PT97000B - Dispositivo para metodos ligando-receptor - Google Patents

Description

Âmbito do Invento

Este invento pertence ao campo dos dispositivos para testes, incluindo dispositivos para métodos 1igando-receptor que são usados para a detecção ds analitos seleccionados numa amostra de fluido vos para

Em particular, este invento di;

a r sa1i za ç â o respeito a dispositiuma

Os testes ds fase sólida exigindo separação de reagentes marcados ligados de não-ligados. dispositivos do invento aqui descritos podem ser usados na realização de testes para determinações qualitativas, semi-quantitativas ou quantitativas de um ou mais analitos no âmbito de um único formato de teste.

Antec edentes do 1nvento de

Na acepção em que aqui é usado, o termo teste ligando-receptor diz respeito a um teste para um analito que pode ser detectado pela formação de um complexo entre um ligando e uma outra substância capaz de interacção específica, com esse ligando, i s to é, um r ec ep to r de 1i gando. analito ou uma substância que,

1igando pode ser próprio raso seja detectada, pode ser usada para inferir a presença do analito numa amostra. No contexto do presente invento, o termo ligando inclui haptenos, hormonas, antigenes, ãcido desoxirribonucleico <DNA.'J, ácidos ribonucleicos <RNA>, metabolitos dos materiais atrás referidas e outras substâncias de origem natural ou sintética que podem ter interesse diagnóstico e possuir um parceiro de ligação específico, isto é, o receptor de .ligando no teste 1igando-receptor. 0 termo receptor de ligando” inclui materiais para os quais existe um parceiro de ligação especifico, isto é, o ligando do teste 1igando-receptor. Os especialxstas na técnica apreciarão que o analito em causa, um membro de um par de ligação específico, pode ser o ligando ou o receptor de ligando», de acordo com o» modo» como »o teste foi concebido.

Os testes 1igando-receptor são, de um modo geral, úteis na determinação invi tro da presença e/ou concentração de ligandos em fluidos oto corpo, produtos alimentares e amostras ambientais. Por exemplo, a determinação de hormonas, proteínas, medicamentos e toxinas específicos em fluidos d»;.· corpo humano melhorou significativamente a capacidade da medicina para diagnosticar e medicamentar seres humanos. Existe uma necessidade permanente de testes simples, rápidos e não-instrumentais para a determinação qualitativa e semi-quantitativa de tais ligandos numa amostra. Esta necessidade de métodos simples e rápidos implica concomitantemente uma necessidade de dispositivos de teste para complementar tais métodos de teste. Além disso, em muitos situações, esses métodos de teste precisam de ser suficíentemente simples para poderem ser realizados e interpretados por utilizadores não-especialistas, sem que haja necessidade de recorrer a equipamentos caros e complexos que sã»c» apenas adequados para utilização num ambiente de laboratório por pessoal a 1 tamente qua lific ado.

Os testes 1igando-receptor baseiam—se na ligaçã»a dos ligandos a receptores para a determinação da concentração dos ligandos numa amostra. Os testes 1igando-receptor podem ser caracterizados como competi tivos ou não-competitivos. Nos testes não competi ti vos, utilizam-se geralmente receptores num excess»a substancial relativamente á quantidade de ligando a determinar. Os testes sanduíche (sandwich assays), em que »o ligando é detectado por ligação a dois receptores, um receptor marcado de modo a permitir a detecção e um segundo receptor tipicamente ligado a uma fase sólida a fim de facilitar a separação dos reagentes ligados dos não-ligados, tal como o primeiro receptor

marcado não-ligado, são exemplos de testes 1igando-receptor não- competi tivos. Proteínas, hormonas s ácido deso.xirribonuc leico (DNA) são exemplos de ligandos vulgarmente detectados usando testes 1igando-receptor não™competi tivos. Os testes competitivos envolvem, de um modo geral, ligando da amostra, um análogo de ligando marcado de modo a permitir a detecção, e a destas espécies por um número limitado de locais 1igando-receptor. Exemplos de ligandos gue são medidos por meio de testes 1igando-receptor competitivos incluem haptenos, hormonas e proteínas. Anticorpos que se ligam a estas classes de ligandos são usados com frequência como receptores de ligando, tanto nos testes competitivos como nos testes não-compet i t i vos.

competição de ligação vulgarmente ff

Os testes 1igando-receptor podem ainda ser descritos como sendo homogéneos ou heterogéneos. Nos testes homogéneos, todos os reagentes que participam na reacção são misturados e a quantidade de ligando é determinada através do seu efeito sobre os processos de ligação envolvendo a. espécie marcada. 0 sinal observado é modulado pela extensão desta ligação e pode ser relacionado com a quantidade de ligando presente na amostra. A Patente dos E.U.A. N2 3,817,837 descreve um teste imunitário competitivo homogéneo deste tipo em que o análogo de ligando marcado é um conjugado 1igando-enzima e o receptor de ligando é um anticorpo capaz de se ligar, quer ao ligando, quer ao análogo de ligando. A ligação do anticorpo ao conjugado 1igando-enzima diminui a actividade da enzima relativamente á actividade obser vada quando o conjugado 1igando-enzima se encontra no estado não-ligado. Devido ã competição entre ligando não ligado e conjugado 1igando-enzima pelos locais de ligação do anticorpo, à medida que a concentração de ligando aumenta, aumenta a quantidade de conjugado 1igando-enzima livre e consequentemente aumenta o sinal observado. 0 produto da reacção enzimática pode depois ser medido cineticamente usando um espectrofotómetro.

Os testes 1igando-receptor heterogéneos exigem uma separação do receptor de ligando marcado ou do análogo de ligando marcado ligados do receptor de ligando marcado ou do análogo de ligando marcado livres, e a subsequente medição da fracção ligada ou da fracção livre. Métodos de realização destes testes competitivos heterogéneos são descritos nas Patentes dos E.U.A. NS 3,654,090, 4,298,685 e 4,506,009 ;

descrito na Patente dos E.U.A. N2 um tal teste não-competitivo é 4,376,110.

A necessidade de testes 1igando-receptor que possam ser realizados sem ser necessário recorrer a instrumentação levou ao desenvolvimento de dispositivos de teste que possam ser interpretados v i sua. 1 men te. As Pa t en tes dos E. U. A. N.2 4,125,372, 4,200,690, 4,246,339, 4,366,241, 4,446,232, 4,477,576, 4,496,654, 4,632,901, 4,727,019 e 4,740,468 des cr evem d i spos i t i vos e mé todos para testes 1igando-receptor heterogéneos que dão lugar a respostas coloridas a fim de permitir uma interpretação visual dos resultados.

Entre os primeiros dispositivos desenvolvidos para testes 1igando-receptor estavam simples dispositivos do tipo dipstick, concebidos de modo a permitir o contacto de um material poroso tal como uma membrana tanto com a amostra como com os reagentes marcados por meio de imersão, deixando que tivessem lugar as incubações de reagente apropriadas, procedendo-se depois à separação do marcador livre do que estava ligado por meio de uma etapa de lavagem. Estes dispositivos são descritos nas Pa tentes oos E. U. A. 8,716*, 192, 4,200, &9O e 4,168,14b e nos Pedidos de Patente do EPO N2 0 032 2-36 e 0 063 810. Uma carac te rás ti ca comum que distingue os í i spos i t i Vi concebidos segundo

formato dipstxck é a ausência de uma zotta de recepção de fluido, no interior do dispositivo para conter a amostra, reagentes líquidos e soluções de lavagem após a realização das incubações da amostra e reagente e da separação do marcador livre do marcador ligado. A ausência de uma tal zona de recepção de fluido, impede a caracterização destes dispositivos do tipo dipstxck como sendo Π © C & 3 3 Â F ’i O autónomos <seif-contained), na medida em que fornecer um receptor de fluido externo a fim capturar a amostra usada, fluido de lavagem usado.

© de

O reagentes marcados não ligados e

Uma classe de dispositivos que constitui um aprefeiçoamento relativamente ao simples dispositivo do tipo dipstxck é a dos dispositivos de banda para teste imunocromafogrãfico <immunochromatographic test strip devxce>. Esta classe de dispositivos apresenta, de um modo geral, uma maior sensibi1 idade na detecção de ligandos relativamente à dos simples dispositivos do tipo dipstxck, em virtude do efeito de concentração de ligando obtido pelo fluir da amostra contendo o ligando por uma zona de receptor de ligando imobilizado. Estes dispositivos proporcionam também uma zona de recepção de fluido reduzida, para os fluidos usados na realização do teste. Uma zona de recepção de fluido é criada aumentando o comprimento do membro poroso a fim de proporcionar um valor adequado de capacidade de volume vazio total. Tais dispositivos são descritos nas Patentes dos E.U.A. M2 4,034,647, 4,235,601, 4,361,537, 4,366,241, 4,435,504, 4,624,329, 4,740,468, 4,7.56,325! e 4,757,004,* Pedidos de Patente do EPO N.2 0 267 006, 0 271 204 e 0 239 425 J e Pedido de Patente PCT N2 US86/0668. Apesar desses dispositivos imunocromatogrãficos incluírem uma zona reduzida de recepção de fluido, não permitem uma separação marcador 1ivre/marcador ligado eficaz, uma vez que a taxa de separação é baixa e está limitada pela taxa a que o fluido percorre o comprimento do membro poroso. Alguns

dispositivos imunocromatográficos estão tão limitados pela capacidade da sua zona de fluido que não é possível realizar qualquer separação marcador 1ivre/marcador ligado) tais dispositivos dependem do aumento da concenfração de marcador na zona de receptor de ligando imobilizado para distinguir marcador ligado de marcador não ligado. Existe a necessidade de um dispositivo gue seja ao mesmo tempo eficaz e rápido na realização da separação do marcador livre do marcador ligado num teste.

Uma forma especializada de um dispositivo imunocromatográf ico é utilizada no método do teste imunitário de parti cão radial (radial partition isnmunoassay > . Neste método de teste, a amostra e os reagentes marcados são aplicados cuidadosamente à zona de receptor imobilizado no centro do material poroso. 0 fluido de lavagem é depois aplicado também d© forma cuidadosa à zona de receptor imobilizado e o marcador não ligado flui radialmente, afastando-se da zona central de receptor imobilizado. Os dispositivos de teste imunitário de partição radial exigem, tal como os dispositivos imunocromatográficos atrás referidos, qu© o volume de fluido de lavagem seja inferior ao volume vazio total do membro poroso que contém o receptor de ligando, uma vez que é o volume vazio do membro poroso que excede o volume da amostra que proporciona a capacidade de fluido adicional

Estes dispositivos de teste .imunitário de partição descritos nas Patentes dos E.U.A. N£ 4,517,288,

4,752,552, 4,774,174 e 4,786,505. Os dispositivos usados para testes imunitários de partição radial não são, de um modo geral, adequados para a. detecção de uma multiplicidade de ligandos. A zona de detecção de ligando utilizável tem necessariamente de ser relativamente pequena e restrita, uma vez que a separação física das espécies marcadas livre e ligada está estritamente limitada pelas dimensões do dispositivo e pela capacidade de fluido total do membro poroso.

necessária, adiai são 4,670,881,

imunitários de partição radial dependem essencialmente da separação horizontal, isto é, ao longo ou no plano do membro poroso, das espécies livre e ligada de modo a ser obtida uma separação física aceitável dos reagentes marcados livres dos gue foram marcados. Uma classe distinta de dispositivos utiliza o fluxo de fluido numa direcção essencialmente transversal relativamente ao plano do membro poroso. Os dispositivos gue funcionam deste modo podem, de um modo geral, ser referidos como sendo dispositivos de fluxo transversal (flow-through). 0 material absorvente gue constitui a zona de recepção de fluídos nestes dispositivos pode estar, quer em contacto não-contínuo com o membro poroso contendo o receptor imobilizado, E.U.A. N2 3,388,623 e 4 membro poroso, tal como 4,336,241, 4,446,232, Patente do EPO N2 0 2 absorvente não está em como se descreve nas Patentes dos E.U.A. N<

tal como se descreve nas Patentes dos ,246,333, quer em contacto continuo com o se descreve nas Patentes dos E.U.A. NS 4,632,301 e 4,727,013 e no Pedido de :81 201. Os dispositivos em que a parte contacto continuo com o membro poroso, tal ,883,623 e 4,246,333

permitem que as soluções contendo a amostra e/ou reagentes marcados entrem em contacto com o membro poroso antes de permitir o fluxo da solução de reagente marcado para o absorvente de fluido. Uma vez que o contacto entre a parte absorvente e o membro poroso não é continuo, o volume de fluido necessário para garantir que o membro poroso está completamente saturado é apenas o volume vazio do membro poroso, não-contínuo são intrinsecamente

Estes dispositivos de contacto mais eficientes na utilização da amostra e dos reagentes do ponto de vista do fluxo tranversal de c desc r i tos nas Pa ten tes 4,727,013. No entanto, contacto não-contínuo marcados, apresentando por isso vantagens custo relativamente aos dispositivos de ontacto continuo, tais como os que são dos E.U.A. N2 4,446,232, 4,632,301 e os dispositivos de fluxo transversal de apresentam a desvantagem de exigirem um

ÍO movimento físico por parte da pessoa que realiza o teste para pôr em contacte parte absorvente separada e memfor<

poroso i permitindo desse modo ção do marcador livr fluxo de fluido necessário para a separa™ io marcador ligado. A exigência de uma intervenção mecânica directa não é desejável, numa perspectiva de facilitar a uti1ização do dispositivo por utilizadores não-especial istas, na medida em que introduz um passo que pode estar sujeito a erro. Os dispositivos de fluxo transversal de contacto contínuo eliminam a necessidade de uma intervenção activa por parte do utilizador para completar o contacto de fluidos entre a parte absorvente e o membro poroso, mas são menos eficazes do ponto de vista da utilização de reagentes marcados dispendiosos. As características de fluxo destes dispositivos são optimizadas, de tal modo que se prefere o fluxo de fluido numa direcção transversal relativamente ao plano do membro poroso. Assim, é necessário um volume de reagente substancialmente maior do que o volume vazio do membro poroso para garantir que a totalidade do membro poroso entra em contacto com a solução contendo os reagentes. Uma. vez que nem os dispositivos de fluxo transversal de contacto não-contínuo, nem os de contacto continuo, descritos na técnica anterior são capazes de proporcionar um dispositivo que apresente características tanto de utilização eficiente dos reagentes marcados, como de eliminação da necessidade de um passo adicional de intervenção mecânica, continua a existir uma necessidade não preenchida de um dispositivo com esses atributos.

Os dispositivos do invento aqui descritos não se restringem quer a um método de fluxo transversal, quer a um método imunocromatográfico, podendo antes ser modificados de modo a obter as vantagens de ambos mediante, por exemplo, o controlo da colocação da amostra ou a concepção e colocação dos membros poroso e não-absorvente. Em realizações preferidas, o fluxo de reagente é essencialmente tangencial à membrana porosa, enquanto

. Í?C-V' que o fluxo de reagente de lavagem é essencialmente transversal relatívamente á canais capilares membrana e depois para o interior da rede de Estas características distinguem este invento dos dispositivos de fluxo tranversal e imunocromatográficos da téc n i c a an ter i o r.

controlo da taxa e do percurso do fluxo do fluido num dispositivo de teste pode ter uma. importância crucial. Para alcançar este objectivo, uma série de dispositivos têm sido descritos na técnica anterior que utilizam superfícies com elementos geométricos dispostos de modo especifico a fim de permitir o controlo do percurso e da taxa de fluxo do fluido. Dispositivos deste tipo são descritos nas Patentes dos E.U.A. NS 3,690,836 e 4,426,4-51 e o Pedido de Patente do EPO NS 0 034 049 utiliza uma disposição em que um membro poroso é colocado entre folhas planas de superfície lisa de um material não-absorvente de modo a conter um fluido no interior do material poroso. Dispositivos tais como os que são descritos nas patentes dos E.U.A. NS 4,233,029 e 4,310,399 utilizam disposições geométricas de canais capilares para modular o fluxo do fluido, de modo que o fluido é dirigido de forma a fluir segundo padrões geométricos regulares e a taxas controladas. Um dispositivo para controlar o fornecimento de fluido a um membro poroso que utiliza uma superfície provida de textura que possui uma rede capilar à superfície é descrito no Pedido de Patente do EPO NS O 239 174. Embora dispositivos descritos sejam adequados para controlar o fluxo fluido, eles não permitem controlar o fluxo de fluido através um membro poroso de modo a permitir a construção de dispositivos de teste que utilizem de forma eficiente a amostra e os reagentes marcados e que contenham uma zona de recepção de fluido adequada para ser usada na. obtenção de uma separação rápida e eficaz da espécie livre da espécie ligada num teste. Permanece assim uma necessidade que não foi até agora preenchida por qualquer um dos os de de .1.2

dispositivos atrás referidos de fluxo controlado pela sua arquitectura.

Um dispositivo preferido para a realização de testes ligando-receptor não deve implicar a necessidade de uma intervenção mecânica durante a realização do teste, uma vez gue tal pode introduzir um erro devido ao operador. Os dispositivos do invento aqui descritos e reivindicados são eficientes na sua utilização da amostra e de reagentes dispendiosos e proporcionam uma zona de recepção de fluido adequada para todos os reagentes líquidos, em particular para os da etapa de separação livre/ligado do teste. Os dispositivos suportam testes ligando-receptor que se destinam á detecção simultânea de uma multiplicidade de 1igandos-alvo e podem ser usados em tipos de testes ligando-receptor análogos, tanto aos testes de fluxo transversal, como aos testes imunocromatogrâíicos.

Uma vantagem dos dispositivos aqui descritos consiste na utilização eficiente dos reagentes, ao mesmo tempo que o protocolo do teste envolve um número mínimo de passos. 0 dispositivo permite a utilização de uma membrana porosa de grandes dimensões e a sua cobertura com zonas de recepção de ligando múltiplas, uma vez que garante o fluxo da amostra sobre a membrana e a sua cobertura total por aquela. Isto é conseguido sem que haja necessidade de recorrer, quer cí grandes volumes de amostra, quer a acção mecânica. Uma outra vantagem deste invento consiste no membro não-absorvente. Quando se adiciona um volume de fluido em excesso, a rede de canais capilares formada pelo contacto do membro poroso e do membro não-absorvente assegura uma lavagem eficiente na medida em que dirige o fluxo para longe do membro poroso, garantindo desse modo uma boa separação do conjugado marcado livre do que está ligado. Numa realização deste invento, o dispositivo pode ser usado em ensaios que utilizam métodos de

fluxo transversal. Numa outra realização, o dispositivo descrito pode ser usado para realizar testes que utilizam métodos imunocromatogrãficos. Além disso, os dispositivos do presente invento cumprem de modo eficiente a tarefa de separar espécies marcadas livres de espécies marcadas ligadas, uma exigência fundamental nos métodos de testes 1igando-receptor heterogéneos.

Sumário do Invento presente invento diz respeito a um aparelho que é particularmente útil para realizar testes 1igando-receptor nos dos que em quais é necessário separar reagentes marcados livres d estão ligados. De um modo geral, os dispositivos são úteis situações em que é desejável separar o marcador que não formou um complexo com o agente de ligação imobilizado do marcador que formou um complexo com o agente de ligação. 0 aparelho do presente invento inclui um membro poroso tal como uma membrana ou um filtro ao qual podem estar ligados uma variedade de agentes de ligação, tais como um anticorpo, de preferência um anticorpo monoclonal para o ligando-alvo (Figs. í e 2). Cf aparelho inclui também um membro não-absorvente com uma superfície provida de textura em comunicação com superf icie inferior do memb r o poroso. A superfície provida de textura do membro não-absorvente pode ser uma superfície provida de sulcos, tal como a superfície de um disco, ou pode ser composta por canais de tal forma que, quando os membros poroso e não absorvente são postos em contacto um com o outro se forma uma rede de canais capilares. A rede de canais capilares forma-se a partir do contacto do membro poroso com a superfície provida de textura do membro não-absorvente e pode ser construída, quer antes, quer após o contacto inicial do membro poroso. Nalgumas realizações, a comunicação capilar entre o membro poroso e o membro não-absorvente favorece o retardamento da transferência de fluido do membro poroso para a rede capilar ' ' -V

formada pelo membro poroso e a superfície provida de textura do membro não-absorvente até o volume do fluido adicionado exceder substancialmente o volume vazio do membro poroso. A transferência de fluido do membro poroso para a rede de canais capilares formada pelo membro poroso e a superfície provida de textura do membro não-absorvente tem lugar sem gue seja necessário utilizar meios externos para induzir a transferência de fluido, incluindo mas não se limitando aos seguintes: pressão externa positiva, vácuo, ou contacto com um material absorvente. Os dispositivos do presente invento podem também incluir um membro facultativo que é posto em contacto com a superfície superior do membro poroso e gue pode ser usado para dividir a superfície superior do dispositivo em aberturas discretas. Estas aberturas podem facultar acesso quer ao membro poroso, quer á superfície provida de textura do segundo membro não-absorvente. 0 membro facultativo pode, em conjunto com o membro não-absorvente, criar uma zona de recepção de fluido na qual não intervem o membro poroso. Uma zona de recepção de fluido construída a partir do membro não-absorvente e do membro facultativo proporciona uma capacidade fluida a adicionar àquela que é proporcionada pela rede de canais capilares criados pelo contacto entre o membro poroso e o membro não-absorvente. As aberturas no membro facultativo podem incluir uma primeira abertura para fluidos e também uma abertura para fluidos adicional. A primeira abertura para fluidos funciona introdução do primeiro fluido como ponto de entrada para a adieionado ao dispositivo. A fluidos adicional aoert-ura para serve de ponto de entrada adicional através do qual podem ser adicionados ao dispositivo do invento fluidos adicionais.

primeiro fluido adicionado ao dispositivo é a amostra. De acordo com a estrutura do protocolo do teste, a amostra pode incluir, embora tal não deva ser considerado limitativo, ligando-alvo derivado da amostra, cojugado de análogo de ligando

marcado, conjugado de receptor de ligando marcado, receptor de ligando, agente de ligação, reagentes de separação de narcador livres/ligados e/ou elementos do sistema de desenvolvimento de sinal. Os flui dos adie :í. ona i s ad i c i onados ao d i spos i t i vo podem conter os restantes reagentes necessários para completar o procedimento do teste. Os reagentes fluidos adicionais gue dependem do protocolo do teste podem incluir, embora tal não deva ser considerado limitativo, ligando-alvo derivado do espécimen, conjugado de análogo de ligando marcado, conjugado de receptor de ligando marcado, receptor de ligando, agente de ligação, reagentes de separação livres/ligados e/ou elementos do sistema de desenvolvimento de sinal. De acordo com a estrutura do protocolo do teste, podem ser necessários vários reagentes fluidos adicionais a fim de completar o procedimento do teste, sendo a composição dos suc ess i vos reagentes flui dos ad i c i ona i s mod i f i c ada ta1 como for apropriado para o protocolo do teste.

Um teste que utilize os dispositivos de acordo com este invento compreende em parte as etapas de adição de um volume da amostra ao membro poroso, onde a amostra permeia o volume vazio do membro poroso contactando desse modo o receptor de ligando imobilizado no membro poroso. Num teste 1igando-receptor não-competitivo, a amostra contendo um ligando-alvo ê aplicada ao membro poroso e ο Iigando-alvo é ligado pelo receptor de ligando que está imobilizado de modo não-difusivo no membro poroso. 0 segundo receptor de ligando marcado ê então adicionado como fluido adicional, ligando-se ao complexo formado pelo ligando e pelo primeiro receptor de ligando imobilizado. Alternativamente, o segundo receptor de ligando marcado pode ser combinado com o 1igando-alvo a fim de formar a amostra antes da aplicação desta ao membro poroso, de modo a que a ligação do segundo receptor de ligando marcado ao ligando-alvo ocorra antes da ligação do liagndo-alvo ao primeiro receptor de ligando imobilizado no membro poroso. Alternativamente, o 1igando—alvo, o segundo receptor de ligando marcado e o primeiro receptor de ligando são combinados e o complexo formado pelo primeiro receptor de ligando/1igando-alvo/segundo receptor de ligando marcado liga-se a um agente de ligação que é combinado com estes reagentes ou imobilizado no membro poroso. Um fluido adicional contendo reagentes para a separação dos reagentes marcados livres dos que estão ligados pode ser adicionado, caso seja necessário, a fim de remover os excessos de ligando e de segundo receptor de ligando marcado. Este dispositivo foi concebido de modo a proporcionar uma sensibilidade suficiente que permita medir pequenas concen™ t r a ç Ses de li ga ndo-a1vo, quantidades de amostra e uma vez que se podem usar grandes remover de modo eficiente o excesso to⁷ tanto de 1igando-alvo como de segundo receptor de ligando marcado. De facto, a separação eficaz do marcador livre do que está ligado conseguida através da rede de canais capilares deste dispositivo permite uma melhor discriminação do sinal especifico associado ao ligando do sinal não-especifico de fundo. Caso seja necessária, adiciona~se de seguida uma solução de desenvolvimento do sinal a fim de permitir que o marcador do segundo receptor de ligando marcado desenvolva um sinal detectãvel. 0 sinal desenvolvido pode depois ser relacionado com a concentração do ligando-alvo na amostra. Numa realização preferida, a transferência de fluido entre o primeiro membro poroso do dispositivo e a rede de canais capilares formada pelo contacto do membro poroso e da superfície provida de textura do segundo membro não-absorvente do dispositivo é geralmente auti-iniciada no ponto em que o volume total de fluido adicionado ao dispositivo excede o volume vazio deste modo a necessidade de uma do utilizador a fim de remover o excesso de fluido da zona de detecção do analito. 0 ponto a que se inicia a transferência de fluido depende dos objectivos do teste. Normalmente, é desejável que seja estabelecido contacto do membro poroso, evitando interacçâo activa por parte

entre a amostra e todas as zonas do membro poroso que contém receptor imobilizado, de modo que a aplicação de fluido adicional proporcione a separação do marcador não-ligado do marcador que se ligou ao membro poroso.

Um teste 1igando-receptor competitivo pode ser levado cabo usando os dispositivos do presente invento, mediante adição de uma amostra contendo o ligando-alvo e conjugado a

de no anãiogo de ligando marcado a receptor de ligando imobilizado membro poroso. 0 conjugado de análogo de ligando marcado e o ligando-alvo competem pelos locais de ligação do receptor de ligando. Alternativamente, o receptor ds ligando pode ser combinado com ligando-alvo e análogo de ligando marcado com a subsequente imobilização do receptor de ligando sobre o membro poroso através do contacto com um agente de ligação. Pode ser adicionado ao dispositivo um fluido adicional a fim de separar o marcador livre do que está ligado, seguido, caso seja necessário, por uma solução de desenvolvimento de sinal para permitir a detecção do marcador do conjugado de análogo de ligando marcado que formou um complexo com o receptor de ligando imobilizado no membro poroso. A quantidade de conjugado de análogo de ligando marcado ligada ao membro poroso é relacionada com a concentração de ligando-alvo na amostra. A transferência de fluido entre o membro poroso e a rede de canais capilares formada pelo contacto do membro poroso com a superfície provida de textura do segundo membro não-absorvente é, de um modo geral, auto-iniciada quando o volume vazio do membro poroso está substancialmente preenchido na sua totalidade com fluido. 0 método do presente invento permite, por conseguinte, a detecção de analitos de um modo que é simples, rápido, conveniente, sensível e eficaz na. utilização de reagentes marcados.

Breve Descrição das Figuras ft Fig. í representa uma vista de cima, ampliada, de um aparelho para a realização de um teste imunitário de acordo com o presente invento.

A Fig. 2 representa uma vista em corte, ampliada, do aparelho representado na Fig. 1.

A Fig. 3 representa uma vista em perpectiva, ampliada, de uma superfície provida de textura com um único conjunto de canais lineares.

A Fig. 4 representa, uma vista em perspectiva, ampliada, de uma superfície provida de textura, composta por dois conjuntos de canais com iguais larguras dos canais.

A Fig. 5 representa uma vista em perspectiva, ampliada, de uma superfície provida de textura composta por dois conjuntos de canais com diferentes larguras dos canais.

A Fig. fo representa uma vista de cxma, ampliada, de um dispositivo com um membro poroso sobre um membro não-absorvente de superfície provida de textura.

A Fig. 7 representa uma vista em corte, ampliada, do dispositivo representado na Fig. 6.

abertura para fluidos, em gue membro poroso exposto pela

A Fig. 8 representa uma vista de cima, ampliada, de um dispositivo com um membro poroso entre um membro não-absorvente de superfície provida de textura e um membro facultativo em gue a amostra é adicionada ao dispositivo através de uma primeira

' ^S · V i(‘ ^κ primeira abertura para fluidos não pode formar uma rede capilar com a superfície provida de textura do segundo membro não-absorvente, e uma abertura para fluidos adicional em gue o membro poroso exposto pela abertura para fluidos adicional forma uma rede de canais capilares com a superfície provida de textura do membro não-absorvente.

A Fig. 9 representa uma vista em corte, ampliada, do dispositivo representado na Fig. 8.

A Fig. 10 representa uma vista de cima, ampliada, de um dispositivo com um membro poroso entre um membro não-absorvente de superfície provida de textura e um membro facultativo em que a amostra é adicionada através de uma primeira abertura para fluidos tal que a superfície provida de textura exposta pela primeira abertura para fluidos não pode formar uma rede capilar com o primeiro membro poroso e uma abertura para fluidos adicional em que o membro poroso exposto pela abertura para fluidos adicional forma uma rede de canais capilares com a superfície provida de textura do membro não-absorvente.

A Fig. 11 representa uma vista em corte, ampliada, do dispositivo representado na Fig. 10.

Definições

Os termos que se seguem, na acepção em que são utilizados neste documento, são definidos como se segue;

Agente de Ligação; uma substância capaz de se ligar por meios químicos, físicos ou imunológicos ao ligando possuindo interesse diagnóstico ou a um receptor de ligando para aquele.

-λ .,· - ζυ Membro Poroso ; urn membro do dispositivo composto de um material poroso, usado para proporcionar o suporte de fase sólida para o agente de ligação.

Volume Vazio; o volume espacial no interior do membro poroso que pode ser ocupado por fluido.

Forças de Retenção de Fluido; forças que retêm fluido» no interior do volume vazio do membro poroso, por ex. tensão superf ic .ial.

Canal! um sulco aberto de dimensões capilares (de um modo geral inferiores a 0,0.20 de uma polegada).

Canais Capilares! canal circunscrito de dimensões capilares (de um modo geral inferiores a 0,20 de uma polegada).

Conjunto de Canais; um grupo de canais por um conjunto de características comuns, por e> segundo um mesmo eixo do dispositivo.

i nden t i f i c á ve1 , alinhamento

Rede de Canais Capilares; um motivo de canais capilares formado pelo contacto do membro poroso com os canais da superfície provida de textura do membro não-absorvente,' as redes podem ser constituídas a partir de um ou mais conjuntos de canais.

Superfície Provida de Texturai superfíc,ie não-absorvente capaz de formar uma rede de canais capilares quando o membro poroso é posicionado sobre ela. A superfície provida de textura pode apresentar motivos regulares ou irregulares.

Membro Não-Absorvente de Superfície Provida de Textura! um membro que não absorve fluidos e que contém a superfície provida de textura numa porção da sua superfície. 0 contacto entre a superfície provida de textura do membro não-absorvente e o membro poroso proporciona a formação da rede de canais capilares .

Membro Facuitativo; um membro adicional que, quando incluído no dispositivo, permite a partição da superfície superior do dispositivo em aberturas discretas.

Primeira Abertura para Fluidos; uma abertura no membro facultativo para permitir a introdução da amostra no dispositivo.

Abertura Adicional para Fluidos.' uma abertura adicional no membro facultativo para permitir a introdução de fluidos adicionais no dispositivo.

.Amostrao primeiro volume ds fluido adicionado ao dispositivo, que pode incluir, embora tal não deva ser considerado limitativo, ligando-alvo derivado do espécimen, conjugado de análogo de ligando marcado, conjugado de receptor de ligando marcado, receptor de ligando, agente de ligação, reagentes de separação de marcador livre/1igado e/ou elementos do sistema de desenvolvimento de sinal.

Flui do Adie i ona 1 qualquer fluido adicional que tenha de ser adicionado ao dispositivo para completar o protocolo de teste, incluindo, embora tal não deva ser considerado limitativo, ligando-alvo derivado do espécimen, conjugado de análogo de ligando marcado, conjugado de receptor de ligando marcado, receptor de ligando, agente de ligação, reagentes de separação de

' -./ „ χ £ C ' marcador livre/ligado e/ou elementos do sistema de desenvolvimento de si na1.

Os dispositivos do invento aqui descritos podem ser usados numa variedade de tipos de testes, incluindo aqueles que são descritos no Pedido de Patente dos E.U.A. NS de Série 295,560, apresentado a 10 de Janeiro de 1989 e que é aqui incorporado a título de referência. Em particular, as definições de ligando, receptor de ligando, conjugado de receptor de ligando e análogo de ligando, tal como são usadas nas reivindicações do método deste pedido de patente, são incorporadas a título da referência do Pedido de Patente NS de Série 295,560.

Descrição Pormenorizada das Formas de Execução Preferidas dispositivo do presente invento utiliza um membro poroso construído a partir de um material poroso tal como uma

membrana, ou filtro. Preferem-se para utilização como membros porosos filtros ou membranas que compreendem, em parte, materiais que permitem a entrada de fluido para o volume vazio do material poroso. 0 volume vazio do material poroso é o volume contido nos limites dimensionais do material que pode ser ocupado por fluido. Deve também notar-se que estes dispositivos do invento podem ser usados com uma variedade de fluidos, incluindo líquidos e gases.

Numa forma de execução do dispositivo preferida, a totalidade da amostra é substancialmente retida nos limites do membro poroso antes de saturar compietamente o volume vazio do membro poroso. Retendo a amostra adicionada ao dispositivo nos limites da membrana porosa atê á altura em que o volume vazio da membrana porosa está substancialmente cheio, ê apenas necessário um volume mínimo de amostra para assegurar a exposição da totalidade da membrana activada com agente de ligação à amostra *

adicionada. Daqui resulta a utilização mais eficiente da amostra adicionada para a realização simultânea de uma multiplicidade de reacções de detecçâo de ligando-alvo na membrana. Os materiais que podem por conseguinte ser usados como membro poroso incluem materiais nos quais existem forças operativas que retêm o fluido nos limites do material, i.e. forças de retenção de fluido. São particularmente preferidos para utilização como membro poroso os materiais em que as forças de retenção do fluido exercidas pelo membro poroso sobre o fluido retido são tais que substancialmente todo o volume vazio do material poroso é preenchido antes de haver uma transferência substancial de fluido entre o membro poroso e a rede de canais capilares criada pelo contacto entre o membro poroso e o membro não-absorvente de superfície provida de textura. As membranas ou filtros que podem ser usados incluem aqueles que são construídos a partir de fibras de vidro e de vários materiais sintéticos e naturais.

método preferido para obter as propriedades de fluido apropriadas no interior do membro poroso selecção de uma membrana, caracterizada por uma poros, tal que as forcas de retenção do fluido

Um retenção de consiste na dimensão de exercidas pela membrana são superiores ãs forças externas que actuam sobre o fluido no interior da membrana. São exemplos destas forcas externas a pressão do fluido acima da membrana (altura de carga de fluido), forças gravi tacionais sobre o fluido no interior da membrana, o grau relativo em que o material pode ser caracterizado como hidrofílico e as forças capilares associadas com capilares externos ou redes de capilares externas que estão em contacto com a membrana. As dimensões dos poros para membranas tais como mebranas de nylon, preferidas para utilização como membro poroso, situam-se no intervalo de valores entre 0,1 e 30 jum, sendo particularmente preferida a utilização de membranas com poros de dimensões entre 0,2 e

5/jm. Quando um teste não

exige a saturação de substancialmente todo o volume vazio do membro poroso antes da transferência do fluido, podem ser usados materiais porosos apresentando forças de retenção de fluido iguais ou inferiores às forças externas que actuam sobre o fluido no interior do membro poroso. Nestas circunstâncias, preferem-se membros porosos tais como membranas com poros de dimensões entre 5 e SOjum.

ligando-alvo ê capturado sobre o membro poroso. 0 processo de captura pode envolver uma captura física tal como aquela que ocorreria durante uma filtração em que o ligando-alvo tem dimensões superiores às dimensões dos poros que caracterizam o membro poroso ou pode dever-se à interacção com um agente, i.e. um agente de ligação, que é capaz de se ligar ao ligando-alvo ou ao receptor de ligando para aquele. Um agente de ligação tal como um receptor de ligando pode ser ligado directa ou indirectamente ao membro poroso. Um receptor de ligando, por exemplo um anticorpo, pode ser imobilizado de modo não-difusivo sobre o membro poroso. Numa forma de execução preferida, o membro poroso é uma membrana tal como uma membrana de nylon sobre a qual o receptor de ligando é imobilizado, e um receptor de ligando preferido é um anticorpo. 0 anticorpo pode provir de uma preparação de anticorpos policlonais, embora um anticorpo preferido seja um anticorpo monoclonal murino. Os métodos de preparação e selecção de tais anticorpos monoclonais murinos são bem conhecidos dos especialistas da técnica, ver, por exemplo, Liu, D., Pursse.ll, R. e Levy, J.Q., C11 nica 1 Toxico 1 ogy, 2-5, 527-538 (1987). 0 anticorpo monoclonal murino é imobilizado de modo não-difusivo sobre a membrana por métodos quer covalentes, quer não—cova1entes, sendos estes métodos igualmente bem conhecidos dos especialistas da técnica, ver, por exemplo, Pluskal, N.Q., P r zek op, M.8., Ka von i aη, M.R. ,

BioTechniques, 4, 272-283 <1988)

Vecoli, D., Hicks, D.A., Numa forma de execução

preferida, o anticorpo monoclonal murino é ligado de modo não-covalente a uma membrana de nylon. Numa forma de execução particularmente preferida, o anticorpo monoclonal é imobilizado de modo não-covalent-e numa zona discreta sobre a membrana de nylon. A imobilização do anticorpo monoclonal numa zona discreta sobre a membrana que compõe o membro poroso é particularmente preferida, uma vez que permite a partição da superfície da membrana numa mui tipiicidade destas zonas discretas de anticorpo imobilizado, contendo zonas diferentes o mesmo anticorpo ou anticorpos diferentes. Cada zona discreta de anticorpo pode ser usada para levar a cabo uma reacção imunoquímica discreta, podendo deste modo ser levadas a cabo simultaneamente uma série des tas r ea c ç ões i munoqu í m i c as.

Numa forma de execução preferida do presente invento, o agente de ligação, um receptor de ligando, é imobilizado de modo substancialmente uniforme numa zona uni ca que abrange a total ida de do membro poroso. Numa outra forma de execução preferida, o receptor de ligando é imobilizado em pelo menos uma zona discreta sobre o membro poroso de tal modo que qualquer destas zonas discretas abranja menos do que a totalidade do membro poroso. Numa forma de execução particularmente preferida, o receptor de ligando é imobilizado de modo uniforme em uma ou mais zonas discretas. Numa outra forma de execução particularmente preferida, uma multiplicidade de receptores de ligando são imobilizados numa multiplicidade de zonas discretas, contendo cada zona pelo menos um receptor de ligando. Numa outra forma de execucão particularmente preferida, a muitipiicidade de zonas discretas é pelo menos tão grande quanto a mui tipiicidade de 1igandos-alvo a serem determinados. Quando existe uma muitipiicidade de zonas discretas de receptor de ligando, é possível a determinação ds uma mu 11 i p 3. i c i dade de 1 i gandos .

•«X ''U-V segundo elemento do presente invento ê uma estrutura não-absorvente possuindo uma textura à superficie que, quando posta em contacto com o membro poroso compreende, em parte, uma rede de canais capilares. A textura da superficie pode ser composta por elementos geométricos quer regulares, quer irregulares, dispostos de tal modo que proporcionem canais. Formam-se conjuntos de canais quando um grupo de canais pode ser caracterizado por características comuns tais como o alinhamento segundo um único eixo. Os canais formam uma rede de canais capilares quando o membro não—absorvente está em contacto com o membro poroso, A rede de canais capilares pode situa?—se por baixo ou em volta da membrana porosa, A comunicação entre os membros poroso e não-absorvente é tal que quando o volume do fluido adicionado ao membro poroso é maior do que o volume vazio do membro poroso, o fluido é transferido do membro poroso para a rede de canais capilares formada pelo contacto entre os membros poroso e não-absorvente. Sob certas circunstâncias, as propriedades de retenção de fluido do membro poroso permitem que essa transferência de fluido ocorra antes de o volume vazio do membro poroso estar substancialmente saturado. 0 membro poroso pode estai- disposto relativamente ao membro não-absorvente de tal modo que se forma uma rede de canais capilares onde os dois membros estão em contacto e as superfícies adjacentes dos dois membros são geralmente paralelas. A distância que separa o membro poroso e a superficie provida de textura do membro não-absorvente é tal que a superfície do membro poroso adjacente á superficie provida de textura do segundo membro completa a formação de uma rede de canais capilares entre os dois membros. De facto, em protocolos de teste em que sâo introduzidos fluidos adicionais, pode não seide todo necessário pôr os membros poroso e não-absorvente em contacto, desde que o volume de fluido usado seja suficiente para enche?- substanc ialmente o volume vazio do membro poroso e desde que os membros poroso e não-absorvente estejam dispostos a uma νΐ ί', ι..

distância relativa um do outro tal que os os canais do membro não-absorvente sejam ainda capazes ds desempenhar a sua função de zona de recepção de fluido, tal como pretendido. As distâncias preferidas separando o membro poroso da superfície provida de textura do membro não-absorvente são distâncias inferiores a 0,2 polegadas. São particularmente preferidas como distâncias de separação entre os dois membros que formam a rede de canais capilares, distâncias inferiores a 0,1 polegadas.

Numa forma de execução preferida do membro não-absorvente, a superfície provida de textura é composta por conjuntos de canais formando motivos geométricos regulares; estão os canais, de um modo geral, alinhados segundo um único eixo e sendo os canais adjacentes, de um modo geral, paralelos (Fig. 3). Na forma de execucão preferida da superfície provida de textura, os fluidos são, de um modo geral, feitos fluir ao longo de canais de modo análogo à descrição de um tal fluxo que é feita na Patente dos E.U.A. N2 4,233,029, que é aqui incluída a título de referência. Numa forma de execucão particularmente preferido do segundo membro, a superfície provida de textura é composta por um motivo geométrico regular em que dois conjuntos de canais se justapõem a um determinado ângulo à superfície do membro, estando cada conjunto de canais, de um modo geral, alinhado segundo o seu eixo único respectivo, com os canais adjacentes segundo um único eixo de um modo geral paralelos. Prefere-se um ângulo para a justaposição tal que os dois conjuntos de canais não sejam colineares. Prefere-se particularmente como ângulo para a justaposição dos dois conjuntos de canais um ângulo substancialmente igual a um ângulo rec to (i.e., ’30°). Numa forma de execucão preferida da superfície provida de textura em que os canais se justapõem em ângulo recto, os canais têm, de um modo geral, a mesma largura, de tal modo que o motivo geométrico criado pelos dois conjuntos de canais é um motivo de quadrados (Fig. 4). Numa forma de

execução particularmente preferida de uma superficie provida de textura em que dois conjuntos de canais se dispõem em ângulo recto relativamente um ao outro, os canais têm, de um modo geral, larguras diferentes, de tal modo que o motivo formado pelos dois conjuntos de canais é um motivo de rectângulos (Fig. 5). A direcção preferencial de fluxo na formação rectangular anisotrópica έ, de um modo geral, primeiro segundo o eixo paralelo ao eixo definido pelos canais mais largos e secundariamente segundo o eixo paralelo ao eixo definido pelos canais mais estreitos. As nossas investigações mostraram que os padrões de fluxo do fluido para placas simples compostas por dois conjuntos de canais justapostos em ângulo recto um relativamente ao outro são análogos aos padrões de fluxo do fluido descritos para sistemas compostos por duas placas, de um modo geral paraleL· em cada qual é composta por um único conjunto de canais e em que as placas se situam a uma distância uma da outra tal que formam um arranjo foidimensional de canais. Os padrões de fluxo destes arranjos foidimensionais de canais são descritos na Patente dos E.U.A. N£ 4,233,029 atrás mencionada e que έ aqui incluída a titulo de referência.

terceiro elemento do dispositivo do invento é composto por um membro facultativo não-absorvente. 0 membro facultativo não-absorvente é colocado sobre a superficie superior do membro poroso. 0 membro facultativo não absorvente pode possuir aberturas através das quais são adicionados fluidos ao membro poroso. As aberturas no membro poroso servem para dividir a superfície superior do membro poroso em zonas, nas quais podem ser introduzidos selectivamente fluidos, tal como for apropriado para o protocolo de teste especifico. A primeira abertura para fluidos é usada para introduzir a amostra no membro poroso. Caso seja apropriado para o protocolo de teste, tal como num teste do ti po f1uxo C f 1ow-through), as ad i ções subsequentes de flu i do,

tal como um fluido de separação de marcador livre/ligado, para fluidos.

podem

Uma facul-

ser feitas através da primeira abertura segunda abertura para fluidos pod© ser incluída no.membro tativo, caso tal seja exigido pelo protocolo d© teste, como por exemplo num teste imunocromatográfico, a fim de permitir a introdução de fluidos adicionais, tais como fluidos contendo elementos do sistema de desenvolvimento de sinal, em porções do membro poroso distintas do local onde é introduzida a amostra. 0 membro facultativo não absorvente pode incluir facultativamente uma superfície provida de textura de natureza análoga á superfície provida de textura do membro não-absorvente. 0 terceiro elemento, em combinação com o membro não-absorvente, pode também formar uma câmara gue contém o membro poroso. Nos casos em gue a amostra é um gás, o gás pode ser injectado na câmara contendo o membro poroso de tal modo gue a amostra passe sobre o e do membro poroso e saia da câmara.

stravés

A rede de canais capilares formada pelo contacto do membro poroso com a superfície provida de textura do memmbro não-absorvente de superfície provida de textura serve de reservatório primário de fluido do dispositivo do invento, dade adicionai de reservatório de fluido pode ser

Uma capacip r opo r c i onada p o r e s ρ a ç ο η o combinação do inte ri o r do d i sposi t i v u uu invento contido pe.l membro não-absorvente de superfície provida de textura e do membro facultativo não-absorvente. Numa forma de execução preferida do dispositivo do invento, a capacidade adicional de reservatório de fluido é proporc ionada pelo espaço contido pelo membro não-absorvente de superfície provida de textura e pelo membro facultativo não-absorvente e não existe, no interior de um tal espaço fechado, qualquer membro poroso intervindo entre os dois membros não-absorventes.

do invento, ο dispositivo inclui em parte um mebro poroso e um membro não-absorvente de superficie provida de textura (Figs. S e 7). Numa forma de execução particularmente preferida do dispositivo do invento, o dispositivo inclui em parte um membro poroso, um membro não-poroso de superficie provida de textura e um membro facultativo não-absorvente com a primeira, abertura para fluidos sobre a porção média do membro poroso. A amostra é introduzida sobre a porção do membro poroso exposta pela primeira abertura para fluidos no membro facultativo não-absorvente. Uma vez introduzida, a. amostra é deixada espalhar-se ou é atraída para o membro poroso e assim induzida a interagir com o receptor de ligando que estã imobilizado de modo não-difusivo sobre o membro poroso. 0 membro não-absorvente do dispositivo inventivo inclui uma superficie provida de textura que compreende conjuntos de canais. Os conjuntos de canais formam uma rede de canais capilares quando o membro não-absorvente é posto em contacto com o membro poroso. Esse contacto pode ser iniciando antes da ou após a etapa inicial de introdução da amostra. A rede de canais capilares formada pelo contacto entre o membro poroso e o membro não-absorvente proporciona uma zona de recepção de fluidos para a qual o fluido pode ser transferido do membro poroso. A rede de canais capilares formada entre o membro poroso e o membro não-absorvente é capaz de iniciar a transferência de fluido entre o membro poroso e o membro não-absorvente sem que seja necessário recorrer â aplicação de meios externos adicionais para induzir a transferência do fluido, tais como pressão ou vácuo.

Numa outra forma de execução particularmente preferida, o dispositivo do presente invento inclui em parte um membro não-absorvente de superfície provida de textura, um membro poroso e um membro facultativo não-absorvente com uma primeira abertura para fluidos e uma abertura para fluidos adicional. A primeira

3Í

abertura para fluidos situa-se numa extremidade do membro poroso. A abertura para fluidos adicional está situada acima, da porção média do membro poroso. A amostra é adicionada ao dispositivo através da primeira abertura para fluidos e é deixada espalhar-se ou é atraída para o membro poroso, sende assim induzida a interagir com o receptor de ligando que está imobilizado· de modo não-difusivo sobre o membro poroso. 0 fluido adicional, na .medida em que seja exigido pelo protocolo· do teste, é adicionado ao dispositivo através da abertura para fluidos adicional, espalhando-se depois para o· membro poroso e completando assim o teste.

Numa outra forma de execução· preferida, o dispositivo do presente invento inclui em parte um membro não-absorvente de superfície provida de textura e um membro poroso que, enquanto em contacto com a superfície provida de textura do membro não-absorvente inclui uma extremidade do membro· poroso que se estende para lá do perímetro da superfície provida de textura do membro não-absorvente. Numa outra forma, de execução particularmente preferida, o dispositivo do presente invento inclui em parte um membro não-absorvente de superfície provida de textura, um membro facultativo não-absorvente com uma primeira abertura para fluidos e uma abertura para fluidos adicional, e um membro poroso que, enquanto em contacto com a superfície provida de textura do membro não-absorvente inclui uma extremidade do membro poroso que se estende para lá. do perímetro da superfície provida de textura do membro não-absorvente (Figs. 8 e 9). A primeira abertura para fluidos situa-se acima da extremidade do membro poroso que sobressai do perímetro da superfície provida de textura do membro nã.o~a.bsorvente. A porção do membro poroso que sobressai do perímetro da superfície provida de textura do membro não-absorvente não participa na formação da rede de canais capilares que resulta, do contacto do membro poroso com com os membros

não-absorventes de superfície provida de textura. A primeira abertura para fluidos é construida de modo a forcar a amostra adicionada através da primeira abertura para fluidos a atravessar o membro poroso e a permanecer substancialmente no interior do membro poroso enquanto os volumes combinados da amostra e do fluido adicional acrescentado não excederem substancialmente o volume vazio do membro poroso. Numa forma de execução partieularmente preferida do dispositivo, a superfície inferior do membro poroso que sobressai da superfície provida de textura está selada de modo a impedir que o fluido passe através dessa superfície. Devido a esses constrangimentos sobre o fluxo do fluido no membro poroso, a amostra adicionada à primeira abertura para fluidos é induzida a viajar no interior do membro poroso de modo sequencial, começando no memvro poroso sob a primeira abertura para fluidos © progredindo para uma região no membro poroso distante relativamente á primeira abertura para fluidos. A abertura para fluidos adicional está situada sobre a porção média do membro poroso e permite a adição de fluido adicional ao dispositivo, na medida em que tal seja exigido pelo protocolo do teste. 0 fluido adicional introduzido através da abertura para fluidos adicional ê deixado espalhai—se sobre o membro poroso de tal modo que o fluxo desses fluidos adicionados ao dispositivo através da abertura para fluidos adicional não seja constrangido a realizar-se unicamente no interior do membro poroso, podendo pe 1 o c on t r á r i o inc 1 u :i. r f 1 uxo de flui do ao 1 ongo da supe r f í c i e exterior do membro poroso. Numa outra forma de execução partieularmente preferida do invento, a capacidade total de recepção de fluido do disposito é aumentada pelo volume associado ao espaço confinado pelo membro não-absorvente e ao membro facultativo em que não existe intervenção do membro poroso.

invente

Numa outra forma de execução, o dispositivo do presente inclui em parte um membro poroso e um membro

\y

não-absorvente de superfície provida de textura com uma porção da superfície provida de textura sobressaindo do perímetro do membro poroso. Numa forma de execução preferida, o dispositivo inclui em parte um membro poroso, um membro não-absorvente de superfície provida de textura com uma extremidade da superfície provida de textura sobressaindo do perímetro do membro poroso e um membro facultativo com uma primeira abertura para introdução de fluidos situada sobre a porção da superfície provida ds textura do membro não-absorvente que sobressai do perímetro do membro poroso. A amostra é adicionada ao dispositivo através da primeira abertura para, fluidos no membro facultativo e é deixada espalhar-se sobre a superfície provida de textura subjacente relatívamente à primeira abertura para fluidos. A extremidade da superfície provida de textura do membro não-absorvente não é coberta pelo membro poroso de modo que quando o membro poroso e a superfície provida de textura do membro não-absorvente são postos em contacto formando assim uma rede de canais capilares na região em que os dois membros se sobrepõem, a extremidade da superfície provida de textura não se torna parte integrante dessa, rede. A amostra adicionada atravessa a extremidade da. superfície provida de textura do membro não-absorvente com origem na primeira abertura para fluidos, progredindo para a. região da rede de canais capilares onde o membro não-absorvente é contíguo ao primeiro membro poroso. Com início no ponto de junção onde a superfície provida, de textura do membro não-absorvente, devido ao contacto com o membro poroso, forma com este uma rede de canais capilares, o fluxo da amostra quer através da rede de canais capilares, quer através do membro poroso é afectado pelas intensidades relativas das forças de retenção do fluido exercidas sobre a amostra pela rede de canais capilares e pelo membro poroso. Com uma amostra aquosa, por exemplo, se o membro poroso exercer uma maior força relativa de retenção do fluido do que a rede de canais capilares, a amostra tenderá a fluir no interior do membro poroso;

inversamente, se o membro poroso exercer umamenor força relativa de retenção do fluido do que a rede de canais capilares, o fluxo da amostra terá lugar principalmente no inetrior da rede de canais capilares. Uma vez que as forças de retenção do fluido favorecem retenção da amostra no interior do membro poroso, após fluxo da amostra no interior da rede de canais capilares, a amostra inicialmente contida na rede de canais capilares é transferida espontaneamente da rede de canais capilares para o membro poroso. 0 volume de uma tal transferência de amostra da rede de canais capilares para o membro poroso está limitado pelo volume vazio do membro poroso.

Numa outra forma de execução preferida, o dispositivo inclui em parte um membro poroso, um membro não-absorvente de superfície provida de textura, com uma. extremidade da superfície provida de textura que sobressai do perímetro do membro poroso e um membro facultativo com uma primeira abertura para introdução de fluidos situada sobre a porção da superfície provida de textura, do membro não-absorvente que sobressai do perímetro do membro poroso, e uma abertura para fluidos adicional situada sobre a porção média do membro poroso (Figs. 10 e 11). fit amostra é introduzida no dispositivo através da primeira abertura para fluidos para. a. porção da. superfície provida de textura que sobressai dos limites do membro poroso. ft amostra desloca-se depois ao longo dos canais da superfície provida de textura até ati ngir a porção da superfície provida de textura que, devido ao contacto entre a superfície provida de textura e o membro poroso, forma a rede de canais capilares. ft amostra flui de seguida no interior da rede de canais capilares ou no interior do membro poroso, de acordo com as intensidades relativas das forças de retenção do fluido dos vários componentes do dispositivo, e, tendo em conta que as forças de retenção do fluido favorecem uma transferência da amostra para o membro poroso, a amostra

inicialmente contida na rede de canais capilares é transferida espontaneamente da rede de canais capilares para o membro poroso. Fluido adicional, se exigido pelo protocolo do teste, pode ser introduzido no dispositivo através da abertura adicional para fluidos, e guando o volume total de fluido adicionado ao dispo-

sitivo exceder substancialmente o volume vazio do membro poroso, inicia-se espontaneamente a transferência de fluido, de tal modo gue o fluido em excesso do volume vazio do membro poroso é transferido para a rede de canais capilares. F\iuma outra forma de execução particularmente preferida do dispositivo, a capacidade total de recepção de fluido do dispositivo é aumentada relativamente à da rede de canais capilares pelo volume associado ao espaço delimitado pelo membro não-absorvente e o membro facultativo em gue o membro poroso não intervem.

amostra é o	primeiro
o. De acor	do c om a
constituída	em parte
receptor de	1igando,
espéc3. men,	conjugado
receptor de	ligando
'r 1 i vre/1 i gado e/ou
‘ sinal. Os	fluidos
ι conter os	restantes

No método do presente invento, a amostra é fluido adicionado ao dispositivo do invento, concepção do método do teste, a amostra pelos, ou pela totalidade dos, seguintes; agente de ligação, ligando-alvo derivado c de análogo de ligando marcado, conjugado marcado, reagentes de separação de mares elementos do sistema de desenvolvimento adicionais adicionados ao dispositivo podem conter reagentes necessários para completar o procedimento do teste. Os reagentes fluidos adicionais, de acordo com o protocolo do método do teste, podem incluir, embora tal não deva ser considerado limitativo, receptor de ligando, ligando-alvo derivado de espécimen, conjugado de análogo de ligando marcado, conjugado de receptor de ligando marcado, receptor de ligando, agente de ligação, reagentes de separação de marcador livre/ligado e/ou elementos do sistema de desenvolvimento de sinal. De acordo com a estrutura do protocolo do teste, podem ser necessários vários

fluidos adicionais para completar o procedimento do teste, sendo a composição dos sucessivos reagentes fluidos adicionais variada, tal como for apropriado para o protocolo do teste. Por exemplo, num teste 1igando-receptor competi tivo, a amostra é constituída em parte por ligando-alvo derivado de espécimen e conjugado de análogo de ligando marcado. Alternativamente, num teste ligando-receptor competitivo de deslocamento em que o membro poroso contém receptor de ligando imobilizado já num complexo com conjugado de análogo de ligando, a amostra é constituída em parte por ligando-alvo derivado de espécimen,' enquanto que num teste 1igando-receptor competitivo de deslocamento sequencial, a amostra pode ser constituída em parte por conjugado de análogo de ligando, e ligando-alvo derivado de espécimen pode ser adicionado ao dispositivo não como amostra mas como um fluido adicional.

Num método de teste não—compettivo sequencial, por exemplo, a amostra é constituída em parte por ligando-alvo derivado de espécimen. 0 fluido adicional pode ser constituído em parte por conjugado de receptor de ligando marcado. Outros fluidos adicionais podem ser constituídos em parte, quer separadamente, quer em combinaçj por reagentes de separação ds marcador 1ivre/1igado e por elementos do sistema de desenvolvimento de sinal. Se o teste consiste num método não™competi tivo simultâneo, a amostra pode ser constituída em parte, por ligando—alvo derivado d© espécimen e conjugado de receptor de ligando marcado. Álternativamente, a amostra pode ser uma combinação de ligando-alvo derivado de espécimen, primeiro receptor de ligando, e conjugado de segundo receptor de ligando marcado. Um agente de ligação pode ser incluido para promover a imobilização do ligando-alvo ou do primeiro receptor de ligando e dos seus complexos no membro poroso. Também aqui us autros fluidos adicionai;

exigidos pelo método do teste podem incluir, por exemplo,

d© SfôPciF0.ÇtòO d© JftôrCâdor 1 Í VF©/1 lQcàdO fir/OLI í? I £“Fft£?F<tO5 do sx&tfôma de desenvoIvimento do sinal.

Numa outra forma de execução preferida do dispositivo do invento, um método 1igando-receptor competitivo do presente invento inclui a adição da amostra ao membro poroso através de uma primeira abertura para fluidos situada sobre a porção média do membro poroso. ft amostra, contendo ligando-alvo derivado do espécimen e análogo de ligando marcado é deixada espalhar-se sobre e para o interior da superfície exposta do membro poroso, sendo deste modo induzida a interagir com o receptor de ligando imobilizado de modo não-difusivo sobre o membro poroso. Numa forma, de execução preferida do dispositivo do invento, o receptor de ligando ê imobilizado de modo substancialmente uniforme numa única zona gue abrange a totalidade do membro poroso. Numa, forma de execução particularmente preferida, o receptor de ligando é imobilizado em pelo menos uma zona discreta sobre o membro poroso. Numa outra forma de execução particularmente preferida, uma mui tipiicidade de receptores de ligando são imobilizados numa multiplicidade de zonas discretas, contendo cada zona pelo menos um receptor de ligando. Numa outra forma de ex^-ecução particularmente preferida, a. mui tipi ic idade de zonas discretas de receptores de ligando é pelo menos tão grande como a multiplicidade de ligandos discretos a determinar. Permite-se a ocorrência de competição entre ligando-alvo e conjugado de análogo de ligando marcado para os locais de ligação em número limitado do receptor de ligando imobilizado. Quando o volume total de fluido adicionado ao dispositivo ê pelo menos suficiente para preencher substancialmente o volume vazio do membro poroso, o fluido que excede essa quantidade é transferido espontaneamente entre o membro poroso e a rede de canais capilares criada pelo contacto entre o membro poroso e a superfície provida de textura do membro não-absorvente. ft transferência de fluido membros

poroso © não-absorvente facilita a separação dò conjugado de análogo de ligando marcado que formou um complexo com o receptor de ligando imobilizado no membro poroso do conjugado d© análogo de ligando marcado que não formou um complexo com o receptor de ligando imobilizado no membro poroso. Os resultados do teste são depois avaliados mediante a determinação da presença ou ausência de conjugado de análogo de ligando marcado no interior de uma zona de receptor de ligando imobilizado. Quando estão presentes uma mui tipiicidades destas zonas discretas de receptor de ligando, é possivel utilizar os dispositivos para detectar ou quantificar simultaneamente mais de um 1igando-alvo de interesse. Numa outra forma de execução preferida, e caso seja exigido pelo protocolo do teste, o fluido adicional, que pode ser constituido em parte por um ou por ambos os seguintes; soluçaõ de separação

3. ivre/1 igado ou elementos do sistema de desenvolvimento do sinal, é adicionado ao dispositivo através de uma abertura para fluidos.

Numa outra forma de execução preferida do dispositivo do invento, o método de teste do presente invento pode ser realizado sob a forma de um protocolo Iigando-receptor competitivo de deslocamento sequencial. Uma amostra constituída ©m parte por um conjugado de análogo de ligando marcado é adicionada através da primeira abertura para fluidos e deixada interagir com o receptor de ligando imobilizado sobre o membro poroso. Um fluido adicional constituido em parte por ligando-alvo derivado de espécimen é adicionado ao dispositivo através de uma abertura para fluidos adicional e deixado deslocar o conjugado de análogo de ligando marcado que formou um complexo com o receptor de ligando imobilizado sobre o membro poroso. Quando o volume total de fluido adicionado ao dispositivo é pelo menos suficiente para preencher substancialmente o volume vazio do membro poroso do membro poroso, o fluido que excede essa quantidade é transferido espontaneamente do membro poroso e a rede de canais capilares

criados pelo contacto entre o membro poroso è ' a superfície provida de textura do membro não—absorvente. bs resultados do teste são depois determinados calculando a quantidade de conjugado de análogo de ligando marcado numa zona de receptor de ligando que não foi deslocado por 1igando-alvo derivado de espécimen. Quando está presente uma multiplicidade destas zonas de receptor de ligando discretas, é possível detectar ou quantificar um ou ma is 1igandos-a.1vo.

Numa outra forma de execução do presente invento, um método imunocromatográfico do presente invento inclui a adição de uma amostra ao dispositivo do invento através da primeira abertura para fluidos, estando essa abertura situada acima de uma extremidade do membro poroso. A extremidade do membro poroso está localizada de tal modo que sobressai do perímetro da superfície provida de textura do membro não-absorvente do dispositivo do .invento. A amostra, é constituída em parte por 1 iga.ndo-a.lvo derivado de espécimen e conjugado de análogo de ligando marcado que competem pelo nómero limitado de locais de ligação associados ao receptor de ligando imobilizado no membro poroso, de execução particularmente preferida do método, a

Numa forma, superf íc ie inferior do membro poroso que sobressai da superfície provida de textura está selada, de modo a impedir a. passagem da amostra através dessa superfície. A amostra atravessa, o membro poroso substancialmente confinada à estrutura, porosa, começando numa zona próxima do ponto de introdução inicial da amostra, e progredindo para uma região do membro poroso distante do ponto de introdução da amostra. 0 conjugado de análogo de ligando marcado e o ligando derivado de espécimen na amostra competem pelo receptor de ligando imobilizado . de modo não—difusivo sobre o membro poroso durante a. travessia, de execução preferida do invento, cio membro poroso. Numa forma o receptor de ligando é imobilizado de modo substancialmente uniforme na totalidade do

Numa forma de execução particularmente preferio receptor de ligando é imobilizado de modo

primei ro membro. da do invento, ao longo do percurso Numa outra forma de uniforme numa ou mais zonas discretas seguido pela amostra na sua travessia, execução preferida, uma muitipiicidade de receptores de ligando ê imobilizada numa mui tipiicidade de zonas discretas contendo, cada qual, pelo menos um receptor de ligando. Numa outra forma de execução particularmente preferida, a multiplicidade de zonas discretas de receptores de ligando é pelo menos tão grande como a multiplicidade de ligandos discretos a ser determinada. Após a travessia do membro poroso pela amostra, um volume de solução de separação de marcador livre/1igado é adicionado á porção média do membro poroso através de uma abertura para fluidos adicional para provocar a separação do conjugado de análogo de ligando marcado não ligado do conjugado de análogo de ligando marcado ligado ao receptor de ligando imobilizado no membro poroso. A porção do membro poroso situada sob a abertura para fluidos adicional está também em contacto com a superfície provida de textura do membro não-absorvente, formando deste modo uma rede de canais capilares. Quando um volume suficiente de fluido foi introduzido no dispositivo, inicia-se espontaneamente a transferência de fluido entre o membro poroso e a rede de canais capilares. Numa forma de execução preferida, do dispositivo do invento em que o receptor de ligando está imobilizado de modo uniforme na totalidade do membro poroso, os resultados do teste são avaliados mediante a determinação da presença ou ausência de conjugado de análogo de ligando marcado que se tenha imobilizado por ligação ao receptor de ligando imobilizado no membro poroso, execução preferida, em que o receptor de modo uniforme na totalidade do membro poroso, a quantidade de ligando presente no espécimen é relacionada com o comprimento da.

membrana porosa qu© formou um complexo com o conjugado de análogo de ligando marcado.

Numa outra forma de ligando está ligad o ae

Numa forma de execução particularmente

cia linear análogo de preferida do dispositivo do invento em que o receptor de ligando está imobilizado numa multiplicidade de zonas discretas, a quantidade de ligando no espécimen é relacionada com o número de zonas discretas em que o conjugado de análogo de ligando marcado á detectado, estando essas zonas situadas ao ongo do percurso que é atravessado pela amostra fluida. A quantidade de ligando contida na amostra pode assim ser relacionada, quer com a distântotal que formou um complexo com o conjugado de ligando marcado ao longo de uma corda ligando as regiões próximas do ponto de introdução da amostra com a região distante desta posição, quando o receptor de ligando está imobilizado de modo substancialmente uniforme no membro poroso, quer com o número de zonas discretas nas quais é detectada a presença de análogo de ligando marcado que formou um complexo com o receptor de ligando, quando o receptor de ligando está imobilizado em várias dessas zonas discretas de receptor de ligando. Numa forma de execução em que uma multiplicidade de receptores de ligando está imobilizada numa multiplicidade de zonas receptores discretas, uma multiplicidade de 1igandos-alvo pode ser detectada mediante a determinação da presença, ou ausência de sinal em zonas receptoras de ligando especificas.

Numa outra, forma de execução preferida do presente invento, um método Iigando-receptor competitivo do presente invento inclui a adição de uma amostra a.o membro poroso do dispositivo através da primeira abertura para fluidos, sendo a amostra constituída em parte por receptor de ligando, ligando-alvo derivado do espécimen e conjugado de análogo de ligando marcado. Antes da adição da amostra ao dispositivo, o ligando-alvo derivado do espécimen e o conjugado de análogo de ligando marcado competiram por um número limitado de locais de ligação no receptor de ligando contido na amostra. A amostra que é adicionada ao dispositivo espalha-se ou é atraída por sobre e através

do membro poroso. 0 ].igando-alvo e o conjugado de análogo de ligando marcado gue não se ligaram ao receptor de ligando na amostra podem ligar-se ao receptor de ligando imobilizado sobre o membro poroso. Numa forma de execução preferida do invento, o receptor de ligando está imobilizado de modo substancialmente uniforme na totalidade do membro poroso. Numa forma de execução particularmente preferida, o receptor de ligando está imobilizado de modo uniforme numa ou mais zonas discretas sobre o membro poroso. Numa outra forma de execução particularmente preferida, uma mui tipiicidade de receptores de ligando está imobilizada numa multiplicidade de zonas discretas, contendo cada zona pelo menos um receptor de ligando. Numa outra forma de execucSo partículas— mente preferida, a multiplicidade de zonas discretas de receptores de ligando é pelo menos tão grande como a multiplicidade de zonas discretas a determinar. Após a incubação do membro poroso com a amostra, um volume de solução de separação de marcados' livre/ligado é adicionada ao membro poroso através de uma abertura para fluidos para provocas' a separação do conjugado de análogo de ligando marcado gue se ligou ao receptor de ligando imobilizado sobre o membro poroso do conjugado de análogo de receptor de ligando gue não se ligou ao receptor de ligando imobilizado no membro poroso. A transferência de fluido do membro poroso para a rede de canais capilares inicia-se guando o volume total de fluido adicionado ao membro poroso preenche substancialmente o volume vazio do membro poroso. Numa forma de execução preferida do dispositivo do invento em gue o receptor de ligando está imobilizado de modo uniforme na totalidade do membro poroso, os resultados do teste são depois determinados por inspecção do membro poroso relativamente á presença ou ausência de conjugado de análogo de ligando marcado gue tenha formado um complexo com receptor de ligando imobilizado sobre o membro poroso. Numa forma de execução particularmente preferida do dispositivo do invento em gue uma muitipiicidade de receptores de ligando está imobilizada numa multiplicidade de zonas discretas, determina-se quais as zonas discretas que apresentam análogo de ligando ma r c ado i mob i1i zado.

ff ff ff

Numa outra forma de execução preferida, um método nãoTompetitivo do presente invento inclui a adição de uma amostra ao membro poroso do dispositivo através da primeira abertura para fluidos, em que a amostra é constituída em parte por ligando-alvo derivado do espécimen. A amostra é deixada espalhar-se sobre e para dentro do membro poroso exposto pela primeira abertura para fluidos e depois para dentro do membro poroso. 0 ligando-alvo contido na amostra liga-se ao primeiro tx—u.........receptor de ligando imobilizado sobre o membro poroso. Numa forma de execução preferida, o primeiro receptor de ligando está imobilizado de modo substancialmente uniforme na totalidade do membro poroso. Numa forma de execucão particularmente preferida, o primeiro receptor de ligando é imobilizado em pelo menos uma zona discreta sobre o primeiro membro. Numa outra forma de execucão particularmente preferida, uma mui tipiicidade de primeiros receptores de ligando é imobilizada numa multiplicidade de zonas discretas, contendo cada zona pelo menos um receptor de ligando. Numa outra forma de execução particularmente preferida, a multiplicidade de zonas discretas é pelo menos tão grande como a multiplicidade de ligandos-alvo a determinar. Depois de deixar o ligando-alvo ligar-se ao primeiro receptor de ligando imobilizado, é adicionado ao dispositivo através da abertura para fluidos adicional fluído adicional contendo o conjugado do segundo receptor marcado. 0 conjugado do segundo receptor marcado liga-se ao ligando-alvo que se imobilizou sobre o membro . poroso por meio da formação de um complexo com o primeiro receptor de ligando imobi1izado. 0 conjugado do segundo receptor marcado que não se ligou ao ligando-alvo imobilizado no membro poroso é removido por meio da adição de solução de separação de

marcador livre/ligado ao dispositivo atravês'dã abertura para fluidos adicional, Ocorre a transferência de fluido entre o membro poroso e a rede de canais capilares formada pelo contacto entre o membro poroso e a superficie provida de textura do membro não-absorvente, que serve para separa?- o conjugado do segundo recepto?- ligado no membro poroso do conjugado do segundo receptor não ligado. Caso seja íiecsssário, adiciona-se ao dispositivo fluido adicional contendo elementos do sistema de desenvolvimento do sinal para permiti?- a detecção do sinal do marcado?- do conjugado do segundo receptor marcado ligado.

Num outro método não-competitivo preferido do dispositivo do invento, em que a amostra inclui em parte ligando-alvo que pode se?- derivado? de material célula?' ou pode estai- adsorvido relativamente a agentes de ligação em partículas, a detecção do ligando é realizada mediante captura física de partículas <poiex. partículas de látex? pelo membro poroso. 0 método inclui a adição de uma amostra ao membro poroso do dispositivo através de uma primeira abertura para fluidos. A amostra é deixada espalhar-se sobre a superfície do membro poroso exposta pela primeira abertura para fluidos e depois para dentro do membro poroso. 0 analito-alvo contido na amostra é retido fisicamente po?- meio de captura, â superfície e nos poros do membro poroso. Após a imobilização física do ligando-alvo sobre o membro-poroso, é adicionado ao dispositivo através da abertura para fluidos adicional fluido adicional contendo conjugado de receptor marcado. 0 conjugado de receptor marcado liga-se aos 1igandos-alvo capturados pelo membro poroso. 0 conjugado de recepto?- marcado que não se ligou ao ligando-alvo imobilizado sobre o membro poroso é removido mediante adição de solução de separação de marcado?- livre/Iigado ao dispositivo através da abertura para fluidos adicional. A transferência de fluido entre o membro poroso e a rede de canais capilares formada pelo contacto entre o

membro poroso e a superfície provida de textúha dò membro não-absorvente serve para separar o conjugado de receptor marcado

ligado do conjugado de receptor não ligado. Caso seja necessário, é adicionado ao dispositivo um fluido adicional contendo elementos do sistema de desenvolvimento do sinal para permitir a detecção do sinal do marcador do conjugado de receptor marcado imobilizado no membro poroso.

invento foi descrito em pormenor em relação, especificamente, às formas de execução atrás referidas. Deve ter-se em conta, todavia, gue é possível introduzir variações e modificações sem fugir do espírito e âmbito do invento.

, )

Exemplo 1

Preparação de Estrona-:3^,~61ucuron-<2-Amino-AAcido Tiolbutanóico

T i o 1 a c tona ) -Am i da C E3G-HCTL .1 —4 mg <1,7 x 10 ' mol) de estrona-3-glucuronida <E3G), -4 mg <1,9 x 10 mol) de hidrocloreto de t-xolactona de homocxsteina, e 0,015 ml <1,3 x 10 ⁴ mol) de piridina foram dissolvidos em 0,47 ml de dimetilformamida. Esta mistura foi adicionada a 4 uma solução contendo 30 mg <1,3 x 10 di imi da em 0,23 m1 de d i met i1f o rmami da, mo1? de d i c i c1ohex i1c a rboCf recipiente foi purgado com árgon, selado e agitado a 25°C durante três horas. 0 precipitado insolúvel foi riltrado e o solvente foi removido sob vácuo. 0 resíduo foi suspenso de novo em 0,4 ml de uma solução de etanol/ãgua <15;12 vzv) e os removidos por meio de filtração.

precipitados insolúveis foram

A mistura de reacção em bruto foi depois dissolvida em 0,5 ml de uma solução de etanol/ãgua <15·! 12 v/v) e introduzida numa coluna de cromatografia liquida de elevada pressão C18 <1 cm x 25 cm) equilibrada com uma mistura 1:3 de metanoi/âgua, utilizando-se uma taxa de fluxo d® 2,0 ml/min. 0 composto foi eluído com um gradiente que variava de uma mistura 1:3 de metanol/água atê uma mistura 11 de metanol/água ao longo de oito minutos, e que foi depois feito variar até uma solução de metanol a 100% ao longo de mais 20 minutos. A E3G-HCTL eluiu entre os minutos 25 e 27. As fracções que continham o produto foram combinadas e os solventes foram removidos sob vácuo. Obtiveram-se 63 mg de

E3G-MCTL.

Reparação de Conjugado Morfina-Albumina de Soro Bovino

Setenta e cinco .ul de uma solução contendo 20 mg de SMCC (Pierce) em 1 ml de acetonitrilo foram adicionados

:0 mg	de
; 1,3	ml
ísío	0, 1
! 7,5.	A
proteína
mei o	de
< GH	OP
»0,1	M,
7,0.	A
ί ml	de
30%	foi
Passados
2 ml	da

solução foi agitada durante uma hora a 25°C, e depois a proteína foi separada do reagente que não tinha reagido por cromatografia de filtração de gel numa coluna contendo borato de potássio 0,02 M, cloreto de sódio 0,15 M, j fracção da proteina foi recolhida. Um volume de 1 hidróxido de potássio 0,12 M, EDTA 0,6 mM em etanol a 30% adicionada a 100 ul ds E3G-HCTL 210 mM em metanol, cinco minutos, 1,1 ml da solução foram adicionados a ΐ albumina de soro bovino derivada com SMCC (6,5 mg/ml). A solução foi agitada durante duas horas a 25 °C e depois foi submetida a diálise contra duas mudas de um litro de ácido <2-<N-morfolino))etanossu1f ón i co 1OmM, pH 5,0.

Preparação de Conjugado ESG-Ouro Coloidal

Ouro coloidal com partículas de diâmetro médio de 45 nm foi preparado de acordo com o método de Frens, Nature, Physical Sciences, 241, 20 (1373). 0 conjugado E3G-ouro coloidal foi preparado adicionando 5,6 ml de ácido (2-CN-morfolino)etanossu1fónico (MES) 0,1 M, pH 5,8 gota a gota a 50 ml de ouro coloidal com agitação rápida. Conjugado E3G-BSA (3 mg/ml em MES 10 nM, azida de sódio 0,02%, pH 5,8) foi adicionado num aglomerado ao ouro coloidal, enquanto se agitava rapidamente. Uma vez obtida a mistura completa, interrompeu-se a agitação s a solução foi incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente. Seguiu-se a adição de 1 ml de BSA (3 mg/ml em MES 10 mM, azida de sódio

0,02%, pH 5,S) com mistura e uma incubação de cinco minutos. Polietileno glicol Cmassa molecular média = 20 000) foi adicionado numa solução a 1% <0,59 ml) e misturado. 0 ouro coloidal foi submetido a centrifugação a 27 000 g durante 12 minutos a 4 °C para se formar um grânulo. 0 material sobrenadante foi removido e o grânulo foi lavado por duas vezes com 35 ml de fosfato de a 0,01%, azida. de sódio a centri fuf i na1, o tampão e potássio 10 mM, glicol de polietileno 0,02%, pH 7,0 mediante nova suspensão e submetendo-o a gação tal como se descreveu. Após a centrifugação grânulo foi suspenso de novo em 0,5 ml da solução armazenado a 4°C.

Construção do Dispositivo e Demonstração da Separação do Conjugado Livre/Ligado

Uma membrana de nylon CPall Imrounodyne 0,55 jum) foi laminada e aplicada à face inferior de uma folha de estireno de 0,020 polegadas com uma pequena primeira abertura para fluidos rectangular de dimensões 0,10 x 1,1 cortada no seu centro. Um anticorpo monoclonal contra ESG foi ligado de modo covalente à membrana de nylon activada sob a forma de uma série de três manchas de 0,6 ,ul dispostas a igual distância umas das outras na primeira abertura para fluidos usando o seguinte procedimento de ligação de proteínas; P0^ 1 M, tetrazole a 100 mg/ml, borato 50 mM, NaCl 150 mM, anticorpo a 1,5 mg/ml,· pH 7,4. A membrana foi bloqueada com uma solução de caseína a 1% p/v e seca de um dia para o outro num exsicador. Após a secagem, o conjunto laminado foi colocado numa parte moldada por injecção de um copolímero de estireno, que .incluía uma série de canais em forma de V a 90° com 0,014 polegadas de largura e 0,007 polegadas de profundidade. 0 conjunto laminado foi depois soldado por pontos <spot welded) com ultrasons à parte moldada por injecção.

Uma amostra de SOjil de conjugado E3Q-ouro coloidal gue não estava ligado a anticorpo anti~E3G foi adicionada à membrana exposta no centro da primeira abertura para fluidos, e deixada absorver pela membrana. Uma parte alíquota de de conjugado E3õ'~ouro coloidal ligado a 100% ao anticorpo anti-E3G foi adicionada ao centro da primeira abertura para fluidos noutro dispositivo. Em ambos os dispositivos, e depois de o conjugado ter sido absorvido, adicionaram-se 100 ,ul de uma solução de lavagem aquosa contendo Lubrol a 0,05% como surfactante è. membrana exposta no centro da primeira abertura para fluidos, deixando que fluíssem através da membrana. Xmediatamente após a etapa de lavagem, a membrana

E3G~ouro série de membrana do primeiro dispositivo, a que fora aplicado conjugado coloidal não ligado ao anticorpo anti-E3G, formou um três manchas vermelhas distintas, tendo o resto da adquirido uma tonalidade branca. No caso da membrana do segundo dispositivo, gue utilizara conjugado E3G-our ligado a 100%, a totalidade da membrana adquiriu uma branca. Isto demonstrou que um conjugado de análogo estava ligado especificamente por meio de receptor imobilizado num membro poroso formada entre o membro poroso de textura funcionava de modo a poroso quaisquer reagentes não o coloidal tonaIi dade de ligando de 1i gando e que a rede de canais capilares e o membro não-absorvente provido transportar para longe do membro 1igados.

Exemplo 2

Preparação de Conjugado Morf ,ina-Fosfatase A1 ca 1 ina

Três mg adi c ionados a 2,2 de potássio 0,1 M, 0,15 M. pH 7,5. hora a 25°C, depoi <6,9 x 10 ° mol) de sulfo-SMCC (Pieree) foram ml de fosfatase alcalina a 4,9 mg/ml em fosfato borato de potássio 0,02 M, cloreto de sódio A solução de proteina foi agitada durante uma s a proteina. foi separada de sulfo-SMCC que não

•50

tinha reagido por meio de cromatografia de filtração de gel numa coluna contendo 40 ml de G'H 25 (Amicon Corporation) equilibrada com fosfato de potássio 0,1 M, borato de sódio 0,02 H, cloreto de sódio 0,15 M, pH 7,0. A fracção contendo a proteina obtida da coluna por eluição foi recolhida. E3G-HCTL foi hidrolizada adicionando 20 ul de carbonato de potássio 0,12 H, EDTA 0,5 mH em metanol a 40% a 13 ul de E3S-HCTL 48,5 mH em metanol. A solução foi mentida em repouso a 25°C durante dez minutos, e depois 30 jul da solução foram adicionados a 250 jul da fosfatas© alcalina derivada com sulfo-SNCC <3,5 mg/ml) em fosfato de potássio 0,1 H, borato de potássio 0,02 M, cloreto de sódio 0,15 M, cloreto de magnésio 0,4H, pH 7,0. 0 pH da solução foi ajustado para o valor 7,0 com HC1 1 N e depois a solução foi agitada durante 30 minutos a 25°C. A proteina foi separada dos reagentes qus não tinham reagido por meio de cromatografia de filtração de gel tal como se descreveu atrás. A fracção da proteina foi recolhida e o conjugado foi diluído para utilização em testes numa solução contendo albumina de soro bovino a 1%, cloreto de magnésio 1 mH, cloreto de zinco 0,1 mH, azida de sódio a 0,1% e ácido 3-<4~morfoIino)~ propanossulfônico 10 mH, pH 7,0.

Construção do Dispositivo e Criação da Rede de Canais Capilares

Após Adição da Amostra

Uma membrana de nylon (Pall Immursodyne 0,55 um) foi laminada e aplicada à face inferior de uma folha de estireno de 0,020 polegadas com uma pequena primeira abertura para fluidos rectangular de dimensões 0,10 x 1,1 cortada no centro. Um anticorpo monoclonal contra E3S foi ligado de modo covalente â membrana de nylon activada sob a forma de uma série de três manchas de 0,05-ul a igual distância umas das outras na primeira abertura para fluidos usando o seguinte procedimento de ligação de proteínas; PD^ 1H, tetrazol© a 100 mg/ml, borato 50 mH, WacL

150 mM, anticorpo a 1,5 mg/ml, pH 7,4; e depois bloqueado com uma solução de caseína a 13 p/v e seco de un dia para o outro num exsicador. Após a secagem, o conjunto laminado foi colocado de tal modo que a parte inferior da membrana estivesse suspensa no ar. Uma parte alíquota de SO/jI de um conjugado de ESG e fosfatase alcalina que não estava ligado ao anticorpo anti-E3G foi adicionada à membrana exposta no centro da. primeira abertura para fluidos e deixada absorver pela membrana. Num outro conjunto laminado com mebrana, SO;jI de um conjugado E3G~fosfatase alcalina ligado a 100% ao anticorpo ant.i-E3G foram adicionados ao centro da primeira abertura para fluidos.

Os conjuntos laminados foram depois montados individualmente sobre uma placa de liga de magnésio sujeita a foto-tratamento íphoto-etched). A placa continha uma série de canais longitudinais em forma de U a 90° com uma largura de 0,014 polegadas e uma profundidade de 0,007 polegadas. Perpendiculares aos canais longitudinais existia uma série de canais em forma de U a 127° com uma largura de 0,028 polegadas e uma profundidade de 0,007 polegadas. Uma parte alíquota de 100 yl de uma solução de lavagem aquosa contendo lubrol a 0,0-5 % como agente surfactante foi então adicionada à membrana exposta no centro da primeira abertura para fluidos e deixada fluir através da membrana.

Isto foi seguido pela adição de 60?.il de solução contendo fosfato de i ndoxi .1 lOm.M, um substrato para a fosfatas© alcalina cspaz de produzir uma coe visível. Passados dois minutos, a membrana do primeiro dispositivo, que utilizara um conjugado E3G-fosfatase alcalina que não estava ligado a anticorpo anti-E3G, apresentava um motivo constituido por três manchas azuis distintas; enquanto que a membrana exposta da segunda membrana, que utilizara um conjugado E3G-fosfata.se alcalina completamente pré-ligado ao anticorpo anti~E3G permanecia branca. Isto demonstrou que a rede de canais capilares resultante do contacto entre o membro poroso

· e os membros não-absorventes de superfície provida de textura pode ser formada apôs a adição inicial da amostra ao membro poroso.

Exemp1o 3

Preparação de Hidrocloreto de 3~0~C2'-<2~Amino~4-Ác ido Tiolbutanóico Ti,olac tona)-Ace tam i dal-Mo r f i na < Mo r f i na-HCTL )

Hidrocloreto de tiolactons de horaocisteína <120 mg, 7,8 mol), 62 mg <7,8 x 10 -4 mol) de piridina e 236 mg <7,8 x 10 mol) de hidrocloreto de 3-0-csrboximetiImorfina foram dissolvidos em 5 ml de dimetiIformamida. Seguiu-se a adição de 1 ml de uma solução de dimetilformamida contendo 177 mg <8,6 x 10 mol) de diciclohexi1carbodiimida. Cf recipiente foi purgado com ãrgon e a solução foi agitada a 2S°C durante três horas. 0 solvente foi evaporado sob vácuo e adicionaram-se 20 ml de água ao resíduo. A solução foi agitada durante cinco minutos e depois a diciclohexil ijri=ia insolúvel foi filtrada. 0 filtrado foi lavado com 10 ml de cloreto de metileno. 0 pH da fase aquosa foi ajustado para o valor 7 com uma solução aquosa saturada de carbonato de potássio. A solução aquosa foi extraída por seis vezes com 10 ml de cloreto de metileno. Os extractos orgânicos combinados foram secos com 2 g de sulfato de magnésio, filtrados, e o solvente foi removido sob vácuo. Adicionou-Se etanol <20 ml) ao resíduo que foi evaporado sob vácuo para remoção da piridina. Adicionou—se acetato de etilo <10 ml) e os materiais insolúveis que precipitaram foram filtrados. Adicionou-se à solução ácido clorídrico etéreo <1 M) com agitação que se manteve até o pH causar a passagem a vermelho do papel de tornessol. 0 sólido branco foi filtrado e lavado com acetato de etilo. 0 produto foi seco sob vácuo e o rendimento foi de 316 mg

Preparação de Conjugado de Morfina-Albumina de Soro Bovino

Setenta e cinco >j! de uma solução contendo 20 mg de SMCC (Pierce) em 1 ml ds acetonitrilo foram adicionados a 1,9 ml de albumina de soro bovino a 20 mg/ml em borato de potássio 0,1 M, fosfato de potássio 0,1 M, cloreto de sódio 0,15 M, pH 7,5. A solução foi agitada durante uma hora a 25°C, e depois a proteina não tinha reagido por meio de gel numa coluna contendo GH 25 foi separada do reagente gue cromatografia de filtração de (Amicon Corporation) equilibrada em fosfato de potássio 0,1 borato de potássio 0,02 M, cloreto de sódio 0,15 M, pH 7,0. fracção da proteina foi recolhida. Um volume de 0,42 ml carbonato de potássio, 0,12 M, EDTA 0,5 mM em metanol a 40% adicionado a 4 mg de morfxna-HCTL. Passados dez minutos, 140

M,

A de ^?oi ,ul da solução foram adicionados a 8,2 ml da albumina de soro bovino derivada com SMCC (4,6 mg/ml). A solução foi agitada **’ duas horas a 25° C, depois foi submetida a diálise em dois de ácido <2-<N-morfoixno))etanossulfónico 10 mM, pH 5,0. A solução tampão da diálise foi mudada por duas vezes antes de se recolher o conjugado morfina-BSA.

durante 1i tros

Preparação de Conjugado Morfina-Quro Coloidal

Ouro coloidal com partículas de diâmetro médio de 45 nm foi preparado de acordo com o método de Erens, Nature, Physical Sciences, 241, 20 (1973). 0 conjugado morfina-ouro coloidal foi preparado adicionando 5,6 ml de ácido (2-(N-morfolino))etanossul~ fónico (MES) 0,1 M, pH 5,8, gota a gota a. 50 ml de ouro coloidal com agitação rápida. 0 conjugado morfina-BSA (a 3 mg/ml em MES 10 mM, az ida de sódio a. 0,02%, p-H 5,8) foi adicionado num aglomerado ao ouro coloidal enquanto se agitava rapidamente. A agitação foi interrompida uma vez completa a mistura e a solução foi incubada durante 30 minutos à temperatura, ambiente. Seguiu-se a.

adição de i ml de BSA (a 3 mg/ml em MES 10 nM, azida de sódio a 0,02%,pH 5,8 ) com mistura e uma incubação ds cinco minutos. Adicionou-se glicol de polietileno (massa molecular média = 20 000) numa solução a .1.% (0,58 ml) e misturou-se. 0 ouro coloidal foi submetido a centrifugação a 27 000 g durante 12 minutos a 4°C para se formar um grânulo. 0 material sobrenadante foi removido e o grânulo foi lavado por duas vezes com 35 ml de fosfato de potássio 10 mM, glicol de polietileno a 0,01%, azida de sódio a 0,02%, pH 7,0, suspendendo-o de novo e submetendo-o a centrifugação tal como se descreveu. Após a centriíugação final, o grânulo foi suspenso de novo em 0,5 ml da solução tampão e armazenado a 4°C.

Construção do Dispositivo Imunoc roma togràf :i.co e Demonstração do

Efei to Imunoc romatográf i co

Uma membrana de nylon (Pall Biodyne C 5 ,um) foi laminada e aplicada á face inferior de uma folha de estireno de 0,020 polegadas gue tinha cortadas uma pequena abertura adicional para fluidos de dimensões 0,10 x 1,10 polegadas e uma primeira abertura para fluidos de dimensões 0,10 polegadas x 0,10 polegadas. Um anticorpo monoclonal membrana por meio de á1c oo1 po1i v i η x 1 i co a 1,17 mg/ml, pH 3,0 e contra morfina

Ό1 adsorçãc i mob i1i zado sob r e a a partir de uma solução contendo 1% MM 2 000, citrato 50 mM, anticorpo a a membrana foi depois bloqueada com uma solução de caseína a 0,1% p/v e álcool polivinilico a 1% MM 2 000 e seca de um dia para o outro num exsicador. Após secagem, o conjunto laminado foi colocado numa parte moldada por injecção de um copolímero de estireno, que continha uma sérir ds canais longitudinais em forma de V a 90° de largura 0,014 polegadas e profundidade 0,007 polegadas. 0 soldado por pontos (spot welded) conjunto laminado foi depois ê. parte moldada por injecção recorrendo a ultrasons, de tal modo que a membrana sob a primeira

abertura para fluidos não estivesse provida de textura da parte moldada em c on ta c to com a supe r f i c i e po r i nj e c ção não-absor ven te.

Partes aliquotas de 60/j1 de uma série de conjugados morfina-ouro coloidal (concentrações relativas de 2, 1,3 e 1 foram então adicionadas à primeira abertura para fluidos de cada um de três dos dispositivos atrás descritos. Depois de o conjugado ter percorrido a totalidade do comprimento da janela, adicionaram-se 100 .ul de uma solução aquosa de lavagem contendo lubrol a 0,05% como agente surfactante ao centro da abertura para fluidos adicional, deixando que a solução fluísse através da membrana. Imediatamente após a conclusão da etapa de lavagem, um região vermelha apareceu na membrana na abertura para fluidos adicional. O comprimento da região vermelha variava proporcionalmente à concentração do conjugado morfina-ouro coloidal. Isto demonstrou que as espécies marcadas na amostra podem ser introduzidas numa extremidade do membro poroso e ser forçadas a reagir com o receptor de ligando imobilizado ao longo do membro poroso

Claims (6)

1. lã - Dispositivo para testar uma amostra suspeita de conter pelo menos um ligando-alvo, carac ter izado por compreender >' um membro poroso possuindo uma superfície superior e uma superfície inferior, sendo a amostra referida aplicada á superfície superior referida,’ e um membro não-absorvente possuindo uma superfície provida de textura com canais capazes de formar uma rede de canais capilares guando aquela ê colocada em comunicação por baixo ou em volta do membro poroso referido, com a rede capilar referida substancialmente paralela à superfície inferior do membro poroso referido;

   mediante o que a amostra, isoladamente ou em combinação com outros fluidos, é atraída através do membro poroso referido para a rede capilar referida formada entre o membro poroso referido e o membro não-absorvente referido quando o volume vazio do membro poroso referido é substancialmente ocupado na sua totalidade com a amostra e/ou fluidos referidos e quando o membro poroso e o membro não-absorvente referidos são postos em contacto .
2. 2ã - Dispositivo para testar uma amostra suspeita de conter pelo menos um ligando-alvo caracterizado por compreender:

   um membro poroso possuindo uma superfície superior e uma superfície inferior, sendo a amostra referida aplicada à superfície superior referida; e em que pelo menos um agente de ligação estâ directa ou indirectamente ligado; e um membro não-absorvente possuindo uma superfície provida ds textura com canais capazes de formar uma rede de canais capilares quando aquela é colocada em comunicação por baixo ou em volta do membro poroso referido, com a rede capilar referida substancialmente paralela à superfície inferior do membro poroso referido,' mediante o que a amostra, isoladamenfe ou em combinação com outros fluidos, é atraída através do membro poroso referido para a rede capilar referida formada entre o membro poroso e o membro não-absorvente referidos quando o volume vazio do membro poroso referido e subsfane iaImente ocupado na sua totalidade con» a amostra e/ou fluidos referidos e quando o membro poroso e o membro não-absorvente referidos são postos em contacto.
3. 3ã - Dispositivo para conter pelo menos um ligando-alvo testa»·' uma amostra suspeita de caracterizado po»' compreender ;

   um membro poroso possuindo uma superfície superior e uma superfície inferior, sendo a amostra referida aplicada â superfície superior referida! e em que pelo menos um receptor de ligando esta directa ou indx rec tamente ligado! e un» membro não-absorvente possuindo uma superfície provida de textura com canais capazes de forma»·* uma rede de canais capilares quando aquela é colocada em comunicação por baixo ou em volta do membro poroso referido, com a rede capilar referida substancialmente paralela à superfície inferior do membro poroso referido!

   mediante o que a amostra, isoladamenfe ou em combinação com outros fluidos, é atraída através do membro poroso referido para a rede capilar referida formada entre o membro poroso e o membro não-absorvente referidos quando volume vazio

   Γΐ membro poroso referido é substancialmente ocupado na sua totalidade com a amostra e/ou fluidos referidos e quando o membro poroso e o membro não-absorvente referidos são postos em contacto.
4. 4â - Dispositivo para testar uma amostra suspeita de conter pelo menos um 1igando-alvo caracterizado por compreender;

   um membro poroso possuindo uma superfície superior e uma superfície inferior, sendo a. amostra referida aplicada à superf í cie super i o r refe r i da; e um membro não-absorvente possuindo uma superfície provida de textura com canais capazes de formar uma rede de canais capilares quando aquela é colocada em comunicacão por baixo ou em volta do membro poroso referido, com a rede capilar referida substâncialmente paralela â superfície inferior do membro poroso referido;

   mediante o que a amostra, isoladamente ou em combinação com outros fluidos, é atraída através do membro poroso referido para a rede capilar referida formada entre o membro poroso e o membro não-absorvente referidos quando o volume da amostra referida, isoladamente ou em combinação com outros fluidos, excede substancialmente o volume vazio do membro poroso referido e quando o membro poroso e o membro não-absorvente referidos são pos tos em c on ta c to.
5. 5â - Dispositivo para testar uma amostra suspeita de conter pelo menos um 1igando-alvo caracterizado por compreender:

   um membro poroso possuindo uma superfície superior e uma superfície inferior, sendo a amostra referida aplicada à de superfície superior referida; e em que pelo manos um agente ligação está ligado directa ou indirectamente; e um membro não-absorvente possuindo uma superfície provida de textura com canais capazes de formar uma rede de canais capilares quando aquela é colocada em comunicação por baixo ou em volta do membro poroso referido, com a rede capilar referida substancialmente paralela à superfície inferior do memfo r o po r oso refe r i do 1 mediante o que a amostra, isoladamente ou em combinação com outros fluidos, é atraída através do membro poroso referido para a rede capilar referida formada entre o membro poroso e o membro não-absorvente referidos quando o volume da amostra referida, isoladamente ou em combinação com outros fluidos, excede substancialmente o volume vazio do membro poroso referido e quando o membro poroso e o membro não-absorvente referidos são pos tos em c on ta c to.

   Sã - Dispositivo para testar uma amostra suspeita de conter pelo menos um ligando-alvo caracterizado por compreender!

   um membro poroso possuindo uma superfície superior e uma superfície inferior, sendo a amostra referida aplicada à superfície superior referida; e em que pelo menos um receptor de ligando está ligado directa. ou indi rec tamente; e um membro não-absorvente possuindo uma superfície provida de textura com canais capazes de formar uma rede de canais capilares quando aquela é colocada em comunicacão por baixo ou em volta do membro poroso referido, com a rede capilar referida sufostancialmente paralela ã membro poroso referido;

   superfície inferior do mediante o gue a amostra, isoladamente ou em combinação com outros fluidos, é atraída através do membro poroso referido para a rede capilar referida formada entre o membro poroso e o membro não-absorvente referidos guando o volume da amostra referida, isoladamente ou em combinação com outros excede substâncialmente o volume vazio do membro poroso e guando o membro poroso e o membro não-absorvente referidos são pos tos em c on ta c to.

   flui dos, referido
6. 7ã - Dispositivo para testar uma amostra suspeita de conter pelo menos um 1igando-alvo caracterizado por compreender:

   Ca) um membro poroso possuindo uma superfície superior e uma superfície inferior, sendo a amostra referida aplicada á superfície superior referida,' e <b) um membro não—absorvente possuindo uma superfície provida de textura com canais capazes de formar uma rede de canais capilares guando aguela e colocada em comunicação por baixo ou em volta do membro poroso referido, com a rede capilar referida substancialmente paralela à superfície inferior do membro poroso referido,’

   Cc) um terceiro membro não-absorvente disposto substancialmente por cima ou substancialmente em volta do membro poroso Ca) referido, possuindo pelo menos uma abertura, de tal modo gue os fluidos aplicados â abertura referida passem sobre e/ou para dentro do membro poroso Cb) referido; e mediante o gue a amostra, isoladamente com outros fluidos, é atraída através do membro ou em comoinação po r oso ref e ri do para a rede capilar referida formada entre o membro poroso e membro não-absorvente referidos guando volume vazio do membro poroso referido é substancialmente ocupado na sua totalidade com a amostra e/ou fluidos referidos e quando o membro poroso e o membro não-absorvente referidos são postos em contacto.

   Sâ - Dispositivo para testar uma amostra suspeita de conter pelo menos um ligando-alvo caracterizado por compreender:

   (a) um membro poroso possuindo uma superfície superior e uma superfície inferior, sendo a amostra referida aplicada à superfície superior referida; e em que pelo menos um agente de ligação está ligado directa ou indirectamente; e (b) um membro não-absorvente possuindo uma superfície provida de textura com canais capazes de formar uma rede de canais capilares quando aquela é colocada em comunicacão por baixo ou em volta do membro· poroso referido, com a. rede capilar referida substancialmente paralela ã superfície inferior do membro poroso referido;

   (cl um terceiro membro não-absorvente disposto substancialmente por cima ou substancialmente em volta do membro poroso Ca) referido, possuindo pelo menos uma abertura, de tal modo que os fluidos aplicados à abertura referida passem sobre e/ou para dentro do membro poroso Cb) referido; e mediante o que a amostra, isoladamente ou em combinação com outros fluidos, é atraída através do membro poroso referido para a rede capilar referida formada entre o membro poroso e o membro não-absorvente referidos quando o volume vazio do membro poroso referido é substancialmente ocupado na sua totalidade com a amostra e/ou fluidos referidos e quando o membro poroso e o membro não-absorvente referidos são postos em contacto.

   -., ο ν'9ã - Dispositivo para testar uma amostra suspeita de conter pelo menos um ligando-alvo caracterizado por compreender;

   f3 (a) um membro poroso possuindo uma superfície superior e uma superfície inferior, sendo a amostra referida aplicada à superfície superior referida; e em que pelo menos um receptor de ligando está ligado directa ou indi rec tamente,’ e <b> um membro não-absorvente possuindo uma superfície provida de textura com canais capazes ds forrnar uma rede de canais capilares quando aquela έ colocada em comunicação por baixo ou em volta do membro poroso referido, com a rede capilar referida substancialmente paralela à superfície inferior do memb r o po r oso r e fs r i do;

   <c) um terceiro membro não-absorvente disposto substancialmente por cima ou substancialmente em volta do membro poroso {. al referido, possuindo pelo menos uma aoertura, de tal modo que os fluidos aplicados; è abertura referida passem sobre e/ou para dentro do membro poroso (bl referido; e mediante o que a amostra, isoiaoamente ou em combinação com outros fluidos, é atraída através do membro poroso referido pa r a a membro a rede capilar referida formada entre o membro poroso· e o não—absorvente referidos quando o volume vazio do membra poroso· referido é substanc ialmente ocupado na sua totalidade con a. amostra e/ou f Iuido*s referidos e quando o membro* poroso e o membro não-absorvente referidos são postos em contacto.

   lOã - Dispositivo para testar uma amostra suspeita de conter pelo menos um ligando-alvo caracterizado por compreender;

   <a) um membro poroso possuindo uma e uma superfície inferior, sendo a amostra super f í c i e super i o r ref erx da apIi c ada ã superfície supe r i o r r e f er i da <b? um membro não-absorvente possuindo uma superficie provida de textura com canais capazes de formar uma rede de canais capilares quando aquela é colocada em comunicação por baixo ou em volta do membro poroso referido, com a rede capilar referida substancialmente paralela à superficie inferior do memb r o po r oso r e feri do

   Cc) um terceiro membro não-absorvente disposto substancialmente por cima ou substancialmente em volta do membro poroso Ca) referido, possuindo pelo menos uma abertura, de tal modo que os fluidos aplicados à abertura referida passem sobre e/ou para dentro membro poroso Cb) referido,' mediante o que a amostra, isoladamente ou em combinação com outros fluidos, é atraída através do membro poroso í-eferido para a rede capilar referida formada entre o membro poroso e o membro não-absorvente referidos quando o volume da amostra referida, isoladamente ou em combinação com outros fluidos, excede substancialmente o volume vazio do membro poroso referido e quando o membro poroso e o membro não-absorvente referidos são postos em contacto.

   ílã - Dispositivo para testar uma amostra suspeita de contei- pelo menos um ligando-alvo caracterizado por compreenderί

   Ca) um membro poroso possuindo uma superficie superior e uma superficie inferior, sendo a amostra referida aplicada à superfície superior referida; e em que pelo menos um agente de ligação está ligado directa ou indirectame-nte;

   Cb) um membro não-absorv provida de textura com canais capazes de formar uma rede de canais capilares quando aquela é colocada em comunicação por baixo ou em volta do membro poroso referido, com a rede capilar referida substancialmente paralela à superfície inferior do membro poroso referido;

   Cc) um terceiro membro não-absorvente cialmente por cima ou substancialmente em volta disposto substancio membro poroso de tal modo que sobre e/ou para

   i. a) referido, possuindo pelo menos uma abertura, os fluidos aplicados à abertura referida passem dentro do membro poroso Cb) referido,’ e mediante o que a amostra, isoladamente ou em combinação com outros fluidos, é atraída através do membro poroso referido para a rede capilar referida formada entre o membro poroso e o membro não—absorvente referidos quando o volume da amostra referida, isoladamente ou em combinação com outros fluidos, excede sufostancialmente o volume vazio do membro poroso referido e quando o membro poroso e o membro não-absorvente referidos são pos tos em c on ta c to.

   Í2ã - Dispositivo para testar uma amostra suspeita de conter pelo menos um ligando-alvo caracterizado por compreender;

   Ca) um membro poroso possuindo uma e uma superfície inferior, sendo a amostra s u F¹ e rf íc i e s u p e r i o r referida ap1 içada à superfície superior referida,' e em que pelo menos um 1i gando estã li gado d i r e c ta ou i nd i re ctamen te;

   receptor de

   Cb) um membro provida de textura com canais capilares quando não-abso r ven te possui ndo uma super fieie canais capazes de formar uma rede de aquela é colocada em comunicação por

   -X baixo ou em volta do membro poroso referido, ,c4m''S''rede capilar referida substancialmente paralela á superfície inferior do membro poroso referido;

   <c) um terceiro membro não-absorvente disposto substancialmente por cima ou substancialmente em volta do membro poroso <a) referido, possuindo pelo menos uma abertura, de tal modo que os fluidos aplicados à abertura referida passem sobre e/ou para dentro do membro poroso (b) referido; e mediante o que a. amostra, isoladamente ou em combinação com outros fluidos, é atraída através do membro poroso referido para a rede capilar referida formada entre o membro poroso e o membro não-absorvente referidos quando o volume da amostra referida, isoladamente ou ©m combinação com outros fluidos, excede substancialmente o volume vazio do membro poroso referido & quando o membro poroso e o membro não-absorvente referidos são postos em contacto.

   tox'

   13® - Dispositivo de acordo com as reivindicações 3 ou & ou 9 ou 12, caracterizado por o receptor de ligando ser um anticorpo monoclonal capaz de se ligar ao ligando-alvo referido.

   14® - Dispositivo de acordo com as reivindicações 1 ou 2-12, caracterizado por o membro poroso referido ser uma membrana de nylon.

   15.® - Método de realização de um teste 1 .igando-receptor não-competitivo utilizando o dispositivo de acordo com as reivindicações 2, 3, 5, &, 8, 9, 11, ou 12, caracterizado· por compreender os seguintes passos,' to/

   Ca) aplicação de um volume da amostra referida ao d i spos i t i vo referi do;

   Cb) adição de um volume de um segundo agente de ligação marcado capaz de se ligar ao complexo gue se forma entre o 1igando-alvo referido e o agente de ligação ligado referido; e

   Cc) lavagem para remoção do excesso de Iigando-alvo e/ou do excesso de fluidos.

   16â - Método de realização de um teste 1igando-receptor competitivo utilizando o dispositivo de acordo com as reivindicações 3, 6, 9 ou .12, carac ter izado por compreender os seguintes £>SOSíi *

   Ca) aplicação de um volume da amostra referida ao dispositivo referido, incluindo a amostra referida pelo menos um 1igando-alvo referido e pelo menos um análogo de ligando marcado cspaz de competir com o .1 igando-al vo referido pela ligação ao receptor de ligando referido ligado no membro poroso referido;

   Cb) ligação do análogo de ligando marcado referido ao receptor de ligando ligado referido,* e

   Cc) lavagem para remoção do excesso de 1igando-alvo e/ou do excesso de fluidos.

   17â - Método de realização de um teste 1igando-receptor competitivo utilizando o dispositivo de acordo com as reivindica9 ou 12, em gue o 1 igando-alvo referido na.

   ç ões 3, 6, referida é amostra um receptor de ligando capaz de competir : om um conjugado de receptor de ligando marcado pela ligação ao agente j 67 de ligação referido ligado no membro poroso referido, caracterizado por compreender os seguintes passos;

   Ca) aplicação de um volume da amostra referida ao dispositivo referido, incluindo a amostra referida pelo menos um 1igando-1vo referido e pelo menos um conjugado de receptor de ligando;

   Cb) ligação do receptor de ligando marcado referido ao receptor de ligando ligado referido; e

   Cc) lavagem p*ara remoção do excesso de ligando alvo e/ou do excesso de fluidos.