JP3135067B2 - 免疫診断検査系およびその利用 - Google Patents
免疫診断検査系およびその利用Info
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は免疫診断の分野に関する。より詳細には、特
別の検査装置を用いた試料の分析による、一つまたは二
つ以上の分析物、またはそうした分析物の性質の測定に
関する。
別の検査装置を用いた試料の分析による、一つまたは二
つ以上の分析物、またはそうした分析物の性質の測定に
関する。
背景および先行技術 数多くの方法において、分析物の測定に利用するため
に、免疫学の分野が取り入れられてきた。分析物または
その性質の測定のために免疫学の原理を応用すること
は、本文に記載される本発明にとって特に興味深い。
に、免疫学の分野が取り入れられてきた。分析物または
その性質の測定のために免疫学の原理を応用すること
は、本文に記載される本発明にとって特に興味深い。
臨床診断は、抗体が特異的な分子に結合するという、
よく知られた抗体の能力を利用する。結果として得られ
る「プローブ」および「標的」の複合体（以下に説明す
る理由によりこの用語を使用する）は、多数の方法によ
り測定される。診断法の一群をなす「均一系アッセイ」
は溶液中で行なわれるが、本文に記載される本発明とは
特に関係はない。不均一系アッセイの一群が関係を有す
る。
よく知られた抗体の能力を利用する。結果として得られ
る「プローブ」および「標的」の複合体（以下に説明す
る理由によりこの用語を使用する）は、多数の方法によ
り測定される。診断法の一群をなす「均一系アッセイ」
は溶液中で行なわれるが、本文に記載される本発明とは
特に関係はない。不均一系アッセイの一群が関係を有す
る。
不均一系アッセイにおいては、標的物質を同定および
／または定量するために、なんらかの相の変化または相
の分離が行なわれる。相の変化は、例えば固相に結合し
たプローブに標的分子を結合させることを包含すること
ができる。ひとたびこうした結合が起これば、多くの場
合第２の標的特異的標識プローブとの接触によって、固
相に結合した複合体が同定される。プローブ上の標識
は、酵素、蛍光分子、放射能標識などを包含する多数の
選択枝から選択可能である。標識されたプローブが固相
上で標的分子と結合する場合、標的と結合しないが固相
には会合している標識プローブを除去することが通常行
なわれる。一般に、これは固相を洗浄することによって
行なわれる。この段階は、必要であるが時間がかかる。
さらに、洗浄は幾分の不正確さをもたらすが、これは固
相の洗浄が不十分であるか、十分すぎて標的に結合した
物質を追い出してしまうかのいずれかに関係しているに
違いない。いずれの場合も測定に不確かさをもたらし、
コントロール実験を行なう必要がある。
／または定量するために、なんらかの相の変化または相
の分離が行なわれる。相の変化は、例えば固相に結合し
たプローブに標的分子を結合させることを包含すること
ができる。ひとたびこうした結合が起これば、多くの場
合第２の標的特異的標識プローブとの接触によって、固
相に結合した複合体が同定される。プローブ上の標識
は、酵素、蛍光分子、放射能標識などを包含する多数の
選択枝から選択可能である。標識されたプローブが固相
上で標的分子と結合する場合、標的と結合しないが固相
には会合している標識プローブを除去することが通常行
なわれる。一般に、これは固相を洗浄することによって
行なわれる。この段階は、必要であるが時間がかかる。
さらに、洗浄は幾分の不正確さをもたらすが、これは固
相の洗浄が不十分であるか、十分すぎて標的に結合した
物質を追い出してしまうかのいずれかに関係しているに
違いない。いずれの場合も測定に不確かさをもたらし、
コントロール実験を行なう必要がある。
ある特定の標識がこの分野で広く用いられているが、
それらに問題がないわけではない。例えば、放射能標識
は、それが結合できるプローブ上のサイトを前提とす
る。そのようなサイトが存在しても、放射能標識は注意
深く取り扱われなくてはならず、熟練した人員を必要と
する。酵素はおそらく最も一般的な標識となっている。
こうした標識を含むアッセイは、酵素基質の使用を必要
とする。接触時に基質に作用し、検出可能なシグナルを
生じる。一般に、そのシグナルは色または色の変化であ
る。こうした方法は放射能標識よりも扱いが容易である
が、酵素と基質との反応は時間がかかる可能性がある。
また、酵素は時間が過ぎると品質が低下し、酵素を使っ
た検査系は在庫有効期間を限定している。
それらに問題がないわけではない。例えば、放射能標識
は、それが結合できるプローブ上のサイトを前提とす
る。そのようなサイトが存在しても、放射能標識は注意
深く取り扱われなくてはならず、熟練した人員を必要と
する。酵素はおそらく最も一般的な標識となっている。
こうした標識を含むアッセイは、酵素基質の使用を必要
とする。接触時に基質に作用し、検出可能なシグナルを
生じる。一般に、そのシグナルは色または色の変化であ
る。こうした方法は放射能標識よりも扱いが容易である
が、酵素と基質との反応は時間がかかる可能性がある。
また、酵素は時間が過ぎると品質が低下し、酵素を使っ
た検査系は在庫有効期間を限定している。
蛍光色素や磁性極微粒子といった標識もさらに開発さ
れているが、いずれも完全に満足できるものではないこ
とが判明している。適当な検査系の開発は、アッセイを
行う時間の長さ、必要な装置、試薬の安定性などを包含
する、数多くの要点の考慮を要する。
れているが、いずれも完全に満足できるものではないこ
とが判明している。適当な検査系の開発は、アッセイを
行う時間の長さ、必要な装置、試薬の安定性などを包含
する、数多くの要点の考慮を要する。
以前は、すべての免疫診断の中心となる反応は、標的
とプローブとの反応とされた。「標的」は多数の基質の
うちのいずれでもよいため、こうした用語が用いられ
る。ホルモン、サイトカイン、糖タンパク質などのよう
な特異的な生物材料はすべて、細胞型、ウイルス、抗
体、細菌およびその他の物質がそうであったように、免
疫診断によって測定されている。分析物という用語を以
後使用するとき、それは免疫診断法によって測定される
べきあらゆる存在物を包含することを意図する。
とプローブとの反応とされた。「標的」は多数の基質の
うちのいずれでもよいため、こうした用語が用いられ
る。ホルモン、サイトカイン、糖タンパク質などのよう
な特異的な生物材料はすべて、細胞型、ウイルス、抗
体、細菌およびその他の物質がそうであったように、免
疫診断によって測定されている。分析物という用語を以
後使用するとき、それは免疫診断法によって測定される
べきあらゆる存在物を包含することを意図する。
プローブ物質は、目的の分析物に結合する物質であ
る。必ずしもすべてではないが多くの場合、このプロー
ブは抗体であり、多クローン性または単クローン性であ
る。また、このプローブは、Fabフラグメントのよう
な、やはり分析物に結合する能力を有する抗体フラグメ
ントであってもよい。分析物それ自体が抗体である場
合、プローブも同様に抗体であってよいが、それは標的
抗体と結合する分析物または分析物フラグメントであっ
てもよい。便宜上、プローブを以後レセプターと称す
る。
る。必ずしもすべてではないが多くの場合、このプロー
ブは抗体であり、多クローン性または単クローン性であ
る。また、このプローブは、Fabフラグメントのよう
な、やはり分析物に結合する能力を有する抗体フラグメ
ントであってもよい。分析物それ自体が抗体である場
合、プローブも同様に抗体であってよいが、それは標的
抗体と結合する分析物または分析物フラグメントであっ
てもよい。便宜上、プローブを以後レセプターと称す
る。
本文記載の本発明に包含されるアッセイの種類は、不
均一系アッセイの中の一群であって、サンドイッチアッ
セイと称される。このようなタイプのアッセイは、少な
くとも三つの構成員からなる固相結合複合体の形成に関
する。三つの構成員のみが関わる場合には、分析物が中
央にあって、固相に結合した捕捉レセプターおよび標識
レセプターが両側面に位置する。上記を以後、第一およ
び第二レセプターと称する。
均一系アッセイの中の一群であって、サンドイッチアッ
セイと称される。このようなタイプのアッセイは、少な
くとも三つの構成員からなる固相結合複合体の形成に関
する。三つの構成員のみが関わる場合には、分析物が中
央にあって、固相に結合した捕捉レセプターおよび標識
レセプターが両側面に位置する。上記を以後、第一およ
び第二レセプターと称する。
分析物を不均一系で定量するためにサンドイッチアッ
セイを応用することは新規ではない。こうしたアッセイ
の例は、例えばRingの米国特許第4,727,037号およびCam
pbellらの米国特許第4,703,017号に見られる。Ringの特
許は、抗体のイソタイプを決定するための装置および方
法を教示する（すなわち試料中の抗体の重鎖および軽鎖
を確定する）。レセプター抗体を膜上に固定化し、試料
と膜を混合してインキュベートする。洗浄後、酵素標識
抗体を添加し、続いて酵素基質を添加する。アッセイを
実施するのに要する時間は２時間より少ない。Campbell
の特許は、やはりドットブロット法を用いる同様の検査
系を教示する。リポソーム標識レセプターを用いるが、
ここにおいてリポソームはローダミンのような色素を含
む。
セイを応用することは新規ではない。こうしたアッセイ
の例は、例えばRingの米国特許第4,727,037号およびCam
pbellらの米国特許第4,703,017号に見られる。Ringの特
許は、抗体のイソタイプを決定するための装置および方
法を教示する（すなわち試料中の抗体の重鎖および軽鎖
を確定する）。レセプター抗体を膜上に固定化し、試料
と膜を混合してインキュベートする。洗浄後、酵素標識
抗体を添加し、続いて酵素基質を添加する。アッセイを
実施するのに要する時間は２時間より少ない。Campbell
の特許は、やはりドットブロット法を用いる同様の検査
系を教示する。リポソーム標識レセプターを用いるが、
ここにおいてリポソームはローダミンのような色素を含
む。
免疫診断アッセイの実施に際して、当業者は本来のア
ッセイを行なう前に阻止剤を使用するのが通例である。
阻止剤を用いて検査担体を処理することによって、分析
物特異的な試薬を含まない試験紙部分を「遮断」し、そ
れによって目的の分析物との非特異的結合を防止する。
ッセイを行なう前に阻止剤を使用するのが通例である。
阻止剤を用いて検査担体を処理することによって、分析
物特異的な試薬を含まない試験紙部分を「遮断」し、そ
れによって目的の分析物との非特異的結合を防止する。
阻止剤およびその利用は、例えば欧州特許出願第2911
94号および第299428号に記載される。いずれの場合も、
アッセイを実施する前に、試験紙を阻止剤溶液に軽く浸
し、次に、すすぎ、乾燥させる。この段階はアッセイに
最低30分を追加する。米国特許第4,727,037号におい
て、阻止段階は、ウシ血清アルブミン（BSA）PBS溶液と
の一晩のインキュベーションを要する。米国特許第4,70
3,017号も、やはりBSAを使用して、阻止のために30分か
ら１時間を要する。阻止段階は、追加の段階および試薬
のみならず多大な時間をアッセイに追加する。
94号および第299428号に記載される。いずれの場合も、
アッセイを実施する前に、試験紙を阻止剤溶液に軽く浸
し、次に、すすぎ、乾燥させる。この段階はアッセイに
最低30分を追加する。米国特許第4,727,037号におい
て、阻止段階は、ウシ血清アルブミン（BSA）PBS溶液と
の一晩のインキュベーションを要する。米国特許第4,70
3,017号も、やはりBSAを使用して、阻止のために30分か
ら１時間を要する。阻止段階は、追加の段階および試薬
のみならず多大な時間をアッセイに追加する。
検査アッセイを実施するのに要する時間を徹底的に短
縮するために、検査担体を阻止剤とプレインキュベート
する必要性を不要にする検査系を利用可能にすることが
望ましい。しかしながら、得られた検査系はやはり正確
な結果を与えなければならない。発明者らは、驚くべき
ことに、阻止段階がかつては必要であったがこれを取り
除くことができることを発見した。その結果、アッセイ
は５分ほどの短時間に完了することができる。
縮するために、検査担体を阻止剤とプレインキュベート
する必要性を不要にする検査系を利用可能にすることが
望ましい。しかしながら、得られた検査系はやはり正確
な結果を与えなければならない。発明者らは、驚くべき
ことに、阻止段階がかつては必要であったがこれを取り
除くことができることを発見した。その結果、アッセイ
は５分ほどの短時間に完了することができる。
発明の要約 本発明は、二つの分析物特異的な結合パートナーを利
用する検査系を作成することが可能であり、ここにおい
て阻止剤を第二の結合パートナーと混合することがで
き、時間のかかる別々の段階において使用するのではな
く結合パートナーと共同して使用することができるとい
う、驚くべき発見に基づく。結果として、本発明のアッ
セイは５分ほどの短時間で実行可能であり、別の阻止段
階は不要である。
用する検査系を作成することが可能であり、ここにおい
て阻止剤を第二の結合パートナーと混合することがで
き、時間のかかる別々の段階において使用するのではな
く結合パートナーと共同して使用することができるとい
う、驚くべき発見に基づく。結果として、本発明のアッ
セイは５分ほどの短時間で実行可能であり、別の阻止段
階は不要である。
以下の詳細な説明は本発明の有効性を示す。
図面の簡単な説明 第１図は、本発明の典型的なイソタイプ測定試験紙の
表面および裏面を示す。
表面および裏面を示す。
第２図は、本発明のイソタイプ測定試験紙が上端から
どの様に現れるかを示す。
どの様に現れるかを示す。
第３図は、本発明で作成された試験紙表面の走査顕微
鏡写真である。
鏡写真である。
望ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、試料中の一つまたは二つ以上の分析物を測
定するために有用な検査系に関する。この方法は、少な
くとも二つの要素を含む。第１の要素は担体であって、
これは多孔質であり、そのなかに必要な数の、測定すべ
き一つまたは二つ以上の分析物に特異的なレセプターま
たは結合パートナーを含んでいる。一つまたは二つ以上
のパートナーは、第１図の横線のように、多孔質検査担
体上に一定の空間配列で配置される。
定するために有用な検査系に関する。この方法は、少な
くとも二つの要素を含む。第１の要素は担体であって、
これは多孔質であり、そのなかに必要な数の、測定すべ
き一つまたは二つ以上の分析物に特異的なレセプターま
たは結合パートナーを含んでいる。一つまたは二つ以上
のパートナーは、第１図の横線のように、多孔質検査担
体上に一定の空間配列で配置される。
この検査系の第２の要素は、阻止剤と結合した、測定
すべき分析物のための標識レセプターまたは結合パート
ナーである。標識レセプターは、即時に可視的に検出可
能な標識によって標識されており、検査担体上の分析物
と結合するが、それによって直接測定可能なシグナルを
用いて結合部位を指示する。
すべき分析物のための標識レセプターまたは結合パート
ナーである。標識レセプターは、即時に可視的に検出可
能な標識によって標識されており、検査担体上の分析物
と結合するが、それによって直接測定可能なシグナルを
用いて結合部位を指示する。
本文で用いられる「即時に可視的に検出可能な」およ
び「直接検出可能な」の意味は、反応が行なわれた直後
に肉眼で結合を検出でき、他の反応段階、洗浄、または
装置を必要としないことである。したがって、標識は、
金コロイド溶液のような目で見て検出できる大きさの金
属粒子、または色のついたラテックス粒子であってよ
く、後者が特に望ましい。ラテックス粒子は0.1μｍか
ら0.4μｍの平均直径を有することが望ましく、約0.2μ
ｍの平均直径が特に望ましい。「即時に可視的に検出可
能な」および「直接検出可能な」は、酵素、蛍光分子、
可視化するために媒染する必要のある指示薬、または即
時に肉眼で検出可能ではない物質を包含しない。
び「直接検出可能な」の意味は、反応が行なわれた直後
に肉眼で結合を検出でき、他の反応段階、洗浄、または
装置を必要としないことである。したがって、標識は、
金コロイド溶液のような目で見て検出できる大きさの金
属粒子、または色のついたラテックス粒子であってよ
く、後者が特に望ましい。ラテックス粒子は0.1μｍか
ら0.4μｍの平均直径を有することが望ましく、約0.2μ
ｍの平均直径が特に望ましい。「即時に可視的に検出可
能な」および「直接検出可能な」は、酵素、蛍光分子、
可視化するために媒染する必要のある指示薬、または即
時に肉眼で検出可能ではない物質を包含しない。
特に望ましい実施態様において、検査系は、抗体のイ
ソタイプの決定に使用できるものである。また、この系
は、酵素のイソタイプや他のタンパク質のイソタイプの
ような抗体ではないタンパク質のイソタイプを区別する
ためにも使用可能である。こうした分子の例には、クレ
アチンキナーゼおよびアルカリホスファターゼ酵素群
（これらはいずれも様々なイソ型を有することが知られ
ている）、およびトロポニンＴのようなタンパク質のイ
ソ型を包含する。後者のタンパク質のイソ型を決定する
ことの重要性は、例えば、Katusら、Clin.Chem.38
（３）:386−393（1992）に認められる。
ソタイプの決定に使用できるものである。また、この系
は、酵素のイソタイプや他のタンパク質のイソタイプの
ような抗体ではないタンパク質のイソタイプを区別する
ためにも使用可能である。こうした分子の例には、クレ
アチンキナーゼおよびアルカリホスファターゼ酵素群
（これらはいずれも様々なイソ型を有することが知られ
ている）、およびトロポニンＴのようなタンパク質のイ
ソ型を包含する。後者のタンパク質のイソ型を決定する
ことの重要性は、例えば、Katusら、Clin.Chem.38
（３）:386−393（1992）に認められる。
本発明の多孔質検査担体は、試験紙製造に有用な当業
者に公知の材料のいずれからも作成することができる。
有用な材料の例としては、ニトロセルロース紙またはセ
ルロース誘導体、ナイロン膜などがある。吸収性のある
紙の孔径は、どこでも平均で直径で約１μｍから12μｍ
までであることが望ましく、特に５μｍが望ましい。孔
径の望ましい範囲は３μｍ−10μｍである。
者に公知の材料のいずれからも作成することができる。
有用な材料の例としては、ニトロセルロース紙またはセ
ルロース誘導体、ナイロン膜などがある。吸収性のある
紙の孔径は、どこでも平均で直径で約１μｍから12μｍ
までであることが望ましく、特に５μｍが望ましい。孔
径の望ましい範囲は３μｍ−10μｍである。
特に望ましい実施態様において、多孔質の二つの細片
を合わせて表裏をなすように結合させるが、この細片は
それぞれ適当な免疫反応物質を含む。これらの材質は二
つの面を持つ試験紙を作成するために当業者に公知のな
んらかの手段にて結合され、積層薄片が特に望ましい。
を合わせて表裏をなすように結合させるが、この細片は
それぞれ適当な免疫反応物質を含む。これらの材質は二
つの面を持つ試験紙を作成するために当業者に公知のな
んらかの手段にて結合され、積層薄片が特に望ましい。
検査担体は一端に導入手段を載せ、もう一端には排液
手段または「排液だめ」を有することが、必須ではない
が望ましい。前者は、捕捉レセプターを含む担体の部分
に液体を引き込む作用をする。後者は、装置を通過した
液体を排出させる作用をし、それによって装置の自然の
クロマトグラフィー的性質を促進する。
手段または「排液だめ」を有することが、必須ではない
が望ましい。前者は、捕捉レセプターを含む担体の部分
に液体を引き込む作用をする。後者は、装置を通過した
液体を排出させる作用をし、それによって装置の自然の
クロマトグラフィー的性質を促進する。
免疫反応物質を担体に取り込むための、なんらかの公
知の手段によって、捕捉レセプターを装置に浸透させ
る。特に望ましい実施態様において、検査担体の材質
は、捕捉レセプターが担体に約0.05μg/cm2から約0.1μ
g/cm2の濃度で浸透するように選択される。ここで用い
る「浸透」とは、検査担体の三次元構造の全体にわたっ
て結合パートナーを配置することを指す。Campbellらの
米国特許第4,703,017号のような先行技術の系では、標
識試薬は担体の上部および下部表面に濃縮されている
が、担体の実際の内部マトリクスには浸透していないた
め、上記の点は重要である。したがって、先行技術の装
置は、本発明の三次元担体よりむしろ二次元担体とし
て、より良く説明される。上記のような低濃度であって
も、本発明の検査担体は十分以上に機能する。
知の手段によって、捕捉レセプターを装置に浸透させ
る。特に望ましい実施態様において、検査担体の材質
は、捕捉レセプターが担体に約0.05μg/cm2から約0.1μ
g/cm2の濃度で浸透するように選択される。ここで用い
る「浸透」とは、検査担体の三次元構造の全体にわたっ
て結合パートナーを配置することを指す。Campbellらの
米国特許第4,703,017号のような先行技術の系では、標
識試薬は担体の上部および下部表面に濃縮されている
が、担体の実際の内部マトリクスには浸透していないた
め、上記の点は重要である。したがって、先行技術の装
置は、本発明の三次元担体よりむしろ二次元担体とし
て、より良く説明される。上記のような低濃度であって
も、本発明の検査担体は十分以上に機能する。
検査担体の第２の部分、標識レセプターは、当業者に
公知の即時に検出可能ななんらかの標識と結合した、上
記の様々な反応物質のいずれであってもよい。捕捉およ
び標識レセプターはいずれも、抗体、抗原、プロテイン
Ａ、（ストレプト）アビジンまたはそれらのなんらかの
反応性部分であってよい。抗体が望ましいが、最も望ま
しいのはポリクローン性抗体である。標識レセプターは
それぞれ異なっていてもよいが、単一の種類の標識レセ
プターのみを用いてもよい。
公知の即時に検出可能ななんらかの標識と結合した、上
記の様々な反応物質のいずれであってもよい。捕捉およ
び標識レセプターはいずれも、抗体、抗原、プロテイン
Ａ、（ストレプト）アビジンまたはそれらのなんらかの
反応性部分であってよい。抗体が望ましいが、最も望ま
しいのはポリクローン性抗体である。標識レセプターは
それぞれ異なっていてもよいが、単一の種類の標識レセ
プターのみを用いてもよい。
第２結合パートナーまたはレセプターは阻止剤と結合
している。上記のように、レセプター／結合パートナー
と検査担体との誤った結合を避けることが阻止剤の働き
である。こうした阻止剤はいつも第２のレセプターを添
加する前に添加されたので、本発明のこの特徴が先行技
術に対して顕著な対照をなす。使用される阻止剤は当業
者に公知のいかなるものであってもよく、例えばポリエ
チレングリコールまたはウシ血清アルブミンがあるが、
前者が特に望ましい。
している。上記のように、レセプター／結合パートナー
と検査担体との誤った結合を避けることが阻止剤の働き
である。こうした阻止剤はいつも第２のレセプターを添
加する前に添加されたので、本発明のこの特徴が先行技
術に対して顕著な対照をなす。使用される阻止剤は当業
者に公知のいかなるものであってもよく、例えばポリエ
チレングリコールまたはウシ血清アルブミンがあるが、
前者が特に望ましい。
本発明にしたがって実行されるアッセイは、先行技術
よりはるかに短い時間内に実施される。阻止段階の省略
がこの理由であり、５分に満たない短時間に正確な読み
を保証することができる。以下の限定的ではない実施例
にみられるように、本発明の検査系は、免疫診断アッセ
イを実施するのに比類なく適している。
よりはるかに短い時間内に実施される。阻止段階の省略
がこの理由であり、５分に満たない短時間に正確な読み
を保証することができる。以下の限定的ではない実施例
にみられるように、本発明の検査系は、免疫診断アッセ
イを実施するのに比類なく適している。
実施例１ 微多孔性ニトロセルロース膜（Schleicher ＆ Schul
l,AE−98）の細片を不活性な裏板に重ねることによっ
て、一連の多孔質検査担体を調製した。セルロース紙と
のポリエステル混紡から成る導入部分およびクロマトグ
ラフィーセルロース紙（31−ET;Whatman Specialty Pro
ducts）から成る貯水部分を細片に取り付けた。重鎖お
よび軽鎖特異性を有する特異的ヤギ抗マウス抗体（IgG
1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、カッパ′、ラム
ダ）の試料を、150mMNaClを含む50mM3−［Ｎ−モルフォ
リノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（“MOPS
O"）、pH7.2に平衡化する。次に、微多孔性担体上にこ
の試料を、総量約125−250ng、1.26ul/cmの割合で、線
状に分配する。四つの分析物特異的抗体および一つのコ
ントロール、合わせて五つの線を細片の各々の側に塗布
した。次に、細片を室温で15分間風乾した 特異的な重鎖または軽鎖に対する標識された第２の抗
体、および阻止剤を結合させることによって結合試薬を
調製した。第２抗体は、カルボキシル基を導入した平均
粒径220nmのブルーラテックスビーズに共有結合させ
た。阻止剤は１％ポリエチレングリコール20,000を含む
バッファー溶液であった。阻止剤および標識された第２
の抗体を結合し、凍結乾燥した。この実施例に関して
は、リン酸緩衝塩類溶液に希釈された公知の重鎖および
軽鎖からなるマウス単クローン性抗体である試料に、こ
の試薬を再溶解した。
l,AE−98）の細片を不活性な裏板に重ねることによっ
て、一連の多孔質検査担体を調製した。セルロース紙と
のポリエステル混紡から成る導入部分およびクロマトグ
ラフィーセルロース紙（31−ET;Whatman Specialty Pro
ducts）から成る貯水部分を細片に取り付けた。重鎖お
よび軽鎖特異性を有する特異的ヤギ抗マウス抗体（IgG
1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、カッパ′、ラム
ダ）の試料を、150mMNaClを含む50mM3−［Ｎ−モルフォ
リノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（“MOPS
O"）、pH7.2に平衡化する。次に、微多孔性担体上にこ
の試料を、総量約125−250ng、1.26ul/cmの割合で、線
状に分配する。四つの分析物特異的抗体および一つのコ
ントロール、合わせて五つの線を細片の各々の側に塗布
した。次に、細片を室温で15分間風乾した 特異的な重鎖または軽鎖に対する標識された第２の抗
体、および阻止剤を結合させることによって結合試薬を
調製した。第２抗体は、カルボキシル基を導入した平均
粒径220nmのブルーラテックスビーズに共有結合させ
た。阻止剤は１％ポリエチレングリコール20,000を含む
バッファー溶液であった。阻止剤および標識された第２
の抗体を結合し、凍結乾燥した。この実施例に関して
は、リン酸緩衝塩類溶液に希釈された公知の重鎖および
軽鎖からなるマウス単クローン性抗体である試料に、こ
の試薬を再溶解した。
150μｌの試料アリコートを、各々の場合において、
凍結乾燥結合試薬を含む10×75mm試験管に添加した。こ
の混合物を、クロマトグラフィー的に細片を上昇させる
と、５分経たないうちに、強い線が観察された。いずれ
の場合も、染色パターンは正しい重鎖または軽鎖が同定
されたことを示した。
凍結乾燥結合試薬を含む10×75mm試験管に添加した。こ
の混合物を、クロマトグラフィー的に細片を上昇させる
と、５分経たないうちに、強い線が観察された。いずれ
の場合も、染色パターンは正しい重鎖または軽鎖が同定
されたことを示した。
実施例２ 唯一の相違点として、腹水を1:10,000−1:50,000の範
囲でPBSで希釈した以外は、実施例１に記載されたのと
同様の方法で、マウス腹水試料をアッセイし、150μｌ
の混合物を試験管に添加した。最前のようにに、５分未
満で正確な結果が保証された。
囲でPBSで希釈した以外は、実施例１に記載されたのと
同様の方法で、マウス腹水試料をアッセイし、150μｌ
の混合物を試験管に添加した。最前のようにに、５分未
満で正確な結果が保証された。
実施例３ マウス培養上清を実施例１および２の試料と同様の方
法で検査した。1:50−1:100の範囲で上清をPBSで希釈
し、そのほかの全段階は上記の通りである。やはり、５
分未満で正確な結果が得られた。
法で検査した。1:50−1:100の範囲で上清をPBSで希釈
し、そのほかの全段階は上記の通りである。やはり、５
分未満で正確な結果が得られた。
実施例４ 精製マウス抗体を、PBSで0.01−1/μg/mlの範囲で希
釈し、上記のようにアッセイすることによって検査し
た。最前のように、５分未満ですべての結果が得られ、
正確であった。
釈し、上記のようにアッセイすることによって検査し
た。最前のように、５分未満ですべての結果が得られ、
正確であった。
実施例５ 検査担体の全体にわたる第１結合パートナーの分布を
調べた。これを行なうために、実施例１に記載の方法で
作成された担体を電子顕微鏡（electron microscopy）
にかけた。この研究は、担体が直径約１μｍから約10μ
ｍの範囲の孔を有することを明らかにした。
調べた。これを行なうために、実施例１に記載の方法で
作成された担体を電子顕微鏡（electron microscopy）
にかけた。この研究は、担体が直径約１μｍから約10μ
ｍの範囲の孔を有することを明らかにした。
ラテックス粒子が上部および下部表面だけでなく担体
全体にわたって分布することが観察された。したがっ
て、ラテックス粒子が三次元構造に浸透していると言う
ことができる。
全体にわたって分布することが観察された。したがっ
て、ラテックス粒子が三次元構造に浸透していると言う
ことができる。
担体におけるオープンスペースの総量を決定するため
に計算を行なった。これは約24％であることが明らかに
なった。さらに計算によれば、結合パートナーは三次元
構造の全体にわたって約0.05μg/cm2から0.10μg/cm2の
範囲で分布していたことが示される。
に計算を行なった。これは約24％であることが明らかに
なった。さらに計算によれば、結合パートナーは三次元
構造の全体にわたって約0.05μg/cm2から0.10μg/cm2の
範囲で分布していたことが示される。
本発明は、分析物または複数の分析物を測定するため
の独創的で有用な検査系を開示することがわかるだろ
う。広範な実施態様において、この検査系は二つの構成
成分を含んでなる。第１は検査担体であって、これは多
孔性である必要があり、さらにこの担体は目的の分析物
に結合する第１のパートナーをその中に浸透させて含
む。この第１結合パートナーは、一定のあらかじめ決め
られた配置で担体上に配置される。これは線、円、ドッ
トまたはいかなる形でもよいが、それによって検査が終
了したときに、当業者は即時に結果を検出することがで
きる。上記のように、様々なセルロースおよびニトロセ
ルロース紙および膜が検査担体として適しているが、こ
れらは上記の範囲の孔径を有する。
の独創的で有用な検査系を開示することがわかるだろ
う。広範な実施態様において、この検査系は二つの構成
成分を含んでなる。第１は検査担体であって、これは多
孔性である必要があり、さらにこの担体は目的の分析物
に結合する第１のパートナーをその中に浸透させて含
む。この第１結合パートナーは、一定のあらかじめ決め
られた配置で担体上に配置される。これは線、円、ドッ
トまたはいかなる形でもよいが、それによって検査が終
了したときに、当業者は即時に結果を検出することがで
きる。上記のように、様々なセルロースおよびニトロセ
ルロース紙および膜が検査担体として適しているが、こ
れらは上記の範囲の孔径を有する。
この検査系の第２の成分は、結合試薬である。この成
分は、即時に可視的に検出可能な標識と結合した第２結
合パートナーを、阻止剤とともに含む。この複合体は、
必須ではないが、凍結乾燥することができる。溶液、粉
末、錠剤などはすべて結合試薬の製剤として可能であ
る。
分は、即時に可視的に検出可能な標識と結合した第２結
合パートナーを、阻止剤とともに含む。この複合体は、
必須ではないが、凍結乾燥することができる。溶液、粉
末、錠剤などはすべて結合試薬の製剤として可能であ
る。
結合パートナーは目的の分析物に結合するいかなる物
質であってもよく、抗体および抗体フラグメントが特に
望ましい。
質であってもよく、抗体および抗体フラグメントが特に
望ましい。
本発明の検査系は、上記のように、特定の分析物を同
定するために使用することができ、また、抗体のタイピ
ングのように、分析物の属クラスの異なった型またはタ
イプを同定するために用いることもできる。検査系が単
一の分析物を測定するために用意される場合には、当
然、装置に浸透させた第１結合パートナーは一種類だけ
を必要とし、結合試薬中の第２結合パートナーも一種類
だけが必要である。分析物の様々なタイプや型を区別す
る場合には、この数が増える。例えば、一般的な抗体イ
ソタイプ測定試験紙には、IgA,IgD,IgE,IgM、およびIgG
のすべての型（IgG1,IgG2a、IgG2b、IgG3）に対するす
べての結合パートナー、ならびにカッパおよびラムダ軽
鎖の両者に対する結合パートナーも存在する。しかしな
がら、通常、こうした完全な測定は必要でなく、例えば
IgDおよびIgE特異的結合パートナーを便宜的に試験紙か
ら削除することができる。抗体イソタイプの区別のほか
に、クレアチンキナーゼのような酵素を包含する様々な
タンパク質のイソ型を本発明の検査系を用いてアッセイ
することができる。抗体イソタイプ試験紙作成について
説明された方法を常法により改変することによって、上
記を達成することができる。さらに労力を必要とせず、
当業者は容易に上述の明細書を応用して、必要とする検
査系を作成することができる。そうであるから、例えば
心臓の機能および異常の研究において、それに伴うタン
パク質を測定することで、本発明の検査系を利用するこ
とができる。こうしたタンパク質の例は、例えばトロポ
ニンＴのようなトロポニンのイソ型を包含する。
定するために使用することができ、また、抗体のタイピ
ングのように、分析物の属クラスの異なった型またはタ
イプを同定するために用いることもできる。検査系が単
一の分析物を測定するために用意される場合には、当
然、装置に浸透させた第１結合パートナーは一種類だけ
を必要とし、結合試薬中の第２結合パートナーも一種類
だけが必要である。分析物の様々なタイプや型を区別す
る場合には、この数が増える。例えば、一般的な抗体イ
ソタイプ測定試験紙には、IgA,IgD,IgE,IgM、およびIgG
のすべての型（IgG1,IgG2a、IgG2b、IgG3）に対するす
べての結合パートナー、ならびにカッパおよびラムダ軽
鎖の両者に対する結合パートナーも存在する。しかしな
がら、通常、こうした完全な測定は必要でなく、例えば
IgDおよびIgE特異的結合パートナーを便宜的に試験紙か
ら削除することができる。抗体イソタイプの区別のほか
に、クレアチンキナーゼのような酵素を包含する様々な
タンパク質のイソ型を本発明の検査系を用いてアッセイ
することができる。抗体イソタイプ試験紙作成について
説明された方法を常法により改変することによって、上
記を達成することができる。さらに労力を必要とせず、
当業者は容易に上述の明細書を応用して、必要とする検
査系を作成することができる。そうであるから、例えば
心臓の機能および異常の研究において、それに伴うタン
パク質を測定することで、本発明の検査系を利用するこ
とができる。こうしたタンパク質の例は、例えばトロポ
ニンＴのようなトロポニンのイソ型を包含する。
明細書および実施例は、本発明を説明するが限定する
ものではなく、本発明の趣旨および範囲に含まれる他の
実施態様が当業者に示唆されると理解される。
ものではなく、本発明の趣旨および範囲に含まれる他の
実施態様が当業者に示唆されると理解される。
フロントページの続き (72)発明者 ヒルガー，バーンド アメリカ合衆国 46250 インディアナ 州 インディアナポリス，ヘイグ ロー ド 9115番地 (72)発明者 ヘングスト，ジェームズ シー．ディ ー. アメリカ合衆国 46250 インディアナ 州 インディアナポリス，ヘイグ ロー ド 9115番地 (72)発明者 ウェブスター，デイヴィッド アメリカ合衆国 46250 インディアナ 州 インディアナポリス，ヘイグ ロー ド 9115番地 (72)発明者 バック，ハーヴェイ アメリカ合衆国 46250 インディアナ 州 インディアナポリス，ヘイグ ロー ド 9115番地 (56)参考文献 特開 平４−235349（ＪＰ，Ａ) 米国特許4727037（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543
Claims (44)
- 【請求項１】（ａ）分析物に特異的な第１結合パートナ
ーを一定の空間配置で浸透させ、三次元構造を有し、阻
害剤で処理していない多孔質ニトロセルロース検査担
体、ならびに； （ｂ）（ｉ）上記分析物と結合し、かつ即時に可視的に
検出可能な十分なサイズを有する粒子と結合した第２結
合パートナー、 および（ii）阻止剤の組み合わせを含む結合試薬とを含
む分析物の測定に有用な検査系。 - 【請求項２】多孔質ニトロセルロース検査担体が一つの
ニトロセルロース膜を含む、請求項１記載の検査系。 - 【請求項３】多孔質ニトロセルロース検査担体は、その
各々が特異的な分析物に特異的に結合する複数の異なる
第１結合パートナーをその中に取り込んでおり、結合試
薬は、その各々が異なる即時に可視的に検出可能な粒子
と結合し、分析物と特異的に結合する複数の異なる第２
結合パートナーを含む、請求項１記載の検査系。 - 【請求項４】即時に可視的に検出可能な粒子が着色粒子
である、請求項１記載の検査系。 - 【請求項５】着色粒子がラテックス粒子である、請求項
４記載の検査系。 - 【請求項６】第２結合パートナーが抗体である、請求項
１記載の検査系。 - 【請求項７】第１結合パートナーが抗体である、請求項
１記載の検査系。 - 【請求項８】即時に検出可能な粒子が金属粒子である、
請求項１記載の検査系。 - 【請求項９】金属粒子が金粒子である、請求項８記載の
検査系。 - 【請求項１０】結合試薬が溶液状態である、請求項１記
載の検査系。 - 【請求項１１】結合試薬が凍結乾燥品の状態である、請
求項１記載の検査系。 - 【請求項１２】第１結合パートナーが抗体、または分析
物特異的抗体フラグメントである、請求項１記載の検査
系。 - 【請求項１３】第２結合パートナーが抗体、または分析
物特異的抗体フラグメントである、請求項１記載の検査
系。 - 【請求項１４】多孔質ニトロセルロース検査担体が約１
μｍから約12μｍの平均直径を有する孔を含む、請求項
１記載の検査系。 - 【請求項１５】孔が約３μｍから約10μｍの平均直径を
有する、請求項14記載の検査系。 - 【請求項１６】孔が約５μｍの平均直径を有する、請求
項15記載の検査系。 - 【請求項１７】第１結合パートナーが、担体の三次元構
造の表面積当り、約0.05μg/cm2から約0.10μg/cm2の密
度で多孔質ニトロセルロース検査担体に浸透している、
請求項１記載の検査系。 - 【請求項１８】複数の異なる第１結合パートナーが少な
くとも二つの異なる抗体重鎖特異的結合パートナーを含
む、請求項３記載の検査系。 - 【請求項１９】少なくとも一つの軽鎖特異的結合パート
ナーをさらに含む、請求項18記載の検査系。 - 【請求項２０】複数の異なる第１結合パートナーが、Ig
A,IgD,IgE,IgGおよびIgM特異的結合パートナーを含む、
請求項18記載の検査系。 - 【請求項２１】複数の異なる第１結合パートナーが、さ
らにカッパ鎖およびラムダ鎖特異的結合パートナーを含
む、請求項20記載の検査系。 - 【請求項２２】多孔質ニトロセルロース検査担体が表側
と裏側を有し、各々の側に少なくとも一つの第１結合パ
ートナーを浸透させた、請求項３記載の検査系。 - 【請求項２３】複数の異なる第１結合パートナーの各々
が、異なるタンパク質イソ型に特異的に結合する、請求
項３記載の検査系。 - 【請求項２４】タンパク質イソ型が酵素イソ型である、
請求項23記載の検査系。 - 【請求項２５】タンパク質イソ型が心臓の異常に特徴的
なイソ型である、請求項23記載の検査系。 - 【請求項２６】酵素イソ型がクレアチンキナーゼイソ型
である、請求項24記載の検査系。 - 【請求項２７】第１結合パートナーがトロポニンのイソ
型と特異的に結合する、請求項１記載の検査系。 - 【請求項２８】トロポニンがトロポニンＴである、請求
項27記載の検査系。 - 【請求項２９】阻止剤がポリエチレングリコールであ
る、請求項１記載の検査系。 - 【請求項３０】（ａ）分析物を含む試料を、 （ｉ）当該分析物と結合し、 かつ即時に可視的に検出可能な粒子と結合した第２結合
パートナー、および （ii）阻止剤の組み合わせを含む結合試薬に結合させて
混合物を形成させること、 （ｂ）三次元構造を有し、当該分析物に特異的な第１結
合パートナーを一定の空間配置で浸透させた多孔質ニト
ロセルロース検査担体に上記混合物を接触させること
（ここで当該多孔質ニトロセルロース検査担体は、当該
接触前に阻害剤で処理していない）、および （ｃ）当該分析物の測定として、上記多孔質ニトロセル
ロース検査担体上の上記の即時に可視的に検出可能な粒
子を測定することを含む分析物を測定する方法。 - 【請求項３１】即時に可視的に検出可能な粒子が着色粒
子である、請求項30記載の方法。 - 【請求項３２】着色粒子がラテックス粒子である、請求
項31記載の方法。 - 【請求項３３】第１および第２結合パートナーのうち少
なくとも一つが抗体である、請求項30記載の方法。 - 【請求項３４】第２結合パートナーが凍結乾燥品の状態
である請求項30記載の方法。 - 【請求項３５】多孔質ニトロセルロース検査担体が約１
μｍから約12μｍの平均直径を有する孔を含む、請求項
30記載の方法。 - 【請求項３６】孔が約３μｍから約10μｍまでの平均直
径を有する、請求項35記載の方法。 - 【請求項３７】第１結合パートナーが、三次元構造の表
面積当り、約0.05μg/cm2から約0.10μg/cm2までの密度
で多孔質ニトロセルロース検査担体に浸透している、請
求項30記載の方法。 - 【請求項３８】着色粒子が約0.1μｍから約0.4μｍの直
径を有する、請求項31記載の方法。 - 【請求項３９】着色粒子が約0.2μｍの平均直径を有す
る、請求項38記載の方法。 - 【請求項４０】多孔質ニトロセルロース検査担体が、表
側と裏側を有し、各々の側に少なくとも一つの結合パー
トナーを浸透させた、請求項30記載の方法。 - 【請求項４１】分析物がタンパク質であって、そのタン
パク質が試料中に存在することが心臓の異常を示す、請
求項30記載の方法。 - 【請求項４２】タンパク質がトロポニンのイソ型であ
る、請求項41記載の方法。 - 【請求項４３】イソ型がトロポニンＴである、請求項42
記載の方法。 - 【請求項４４】試料および結合試薬を混合してから５分
またはそれより短い時間で分析物を測定することを含
む、請求項30記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US943,897 | 1992-09-11 | ||
| US07/943,897 | 1992-09-11 | ||
| US07/943,897 US5807752A (en) | 1992-09-11 | 1992-09-11 | Assay using an unblocked solid phase with immobilized analyte binding partner |
| PCT/US1993/008521 WO1994007136A1 (en) | 1992-09-11 | 1993-09-09 | Immunodiagnostic test system and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08501628A JPH08501628A (ja) | 1996-02-20 |
| JP3135067B2 true JP3135067B2 (ja) | 2001-02-13 |
Family
ID=25480444
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06508173A Expired - Fee Related JP3135067B2 (ja) | 1992-09-11 | 1993-09-09 | 免疫診断検査系およびその利用 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5807752A (ja) |
| EP (1) | EP0660929A4 (ja) |
| JP (1) | JP3135067B2 (ja) |
| WO (1) | WO1994007136A1 (ja) |
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