JP2001296300A

JP2001296300A - 乳酸菌検出方法

Info

Publication number: JP2001296300A
Application number: JP2000113793A
Authority: JP
Inventors: Yoichi Tsuchiya; 陽一土屋
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 2000-04-14
Filing date: 2000-04-14
Publication date: 2001-10-26

Abstract

(57)【要約】【課題】乳酸菌検出試料から、抗体を用いて、抗原タ
ンパク質を変性させることなく、より高感度に乳酸菌を
検出する方法を提供すること。【解決手段】乳酸菌検出用試料にSDS溶液を加えて混
合する前処理工程と、前記前処理された前記乳酸菌検出
用試料に特定乳酸菌中の抗原を認識する抗体を含む検出
用抗体を加える抗体添加工程と、該抗体と該抗原との抗
原抗体反応の有無を検出する抗原抗体反応検出工程とを
含むことを特徴とする、乳酸菌検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特定の乳酸菌の検
出方法に関し、より詳しくは、麦芽アルコール飲料等の
製造工程において有害な乳酸菌の検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】食品または飲料、特に麦芽アルコール飲
料の製造工程において、微生物汚染によって受ける被害
は甚大である。例えば、耐酸性と耐アルコール性を有す
るある種の乳酸菌が麦芽アルコール飲料の製造工程で混
入すると、乳酸菌によって生じた濁りや酸敗などによっ
て、製造された麦芽アルコール飲料の品質を損なう場合
があることが知られている。具体的には、ラクトバチル
ス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌であるラクトバ
チルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）またはラ
クトバチルス・リンドネリ（Lactobacillus lindner
i）、または、ペディオコッカス（Pediococcus）属に属
する乳酸菌であるペディオコッカス・ダムノサス（Pedi
ococcus damnosus）が麦芽アルコール飲料混濁能を有す
る代表的な乳酸菌として挙げられる。

【０００３】そのため、これらの乳酸菌を迅速かつ高感
度に検出する方法の開発が試みられており、例えば特定
の乳酸菌が有する抗原を認識する抗体を用いた、いわゆ
る抗体法による検出方法が開発されている。しかしなが
ら、抗体法は特定の乳酸菌が有する抗原を特異的に認識
する選択性には優れているが、乳酸菌を培地にて何度も
植え継ぎを繰り返した場合に、乳酸菌の種類や培養条件
によっては、抗原に対する抗体の反応性が低下するとい
う問題があった。

【０００４】一方、上記の抗体法を用いて、より感度良
く乳酸菌を検出する方法として、特許登録第２９３７２
４５号公報には、乳酸菌検出用試料をアルカリ液処理、
酸液処理または加熱処理することにより細胞表層に抗原
を露出し、高感度に抗原抗体反応を行う方法が記載され
ている。しかし、このような処理をすると、その際に抗
原となるタンパク質が変性し、抗原性が低下する恐れが
あった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来技
術の有する課題に鑑みてなされたものであり、抗体を用
いて、抗原タンパク質を変性させることなく、より高感
度に乳酸菌検出用試料における特定の乳酸菌の有無を検
出する方法を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成すべく鋭意研究を重ねた結果、乳酸菌検出用試料を
界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で前処
理することによって乳酸菌表層へ抗原を露出させ、前記
抗原とこれを認識する抗体との反応性を高めることによ
り、高感度に乳酸菌を検出することができることを見出
し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明の乳酸菌検出方法は、乳
酸菌検出用試料にSDS溶液を加えて混合する前処理工程
と、前記前処理された前記乳酸菌検出用試料に特定乳酸
菌中の抗原を認識する抗体を含む検出用抗体を加える抗
体添加工程と、該抗体と該抗原との抗原抗体反応の有無
を検出する抗原抗体反応検出工程とを含むことを特徴と
する、乳酸菌検出方法である。

【０００８】本発明の乳酸菌検出方法においては、前記
乳酸菌が麦芽アルコール飲料混濁能を有する乳酸菌であ
ることが好ましい。

【０００９】また、本発明の乳酸菌検出方法において
は、前記SDSの濃度が０．０５〜１．０重量％の溶液で
あることが好ましい。

【００１０】さらに、本発明の乳酸菌検出方法において
は、前記乳酸菌検出用試料と前記SDS溶液との混合液に
おいて、pHを６．０〜８．０に維持することが好まし
く、温度を２０〜５０℃に維持することが好ましい。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の好適な実施形態に
ついて詳細に説明する。

【００１２】本発明の乳酸菌検出方法は、乳酸菌検出用
試料にSDS溶液を加えて混合する前処理工程と、前記前
処理された前記乳酸菌検出用試料に特定乳酸菌中の抗原
を認識する抗体を含む検出用抗体を加える抗体添加工程
と、該抗体と該抗原との抗原抗体反応の有無を検出する
抗原抗体反応検出工程とを含むことを特徴とする、乳酸
菌検出方法である。

【００１３】まず、本発明にかかる乳酸菌検出用試料に
SDS溶液を加えて混合する前処理工程について説明す
る。

【００１４】本発明にかかる乳酸菌検出用試料として
は、食品または飲料、なかでも麦芽アルコール飲料（例
えばビール、発泡酒）、ワイン、清酒、酢、醤油等の発
酵食品または飲料であって、その製造工程において乳酸
菌の混入が疑われるものが挙げられる。乳酸菌検出用試
料が液体である場合、液体そのものを前記試料として用
いることができるほか、液体をメンブレンフィルターで
ろ過してフィルター上に目的の菌を捕捉したもの、ある
いはそのフィルターを培地に置き、培養したものなどを
用いることができる。また、乳酸菌検出用試料が液体で
はない場合には、前記の試料を懸濁液に懸濁して溶液と
し、前記の液体試料と同様に試料として用いることがで
きる。

【００１５】また、本発明において検出対象となる乳酸
菌は、ラクトバチルス(Lactobacillus)属およびペディ
オコッカス(Pediococcus)属に属するものが好ましく、
具体的には、例えば、ラクトバチルス属としてはラクト
バチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバ
チルス・リンドネリ(Lactobacillus lindneri)、ラクト
バチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)およびラクト
バチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)等
が挙げられ、ペディオコッカス属としてはペディオコッ
カス・ダムノサス(Pediococcus damnosus)、ペディオコ
ッカス・イノピナタス(Pediococcus inopinatus)および
ペディオコッカス・ペントサセウス(Pediococcus pento
saceus)等が挙げられる。

【００１６】また、SDSを溶解する溶媒としては特に制
限はないが、例えば、水が挙げられる。

【００１７】本発明の乳酸菌検出方法における前処理工
程においては、上述のようにして乳酸菌検出用試料に上
記のSDSを添加して混合すればよい。

【００１８】前処理に使用するSDS溶液および処理の条
件、例えば、SDSの濃度、反応時間、温度、pHは、乳酸
菌の細胞膜を溶解して乳酸菌表層へ抗原を露出させるの
に十分な条件であれば特に限定されず、処理する乳酸菌
検出用試料または乳酸菌の種類に応じて適宜設定すれば
よいが、SDSの濃度は０．０５〜１．０重量％が好まし
く、反応時間は１０分間〜１時間が好ましく、温度は２
０〜５０℃が好ましく、pHは６．０〜８．０が好まし
い。また、このとき、乳酸菌検出用試料とSDSとの混合
液は静置したまま、または攪拌しながら反応させればよ
い。

【００１９】なお、前記で用いたSDSは、条件によって
は、その後の抗体反応を阻害する場合がある。従って、
前処理の済んだ溶液からSDSを除く工程をさらに含むこ
とが好ましい。このようなSDSを除く手段は特に限定さ
れないが、例えば遠心分離することにより乳酸菌を沈殿
させ、SDSを含む上清を除いた後、沈殿のみを試料とし
て用いるか、あらかじめメンブランに乳酸菌を捕捉した
後、前処理を行うことにより、SDSを除いた状態で抗体
反応を行うことが好ましい。

【００２０】次に、前記前処理された前記乳酸菌検出用
試料に特定乳酸菌中の抗原を認識する抗体を含む検出用
抗体を加える抗体添加工程について説明する。

【００２１】本発明にかかる検出用抗体とは、上記の前
処理によって、検出する対象となる乳酸菌の細胞表面へ
露出した抗原と反応するような抗体であって、好ましく
は複数種の乳酸菌株に反応する抗体、すなわちこれらの
株の共通抗原に対する抗体を含んでいるものである。前
記の抗体はモノクローナル抗体が好適に使用可能である
が、ポリクローナル抗体であっても、作製過程におい
て、免疫する抗原の条件や得られた抗血清を精製して用
いる等の種々の条件を検討することにより、抗原特異性
および検出感度が実用に耐え得る状態になったものであ
れば好適に使用可能である。

【００２２】前記のモノクローナル抗体としては、例え
ば、以下の方法で作成されたものが使用可能である。す
なわち、麦芽アルコール飲料中あるいは環境中から単離
した乳酸菌を、直接麦芽アルコール飲料に添加して混濁
を生じさせる能力を有する菌株を得、定法に従ってマウ
スに免疫を行った後、ハイブリドーマを作成し、目的の
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローン
を樹立する。具体的には、麦芽アルコール飲料中で増殖
させた乳酸菌を集菌し生理食塩水で洗浄後、リン酸緩衝
液（PBS）に懸濁する。この溶液をマウスに数回に渡っ
て免疫し、血中の抗体価が上昇したら最終免疫を行う。
最終免疫より３日後にマウスより脾臓を摘出し、細胞を
単離した後、適当な細胞融合剤存在下でミエローマ細胞
と融合する。９６穴マイクロプレートに融合細胞を播
き、HAT培地等の選択培地で培養を行う。続いて、ELISA
等の方法を用いて、目的の抗体を産生するハイブリドー
マを選択し、クローニングすることによりハイブリドー
マクローンを樹立する。前記のハイブリドーマクローン
を培地中で培養した後、細胞を回収し、これをマウスの
腹腔内へ注射する。次に、腹腔内より抗体を含んだ腹水
を採取し、これより硫安沈殿やプロテインAまたはプロ
テインGを用いたアフィニティ精製を行うことにより目
的とする抗体を得る。あるいは、前記ハイブリドーマク
ローンを培地中で大量培養した後、培養液から硫安沈殿
およびイオン交換カラムを用いた方法等によりモノクロ
ーナル抗体を精製する。

【００２３】また、ポリクローナル抗体としては、例え
ば、以下の方法で作成されたものが使用可能である。す
なわち、麦芽アルコール飲料中あるいは環境中から単離
した乳酸菌を、直接麦芽アルコール飲料に添加して混濁
を生じさせる能力を有する菌株を得た後、これをウサギ
またはマウス等に免疫することによって抗血清を得、必
要に応じて麦芽アルコール飲料混濁能がない乳酸菌の界
面活性剤処理菌体を用いて非特異的抗体を吸着除去した
ものが挙げられる。

【００２４】本発明の乳酸菌検出方法における抗体添加
工程においては、上述のようにして得られた抗体を上記
の前処理された乳酸菌検出用試料に添加する。このとき
の条件としては、前記試料と抗体の混合溶液の温度が２
０〜４０℃、pHが６．０〜９．０が好ましい。温度が２
０℃より低いと抗原抗体反応の効率が低下する傾向にあ
り、他方、４０℃より高いと抗原または抗体が変性して
抗原抗体反応の効率が低下する傾向にある。また、pHが
６．０より低い、あるいは９．０より高い場合にも抗原
または抗体が変性し抗原抗体反応の効率が低下する傾向
にある。

【００２５】次に、前記抗体と前記抗原との抗原抗体反
応の有無を検出する抗原抗体反応検出工程について説明
する。

【００２６】本発明の抗原抗体反応の有無を検出する抗
原抗体反応検出工程においては、まず、上記の乳酸菌検
出用試料に添加された抗体のうち、抗原と反応しなかっ
た抗体を洗浄することにより除く工程を含むことが好ま
しい。その後、周知の抗原抗体反応、例えば凝集反応、
菌体細胞を蛍光標識して蛍光顕微鏡で観察もしくは自動
測定する蛍光抗体法、酵素抗体法、ラジオイムノアッセ
イ法などを用いて特定の乳酸菌を検出すればよい。例え
ば、酵素抗体法を用いて特定の乳酸菌を検出する場合、
二次抗体として、ペルオキシダーゼが結合された抗マウ
ス抗体を添加し、適当な時間静置した後、洗浄し、メン
ブラン上の乳酸菌に結合している抗体を検出することに
より、目的とする乳酸菌を検出することが可能となる。

【００２７】本発明の乳酸菌検出方法により、食品また
は飲料中に混入した特定の乳酸菌を含む試料をSDSで前
処理することで、抗体を用いて乳酸菌を高感度に検出す
ることが可能となる。SDSによる前処理によって抗体の
反応感度が向上する理由としては、ある種の乳酸菌が細
胞表面に有するＳ層タンパク質(S-layer protein)がSDS
処理によって除去され、Ｓ層タンパク質によって抗体と
の反応部位を塞がれていた抗原が乳酸菌表層へ露出する
ことにより抗体との反応性が上昇すると本発明者は考え
ている。従って、乳酸菌のみならず、Ｓ層タンパク質を
有する全ての微生物についても、本発明の乳酸菌検出方
法は適用可能であり、Ｓ層タンパク質の存在に起因する
抗原性または抗体の反応性の低下を改善することが可能
である。

【００２８】

【実施例】以下に、実施例により本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。

【００２９】（実施例１および比較例１〜２）（１）菌体の調製ビールから単離したビール混濁能を有するラクトバチル
ス・ブレビスをビール中（市販の麦芽１００％、pH約
４．４、苦味価２８）に植菌し、打栓して嫌気状態に保
った後、２５℃で一週間増殖させた。その後、菌体を回
収し、一部をLactobacilli MRS Broth(DIFCO社製)に植
菌して培養した後、菌体を回収するとともに、さらに同
培地にて、植菌および培養を繰り返すことで、段階的に
抗原に対する抗体の反応性が低下した菌体を準備した。
具体的には０、１０、２０、３０世代継代したラクトバ
チルス・ブレビスをそれぞれ準備した。

【００３０】（２）菌体の抗体反応性の測定予めカゼインでブロッキングしたフィルター付き遠心チ
ューブを３本準備し、それぞれに（１）で準備した菌体
溶液（OD₆₆₀＝0.3）２５μlを添加した。これらのチュ
ーブに以下の３種の溶液：（１）生理食塩水（比較例１）（２）０．２重量％ドデシル硫酸ナトリウム溶液（リ
ン酸生理食塩水に懸濁し、pH７．０に調整したもの）
（実施例１）（３）０．２重量％NaOH溶液（比較例２）をそれぞれ菌体懸濁液と同量ずつ添加して混合した後、
室温で１０分間静置して前処理を行った。なお、実施例
１における混合液中のドデシル硫酸ナトリウム濃度は
０．１重量％であり、比較例２における混合液中のNaOH
濃度は０．１重量％である。

【００３１】上記の反応終了後、遠心分離により菌体か
ら溶液を除いた後、フィルター上に菌体を捕捉した。

【００３２】次に、フィルター上に捕捉された菌体に、
ハイブリドーマセルラインBLb2F37(FERM BP-6744)が産
生するモノクローナル抗体およびペルオキシダーゼ結合
抗マウスIgG＋M（和光純薬社製）を加えて攪拌した後、
室温にて１５分間静置した。その後、遠心分離にて抗体
溶液を除き、洗浄液（0.05％ Tween20を含む10mM Tris-
HCl pH8.0）を添加し、さらに遠心分離して洗浄液を除
くことで菌体を洗浄した。

【００３３】次に、上記フィルターに基質溶液（1mg/ml
二塩酸オルトフェニレンジアミンを含む0.25Mクエン
酸ナトリウムpH4.2）を添加し、フィルター上の基質溶
液が発色するのを確認した後、反応停止液（1g/l Na₂SO
₄を含む0.5M H₂SO₄）を添加した。この溶液を９６穴マ
イクロタイタープレートに移し、OD₄₉₂−OD₆₃₀（492nm
の吸光度の値から630nmの吸光度の値を引いた値）を測
定した。

【００３４】その結果、図１に示すように、比較例１の
未処理（生理食塩水添加）菌体は、ビールより単離した
後、培地にて継代するにつれて抗体との反応性が著しく
低下したのに対して、実施例１のドデシル硫酸ナトリウ
ム処理菌体は未処理（生理食塩水添加）菌体と比較して
抗体反応性の向上が確認された。なお、抗体反応性の向
上の程度は、実施例２の特許登録２９３７２４５号公報
に記載されているアルカリ処理（NaOH添加処理）された
菌体と比較しても同程度であることが判明した。（実施例２〜２１および比較例３）図１に示した継代１
０世代目の菌体を使用し、菌体を処理するドデシル硫酸
ナトリウム溶液の濃度とpHを以下に示した条件に設定し
た以外は実施例１と同様にして抗原抗体反応を行い、抗
体反応性を未処理（生理食塩水添加）菌体（比較例３）
と比較した。

【００３５】

【００３６】その結果、図２に示すように、試験した全
てのドデシル硫酸ナトリウムの濃度およびpHにおいて抗
体反応性の向上が観察された。なお、ドデシル硫酸ナト
リウムの濃度およびpHの違いによって、抗体反応性の向
上の程度に大きな差は見られず、抗原タンパク質が変性
していないことも確認された。

【００３７】

【発明の効果】以上説明したように、本発明の乳酸菌検
出方法によれば、乳酸菌検出試料から抗体を用いて、抗
原タンパク質を変性させることなく、より高感度に特定
の乳酸菌の存在を検出することが可能となる。

【００３８】従って、本発明の乳酸菌検出方法によれ
ば、食品または飲料、特には麦芽アルコール飲料の製造
工程において混入した特定の乳酸菌を高感度に検出可能
となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）および水酸化
ナトリウムで乳酸菌検出用試料を前処理した際等におけ
る、菌体の継代回数と抗体反応性の関係を示すグラフで
ある。

【図２】乳酸菌検出用試料の前処理におけるドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）の濃度およびpHと抗体反応性の関
係を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】乳酸菌検出用試料にドデシル硫酸ナトリ
ウム(SDS)溶液を加えて混合する前処理工程と、前記前
処理された前記乳酸菌検出用試料に特定乳酸菌中の抗原
を認識する抗体を含む検出用抗体を加える抗体添加工程
と、該抗体と該抗原との抗原抗体反応の有無を検出する
抗原抗体反応検出工程とを含むことを特徴とする、乳酸
菌検出方法。
【請求項２】前記乳酸菌が麦芽アルコール飲料混濁能
を有する乳酸菌であることを特徴とする、請求項１に記
載の乳酸菌検出方法。
【請求項３】前記前処理工程において、前記ドデシル
硫酸ナトリウム(SDS)溶液によって乳酸菌細胞膜の少な
くとも一部が溶解し、前記抗原が乳酸菌の表面に露出す
ることを特徴とする、請求項１または２に記載の乳酸菌
検出方法。
【請求項４】前記乳酸菌検出用試料と前記ドデシル硫
酸ナトリウム(SDS)溶液との混合液における、該ドデシ
ル硫酸ナトリウム(SDS)の濃度が０．０５〜１．０重量
％であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１
項に記載の乳酸菌検出方法。
【請求項５】前記前処理工程において、前記乳酸菌検
出用試料と前記ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液との
混合液のpHを６．０〜８．０に維持することを特徴とす
る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の乳酸菌検出方
法。
【請求項６】前記前処理工程において、前記乳酸菌検
出用試料と前記ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液との
混合液の温度を２０〜５０℃に維持することを特徴とす
る、請求項１〜５のいずれか１項に記載の乳酸菌検出方
法。