JPH01316660A - 物質の免疫学的検出方法及びこれに使用する組成物及びテストキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （説明） 本発明は、物質の免疫学的検出方法で、該物質を次に挙
げる機能、 １、検出すべき物質に関する特異性（特異的成分）、２
、直接もしくは間接的検出可能性（検出成分）、３、　
該特異的成分及び該検出成分の間に結合を起こさせるこ
と（架橋成分）。

のうち、１つもしくは２つの機能を有する成分を含む試
薬とインキュベーションし、かつ該成分が多重層形成に
関与できる場合の方法に関するものである。さらに、本
発明は、物質の免疫学的検出のための組成物及びテスト
キットに関するものである。

最近の数年間に、免疫検定法が基礎研究及び医学に増々
重要になってきている。それらは、例えば、血清、リカ
ー、唾液及び尿などの体液由来の組織サンプル中の物質
の検出及び／又は同定を可能にする。このことは、薬剤
及び治療薬の検出ばかりでなく、通常の代謝物質の定量
に関連づけることができる。増々重要になってきた、別
の応用分野は、臨床診断、例えばウィルス病原体の直接
的検出もしくは、これらの病原体に対して形成される抗
体の間接的検出に対する臨床診断の分野である。

使用しうる免疫学的検出システムは、通常、リガンド及
び該リガンドと特異的に反応する抗リガンドの間の相互
作用に基づいている。“リガンド−抗リガンド対には、
異なる分子間で可能な特異的相互作用が含まれる。はと
んどの場合、このリガンドには、抗原性を有する分子、
例えば細菌の細胞壁に由来する例えばタンパク質もしく
は（リボ）多糖などが対応する。これに対応する抗リガ
ンドには、例えば抗体があり、また、この関係において
、該抗体がモノクローナル抗体か、もしくはポリクロー
ナル抗体かは、重要なことではない。つづいて、結合し
た抗リガンドを、例えば標識した抗体との反応により定
量する。しかしながら、抗体は、リガンド及び抗リガン
ドの間の本質的相互作用に必ずしも関係づける必要はな
い。

基本的同定反応への抗体の直接的関与がない場合の、リ
ガンド−抗リガンド対の一例には、例えば糖タンパク質
等のグリコジル化分子及びこれと特異的に反応するレク
チンの間の相互作用がある。

通常、インビトロで誘導されるリガンド及び抗リガンド
間の相互作用は、物理的もしくは化学的に検出可能な反
応で観察される。この目的のため、例えば抗体を螢光物
質と結合し、ある種の分子を放射能で標識し、又は共有
結合もしくは免疫複合体の形で酵素をリガンドもしくは
抗リガンドと特異的に反応する分子と結合することがで
きる。シグナル生成の方法により、免疫検定法は例えば
、酵素免疫検定法（Ｅ　Ｉ　Ａ）もしくはラジオイムノ
アッセイ（ＲＩ　Ａ）等のグループに分類される。

免疫学的検出法の使用の実現性は、それらの感度及び実
行するのに必要とされる時間に決定的に依存する。検出
すべき分子と、この分子と特異的に反応する一次抗体と
の継続的反応、及びその調製物と一次抗体と結合する二
次抗体との引きつづく反応により生まれる増巾効果は、
すでに検出限界を改善する目的で長い間にわたって利用
されてきた。例えば免疫組織学的検定法のため、まず組
織サンプルを一次抗体を含む特別の血清、いわゆる−次
血清とインキュベートする。これらの−次抗体は、検出
を目的とする物質及び構造と特異的に反応するものであ
る。この特別な抗原に結合した一次抗体は、その後、該
−次抗体と特異的に結合する二次抗体によって認識され
る。はとんどの場合、この二次抗体には、例えば共有結
合的に螢光性分子に結合しているか、もしくは放射性ラ
ベルすることによる等の検出可能な標識がつけられてい
る。成功実験例において、これらの目印が最終的に抗原
も存在する部位にのみ発見されるという事実に基づき、
シグナルの出現は、検出すべき抗原の存在と直接関係づ
けられる。

比較しろる組織サンプルを用いる場合で、かつ、高い特
異性及び結合親和性を有する抗体婆−次抗体として用い
る条件では、検出感度は二次反応レベルに関してのみ改
善することができる。

過去において、このような改良は三種の方法で成し遂げ
られた。

１、抗体及び酵素分子間の共有結合に対する化学的結合
方法の改良。

２、ＡＢＣ（アビジン−ビオチン−複合体）法の導入。

スー（Ｈｓｕ）等により報告されたくジャーナル　オブ
　ヒストケミストリー　アンドサイトケミストリー　２
９巻、５７７頁、１９８１年）、この方法の場合、アビ
ジン−ビオチンリガンド−抗リガンド対から予め生成さ
れたマーカー複合体を、結合した一次抗体の検出に用い
た。しかし、アビジン−ビオチン複合体を予め生成した
複合体としてこの混合物に添加したときにのみ、シグナ
ル増巾が観測された。個々の成分の添加は、この反応混
合物中での効果的複合体形成を起こさなかった。

３、免疫学的に結合したマーカー酵素の使用。この方法
において、検出に用いる酵素は化学的に結合していない
が、免疫複合体の形でこの検出システムに含まれている
。

最後に述べた方法は、スターンバーガー（Ｓｔｅｒｎ−
ｂｅｒｇｅｒ）　とククリス（ｃｕｃｕｌｉｓ）　　（
ジャーナル　オブ　ヒストケミストリー　アンド　サイ
トケミストリー　１７巻、１９０頁、１９６９年）、及
びメイソン（！Ｊａｓｏｎ）等（ジャーナル　オブ　ヒ
ストケミストリー　アンド　サイトケミストリー１７巻
、５６３頁、１９６９年）によって始めて報告された。

これらの最初の実験においてはホースラデイツシュ・パ
ーオキシダーゼ酵素に対する抗体を含む血清が、このよ
うな免疫複合体を形成するのに用いられた。その後、こ
の免疫学的に結合した分子の酵素活性が丁度、二次抗体
への化学的結合の場合と同じように、シグナル生成に使
用された。

予め形成された免疫複合体の導入は、この方法を実質的
に改善した。例えば、パーオキシダーゼ／抗パーオキシ
ダーゼ（ＰＡＰ）複合体（スターンバーガー（Ｓｔｅｒ
ｎｂｅｒｇｅｒ）等、シマーナル　　オブヒストケミス
トリー　アンド　サイトケミストリー　　１８巻、３１
５頁、１９７０年）等の、このような免疫複合体は、パ
ーオキシダーゼと反応する抗体のみを含んでいる。この
ような免疫複合体は、ポリクローナル抗血清を用いるこ
とにより、もしくは、よりよい標準化を可能とするモノ
クローナル抗体を用いることにより生成することができ
る。モノクローナル抗体を用いた酵素／抗酵素複合体は
、多くの酵素、例えば、パーオキシダーゼ、アルカリホ
スファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼ（メイソン（！
Ｊａｓｏｎ）等、ジャーナル　オブヒストケミストリー
　アンド　サイトケミストリー　３０巻、１１１４頁、
１９８２年；コーゲル（ｃａｒｄａｌｌ）等、ジャーナ
ル　オブ　ヒストケミストリー　アンド　サイトケミス
トリー　３２巻、２１９頁、１９８４年；ダービン（Ｄ
ｕｒｂｉｎ）とポドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）　、ジャーナ
ル　オブ　イムノロジカル　メソーズ　９７巻、１９頁
、１９８７年）について報告されている。

テストする物質は、この場合、最初に特異的−次抗体と
インキュベーションする。数回の洗浄ステップの後、い
わゆる架橋抗体とのインキュベーションを行なう。この
ような架橋抗体は二価であリ、すなわちそれらは、２つ
の結合部位を有している。

架橋抗体が１つの結合手を介してのみ一次抗体に付着す
るような実験条件を選んだとき、それらは第二の結合手
を介して免疫複合体への架橋を形成することができる。

結合していない架橋抗体は、次の検出プロセスを妨害す
るので、免疫複合体を加える前に数回の洗浄ステップで
除去しなければならない。これらの洗浄ステップを行っ
たときＩこ限り、（酵素）免疫複合体を加え、まだ空の
第２の結合部位を介して架橋抗体に結合に結合させる（
免疫複合体及び−次抗体は、同種の生物に由来するもの
でなければならない。） 非結合免疫複合体を除去する数回の洗浄ステップの後、
結合したマーカーは、その酵素機能に基づき検出するこ
とができる。この結合によって生成するシグナルは抗原
量に比例する。

この検出感度は、架橋抗体及び酵素免疫複合体とのイン
キュベーションステップを数回繰り返す方法によりさら
に増加することができる。

最終的分析において、マウス−次抗体：ご結合したパー
オキシダーゼ量は、抗マウスイムノグロブリン（架橋抗
体）及び（モノクローナル）マウスＰＡＰＩ合体とのイ
ンキュベーションサイクルを数回繰り返すことにより広
い範囲にわたって変化させることができることを、ラン
スドープ（Ｌａｎｓｄｏｒｐ　、ジャーナル　オブ　ヒ
ストケミストリー　アンド　サイトケミストリー　３２
巻、１７２頁、１９８４年）等が発見した。しかしなが
ら多重層形成により達成された検出感度の改善のための
代償は仕事量と時間の著しく大きい消費となった。

そこで、本発明は特異的分子の免疫学的検出が高い感度
で、かつわずかな仕事量及び時間の消費で行なうことが
できる方法を提供するという課題を解決しなければなら
なかった。

始めに述べたタイプの方法の場合、この課題は、多重層
形成に関与する成分が同時に精密に相関する濃度でイン
キュベートされるという特性により解決される。

以下では、単一インキュベーション多重層免疫技術（Ｓ
　ｉｎｇｌｅユｎｃｕｂａｔｉｏｎ　Ｍｕｌｔｉｌａｙ
ｅｒユｍｍｕｎ。

Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を意味する“ＳＩＭＩＴ”という
略号を本発明の方法で使用する。

一方で本発明の方法は、いくつかの層を利用し、結果的
に生成するシグナルを大きく増巾する検出方法の利点を
拡張しており、かつ他方で、本発明の方法は、多重層形
成に関与する成分のワンステップインキュベーションに
より、かつて各々のインキュベーション後に行なわなけ
ればならなかった反復洗浄ステップに伴なう仕事量と時
間の消費を回避している。

従って、驚くべきことに、得られた結果に関する限り、
通常の欠点を享受することがなく、おそらく多重層免疫
複合体法に対応する非常に感度の高い検出システムを作
ることが可能である。すでに述べてきたように、従来こ
の分野で知られてきた方法に従かい免疫学的実験を行う
上での重要な点は、非特異的反応を回避するための反復
洗浄ステップを注意深く行うことである。この点を考慮
してもなお、新しく開発された技術が消費時間及びイン
キュベーションサイクル数の激烈な減少同様、洗浄ステ
ップ数の激烈な減少を可能にすることは驚くべきことで
ある。

同一の反応において同時に架橋成分及び検出成分を用い
ることができることが判明した。もしも多重層形成に関
与する成分の濃度が相関するなら、強い多重層が形成さ
れ、検出すべき物質ユニット当りの増巾が成し遂げられ
、結果的にこの検出システムの感度が改善される。この
異常な検出感度は、抗原に結合した一次抗体の部位にお
けるより大きな免疫複合体あ形成により説明することが
できる。本発明の方法は非常に感度がよく、利用が容易
で複雑な装置を必要とせず、また少ない消費時間で行う
ことができる。それゆえ、この方法は、これまで知られ
てきた方法よりも明らかに秀れている。

通常、免疫学的に検出すべき物質、すなわちリガンドは
、液相中に存在しかつ最初に固相キャリヤーに結合され
る抗原である。この結合は、化学的−物理的相互作用に
よる非特異的吸着、又は例えば抗体などの抗リガンドと
の特異的相互作用により行なわれる。例えば生検などそ
の他の場合、抗原は溶液中にはない。この検出は、サン
プル物質の上もしくは内部で直接行なわれる。

また、本発明の方法の場合、特異的反応成分は、それら
が架橋形成成分とともに形成する多重層形成に関与する
ことができる。測定すべき抗原を検出するこの方法は、
さらに１回のインキュベーションとそのインキュベーシ
ョン後に行なわなければならない洗浄ステップを省くこ
とができることになる。

架橋成分及び検出成分を成分とする多重層が本発明の方
法により形成される場合、該成分の１つが検出可能であ
るべきである。数層にわたる包含により、測定すべきシ
グナルが増巾される。上述の場合、多重層形成に関与す
る検出成分の成分には、検出可能マーカーを含むことが
望ましい。本発明に従う検出成分には、例えば、検出可
能な免疫複合体がある。しかし、、架橋成分がレクチン
特異的抗体を含む場合、付加的な、好ましくは検出可能
なレクチンが検出成分として利用されなければならない
。

しかし、架橋成分が同時に検出可能マーカーを有する様
な、本発明の方法を行なうことも可能である。その後、
多重層形成は２種類の様式で起こりうる。（ａ）検出す
べき分子と特異的に反応する成分は、それ自身多重層形
成に関与することができる；しかじ、もし検出すべ含分
子と特異的に反応する成分が例えば非常に価値のある貴
重な抗体であるなら、多重層形成に関与する架橋成分及
び検出成分から全く同様に多重層を形成でき、多重層形
成に関与する検出成分により満たされなければならない
唯一の必要条件は、検出すべき分子と特異的に反応する
成分と同じ種から抗体として得たものでなければならな
いということである。（ｂ）シかし、特異的成分自身が
検出可能で、かつ、もしそれも多重層形成に関与してい
るなら、その結果検出可能なシグナルを増巾することは
全く同様に可能である。

本発明に従い、この方法は、少なくとも１つのイムノグ
ロブリンが免疫学的検出に関与するよう行なわれる。こ
のイムノグロブリンは、種々の部位での反応成分として
、すなわち（ａ）検出すべき分子と特異的に反応する成
分として、すなわち例えば−次抗体として、（ｂ）多重
層形成に関与する架橋成分として、すなわち架橋抗体と
して、（ｃ）検出成分として、例えば、多重層形成に関
与している検出可能な免疫複合体の形で用いることがで
きる。

検出すべき分子がグリコジル化された分子であり、かつ
、このグリコジル化されている分子と特異的に反応する
成分がレクチンである場合でさえ、イムノブ西プリンは
、通常多重層形成に関与する架橋成分として使用される
。検出すべき分子と特異的に反応する成分が一次抗体で
あり、かつ架橋成分として含まれる架橋抗体が、−次抗
体を得た生物種の抗体と結果的：こ特異的反応を起こさ
なければならない全ての方法とは反対に、検出可能なレ
クチンは、架橋形成に関与する付加的成分として、上述
の場合に使用されることが好ましい。

全んどの場合、検出すべき物質と特異的に反応する成分
を含む試薬は、この反応成分として一次抗体を含んでい
る。この抗体はポリクローナル抗体ばかりでなくモノク
ローナル、抗体であることもあり、結果のよりよい再現
性のためにはモノクローナル抗体であることが好ましい
。

特別な目的のため、特異的成分として一次抗体を各々の
関係において特異的！こ反応するいくつかの他の分子と
置き換えることができる。典型的例は、グリコジル化さ
れた分子検出のためのレクチンもしくはレクチン誘導体
の使用である。レクチンは、例えば血清診断もしくは細
胞の顕微鏡分析の分野で使用される。

本発明の方法の場合、架橋抗体をレクチンに直接結合さ
せることもできるし、また最初にレクチン処理サンプル
をレクチン特異的−次抗体で処理することもできる。こ
のように、この−次抗体は、例えば、検出すべき分子と
直接結合する一次抗体と同じ機能を満たしている。しか
し最初にレクチンと反応し続いて一次抗体と反応するサ
ンプルの継続的反応も、シグナルを増巾する役割を果た
すことができる。

本発明の方法の好ましい態様に従かうと、多重層形成に
関与する架橋成分は架橋抗体であるということになる。

この架橋抗体は、検出すべき物質と特異的な反応する成
分として用いろれる一次抗体又は検出成分中に用いられ
ている抗体を得るのに用いた種とは異なる種から得たも
のでなければならない。−次抗体に比例して、通常、架
橋抗体は過剰：こ存在させ、る。

別の態様において、架橋試薬は、ＩｇＧ分子のＦｃ　８
分と特異的に結合する、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）由来のプロティンＡ及び／又はス
トレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）　由来
のプロティンＧを含んでいる。この場合、両タンパク質
は二価抗体と丁度同じ架橋機能を満たしている。

例えば架橋抗体；ごより結合を受けた検出成分の検出は
、多くの方法で行なうことができる。これに関する従来
の方法には放射能標識があり、この場合好ましい方法と
して検出目的に適した抗体もしくは他の分子のヨウ素化
がある。結合した放射能量は、オートラジオグラフィー
もしくはシンチレーション測定：こより測定することが
できる。しかし、多くの場合、放射能標識した物質を取
扱うことは望ましくない。通常の代替手段として螢光標
識が用いられる。この点において、よく用いられる方法
は、適当な抗体とフルオレセイン、イソチオシアネート
との反応がある。その他の方法には化学発光分子の結合
又は酵素活性をひきつづくいくつかの方法で測定するマ
ーカー酵素の結合がある。

このような場合で使用される、最も広く知られているマ
ーカー酵素には、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ、ミクロパーオキシダーゼ、及びホースラデ
イツシュ・パーオキシダーゼがある。好適な条件下、こ
れらの酵素は全て酵素反応により発色反応を引き起こす
ことができる。

酵素的に生成した発色の光学的測定量は、この場合各々
の酵素と結合した結合抗体量の尺度となる。

本発明の方法において、検出成分は、第１の免疫複合体
中に結合されている酵素が第２の免疫複合体中に結合し
ている酵素に対する基質を提供する、２つの免疫複合体
の混合物から成り立つことも可能である。“近接結合（
Ｐｒｏｘｉｍａｌ　Ｌｉｎｋａｇｅ）’″　（セピア（
Ｓｅｖｉｅｒ）等、クリニカル　ケミストリー２７巻、
１７９７頁、１９８１年）と呼ばれる、このシステムで
使用するのに適した酵素組合せの例：こは、例えばヘキ
ソキナーゼ／グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ、クルコースオキシダーゼ／パーオキシダーゼ、
ＮＡＤ−オキシド−リダクターゼ／ルシフェラーゼ、ホ
スホフラクトキナーゼ／ホスホエノールビルベート力ル
ポキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラー
ゼ／ホスホエノールビルベート力ルポキシラーゼ、パー
オキシダーゼ／ルミノールのような対がある。測定され
た産物は各々の第２の酵素活性の産物である。

上述のマーカー酵素が各々の抗体に共有結合しているこ
とは絶対的に必要なものではなく、それらは酵素／抗酵
素免疫複合体の形でも同様に存在しうる。この酵素／抗
酵素免疫複合体は、通常、問題としている免疫検定法に
おける各々のマーカー酵素の包含前に形成させる。

しかし、常に同一の特異性を、もつ抗体に関して同一マ
ーカー酵素がひんばんに使用される場合、この抗体への
マーカー酵素の化学的結合が望ましい。

種々の架橋抗体調製物は種々の割合で、特異的及び反応
性抗体を含んでいる。本発明の方法をうま〈実施するた
めに、多重層形成に関与する成分の至適関係が決定され
ねばならない。

それから、このように決定された検出成分に対しての多
重層形成に関与する架橋成分の関係を全ての実験につい
て維持し、また、本発明の方法の実行可能性は、上下２
倍の変化で妨害されることはなかった。好適に使用され
る架橋成分は、その濃度が検出成分濃度の１〜２０倍、
好ましくは５〜１０倍である架橋成分である。抗体を使
用する場合、架橋抗体及び検出成分の絶対的抗体濃度は
その他の事柄の中でもテストシステム（ＥＬＩＳＡ１免
疫蛍光、イムノヒスドロジー、その他）に依存して、多
重層形成に関与する検出成分に対し、例えば約０．１〜
２０μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０μｇ／ｍβの範囲
内で変化することができる。

本発明に従い、多重層形成に関与する成分、すなわち、
通常架橋抗体及び検出に適した抗体が相関実る濃度で提
供される組成物がさらに提供される。多重層形成に関与
している架橋成分、例えば架橋抗体の濃度は、多重層形
成に関与する検出成分濃度の１〜２０倍が好ましく、特
に好ましい場合には５〜１０倍である。

本発明の別の態様に従い、多重層形成に関与する架橋成
分ばかりでなく、検出すべき分子と特異的：こ反応しか
つ多重層形成：こ関与する成分が相関する濃度で提供さ
れる組成物が使用される。この場合も、多重層形成に関
与する架橋成分、例えば架橋抗体の濃度は、多重層形成
に関与する各々の付加成分濃度に対して好ましくは１〜
２０倍、特に好ましい場合には５〜１０倍である。

本発明に従い、上述の組成物の少なくとも１成分は検出
可能でなければなるない。すでに述べたように、この検
出可能成分は、意図する検定法のタイプによって、検出
成分、架橋成分もしくは特異的成分であることができる
。

本発明の組成物は種々の型で使用することができる。本
質的に輸送及び貯蔵に有利な一般的形状は、凍結乾燥状
態である。もっとも、この組成物は水性溶液中に存在す
ることも可能であるが、この場合には、長期の貯蔵には
凍結すべきである。

本発明の組成物の絶対的濃度は広い範囲で変化すること
ができる。直ぐ使用するときは、望ましい組成物を直接
使用に適した濃度にすることが有利である。しかしなが
ら通常この組成物は濃縮物を作り、使用前にそれを、水
または適当なバッファで希釈しなければならない。上述
の凍結乾燥した組成物の場合、決った量の水を加えると
、これは、各々の成分及び望ましいバッファの決った濃
度を調整する効果を同時に有している。

実験室又は医療機関で本発明を使用する人のための本発
明の使用は、テストキットの提供により可能となる。組
成物の形だけでなく、個々に提供することができる架橋
成分及び検出成分に加えて、これらのテキストキットは
、例えば、その他の必要とされる付加的物質も含んでい
る。例えば、抗体結合酵素複合体が検出成分として提供
される場合、この酵素の基質は適当な濃度に作ることが
できる。

別の態様の場合、場合によっては１個又は数個の抗体に
関係する特異的成物、例えば特異的反応−次抗体、レク
チン又はレクチン誘導体が同時に提供される。

多重層が特異的反応成分及び架橋成分から成り立つ状況
で免疫学的検出を行う場合、問題とする成分は個々に、
もしくは組成物の形でテストキット中に含められる。あ
る場合には、このテストキットには検出に必要な付加的
成分、例えばその酵素活性が検出可能な酵素の基質を含
めることができる。

テストキットの特別な態様の場合、マウス−ＰＡＰ−Ｗ
合体の他に、マウス由来のモノクローナル抗体、ヤギー
抗マウス−イムノグロブリン結合体が提供される。

以後に示す図式及び例は本発明を説明するものである。

例１ 検出成分濃度に対する架橋成分濃度の至適関係の決定 （ａ）コーティング ミクロ−ＥＬＩＳＡ−プレート　（ダイナチク、＃〜（
２４）を、精製マウスイムノグロブリンでコートした。

ＰＢＳ　（’Ｊン酸緩衝生理食塩水）で希釈した抗体溶
液（５０ｎｇ／ｍβ）１００μｌをピペットで各ウェル
に添加した。コーティングは４℃で一晩で行った。

（ｂ）飽　和 コーティング溶液を除いた後、空のタンパク質結合部位
を、０．０５％トウィーン２０ＲのＰＢＳ溶液（溶液Ａ
）による飽和でブロックした（室温、３０分間）。各ウ
ェルを溶液Ａで２度洗浄した。

（ｃ）架橋試薬の添加 ８種の架橋試薬を各々６段階に希釈して、繰り返し検定
した（第１表参照）。溶液Ａで希釈した架橋抗体１００
μｌを各ウェルに添加した。

（ｄ）　Ｐ　Ａ　Ｐ−複合体の添加 室温で１５分間のインキュベーションの後、プロジエン
（ＰＲＯＧＥＮ）−ＰＡＰ−複合体（溶液Ａ中１０μｇ
　／ｍｆ）１００μｆを各ウェルに添加した。

（ｅ）基質の添加 三回の洗浄ステップの後、結合したＰＡＰ−複合体量は
、１５０μβの基質（０，（１１％Ｈ２Ｏ２を含む０．
１Ｍクエン酸バッファ　（ｐＨ５，０）中、ｌ　ｍｇ、
’＋ｙ＋ｆ！ｏ−フエニ）Ｌｔ−ジアミン−〇ＰＤ溶液
）の添加により測定した。

（ｆ）評　価 ５分後、酵素反応を５０μ１０２．５　Ｎ　Ｈ２ＳＯ４
を添加することで停止させ、ついで、ＥＬＩＳ八プレへ
ト測定装置で４９６ｎｆｌｌの吸光度を測定した。

光学密度（ＯＤ）の反復測定から得られた平均値を第１
表にまとめた。

第１表 例１に関する測定値 架橋抗体の希釈度 第１表は、テストした架橋抗体調製物８個全てに対して
至適範囲が存在する、すなわち、５ｌＮＩＩＴ法におい
て反応性を有する抗体量に依存して、個々の調製物を至
適複合体形成が起こるように、別々の希釈を行なわなけ
ればならないことを示している。

また第１表は、例えば調製物、ジャクソン＃１１５−０
５０３を使用する場合、ＰＡＰ−複合体濃度が１０μｇ
／ＩＴＩＩ！の際は１：１５０の希釈が最適であること
を示している。

例２ 標準ＰＡＰ−各々Ｓ　Ｉ　Ｍ　Ｉ　Ｔ法の比較（ａ）コ
ーティング ２個のミクロ−ＥＬＩＳＡ−プレート　（ダイナチク、
＃Ｍ２４）を精製マウスＩｇＧでコーティングした。Ｐ
ＢＳで希釈した抗体とともに、このプレートを４℃で一
晩インキコベートした。

次に示すピペッティングスキームを使用した。

（ウェル当り１００μ！使用） 例２に関するピペッティングスキーム （ｂ）飽和 コーティング溶液を除去し、空のタンパク質結合部位を
、溶液Ａで飽和することによりでブロックした（室温、
３０分間）。溶液Ａを用いた２回の洗浄ステップ後、架
橋試薬を添加した。

（ｃ）　　架橋試薬への添加 Ａ＋Ｂ、Ｅ＋Ｆの列の各ウェルに、２００、ｌ−１ｇ　
７ｍ　ＡのＩｇＧ濃度に相当する１：１００に希釈シた
ベーリンガー・マンハイム社のヒツジ抗マウス−Ｆｃ　
（ｒ）−イムノグロブリン１００μβを使用しく例１の
血清と同一ではない）、また、Ｃ−！−Ｄ、Ｇ＋Ｈの列
の各ウェルに再度１：１００に希釈したダコ＃２２５９
社のヒツジ抗マウス−ＦＣ（Ｔ）−イムノグロブリン（
約３１ｐｇ／ｍｆり１００μｆを使用した。

（ｄｌ）標準法 室温下６０分のインキユベーションの後、架橋試薬を除
去した。つづいて、３回の洗浄ステップを行ない、つい
でモノクローナルマウス−ＰＡＰ−複合体１００μｌと
のインキュベーションを、室温で９０分間行った。この
場合、モノクローナル−マウスＰＡＰ−ＩＪｊ合体は三
種の濃度で使用した（カラム１２及び７．８は２．５μ
ｇ／ｍｆ！、カラム３．４及び９．１０は５μｇ／ｍｌ
、カラム５．６及び１１．１２は１０μｇ／ｍ１ｌ）。

（ｄ２＞ＳＩＭＩＴ法 各々１００μｌの架橋試薬を含むウェルに１５分後、１
００μβのマウス−ＰＡＰ−複合体（濃度ｄ１参照）を
加えた。

同時のインキュベーション条件：室温６０分間。

（ｅ）基質の添加 ３回の洗浄ステップの後、検出したＰＡＰ−複合体量は
１５０μｉの基質の添加により（０，（１１％Ｈ２Ｏ２
を含む０．１Ｍクエン酸バッフｙ（ｐＨ５，０）中、１
ｍｇ／ｍＡの０−フエニルジアミン−〇ＰＤ）測定した
。

（ｆ）評　価 ５°分後、この酵素反応を５０μｌの２．５ＮＨ，３口
、の添加により停止させ、ついでＥＬＩＳＡプレート測
定装置を用い、４９６０ｍの吸光度を測定した。

４つの代表的測定値の平均値を下記の表にまとめた。

第２表 例２に関する測定値 マウス−ＰＡＰ−複合体の濃度（μｇ／ｍ　１　）２．
５　　５　　１０　　２．６　５１０列　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　方式この表は、従来の方
法と比較して、ＳＩＭＩＴ法がより感度が高いことを明
白に示しているう例　　３ 抗原に結合したマウス−次抗体の検出 この例は、一方では、抗体のキャリヤ物質への直接的吸
着と、他方、それらの抗体により確認される抗原を介し
たそれらの“固定化”の平行したプロセスを含んでいる
。

（ａ）コーティング ミクロ−ＥＬＩＳ、Ａ−プレート　（ダイナチク、＃Ｍ
２４）の全てのウェルを、１００μｌのフィブリンモノ
マー溶液（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｆ！、ｐ）（７，４，３
Ｍ尿素含有）でコーティングした。

第２のプレートのウェルを種々の濃度のフィブリン特異
的モノクローナル抗体でコーティングした。この目的の
ため、後に示される各濃度のもの（ＰＢＳ希釈物）１０
０μβを調製し、ピペットで各列に移したくＡ列１μｇ
／ｒｎｌ、８列０．２５μｇ／ｍ＋ｊ！、Ｃ列６３ｎｇ
／ｍｉ’、Ｄ列１６ｎｇ／ｍｊ！、Ｅ列４ｎｇ／ｍｊ７
、Ｆ列１ｎｇ／ｍｊ２゜０列０．２５ｎｇ／ｍ１ＳＨ列
はＰＢＳのみ含有）Ｃ（ｂ）飽　和 例２参照 （ｃ）−次抗体とのインキュベーションフィブリンでコ
ーティングしたプレートを、溶液Ａで希釈したコーティ
ングプロセスで使用したものと同濃度のフィブリン特異
的モノクローナル抗体とインキュベートした（室温、６
０分間）、溶液、へによる３回の洗浄の後、両プレート
について、さらに同一の処理を行なった。

（ｄ）架橋試薬とのインキュベーション２つの異なる架
橋試薬調製物（ダコ＃Ｚ２５９及びジャクソン＃１１５
−０５０３）を、溶液Ａで１　：　１’ＯＯに希釈し、
ついで各々、１００μ！量を、半分のウェル中で１５分
間インキュベーションした。モノクローナルＰＡＰＩ合
体（ＩｇＧ濃度、５μｇ／ｍｆ）との同時インキュベー
ションをつづいて７５分間行った。以後の全てのステッ
プは、例２で述べた方法：ごより行った。

結果 例３の結果を第３表にまとめた。この応用例において、
ＳＴＭＩＴ法は、抗原に結合した特異的モノクローナル
抗体の検出に非常に適していることは明らかであり、ま
たこのことは、また抗原の検出にも非常に適しているこ
とを意味している。

第３表 架橋試薬　　　　１　　２　　　　１　　２ダコ　ジャ
クソン　　ダコ　ジャクソン１０００　　　　＞２　　
　　＞２　　　　＞２　　　　＞２２５０　　　　＞２
　　　　＞２　　　　＞２　　　　＞２６３　　　１、
６５６　　１．５２３　　　１．９１０　　　＞２１６
　　　０．４７３　　０．４６０　　　０．９５２　　
０．７８８４　　　０．０５ｇ　　　０．０４１　　　
０．３４８　　０．２８８１　　　　　　　　　　　　
　　０．０８３　　０．０４００．２５　　−−　　　
　−−　　　　　−−　　　　−−例４ 多重層形成に関与する試薬（１）の特異的反応成分及び
多重層形成に関与する架橋試薬（２）の成分に由来する
多重層形成下での免疫学的検出光に１回以上述べてきた
ように、ＳＩＭＩＴ技術は全ての考えうるマーカー及び
非常に多くのりガント−抗リガンドの組合せを用いて使
用することができる。これらの多種類の使用例の中の１
つをここで述べる。

クラミゾイア（ｃｈ　ｌａｍｙｄ　１ａｓ）は検出が困
難な病原体である。この病原体の培養による検出に加え
て使用されるこの方法は事実上全て免疫学的方法である
。

このような免疫学的検出は、例えば酵素イムノアッセイ
によって行うことができる。述べられている例において
、バクテリア抗原（５種の異なる調製物）を種々の濃度
でマイクロプレートのウェルに固定化した。その検出は
２つの方法で行なわれた。

（ａ）間接的ＥＩＡ タラミゾイアに特異的なモノクローナル抗体を、予め抗
原でコーティングし、６０分間飽和させたウェル中に過
剰に保持する。三回の洗浄ステップ後、パーオキシダー
ゼｔｔした抗マウス抗体（濃度は飽和レンジ）を添加し
、ついで二のマイクロプレートを室温で９０分間インキ
ュベーションした。３回の洗浄ステップの後、応用例２
ｅ及びｆで述べたタイプの定量を行った。

（ｂ）ＳＩＭＩＴ クラミゾイアに特異的なマウスのモノクローナル抗体（
０，４μｇ／ｍｆり及びパーオキシダーゼで！２した抗
マウスイムノグロブリン調製物（ジャクソン社のヤギ抗
マウスパーオキシダーゼ結合物、＃１１５−３５０３．
１：５０００希釈物）を１５分間混合し、その後、６０
分間飽和したウェル中に維持した。３回の洗浄ステップ
の後、応用例２ｅ及びｆで述べたタイプの定量を行った
。

結果 得られた結果を第４表にまとめた。　ＳｌλＩＩＴ°技
術の感度が少なくとも１０倍高いことは明白である。こ
のことは、ＳＩＭＩＴ法の場合、クラミゾイア検出のた
めにより少ない抗原量で十分であることを意味している
。

第４表 ４６９ｎｍにおける光学密度 コントロール　　１：１００　　　ＩＥ＝０．００３Ｓ
ＩＭ＝０．００８ ＊　　ＩＥ：　　間接ＥＩＡ ＳＩＭ：　ＳＩＭＩＴ法 例５ テストキットの組成物 本発明に従うサイトケラチン１３に対するテストキット
は、例えば１．試薬　マウス抗サイトケラチン１３モノ
クローナル抗体凍結乾燥物、２゜架橋成分　　モノクロ
ーナルヤギ抗マウスＩｇＧ凍結乾燥物、３．モノクロー
ナル　マウス−ＰＡＰ−１合体水溶液を含む。

この試薬を使用する前に、凍結乾燥試薬は各々１ｍｌの
二回蒸留水に懸濁した。本方法において、サイトケラチ
ン１３の免疫学的検出のために、上述の試薬を使用する
前に、それらを行なう実験に応じて適当な方法で希釈し
た。Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａもしくはイムノプロットで使用
する時、この試薬の、１：１０００希釈物でさえ、サイ
トケラチン１３の高感度な検出が可能である。この試薬
を、イムノエレクトロンマイクロスコピーモシクはイム
ノヒスドロジー゛で使用する場合は、この試薬を１＝２
０程度に希釈するのが好ましい。

【図面の簡単な説明】

図は、本発明の方法で生成する多重層構造を図で示した
ものである。該図において、参照番号１は一次抗体を示
し、２は架橋抗体を示し、３は検出可能抗体を示してい
る。抗体３の先端の黒い三角形は特異的標識を表わして
いる。 手続補正書（方式） 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 ■、事件の表示　　平成１年特許願第５４８４６号名　
称　　プロゲン　ビオテクニーク　ゲゼルシャフトミッ
ト　ベシュレンクテル　ハフラング４、代理人 ５Ｊ正命令の日付　　　平成１年５月３０日６Ｊｔ正の
対象　　　　　明Ｍ書の図面の簡単な説明の構図面 ７、補正の内容 （１）明細書の第４５頁の下から５行目の“図は、“を
「第１図は、」に訂正する。 （２）図面を別紙のとおり訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）次に挙げる機能、 （ａ）検出物質に対する特異性（特異的成分） （ｂ）直接又は間接的検出可能性（検出成分） （ｃ）該特異的成分及び該検出成分の間に結合を起こさ
   せること（架橋成分） のうちの１又は２の機能を有する成分を含む試薬と検出
   物質をインキュベートする場合で、かつ該成分が多重層
   形成に関与することができる場合の物質の免疫学的検出
   方法であって、この多重層形成に関与する成分が精密に
   相関する濃度で同時にインキュベートされることを特徴
   とする該方法。 （２）該多重層が該架橋成分及び該検出成分を含むこと
   を特徴とする、請求項（１）記載の方法。 （３）該多重層が該架橋成分及び該特異的成分を含むこ
   とを特徴とする、請求項（１）記載の方法。 （４）該架橋成分が同時に該検出成分の機能を満たすこ
   とを特徴とする、請求項（１）記載の方法。 （５）該特異的成分がモノクローナル抗体もしくはポリ
   クローナル一次抗体及び／又はレクチンもしくはレクチ
   ン誘導体であることを特徴とする、請求項（１）乃至（
   ４）のいずれか１項に記載の方法。 （６）該架橋成分が架橋抗体であることを特徴とする、
   請求項（１）乃至（５）のいずれか１項に記載の方（７
   ）該架橋成分がプロテインＡ及び／又はプロテインＧで
   あることを特徴とする、請求項（１）乃至（５）のいず
   れか１項に記載の方法。 （８）該検出成分が検出可能なイムノグロブリンである
   ことを特徴とする、上記請求項のいずれか１項に記載の
   方法。 （９）該検出成分が検出可能なレクチンであることを特
   徴とする、請求項（１）乃至（７）のいずれか１項に記
   載の方法。 （１０）該検出成分が、好ましくは螢光、放射活性、も
   しくは化学発光により直接検出されるように適合化され
   ていることを特徴とする、上記請求項のいずれか１項に
   記載の方法。 （１１）該検出成分が、好ましくは少なくとも１つのマ
   ーカー酵素の酵素活性により間接的に検出されるように
   適合化されていることを特徴とする、請求項（１）乃至
   （９）のいずれか１項に記載の方法。 （１２）該マーカー酵素がアルカリホスファターゼ、β
   −ガラクトシダーゼ、ミクロパーオキシダーゼ、もしく
   はホースラディッシュパーオキシダーゼであることを特
   徴とする、請求項（１１）記載の方法。 （１３）該マーカー酵素が酵素／抗酵素免疫複合体の形
   で存在することを特徴とする、請求項（１１）もしくは
   （１２）の記載の方法。 （１４）該検出物質がウィルスもしくはウィルスの一部
   、細菌もしくは細菌の一部、病原体に対して形成された
   抗体、もしくは体液中に含まれかつその存否がテストさ
   れるその他の分子であることを特徴とする、上記請求項
   のいずれか１項に記載の方法。 （１５）該架橋成分濃度が、該多重層形成に関与する成
   分、すなわち、該検出成分もしくは該特異的成分の濃度
   の１〜２０倍、好ましくは５〜１０倍であることを特徴
   とする、上記請求項のいずれか１項に記載の方法。 （１６）該検出成分が最終濃度１〜２０μｇ／ｍｌで使
   用される免疫複合体であることを特徴とする、請求項（
   １５）記載の方法。 （１７）検出物質がクラミディアであり、該特異的成分
   がクラミディアに特異的なモノクローナル抗体であり、
   ヤギ抗マウスパーオキシダーゼ結合体が同時に該架橋成
   分及び該検出成分である成分として使用され、かつヤギ
   抗マウスパーオキシダーゼ結合物濃度がクラミディアに
   特異的なモノクローナル抗体濃度のおよそ１０倍である
   ことを特徴とする、請求項（１４）記載の方法。 （１８）次に挙げる機能、 （ａ）検出物質に対する特異性（特異的成分）、 （ｂ）直接又は間接的検出可能性（検出成分）、 （ｃ）該特異的成分及び該検出成分の間に結合を起こさ
   せること（架橋成分）、 のうちの１又は２の機能を有する成分を含み、かつ、該
   成分が多重層形成に関与し該成分が精密に相関する濃度
   で存在することを特徴とする、物質を免疫学的に検出す
   るための組成物。 （１９）該架橋成分濃度が該検出成分濃度又は場合によ
   っては該特異的成分濃度の１〜２０倍、好ましくは５〜
   １０倍であることを特徴とする、請求項（１８）の記載
   の組成物。（２０）凍結乾燥形として提供されることを
   特徴とする、請求項（１８）又は（１９）に記載の組成
   物。 （２１）使用前に、水もしくは適当なバッファで希釈す
   ることを特徴とする、請求項（２０）記載の組成物。 （２２）次に挙げる機能、 （ａ）検出物質に関する特異性（特異的成分）、 （ｂ）直接もしくは間接的検出可能性（検出成分）、 （ｃ）該特異的成分及び該検出成分の間の結合を起こさ
   せること（架橋成分）、 のうちの１又は２の機能を有する少なくとも２つの成分
   を含み、該成分が多重層形成に関与することができ、該
   多重層形成に関与する該成分が精密に相関する濃度で存
   在し、該成分が個別に又は請求項（１８）乃至（２１）
   記載の組成物の形で含有され、かつ場合によってはさら
   に検出成分に対する基質を含むことを特徴とする、物質
   を免疫学的に検出するためのテストキット。 （２３）該特異的成分がモノクローナル抗体もしくはポ
   リクローナル一次抗体及び／又はレクチンもしくはレク
   チン誘導体であることを特徴とする、請求項（２３）記
   載のテストキット。 （２４）該架橋成分が請求項（６）又は（７）記載の架
   橋成分であることを特徴とする、請求項（２２）又は（
   ２３）に記載のテストキット。 （２５）該検出成分が請求項（８）乃至（１２）記載の
   検出成分であることを特徴とする、請求項（２２）乃至
   （２４）のいずれか１項に記載のテストキット。 （２６）マウスＰＡＰ複合体以外にマウス由来のモノク
   ローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、ヤギ抗マウ
   スイムノグロブリン結合体を含むことを特徴とする、請
   求項（２２）乃至（２５）のいずれか１項に記載のテス
   トキット。