色領域が現われた。

赤色領域の長さは、モルフイン−コロイド金複合体の濃度に従って異なった。こ の事は、試料の中の標識された種は、多孔性要素の一方の端に導入されて、多孔 性要素に沿った固定されたりガントレセプターと反応させられることを証明して いる。

ＦＩＧ、　Ｉ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、　８ 国際調査報告 特表千４−５０６１１７　（２６）

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．試料が上面に適用される、上面及び下面を有する多孔性要素及び、 該多孔性要素の下または回りに連絡するように位置する時、毛細管流路のネット ワーク（ただしこの毛細管ネットワークは該多孔性要素の下面に対し実質上平行 である）を形成することのできる流路を持つ凹凸模様のある表面を有する非吸収 性要素；からなり、それにより、単独または他の流体と組み合わされた試料が、 該多孔性要素の実質上全ての中空容積が該試料及び／または流体で満たされ、且 つ該多孔性要素及び該非吸収性要素の間に接触が起こる時、該多孔性要素と該非 吸収性要素との間に形成される該毛細管ネットワークに、該多孔性要素を通って 導かれる、少なくとも一つの標的リガンドを含有することが疑われる試料を検定 するための装置。
2. ２．試料が上面に適用され、ここで少なくとも一つの結合試薬が直接または間接 的に結合している、上面及び下面を有する多孔性要素；及び、 該多孔性要素の下または回りに連絡するように位置する時、毛細管流路のネット ワーク（ただしこの毛細管ネットワークは該多孔性要素の下面に対し実質上平行 である）を形成することのできる流路を持つ凹凸模様のある表面を有する非吸収 性要素；からなり、それにより、単独または他の流体と組み合わされた試料か、 該多孔性要素の実質上全ての中空容積が該試料及び／または流体で満たされ、且 つ該多孔性要素及び核非吸収性要素の間に接触が起こる時、該多孔性要素と該非 吸収性要素との間に形成される該毛細管ネットワークに、該多孔性要素を通って 導かれる、少なくとも一つの標的リガンドを含有することが疑われる試料を検定 するための装置。
3. ３．試料が上面に適用され、ここで少なくとも一つのリガンドレセプターが直接 または間接的に結合している、上面及び下面を有する多孔性要素；及び、 該多孔性要素の下または回りに連絡するように位置する時、毛細管流路のネット ワーク（ただしこの毛細管ネットワークは該多孔性要素の下面に対し実質上平行 である）を形成することのできる流路を持つ凹凸模様のある表面を有する非吸収 性要素；からなり、それにより、単独または他の流体と組み合わされた試料が、 該多孔性要素の実質上全ての中空容積が該試料及び／または流体で満たされ、且 つ該多孔性要素及び該非吸収性要素の間に接触が起こる時、該多孔性要素と該非 吸収性要素との間に形成される該毛細管ネットワークに、該多孔性要素を通って 導かれる、少なくとも一つの標的リガンドを含有することが疑われる試料を検定 するための装置。
4. ４．試料が上面に適用される、上面及び下面を有する多孔性要素及び、 該多孔性要素の下または回りに連絡するように位置する時、毛細管流路のネット ワーク（ただしこの毛細管ネットワークは該多孔性要素の下面に対し実質上平行 である）を形成することのできる流路を持つ凹凸模様のある表面を有する非吸収 性要素；からなり、それにより、単独または他の流体と組み合わされた試料が、 該試料の容量が単独または他の流体と組み合わされて該多孔性要素の中空容積を 実質上超え、且つ該多孔性要素及び該非吸収性要素の間に接触が起こる時、該多 孔性要素と該非吸収性要素との間に形成される該毛細管ネットワークに、該多孔 性要素を通って導かれる、 少なくとも一つの標的リガンドを含有することが疑われる試料を検定するための 装置。
5. ５．試料が上面に適用され、ここで少なくとも一つの結合試薬が直接または間接 的に結合している、上面及び下面を有する多孔性要素；及び、 該多孔性要素の下または回りに連絡するように位置する時、毛細管流路のネット ワーク（ただしこの毛細管ネットワークは該多孔性要素の下面に対し実質上平行 である）を形成することのできる流路を持つ凹凸模様のある表面を有する非吸収 性要素；からなり、それにより、単独または他の流体と組み合わされた試料が、 該試料の容量が単独または他の流体と組み合わされて該多孔性要素の中空容積を 実質上超え、且つ該多孔性要素及び該非吸収性要素の間に接触が起こる時、該多 孔性要素と該非吸収性要素との間に形成される該毛細管ネットワークに、該多孔 性要素を通って導かれる、 少なくとも一つの標的リガンドを含有することが疑われる試料を検定するための 装置。
6. ６．試料が上面に適用され、ここで少なくとも一つのリガンドレセプターが直接 または間接的に結合している、上面及び下面を有する多孔性要素；及び、 該多孔性要素の下または回りに連絡するように位置する時、毛細管流路のネット ワーク（ただしこの毛細管ネットワークは該多孔性要素の下面に対し実質上平行 である）を形成することのできる流路を持つ凹凸模様のある表面を有する非吸収 性要素；からなり、それにより、単独または他の流体と組み合わされた試料が、 該試料の容量が単独または他の流体と組み合わされて該多孔性要素の中空容積を 実質上超え、且つ該多孔性要素及び該非吸収性要素の間に接触が起こる時、該多 孔性要素と該非吸収性要素との間に形成される該毛細管ネットワークに、該多孔 性要素を通って導かれる、 少なくとも一つの標的リガンドを含有することが疑われる試料を検定するための 装置。
7. ７．（ａ）試料が上面に適用される、上面及び下面を有する多孔性要素；及び、 （ｂ）該多孔性要素の下または回りに連絡するように位置する時、毛細管流路の ネットワーク（ただしこの毛細管ネットワークは該多孔性要素の下面に対し実質 上平行である）を形成することのできる流路を持つ凹凸模様のある表面を有する 非吸収性要素；（ｃ）開口部に適用された流体が毛管作用により該多孔性要素（ ｂ）の上及び／または中に運ばれるような、少なくとも一つの開口部を有する、 該多孔性要素（ａ）の実質上上または実質上回りに配置された非吸収性第三要素 ；からなり、そしてそれにより、単独または他の流体と組み合わされた試料が、 該多孔性要素の実質上全ての中空容積が該試料及び／または流体で満たされ、且 つ該多孔性要素及び該非吸収性要素の間に接触が起こる時、該多孔性要素と該非 吸収性要素との間に形成される該毛細管ネットワークに、該多孔性要素を通って 導かれる、少なくとも一つの標的リガンドを含有することが疑われる試料を検定 するための装置。
8. ８．（ａ）試料が上面に適用され、ここで少なくとも一つの結合試薬が直接また は間接的に結合している、上面及び下面を有する多孔性要素；及び、 （ｂ）該多孔性要素の下または回りに連絡するように位置する時、毛細管流路の ネットワーク（ただしこの毛細管ネットワークは該多孔性要素の下面に対し実質 上平行である）を形成することのできる流路を持つ凹凸模様のある表面を有する 非吸収性要素；（ｃ）開口部に適用された流体が毛管作用により該多孔性要素（ ｂ）の上及び／または中に運ばれるような、少なくとも一つの開口部を有する、 該多孔性要素（ａ）の実質上上または実質上回りに配置された非吸収性第三要素 ； からなり、そしてそれにより、単独または他の流体と組み合わされた試料が、該 多孔性要素の実質上全ての中空容積が該試料及び／または流体で満たされ、且つ 該多孔性要素及び該非吸収性要素の間に接触が起こる時、該多孔性要素と該非吸 収性要素との間に形成される該毛細管ネットワークに、該多孔性要素を通って導 かれる、少なくとも一つの標的リガンドを含有することが疑われる試料を検定す るための装置。
9. ９．（ａ）試料が上面に適用され、ここで少なくとも一つのリガンドレセプター が直接または間接的に結合している、上面及び下面を有する多孔性要素；及び、 （ｂ）該多孔性要素の下または回りに連絡するように位置する時、毛細管流路の ネットワーク（ただしこの毛細管ネットワークは該多孔性要素の下面に対し実質 上平行である）を形成することのできる流路を持つ凹凸模様のある表面を有する 非吸収性要素；（ｃ）開口部に適用された流体が毛管作用により該多孔性要素（ ｂ）の上及び／または中に運ばれるような、少なくとも一つの開口部を有する、 該多孔性要素（ａ）の実質上上または実質上回りに配置された非吸収性第三要素 ； からなり、そしてそれにより、単独または他の流体と組み合わされた試料が、該 多孔性要素の実質上全ての中空容積が該試料及び／または流体で満たされ、且つ 該多孔性要素及び該非吸収性要素の間に接触が起こる時、該多孔性要素と該非吸 収性要素との間に形成される該毛細管ネットワークに、該多孔性要素を通って導 かれる、少なくとも一つの標的リガンドを含有することが疑われる試料を検定す るための装置。
10. １０．（ａ）試料が上面に適用される、上面及び下面を有する多孔性要素； （ｂ）該多孔性要素の下または回りに連絡するように位置する時、毛細管流路の ネットワーク（ただしこの毛細管ネットワークは該多孔性要素の下面に対し実質 上平行である）を形成することのできる流路を持つ凹凸模様のある表面を有する 非吸収性要素；（ｃ）開口部に適用された流体が毛管作用により該多孔性要素（ ｂ）の上及び／または中に運ばれるような、少なくとも一つの開口部を有する、 該多孔性要素（ａ）の実質上上または実質上回りに配置された非吸収性第三要素 ； からなり、そしてそれにより、該試料の容量が単独または他の流体と組み合わさ れて該多孔性要素の中空容積を実質上超え、且つ該多孔性要素及び該非吸収性要 素の間に接触が起こる時、単独または他の流体と組み合わされた試料が、該多孔 性要素と該非吸収性要素との間に形成される核毛細管ネットワークに、該多孔性 要素を通って導かれる、 少なくとも一つの標的リガンドを含有することが疑われる試料を検定するための 装置。
11. １１．（ａ）試料が上面に適用され、ここで少なくとも一つの結合試薬が直接ま たは間接的に結合している、上面及び下面を有する多孔性要素； （ｂ）該多孔性要素の下または回りに連絡するように位置する時、毛細管流路の ネットワーク（ただしこの毛細管ネットワークは該多孔性要素の下面に対し実質 上平行である）を形成することのできる流路を持つ凹凸模様のある表面を有する 非吸収性要素；（ｃ）開口部に適用された流体が毛管作用により該多孔性要素（ ｂ）の上及び／または中に運ばれるような、少なくとも一つの開口部を有する、 該多孔性要素（ａ）の実質上上または実質上回りに配置された非吸収性第三要素 ； からなり、そしてそれにより、該試料の容量が単独または他の流体と組み合わさ れて該多孔性要素の中空容積を実質上超え、且つ該多孔性要素及び該非吸収性要 素の間に接触が起こる時、単独または他の流体と組み合わされた試料が、該多孔 性要素と該非吸収性要素との間に形成される該毛細管ネットワークに、該多孔性 要素を通って導かれる、 少なくとも一つの標的リガンドを含有することが疑われる試料を検定するための 装置。
12. １２．（ａ）試料が上面に適用され、ここで少なくとも一つのリガンドレセプタ ーが直接または間接的に結合している、上面及び下面を有する多孔性要素； （ｂ）該多孔性要素の下または回りに連絡するように位置する時、毛細管流路の ネットワーク（ただしこの毛細管ネットワークは該多孔性要素の下面に対し実質 上平行である）を形成することのできる流路を持つ凹凸模様のある表面を有する 非吸収性要素；　（ｃ）開口部に適用された流体が毛管作用により該多孔性要素 （ｂ）の上及び／または中に運ばれるような、少なくとも一つの開口部を有する 、該多孔性要素（ａ）の実質上上または実質上回りに配置された非吸収性第三要 素； からなり、そしてそれにより、該試料の容量が単独または他の流体と組み合わさ れて該多孔性要素の中空容積を実質上超え、且つ該多孔性要素及び該非吸収性要 素の間に接触が起こる時、単独または他の流体と組み合わされた試料が、該多孔 性要素と該非吸収性要素との間に形成される該毛細管ネットワークに、該多孔性 要素を通って導かれる、 少なくとも一つの標的リガンドを含有することが疑われる試料を検定するための 装置。
13. １３．該リガンドレセプターが、該標的リガンドと結合することのできるモノク ローナル抗体である、請求項３または６または９または１２に記載の装置。
14. １４．該多孔性要素がナイロン膜である請求項１または２−１２に記載の装置。
15. １５．請求項２、３、５、６、８、９、１１または１２の装置を使用して非競合 的リガンドレセプター検定を実施する方法であって、（ａ）或る容量の該試料を 該装置に適用し；（ｂ）該標的リガンド及び結合した該結合試薬の間に形成され た複合体と結合することのできる、標識された第二の結合試薬の或る容量を加え ；そして、 （ｃ）洗浄して、過剰の標的リガンド及び／または過剰の流体を除去する、 工程からなる方法。
16. １６．請求項３、６、９または１２の装置を使用して競合的リガンドレセプター 検定を実施する方法であって、（ａ）少なくとも一つの該標的リガンド、及び、 該多孔性要素において結合している該リガンドレセプターへの結合を該標的リガ ンドと競合することのできる、少なくとも一つの標識されたリガンド類似体、を 含む、該試料のある容量を、該装置に適用し；（ｂ）標識された該リガンド類似 体を、結合している該リガンドレセプターに結合させ；そして、 （ｃ）洗浄して、過剰の標的リガンド及び／または過剰の流体を除去する、 工程からなる方法。
17. １７．該試料中の該標的リガンドが、該多孔性要素において結合している該結合 試薬への結合を、標識されたリガンドレセプター複合体と競合することのできる リガンドレセプターである、請求項３、６、９または１２の装置を使用して競合 的リガンドレセプター検定を実施する方法であって、 （ａ）少なくとも一つの該標的リガンド及び少なくとも一つのリガンドレセプタ ー複合体を含む、該試料の成る容量を、該装置に適用し； （ｂ）標識された該リガンドレセプターを、結合している該リガンドレセプター に結合させ； （ｃ）洗浄して、過剰の標的リガンド及び／または過剰の流体を除去する、 工程からなる方法。