JPH05223820A - 抽出組成物として界面活性剤混合物を使用する歯周病に随伴する微生物検出用キットおよびその検出方法 - Google Patents

抽出組成物として界面活性剤混合物を使用する歯周病に随伴する微生物検出用キットおよびその検出方法

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JPH05223820A
JPH05223820A JP4265912A JP26591292A JPH05223820A JP H05223820 A JPH05223820 A JP H05223820A JP 4265912 A JP4265912 A JP 4265912A JP 26591292 A JP26591292 A JP 26591292A JP H05223820 A JPH05223820 A JP H05223820A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 少なくともpH8に緩衝化されており、そして
カチオン界面活性剤とアニオン界面活性剤とを含む抽出
組成物を使用して、特に歯周病に随伴する微生物から抗
原を有利に抽出する方法。次に抽出された抗原は、各種
免疫方法により測定できる。 【効果】 迅速、かつ高感度を維持し、そしてアッセイ
のバックグランドを低く保ちながら、目的とするすべて
の抗原が抽出できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、歯周病に随伴する微生
物を抽出しそして測定するための界面活性剤混合物を使
用する診断試験キットおよびその方法に関する。特に、
この方法は、微生物アクチノバシラス・アクチノマイセ
テムコミタンス(Actinobacillus ac
tinomycetemcomitans)、プレボテ
ーラ・インターメディア(Prevotella in
termedia)〔正式には、バクテロイデス・イン
ターメディウム(Bacteroides inter
medius)として知られている〕またはポルフィロ
モナス・ギンギバリス(Porphyromonas
gingivalis)〔正式には、バクテロイデス・
ギンギバリス(Bacteroides gingiv
alis)として知られている〕のいずれかに由来する
抗原の抽出および測定に有用である。
【0002】
【従来の技術】医療上、生物学的流体中に低濃度で存在
する生物学的物質の迅速、正確な定性的または定量的測
定のための研究および診断手段の必要性は依然として存
在する。
【0003】一般的に、生物学的な被検体における目的
とする微生物からの抗原の抽出は、正確、迅速かつ高感
度なアッセイを提供する上で重要である。超音波、加熱
または遠心による細胞の物理的破砕を始めとする多種多
様な方法が抽出に使用されてきた。また、化学的抽出組
成物も開発されてきた。例えば、ドデシル硫酸ナトリウ
ムなどの各種界面活性剤が抽出組成物で個別に使用され
てきた。
【0004】特定の微生物が、ヒトおよび動物の多様な
歯周病、例えば歯肉炎や歯根膜炎などの指標として関係
づけられてきた。これらの疾病の重要性は、ますます高
まってきている。
【0005】歯周病に随伴する微生物の検出分野の進展
はヨーロッパ特許出願公開第439210号明細書に記
載されている。これは、微孔質濾過膜の特定領域で水不
溶性試薬を使用する免疫アッセイにより微生物、具体的
には、アクチノバシラス・アクチノマイセテムコミタン
ス、ポルフィロモナス・ギンギバリスおよびプレボテー
ラ・インターメディアの同時識別および検出を記載す
る。これらの微生物からの抗原は、ドデシル硫酸ナトリ
ウムの10重量%溶液を使用して抽出されていた。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】記載された同時アッセ
イは上記微生物の検出技術分野における重要な進歩を示
すものであるが、ある場合、特に臨床被検体を試験する
ときには許容できないバックグランドが観察された。ま
た、既知の界面活性剤抽出組成物は、目的微生物すべて
の血清型から抗原を抽出するのに適当でないこともわか
った。このアッセイの使用者にとって、著しいバックグ
ランドを伴うことなく疾病の有効な診断および治療を行
う上で、各微生物の識別は非常に重要であるため、この
課題の解決は重要である。また、関連微生物の血清型す
べての抽出に使用できる汎用性抽出組成物を入手するこ
とも有用であろう。
【0007】
【課題を解決するための手段】上記課題は、(a.)少
なくとも0.05重量%の水溶性カチオン界面活性剤
と、(b)少なくとも0.05重量%のアニオン界面活
性剤とを含む少なくともpH8に緩衝化された抽出組成物
を含んでなる診断試験キットを使用することで解決され
た。
【0008】本発明はまた、微生物またはウイルスから
抗原を抽出するのに有効な時間および温度条件下で、上
記組成物を被検体と接触する工程を含んでなる抗原の抽
出方法も提供する。
【0009】さらにまた、(A)微生物またはウイルス
から抗原を抽出するのに有効な時間および温度条件下
で、上記抽出組成物を被検体と接触する工程、(B)抽
出された抗原とその抗原に特異的な抗体との検出可能な
免疫複合体を形成する工程、ならびに(C)前記免疫複
合体を検出する工程を、含んでなる微生物またはウイル
スの測定方法も提供する。
【0010】
【具体的な態様】本発明は、目的のリガンドを微生物
(または他の生物体もしくはその成分)またはウイルス
粒子から抽出し、その対応する受容体と複合体を形成
し、次いでその複合体を適当な手段で検出するようなす
べての特異的バインディングアッセイで使用できる診断
試験キットを提供する。こうして検出されるリガンドと
しては、抗原性タンパク質および糖類、毒物類、レクチ
ン類、酵素類、多糖類、糖脂質類、抗体類、核酸類、ア
ミノ酸類、ペプチド類、ポリペプチド類、糖タンパク質
類およびそれらのいずれかの成分が挙げられる。
【0011】目的のリガンドを検出する方法は、限定す
るものではないが、全血、血漿、血清、リンパ液、胆
汁、尿、髄液、精液、膣分泌液、喀痰、汗、便検体、組
織流体調製物、歯周組織、歯垢、歯肉溝液および唾液を
含む、目的のヒトまたは動物の生物学的流体または被検
体のアッセイに使用することができる。
【0012】本明細書で開示される抽出組成物は、特
に、同一の試験デバイスで数種のリガンドが同時に検出
される場合に低いバックグランドを維持する水性緩衝溶
液である。これは歯周病に随伴する微生物の同時検出に
関する後述の具体例で示される。
【0013】本発明の抽出組成物は、比較的高いpH、す
なわち8以上に緩衝化される。組成物のpHは、8〜11
が好ましい。適量の1種以上の適当な緩衝剤を使用して
適当なpHを提供できる。使用する緩衝剤にとって必要な
pHに高めるのに水酸化物のような塩基を加えてもよい。
【0014】抽出組成物の必須成分の1つは、水溶性カ
チオン界面活性剤である。一般に、有用なカチオン界面
活性剤は、第4級アンモニウム塩、第4級ホスホニウム
塩、第4級ピリジニウム塩、第4級イミダゾリウム塩お
よびそれらのいずれかの混合物のような1以上のカチオ
ン基を有する。
【0015】有用なカチオン界面活性剤としては、分子
量3000未満の非ポリマー性の脂肪族、複素環式また
は炭素環式化合物が挙げられる。好ましくは、これらの
化合物は、脂肪族、複素環式または炭素環式第4級アン
モニウム化合物である。例えば、ヨーロッパ特許出願公
開第85448号明細書を参照されたい。
【0016】本明細書で使用する「脂肪族」化合物と
は、正電荷を付与するヘテロ原子(例えば、リンまたは
窒素)に結合する脂肪族(開環鎖)基を含む有機カチオ
ン性化合物をいう。これらの基は、炭素原子1〜30個
を含み、各化合物が少なくとも1個の炭素原子を有する
ことを前提として、鎖に沿って酸素原子または硫黄原子
で中断されていてもよい。いずれかの脂肪族鎖の1以上
の水素原子がフッ素原子で置換されて、フッ素化された
基が提供されていてもよい。また、これらの基は、1以
上の他のハロゲン原子、アリール、アルコキシ、アミ
ノ、シクロアルキルまたは他の基で置換されていてもよ
い。
【0017】本明細書で使用される「複素環式」化合物
とは、カチオン性電荷を提供する原子に結合した複素環
式部分少なくとも1つを有する有機カチオン化合物をい
う。カチオン性電荷は場合によって複素環式基中にある
か、あるいはその分子の他の部分にあってもよい。それ
は、芳香族または非芳香族であることができ、そして炭
素原子と同時に窒素、硫黄、酸素またはセレン原子を含
むことができる。一般的に、複素環式部分は、単環式も
しくは多環式環(もしくは核)に水素原子以外の原子5
〜15個を有し、そして1以上の他の有機基で置換され
ていてもよい。
【0018】「炭素環式」化合物の語は、カチオン性電
荷を提供する原子に結合した1以上の炭素環式部分を有
する有機化合物をいう。このような部分としては、炭素
原子5〜20個の一般的なシクルアルキル、炭素原子5
〜20個の一般的なシクロアルキレン、および単環式も
しくは多環式環もしくは核に炭素原子6〜14個を有す
る一般的なアリールが挙げられる。それらは、1個以上
の他の有機基で置換されているかまたは置換されていな
くてもよい。
【0019】本発明で使用できる代表的なカチオン界面
活性剤としては、ポリプロポキシ第4級アンモニウム塩
化物、アセテートおよびホスフェート、脂肪酸アミノア
ルキルジメチルアミン、エトキシル化脂肪族アミン、長
鎖アルキルジエタノールメチル第4級アンモニウム塩化
物、イミダゾリンの脂肪酸誘導体ならびに長鎖アルキル
ヒドロキシエチルイミダゾリン類が挙げられる。最も有
用な界面活性剤は、ポリプロポキシ−t−アミンの第4
級アンモニウム塩またはそれらの混合物(例えば、EM
COL(商標)CC−9,CC−36,CC−55およ
びCC−57などの市販されているもの)である。
【0020】他の有用なカチオン界面活性剤としては、
ノニルトリメチルアンモニウムブロマイド、ドデシルト
リメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメ
チルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルピリジニウ
ムブロマイド、ベンジルトリエチルアンモニウムクロラ
イド、ジドデシルジメチルアンモニウムブロマイド、ベ
ンジルジメチルフェニルアンモニウムクロライド、テト
ラヘキシルアンモニウムクロライド、ステアリルジメチ
ルベンジルアンモニウムクロライドおよびポリプロポキ
シ第4級アンモニウムクロライドが挙げられる。
【0021】本発明の組成物で使用されるカチオン界面
活性剤の量は、総組成物重量当り少なくとも0.05重
量%である。この量は、1〜10重量%が好ましい。
【0022】本発明の抽出組成物の第二の必須成分は、
アニオン界面活性剤である。本発明のもっとも広義に
は、アニオン界面活性剤は全体として負電荷を帯びてお
り、アニオン界面活性剤に属する特性を示すいずれかの
水溶性または水分散性化合物であることができる。
【0023】有用な部類のアニオン界面活性剤として
は、カルボン酸塩およびスルホン酸塩(例えば、アルキ
ルベンゼンカルボキシレート、アルキルベンゼンスルホ
ネート、アルキルスルホネート、スルホスクシネートエ
ステル塩、ナフタレンとアルキルナフタレンスルホネー
トとのホルマリン縮合体)、硫酸エステル塩(例えば、
アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシアルキレンアルキ
ルエーテル硫酸エステル塩またはポリオキシアルキレン
アルキルアリールエーテル硫酸エステル塩)およびリン
酸エステル塩(例えば、アルキルホスフェートエステル
塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルホスフェー
トエステル塩またはポリオキシアルキレンアルキルアリ
ールエーテルホスフェートエステル塩)が考慮されてい
る。
【0024】好ましい態様では、アニオン界面活性剤
は、炭素原子6〜14個(直鎖または分岐鎖の、例えば
ヘキシル、オクチル、デシル、2−メチルヘキシル、ド
デシルおよびテトラデシル)のアルキル硫酸アニオンと
アルカリ金属カチオンもしくはアンモニウムカチオンと
を含んでなる。
【0025】好ましくは、硫酸アニオンは炭素原子8〜
12個を有し、デシル硫酸アニオンおよびドデシル硫酸
アニオンがもっとも好ましいものである。代表的なアル
カリ金属カチオンとしては、リチウム、ナトリウム、カ
リウムおよびルビジウムカチオンが挙げられる。有用な
界面活性剤としては、デシル硫酸アンモニウム、ドデシ
ル硫酸ナトリウム、デシル硫酸カリウム、ヘキシル硫酸
リチウムおよびテトラデシル硫酸ナトリウムが挙げられ
る。これらの化合物の対応する酸も有用である。ドデシ
ル硫酸ナトリウムがもっとも好ましい化合物である。所
望であれば、アニオン界面活性剤の混合物も使用でき
る。
【0026】アニオン界面活性剤は、抽出組成物中、一
般に少なくとも0.05重量%(組成物重量基準)の量
で存在する。この量は、1〜10重量%が好ましい。
【0027】診断試験キットは、個々の包装または容器
に抽出組成物と他の各キット成分を1個以上含めること
ができる。もっとも好ましい態様では、リガンド受容体
として、歯周病に随伴する微生物から抽出される抗原に
特異的な抗体、例えばアクチノバシラス・アクチノミセ
テムコミタンス(Actinobacillus ac
tinomycetemcomitans)、プレボテ
ーラ・インターメディア(Prevotella in
termedia)およびポルフィロモナス・ギンギバ
リス(Porphyromonas gingival
is)のいずれかに対する抗体を含める。
【0028】また、目的のリガンドに特異的にバインデ
ィングする受容体は、検出可能に標識されている(例え
ば、酵素または他の標識手段により)か、または適当な
支持体に固定化されていることが好ましい。一般的に
は、抽出は15℃以上の水が沸点までの温度(大気圧
下)で実施できる。抽出時間は、数秒〜数分の広範囲に
変動できる。
【0029】抽出された抗原は、その存在または量を検
出する多様な分析手段で検出できる。このような手段と
しては、放射状免疫拡散法、免疫電気泳動法および血清
学試験が挙げられる。好ましくは、抽出された抗原は免
疫アッセイにより検出される。免疫アッセイでは抽出さ
れた抗原が特異的に1種以上の抗体と免疫反応する。こ
うして得られた免疫複合体が濁度測定、反射率測定、放
射性測定、比色測定、蛍光測定または化学発光測定法を
始めとする適当な方法により検出される。
【0030】特に、本発明では、微生物アクチノバシラ
ス・アクチノミセテムコミタンス、ポルフィロモナス・
ギンギバリスおよびプレボテーラ・インターメディア
が、個別にまたは集合的に、これらの微生物の血清型の
1種またはすべてから抗原を抽出し、そしてその後各々
を検出することによって測定される。
【0031】本発明の実施に有用な抗体は、モノクロー
ナルまたはポリクローナルであることができる。ポリク
ローナル抗体も標準的な操作により生産できる。抗原の
抽出およびその抗原に特異的な抗体の供給後、本発明の
方法はその抗原と抗体の検出可能な免疫複合体を形成す
ることによって実施される。この複合体形成は、各種方
法によって達成でき、そして「サンドイッチ」アッセイ
がもっとも好ましいが本発明は特定の方法に限定されな
い。
【0032】一の態様では、抽出された抗原が固体支持
体、例えばポリマーもしくはガラス粒子、濾過膜、セル
ロース性濾紙、固体ポリマーもしくは樹脂被覆フィル
ム、試験管のガラススライドもしくはガラス壁、ガラス
もしくはポリマーキュベットおよび当業者により容易に
選択されうる他の支持体に直接吸着または共有結合によ
り不溶化される。
【0033】本発明の好ましい態様は、抽出された抗原
が2つの抗体〔1つは検出可能に標識されており、もう
1つは固定化(またはアビジンとビオチンの反応もしく
は他の特異的なバインディング反応を介して固定化する
もの)されている〕と異なるエピトープ部位で反応され
るイムノメトリックアッセイまたはサンドイッチアッセ
イである。好ましくは、生体、天然ポリマーまたは合成
ポリマー、ガラス、セラミックス、珪藻土または磁性体
から形成された粒状キャリヤ材料が使用される。
【0034】これらの抗体は、物理的または化学的手段
(例えば、吸着または粒状キャリヤー材料の表面反応性
基を使用する共有結合形成反応)を介して前記材料へ結
合して水不溶性免疫試薬を形成することができる。共有
結合がアッセイ最高感度にとって好ましい。当業者は、
反応性基、カルボキシ、2−置換エチルスルホニル、ビ
ニルスルホニル、エポキシ、アルデヒド、活性ハロゲン
原子、アミノ、ヒドラジトおよびスクシンイミドキシカ
ルボニルのような活性エステルのいずれかを担持する前
記のような材料をどのようにして調製するかを容易に理
解するであろう。
【0035】特に有用な粒状キャリヤー材料は、例えば
ヨーロッパ特許出願公開第323692号明細書に記載
されるような、活性ハロゲン原子、活性2−置換エチル
スルホニル基またはビニルスルホニル基を担持する1種
以上のエチレン系不飽和重合性モノマーから調製される
ポリマービーズである。他の特に有用な粒状材料は、反
応性カルボキシ基を担持するものであって、ヨーロッパ
特許出願公開第466220号明細書に記載されてい
る。
【0036】より好ましくは、上記免疫試薬は化学的ま
たは生物学的な反応に不活性な微孔質濾過膜上に塗布ま
たは堆積される。限定されるものではないが、有用な膜
材料としては、多孔質の天然ポリマーまたは合成ポリマ
ー、焼結ガラス、ガラスまたはポリマーフィルムまたは
織布の膜、セラミックス材料、セルロース材料および付
着性またはバインディング材料で結合されたビーズ構造
物が挙げられる。特に有用な材料は、商標LOPROD
YNEおよびBIODYNEの下でPallCorpか
ら市販されているもののような処理済みまたは未処理ポ
リアミド微孔質膜である。
【0037】適当な抗体を有する水不溶性免疫試薬は、
膜の全面または特定の領域に固定できる。次に、水不溶
性免疫複合体は、検出手段に応じて各種標準試薬と方法
を使用して検出できる。例えば、複合体は当該技術分野
で既知のトレーサーやシグナル発生標識を使用すること
なく、光散乱法を使用して検出してもよい。凝集体は簡
単に検出できる。
【0038】しかしながら、アッセイフォーマットが直
接バインディングアッセイであろうと、イムノメトリッ
クアッセイであろうと、免疫複合体をリガンドに対する
水溶性受容体(例えば、抗体)の検出可能な標識を介し
て検出することが好ましい。このような標識としては、
限定されるものではないが、酵素、アビジン、ビオチ
ン、放射性同位体、蛍光体および発色体が挙げられる。
酵素が好ましく、酵素を使用して肉眼で評価できるか、
または標準的な分光光度計により電磁線濃度、スペクト
ルまたは強度を測定できる比色シグナル、蛍光シグナル
または化学発光シグナルを発生できる。別法として、酵
素標識を1種以上の反応に使用して化学発光シグナルを
発生できる。
【0039】
【実施例】以下の具体例は本発明の実施を具体的に説明
するものであり、本発明がそれらのいずれかの態様に限
定されることを意味しない。特記しない限り、すべての
パーセンテージは重量基準である。
【0040】例の材料および方法 3つの試験ウェル中に組み込まれたLOPRODYNE
(商標)微孔質濾過膜(平均細孔サイズ5μm)を含む
SURECELL(商標)使い捨て試験デバイスを使用
した。この膜は、非イオン界面活性剤FC135(商
標:3M Corporation)で被覆した後に使
用した。
【0041】洗液は、リン酸緩衝溶液(pH7.2)中デ
シル硫酸ナトリウム(1.8%)からなる。色素生成性
組成物は、4,5−ビス(4−メトキシフェニル)−2
−(3,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシフェニル)イ
ミダゾールロイコ染料(0.008%)、ポリ(ビニル
ピロリドン)(1%)、リン酸緩衝液(10ミリモル、
pH6.8)、過酸化水素(10ミリモル)、4′−ヒド
ロキシアセタニリド(2ミリモル)およびジエチレント
リアミン五酢酸(10マイクロモル)を含めて調製し
た。
【0042】色素の停止液は、リン酸緩衝溶液中アジ化
ナトリウム(0.1%)からなる。
【0043】3種の微生物アクチノバシラス・アクチノ
ミセテムコミタンス〔Actinobacillus
actinomycetemcomitansA.
a.)〕、プレボテーラ・インターメディア〔Prev
otella intermediaP.i.)〕お
よびポルフィロモナス・ギンギバリス〔Porphyr
omonas gingivalisP.g.)〕の
それぞれに向けられたポリクローナル抗体は、ウサギへ
の静注によって産生させた。IgG画分を硫酸アンモニ
ウム沈殿により調製し、リン酸緩衝溶液(0.3〜0.
4%溶液)として4℃で貯蔵した。単離体は嫌気性プレ
ート上で継代培養した。これらの微生物は、A.a.
(血清型A,BおよびC)について、それぞれATCC
43717,ATCC43718およびATCC437
19、P.i.(血清型A,BおよびC)について、そ
れぞれATCC25611,NCTC9336およびA
TCC49046、ならびにP.g.(血清型A,Bお
よびC)について、それぞれATCC33277,AT
CC53978およびATCC53977の寄託番号で
寄託されている。ATCCは、American Ty
pe CultureCollection(Rock
ville,Maryland)であり、NCTCはN
ational Collection of Typ
e Cultures(London,U.K.)であ
る。
【0044】水不溶性試薬は、ヨーロッパ特許出願公開
第323692号(上述)明細書の操作により調製した
ポリ〔スチレン−コ−4−(2−クロロエチルスルホニ
ルメチル)スチレン〕(モル比95.5:4.5)のポ
リマー粒子(平均直径1μm)に微生物(血清型A,B
およびCのすべて)のそれぞれに対して特異的な抗体を
共有結合することにより調製した。共有結合は、目的の
微生物(各血清型A,BおよびC 0.25mg/mLを有
する最終溶液0.75mg/mL)に対して特異的な抗体を
試験管中のホウ酸緩衝液(0.05モル濃度、pH8.
5)に加え、十分に混合することにより行った。上記ポ
リマー粒子(固形分3%)を、上記緩衝混合物に加え、
得られた懸濁液を室温で4〜24時間回転させ、粒子に
抗体を共有結合させた。次に、懸濁液を10分間280
0rpm で遠心した。上澄を廃棄し、ペレットをマーシオ
レート(merthiolate)(0.01%)含有
グリシン緩衝液(0.1%,pH8.5)に懸濁した。
【0045】上記試薬の塗布懸濁液(固形分0.95
%)は、グリシン緩衝液(0.1モル濃度、pH8.5)
中にポリアクリルアミドバインダー(5%)を有するよ
うに調製した。個別の抗原に向けた各試薬を、上記試験
デバイスにおける膜の特定領域に塗布した。
【0046】酵素−抗体結合物は、Yoshitake
ら、Eur.J.Biochem.,101,395,
1979の操作により西洋ワサビペルオキシダーゼに各
微生物に対する抗体を結合することで調製した。これら
の結合物を含む各結合組成物(1mL当り各抗体7.5〜
15μg)を、緩衝液(0.1モル濃度、pH7.5)
中、カゼイン溶液〔0.1モルの3−(N−モルホリ
ノ)プロパンスルホン酸緩衝液による1%溶液由来の
0.5%,pH7.5〕、TWEEN(商標)20非イオ
ン界面活性剤(0.3%)、マーシオレート(0.01
%)および4′−ヒドロキシアセタニリド(10ミリモ
ル)の溶液に加えた。A.a.(全血清型)およびP.
g.(全血清型)に特異的な抗体量は、10μg/mLで
あった。P.i. (血清型AおよびC)に対する特異
的抗体量は、7.5μg/mLで、血清型Bに対するそれ
は、10μg/mLとした。
【0047】例1 好ましい抽出組成物と各種抽出組成
物を使用するアッセイの比較 本発明で使用した好ましい抽出組成物は、グリシン緩衝
液(0.1モル濃度、pH8.5)中、ドデシル硫酸ナト
リウム界面活性剤(5%)とEMCOL(商標)CC−
9カチオン界面活性剤(5%)とを混合して調製した。
比較例は、各種の常用されている抽出組成物を使用して
調製した。
【0048】これらの比較において、対照アッセイは下
記抗原抽出用組成物を使用して行った。 対照A:蒸留水。 対照B:リン酸緩衝溶液(0.05モル濃度、pH7.
3)。 対照C:水中ドデシル硫酸ナトリウム(0.1%)。 対照D:水中ドデシル硫酸ナトリウム(1%)。 対照E:水中ドデシル硫酸ナトリウム(10%)。 対照F:グリシン緩衝液(0.1モル濃度、pH8.5)
中ドデシル硫酸ナトリウム(0.1%)。 対照G:グリシン緩衝液(0.1モル濃度、pH8.5)
中ドデシル硫酸ナトリウム(10%)。 対照H:コハク酸緩衝液(0.1モル濃度、pH4.5)
中ドデシル硫酸ナトリウム(10%)。 対照I:グリシン緩衝液(0.1モル濃度、pH8.5)
中EMCOL(商標)CC−9カチオン界面活性剤
(7.5%)。
【0049】抽出操作 次のように各抽出組成物を使用した。適当容量の微生物
原液(1×109 個細胞/mL)を、室温で約1分間抽出
組成物と混合し、所定の細胞濃度とした。最終溶液の細
胞量は、次のとおりであった。
【0050】下記表Iに示すデータでは、アクチノバシ
ラス・アクチノマイセテムコミタンス(A.a.)、血
清型AおよびBについて、抗原希釈「12」は9.8×
10 5 個細胞/mLを含め、抗原希釈「14」は2.4×
105 個細胞/mLを含め、そして抗原希釈「18」は
1.5×104 個細胞/mLを含めた。血清型Cについて
は、抗原希釈「10」は3.9×106 個細胞/mLを含
め、抗原希釈「14」は2.4×105 個細胞/mLを含
め、そして抗原希釈「16」は6.0×104 個細胞/
mLを含めた。
【0051】下記表IIに示すデータでは、A.a.の全
血清型について、抗原希釈「10」は3.9×106
細胞/mLを含め、抗原希釈「14」は2.4×105
細胞/mLを含め、そして抗原希釈「18」は1.5×1
4 個細胞/mLを含めた。プレボテーラ・インターメデ
ィア(Prevotella intermedia
P.i.)およびポルフィロモナス・ギンギバリス
Porphyromonas gingivali
)(P.g.)については、抗原希釈「5」は1.3
×108 個細胞/mLを含め、抗原希釈「8」は1.6×
107 個細胞/mLを含め、そして抗原希釈「11」は
2.0×106 個細胞/mLを含めた。
【0052】アッセイ操作 上記抽出操作から得た各抽出試料(50μL)を、上記
のような使い捨て試験デバイスの各試験ウェルに加え、
膜上の免疫試薬(抗体含有)と抽出された抗原を複合体
形成を行いながら、試験ウェル中の膜を通して流体を排
出させた。
【0053】すぐさま、ペルオキシダーゼと抗体の結合
物(40μL)をウェルに加え、室温で5分間インキュ
ベーションしてサンドイッチ複合体を形成させた。各試
験ウェルを洗液(約400μL)で半分満たし、次いで
膜を通して排出した。この操作をもう一度繰り返した。
【0054】最後の洗浄後、色素生成性組成物(40μ
L)を各試験ウェルに加え、次いで室温にて2分間イン
キュベーションした。次に、得られた色素シグナルを視
覚的に評価し、反射濃度値を伴う標準色標と比較した。
次に、これらの反射濃度を、通常のウイリアムス−クラ
ッパー(Williams−Clapper)変換
J.Optical Soc.Am.,43,59
5,1953参照)により透過濃度(DT )に変換し
た。これらの結果を下記表にまとめる。0.003以下
のDT 値は、「色素シグナルなし」の視覚的評価に対応
する。
【0055】下記表にみられる結果は、次のように説明
される。対照A〜Eを使用するA.a.の血清型A,B
およびCから抽出された抗原のアッセイ由来のデータを
表Iに示す。組成物で使用するドデシル硫酸ナトリウム
の量が増大するにつれて、バックグランドのシグナルは
減小するが、血清型BおよびCから抽出された抗原に対
する感度は、一様に低減した。無論、商業的に実用可能
なアッセイを入手するにはこの微生物のすべての血清型
を検出することが極めて重要であるので、上記結果はま
ったく好ましくない。
【0056】
【表1】 例1で使用した抽出組成物と他の対照抽出組成物と比較
したさらなる結果を下記表IIに具体的に示す。グリシン
緩衝液(pH8.5、対照FとG)にドデシル硫酸ナトリ
ウムを入れたものは、特に、A.a.の血清型Bおよび
Cに対して、若干改善されたアッセイ感度を示す。酸性
媒体(対照H)中のドデシル硫酸ナトリウムは、等量の
界面活性剤を高pHで使用する対照Gより劣る。カチオン
界面活性剤を単独使用する場合(対照I)血清型Bおよ
びCの抗原に対する感度は改善されるが、血清型A抗原
の感度は許容できない。
【0057】高pHでカチオン界面活性剤とアニオン界面
活性剤の両方を含む組成物を使用する実施例1だけが、
P.i.P.g.のすべての血清型から抽出された抗
原に対して感度の低下を招くことなく、A.a.の全血
清型の所望の抽出および感度を示すと同時に、許容でき
る程度の低いバクグランドシグナルを維持するにすぎな
い。
【0058】
【表2】
【0059】例2 好ましい抽出および洗浄組成物を使
用するサンドイッチアッセイ この例は、好ましい抽出組成物(例1)と共に好ましい
洗浄組成物の使用を具体的に説明する。
【0060】洗浄組成物 リン酸緩衝液(0.1モル濃度、pH10)中TERGI
TOL(商標)4アニオン界面活性剤(2.7%)から
なる洗浄組成物を使用した。
【0061】アッセイ操作 ATCC53978〔血清型B,P.g.〕由来の抗原
を、室温で数秒間例1で使用した抽出組成物に細胞をさ
らすことにより抽出し、最終濃度1.25×108 個細
胞/mLを達成した。
【0062】抽出物(450μL)を1.2μm膜を介
して濾過し、次いで上記試験デバイスの試験ウェルの1
つに加えた。試験デバイスの膜は、A.a.P.g.
およびP.i.にそれぞれ特異的な限定された試薬領域
を担持させた。試験ウェルの膜を通して流体を排出し
た。各試験ウェルに抗体結合組成物(80μL)を直ち
に加え、次いで室温(約20〜25℃)にて2分間イン
キュベーションした。次に、洗浄液(500μL)を各
試験ウェルに加え、排液した後、第二の洗浄を行った。
【0063】各試験ウェルに(0.5ミリモルの4′−
ヒドロキシアセタニリドを含む以外)上記に類似する色
素生成性組成物を加え、次いで室温にて1分間インキュ
ベーションした。次に、色素シグナルを視覚的に評価
し、反射濃度値を伴う標準色標と比較した。次に、反射
濃度値をWilliams−Clapper変換(J.
Optical Soc.Am.,43,595ページ
(1953)、参照〕により透過濃度に変換した。0.
003以下のDT 値は、「色素シグナルなし」の視覚的
評価に対応する。結果を下記表III にまとめる。
【0064】
【表3】
【0065】
【発明の効果】本発明は、歯周病に随伴する微生物の迅
速かつ高感度の検出用手段を提供する。特に、本発明
は、個別には汎用抽出組成物を使用する上記微生物の全
血清型の迅速抽出および検出を可能にする。すなわち、
既知の抽出組成物はそれらの一定の微生物または血清型
を有効に抽出するが、本明細書で開示される組成物は関
連微生物の全血清型を抽出する。これらの利点は、水溶
性カチオン界面活性剤とアニオン界面活性剤の両者を含
むそれぞれ個別には汎用されている抽出組成物を使用す
ることで達成される。また、その組成物は、比較的高い
pH、すなわち少なくともpH8に緩衝されていることが重
量である。この組成物は、他の抽出組成物より優れた抽
出を提供し、しかも標的抗原に対する適切なアッセイ感
度を維持しながらアッセイにおけるバックグランドを相
当低くする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キャサリン テレサ アブラムス アメリカ合衆国,ニューヨーク 14626, ロチェスター,ハーベスト ドライブ 226 (72)発明者 エリザベス アン グローガン アメリカ合衆国,ニューヨーク 14624, ロチェスター,ブルックビュー ロード22

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 a.少なくとも0.05重量%の水溶性
    カチオン界面活性剤と、 b.少なくとも0.05重量%のアニオン界面活性剤と
    を含む少なくともpH8に緩衝化された水性抽出組成物
    を、含んでなる診断試験キット。
  2. 【請求項2】 微生物またはウイルスから抗原を抽出す
    るのに有効な時間および条件下で、a.少なくとも0.
    05重量%の水溶性カチオン界面活性剤と、 b.少なくとも0.05重量%のアニオン界面活性剤と
    を含む少なくともpH8に緩衝化された水性組成物を、被
    検体と接触させる工程を含んでなる抗原の抽出方法。
  3. 【請求項3】 微生物またはウイスルの測定方法であっ
    て、 A.微生物またはウイルスから抗原を抽出するのに有効
    な時間および温度条件下で、 a.少なくとも0.05重量%の水溶性カチオン界面活
    性剤と、 b.少なくとも0.05重量%のアニオン界面活性剤と
    を含む少なくともpH8に緩衝化された抽出組成物を、被
    検体と接触する工程、 B.前記で抽出された抗原とその抗原に特異的な抗体と
    の検出可能な免疫複合体を形成する工程、ならびに C.前記免疫複合体を検出する工程、を含んでなる方
    法。
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