JP2002119297A - 大腸菌凝集アッセイ - Google Patents
大腸菌凝集アッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、高度に鋭敏であり特異的な大腸菌
凝集アッセイを、全尿素抽出大腸菌抗原に対する抗体を
使用して行なおうとするものである。 【解決手段】 本発明は、下記工程を含むことを特徴と
する、大腸菌（Escherichia coli）の検出方法である：
大腸菌を含む疑いのある試料を用意する；当該試料を、
大腸菌の一種またはそれ以上の表面抗原に特異的な抗体
の混合物または抗血清で被覆したビーズと接触させる
（ただし、上記一種またはそれ以上の表面抗原の各々
は、次ぎの分子量から成るグループから選択されたいず
れかの分子量を有するものである：21±2 KDa、26±2 K
Da、31±2 KDa、36±2 KDa、38±2 KDa、67±2 KDa、お
よび77.8±2 KDa)；および当該ビーズの凝集を観察する
（凝集の存在は、試料中における大腸菌の存在を示
す）。
凝集アッセイを、全尿素抽出大腸菌抗原に対する抗体を
使用して行なおうとするものである。 【解決手段】 本発明は、下記工程を含むことを特徴と
する、大腸菌（Escherichia coli）の検出方法である：
大腸菌を含む疑いのある試料を用意する；当該試料を、
大腸菌の一種またはそれ以上の表面抗原に特異的な抗体
の混合物または抗血清で被覆したビーズと接触させる
（ただし、上記一種またはそれ以上の表面抗原の各々
は、次ぎの分子量から成るグループから選択されたいず
れかの分子量を有するものである：21±2 KDa、26±2 K
Da、31±2 KDa、36±2 KDa、38±2 KDa、67±2 KDa、お
よび77.8±2 KDa)；および当該ビーズの凝集を観察する
（凝集の存在は、試料中における大腸菌の存在を示
す）。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】大腸菌は、健康な個体の一般
的な腸叢の１つと考えられているが、この微生物は、ま
た、尿路感染症、髄膜炎、および下痢を含む人間のかか
る病気および状態において、重要な病原体であると認め
られている。それゆえに、生物学的試料中の大腸菌を迅
速に同定できる、高度に鋭敏であり特異的な方法は、有
用であろう。
的な腸叢の１つと考えられているが、この微生物は、ま
た、尿路感染症、髄膜炎、および下痢を含む人間のかか
る病気および状態において、重要な病原体であると認め
られている。それゆえに、生物学的試料中の大腸菌を迅
速に同定できる、高度に鋭敏であり特異的な方法は、有
用であろう。
【０００２】
【発明の概要】本発明は、高度に鋭敏であり特異的な大
腸菌凝集アッセイを、全尿素抽出大腸菌抗原に対する抗
体を使用して行なうことができるという発見に基づいて
いる。驚くべきことに、特定の大腸菌抗原に対する抗体
を使用すると、そのようなストラテジーが他の細菌の凝
集アッセイでは有用性が証明されているものであって
も、アッセイの感受性が劇的に減少した(例えば米国特
許番号 5,418,140参照)。従って、本発明は、１部にお
いて、特異的な表面抗原に対する抗体を用いる場合より
予想外に優れた効果を達成する、全尿素抽出抗原に対す
る抗体を用いるアッセイに関する。
腸菌凝集アッセイを、全尿素抽出大腸菌抗原に対する抗
体を使用して行なうことができるという発見に基づいて
いる。驚くべきことに、特定の大腸菌抗原に対する抗体
を使用すると、そのようなストラテジーが他の細菌の凝
集アッセイでは有用性が証明されているものであって
も、アッセイの感受性が劇的に減少した(例えば米国特
許番号 5,418,140参照)。従って、本発明は、１部にお
いて、特異的な表面抗原に対する抗体を用いる場合より
予想外に優れた効果を達成する、全尿素抽出抗原に対す
る抗体を用いるアッセイに関する。
【０００３】それゆえに、本発明は、大腸菌を含む疑い
のある試料を用意すること；当該試料を、大腸菌の一種
またはそれ以上の表面抗原に特異的な抗体の混合物また
は抗血清で被覆したビーズと接触させること（ただし、
上記一種またはそれ以上の表面抗原の各々は、次ぎの分
子量を有するものである：21±2 KDa、26±2 KDa、31±
2 KDa、36±2 KDa、38±2 KDa、67±2 KDa、および77.8
±2 KDa）；そして当該ビーズの凝集を観察すること
（凝集の存在は、試料中における大腸菌の存在を示
す）、による試料中の大腸菌の検出方法であることを特
徴とする。この方法は、さらに、試料中の微生物がイン
ドールまたは発酵ラクトースを産生するか否かの測定
(両方共大腸菌に特有である)を含んでもよい。
のある試料を用意すること；当該試料を、大腸菌の一種
またはそれ以上の表面抗原に特異的な抗体の混合物また
は抗血清で被覆したビーズと接触させること（ただし、
上記一種またはそれ以上の表面抗原の各々は、次ぎの分
子量を有するものである：21±2 KDa、26±2 KDa、31±
2 KDa、36±2 KDa、38±2 KDa、67±2 KDa、および77.8
±2 KDa）；そして当該ビーズの凝集を観察すること
（凝集の存在は、試料中における大腸菌の存在を示
す）、による試料中の大腸菌の検出方法であることを特
徴とする。この方法は、さらに、試料中の微生物がイン
ドールまたは発酵ラクトースを産生するか否かの測定
(両方共大腸菌に特有である)を含んでもよい。
【０００４】本発明は、さらに、大腸菌が試料中に存在
するか否かを試験するキットを特徴とする。このキット
は、ビーズ、および１種またはそれ以上の大腸菌の表面
抗原に特異的な抗体の混合物または抗血清を含んでいる
(ただし、１種またはそれ以上の各表面抗原が、21±2 K
Da、26±2 KDa、31±2 KDa、36±2 KDa、38±2 KDa、67
±2 KDa、および77.8±2 KDaからなるグループから選択
される分子量を有するものである)。このキットは、さ
らに(1)微生物がラクトースを発酵するか否かを決定す
るためのエオシン-メチレンブルーを含む組成物、(2)微
生物がインドールを産生するか否かを決定するためのp-
ジメチルアミノシンナムアルデヒドを含む組成物、(3)
抗体の混合物で被覆したビーズを凝集させることが期待
される陽性制御剤(positive control reagent)、または
(4)抗体の混合物で被覆したビーズを凝集させることが
期待されない陰性制御剤(negative control reagent)、
を含んでいてもよい。
するか否かを試験するキットを特徴とする。このキット
は、ビーズ、および１種またはそれ以上の大腸菌の表面
抗原に特異的な抗体の混合物または抗血清を含んでいる
(ただし、１種またはそれ以上の各表面抗原が、21±2 K
Da、26±2 KDa、31±2 KDa、36±2 KDa、38±2 KDa、67
±2 KDa、および77.8±2 KDaからなるグループから選択
される分子量を有するものである)。このキットは、さ
らに(1)微生物がラクトースを発酵するか否かを決定す
るためのエオシン-メチレンブルーを含む組成物、(2)微
生物がインドールを産生するか否かを決定するためのp-
ジメチルアミノシンナムアルデヒドを含む組成物、(3)
抗体の混合物で被覆したビーズを凝集させることが期待
される陽性制御剤(positive control reagent)、または
(4)抗体の混合物で被覆したビーズを凝集させることが
期待されない陰性制御剤(negative control reagent)、
を含んでいてもよい。
【０００５】本明細書中の“全尿素抽出大腸菌抗原”
は、約４Ｍの尿素を含む水性混合物中でインキュベート
した大腸菌細菌を含む混合物の、遠心分離機にかけた上
清から集めた抗原を意味する。本発明の他の特徴または
利点は、下記の詳細な説明および請求の範囲から明らか
になるであろう。
は、約４Ｍの尿素を含む水性混合物中でインキュベート
した大腸菌細菌を含む混合物の、遠心分離機にかけた上
清から集めた抗原を意味する。本発明の他の特徴または
利点は、下記の詳細な説明および請求の範囲から明らか
になるであろう。
【０００６】
【詳細な説明】本発明は、生物学的試料などの(例え
ば、血清または大脳脊髄液試料)試料中の大腸菌を、凝
集アッセイを使用して検出する方法に関する。凝集アッ
セイは試料中の様々な種の細菌の検出に使用されている
が、ビーズに付着する部分および凝集に有用な部分は、
検出する種によって異なる(例えば Chang et al., J. F
oodProtect. 57:31-36, 1994; および Chang et al.,
J. Food Protect. 56:759-762, 1993参照)。実際、何れ
の部分が異なる種の細菌の検出に必要であるかは、全く
不明である。
ば、血清または大脳脊髄液試料)試料中の大腸菌を、凝
集アッセイを使用して検出する方法に関する。凝集アッ
セイは試料中の様々な種の細菌の検出に使用されている
が、ビーズに付着する部分および凝集に有用な部分は、
検出する種によって異なる(例えば Chang et al., J. F
oodProtect. 57:31-36, 1994; および Chang et al.,
J. Food Protect. 56:759-762, 1993参照)。実際、何れ
の部分が異なる種の細菌の検出に必要であるかは、全く
不明である。
【０００７】本発明は、一部において、大腸菌の検出を
目的とする高度に鋭敏で特異的な凝集アッセイに必要と
される特定の部分の同定に基づいている。下記の実施例
のとおり、全尿素抽出大腸菌抗原に特異的な抗体混合物
でビーズを(例えば、一般的な共有的または非共有的方
法で)被覆しないかぎりは、大腸菌凝集アッセイは臨床
適用に十分であるほど特異的ではない。このような抗体
の混合物は、下記の実施例に記載されているような標準
的技術を使用して、全尿素抽出大腸菌抗原で脊椎動物を
免疫化し、動物によって産生される抗体を採取すること
によって調製することができる。
目的とする高度に鋭敏で特異的な凝集アッセイに必要と
される特定の部分の同定に基づいている。下記の実施例
のとおり、全尿素抽出大腸菌抗原に特異的な抗体混合物
でビーズを(例えば、一般的な共有的または非共有的方
法で)被覆しないかぎりは、大腸菌凝集アッセイは臨床
適用に十分であるほど特異的ではない。このような抗体
の混合物は、下記の実施例に記載されているような標準
的技術を使用して、全尿素抽出大腸菌抗原で脊椎動物を
免疫化し、動物によって産生される抗体を採取すること
によって調製することができる。
【０００８】さらに詳述しなくても、当業者は上記の記
載および下記の凝集アッセイに基づいて本発明を最大限
で利用できると考えられる。下記の実施例が、当業者が
どのように全尿素抽出大腸菌抗原を単離し、動物をこの
ような抗原で免疫化し、さらに動物によって産生される
抗体を採取できるかを例示説明しているにすぎないと解
釈されるべきであり、そして開示の残りの部分を何ら限
定するものではない。本明細書で引用した何れの刊行物
も、出典明示により本明細書に組込まれている。
載および下記の凝集アッセイに基づいて本発明を最大限
で利用できると考えられる。下記の実施例が、当業者が
どのように全尿素抽出大腸菌抗原を単離し、動物をこの
ような抗原で免疫化し、さらに動物によって産生される
抗体を採取できるかを例示説明しているにすぎないと解
釈されるべきであり、そして開示の残りの部分を何ら限
定するものではない。本明細書で引用した何れの刊行物
も、出典明示により本明細書に組込まれている。
【０００９】
【実施例】材料および方法 細菌株および培養条件 本研究に使用する微生物を表１に列挙する。合計１８３
８株のグラム陰性細菌を試験し、その中には、１０２８
株のE. coli(その中では、７４８株が臨床的試料由来で
あり、２６８株が食料サンプル由来であり、そして、１
２株がCultureCollection and Research Center[CCRC]
Hsinchu, Taiwan由来であった)、E. coli以外の６３２
株のEnterobacteriaceae、２１株のAeromonas spp.、７
５株のPseudomonas spp.、１８株のVibrio spp.、およ
び６４株の他の細菌が含まれていた。殆どの株は、臨床
的単離株であった。すべての細菌は、最初にトリプシン
・ソイ・アガー(tryptic soy agar)にサブカルチャー(V
ibrio parahaemolyticusを除き、２％NaClのトリプシン
・ソイ・アガーに培養した)し、次いで、ヒツジの血液
寒天培地およびレビンズ・エオシン-メチレンブルー(Ｅ
ＭＢ)アガーにサブカルチャーした。当該プレートを３
５℃で１８から２４時間インキュベートした。ＥＭＢ上
で増殖した株について、ラクトース発酵の能力を観察し
た。そうすると、褐色(または黒色)中心または金属光沢
のコロニーを有する株がラクトース発酵していると思わ
れた。血液寒天培地で増殖した細菌に、ｐ-ジメチルア
ミノシンナムアルデヒド試薬(BBL DMACA Indole Reagen
t Droppers, Becton DickinsonMicrobiology Systems,
Cockeysville, Md)を用いるスポットインドール試験に
よるインドール生成についての試験をした。血液寒天培
地で増殖した細菌をまたラテックス凝集試験(ＬＡＴ)に
使用した。
８株のグラム陰性細菌を試験し、その中には、１０２８
株のE. coli(その中では、７４８株が臨床的試料由来で
あり、２６８株が食料サンプル由来であり、そして、１
２株がCultureCollection and Research Center[CCRC]
Hsinchu, Taiwan由来であった)、E. coli以外の６３２
株のEnterobacteriaceae、２１株のAeromonas spp.、７
５株のPseudomonas spp.、１８株のVibrio spp.、およ
び６４株の他の細菌が含まれていた。殆どの株は、臨床
的単離株であった。すべての細菌は、最初にトリプシン
・ソイ・アガー(tryptic soy agar)にサブカルチャー(V
ibrio parahaemolyticusを除き、２％NaClのトリプシン
・ソイ・アガーに培養した)し、次いで、ヒツジの血液
寒天培地およびレビンズ・エオシン-メチレンブルー(Ｅ
ＭＢ)アガーにサブカルチャーした。当該プレートを３
５℃で１８から２４時間インキュベートした。ＥＭＢ上
で増殖した株について、ラクトース発酵の能力を観察し
た。そうすると、褐色(または黒色)中心または金属光沢
のコロニーを有する株がラクトース発酵していると思わ
れた。血液寒天培地で増殖した細菌に、ｐ-ジメチルア
ミノシンナムアルデヒド試薬(BBL DMACA Indole Reagen
t Droppers, Becton DickinsonMicrobiology Systems,
Cockeysville, Md)を用いるスポットインドール試験に
よるインドール生成についての試験をした。血液寒天培
地で増殖した細菌をまたラテックス凝集試験(ＬＡＴ)に
使用した。
【００１０】細胞表面抗原の調製 E. coli CCRC 15481をトリプシン・ソイ・アガーにおい
て、３５℃、１８から２４時間増殖させた。各プレート
の細胞を、リン酸緩衝性生理食塩水(ＰＢＳ；１０ｍＭ
リン酸緩衝液、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２)２ｍ
ｌ中に懸濁させ、室温で遠心分離(２，０００×ｇ、１
５分間)してペレット化することにより回収した。細菌
細胞をＰＢＳで洗浄し、４Ｍ尿素１ｍｌ中に懸濁し、５
０℃の水浴で９０分間、随時攪拌しつつインキュベート
した。当該細胞懸濁液を室温で遠心分離(１０，０００
×ｇ、１５分間)し、不溶性粒子を除去し、上清を０．
２×強度のＰＢＳで透析し、尿素を除去した。任意に選
択した２種(Enterobacter sakazakii CCRC 1415 および
Klebsiella pneumoniae 06048、臨床的単離体)の細胞表
面抗原をもまた４Ｍ尿素で抽出し対照とした。
て、３５℃、１８から２４時間増殖させた。各プレート
の細胞を、リン酸緩衝性生理食塩水(ＰＢＳ；１０ｍＭ
リン酸緩衝液、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２)２ｍ
ｌ中に懸濁させ、室温で遠心分離(２，０００×ｇ、１
５分間)してペレット化することにより回収した。細菌
細胞をＰＢＳで洗浄し、４Ｍ尿素１ｍｌ中に懸濁し、５
０℃の水浴で９０分間、随時攪拌しつつインキュベート
した。当該細胞懸濁液を室温で遠心分離(１０，０００
×ｇ、１５分間)し、不溶性粒子を除去し、上清を０．
２×強度のＰＢＳで透析し、尿素を除去した。任意に選
択した２種(Enterobacter sakazakii CCRC 1415 および
Klebsiella pneumoniae 06048、臨床的単離体)の細胞表
面抗原をもまた４Ｍ尿素で抽出し対照とした。
【００１１】抗体の調製および精製 E. coli尿素抽出細胞表面抗原(約１ｍｇ／ｍｌ)を、同
体積の不完全フロインドアジュバント(Difco Laborator
ies, Detroit, Mi)でエマルジョン化した。エマルジョ
ン化抗原２ミリトルを、各ニュージーランド・ホワイト
・ラビットの背中に４から６箇所、皮下注射した。当該
動物は、４週間おきに、初期接種と同じ注射条件を用
い、４回同じ抗原を投与し免疫を増強(boost)させた。
最終注射から１０日後、耳の動脈血を採取した。血清中
の抗体力価を、マイクロタイタープレート(Nunc, Kamst
rup, Denmark)のウェルに被覆した尿素抽出細胞表面抗
原(１０μｇ／ｍｌ)を捕捉成分として用いる酵素結合免
疫収着検定法(ＥＬＩＳＡ)により測定した。連続的に１
０倍希釈した抗血清 約０．１ｍｌを各ウェルに添加し
た。標準的な洗浄の後、セイヨウワサビペルオキシダー
ゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ(Sigma Chemical Co., St. L
ouis, Mo)を各ウェルに添加した。
体積の不完全フロインドアジュバント(Difco Laborator
ies, Detroit, Mi)でエマルジョン化した。エマルジョ
ン化抗原２ミリトルを、各ニュージーランド・ホワイト
・ラビットの背中に４から６箇所、皮下注射した。当該
動物は、４週間おきに、初期接種と同じ注射条件を用
い、４回同じ抗原を投与し免疫を増強(boost)させた。
最終注射から１０日後、耳の動脈血を採取した。血清中
の抗体力価を、マイクロタイタープレート(Nunc, Kamst
rup, Denmark)のウェルに被覆した尿素抽出細胞表面抗
原(１０μｇ／ｍｌ)を捕捉成分として用いる酵素結合免
疫収着検定法(ＥＬＩＳＡ)により測定した。連続的に１
０倍希釈した抗血清 約０．１ｍｌを各ウェルに添加し
た。標準的な洗浄の後、セイヨウワサビペルオキシダー
ゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ(Sigma Chemical Co., St. L
ouis, Mo)を各ウェルに添加した。
【００１２】ＩｇＧ画分の抗血清を、Linn et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 70: 1865-1869, 1973に記載
のようにジエチルアミノエチル(ＤＥＡＥ)イオン交換ク
ロマトグラフィーで精製した。ＩｇＧ画分を、更に、製
造者説明書に従ってＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂゲ
ル(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)に
結合したE. coliの尿素抽出細胞抗原を用いるアフェニ
ティークロマトグラフィーにより精製した。特異的抗体
を、０．１Ｍ グリシン-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ２．６でアフ
ェニティーカラム(１．５×５ｃｍ)から溶出し、その
後、１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で直に中
性化した。
c. Natl. Acad. Sci. USA 70: 1865-1869, 1973に記載
のようにジエチルアミノエチル(ＤＥＡＥ)イオン交換ク
ロマトグラフィーで精製した。ＩｇＧ画分を、更に、製
造者説明書に従ってＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂゲ
ル(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)に
結合したE. coliの尿素抽出細胞抗原を用いるアフェニ
ティークロマトグラフィーにより精製した。特異的抗体
を、０．１Ｍ グリシン-ＨＣｌ緩衝液ｐＨ２．６でアフ
ェニティーカラム(１．５×５ｃｍ)から溶出し、その
後、１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０で直に中
性化した。
【００１３】ラテックスの感受性化 ラテックス粒子を物理的吸着により抗体で被覆した。１
０％(ｗｔ／ｖｏｌ)ラテックス懸濁液(直径1.09μｍ、J
apan Synthetic Rubber, Tokyo)１ミリリッターを２回
脱イオン水で洗浄し、水２０ｍｌ中に懸濁した。洗浄し
たラテックス懸濁液に、同体積の親和性精製抗体(７０
μｇ／ｍｌ)を加えた。当該懸濁液を室温で、１時間、
エンド・オーバー・エンド・ミキサーでインキュベート
し、次いで、遠心分離(２，０００×ｇ、１５分間)し、
未結合抗体を除去した。抗体被覆ラテックスを、２回、
０．１％ウシ血清アルブミンで洗浄し、０．１％ウシ血
清アルブミン２０ｍｌ中に再懸濁した。対照ラテックス
を、同じ方法で免疫前血清ＩｇＧで被覆した。ラテック
ス試薬の最終濃度は０．５％(ｗｔ／ｖｏｌ)であった。
０％(ｗｔ／ｖｏｌ)ラテックス懸濁液(直径1.09μｍ、J
apan Synthetic Rubber, Tokyo)１ミリリッターを２回
脱イオン水で洗浄し、水２０ｍｌ中に懸濁した。洗浄し
たラテックス懸濁液に、同体積の親和性精製抗体(７０
μｇ／ｍｌ)を加えた。当該懸濁液を室温で、１時間、
エンド・オーバー・エンド・ミキサーでインキュベート
し、次いで、遠心分離(２，０００×ｇ、１５分間)し、
未結合抗体を除去した。抗体被覆ラテックスを、２回、
０．１％ウシ血清アルブミンで洗浄し、０．１％ウシ血
清アルブミン２０ｍｌ中に再懸濁した。対照ラテックス
を、同じ方法で免疫前血清ＩｇＧで被覆した。ラテック
ス試薬の最終濃度は０．５％(ｗｔ／ｖｏｌ)であった。
【００１４】ラテックス凝集試験 顕微鏡のスライド上で、直径約１．５ｃｍの２つのサー
クルにワックスペンシル(wax pencil)で印をつけた。滅
菌した爪楊枝を用い、血液寒天培地で一夜増殖させた１
ないし２のコロニーを、スライド上のそれぞれのサーク
ルに移した。対照ラテックスの１滴を一方のサークル
(対照のサークル)に加え、試験ラテックスの１滴(抗体
で感受性化した)を他方のサークル(試験のサークル)に
加えた。当該内容物を爪楊枝でなすり、１ないし２分間
ゆるやかに前後に動かした。対照サークル中では凝集が
見られないが、試験サークル中では凝集が観察される試
験は、陽性であった。試験サークル中で凝集が見られな
かった場合、試験は陰性とした。対照サークルと試験サ
ークルの両方において、自己凝集(autoagglutinatio
n)、すなわち凝集を生ずる数株が見られた。これらの株
は、試験結果の算出から除き、表１には含めなかった。
クルにワックスペンシル(wax pencil)で印をつけた。滅
菌した爪楊枝を用い、血液寒天培地で一夜増殖させた１
ないし２のコロニーを、スライド上のそれぞれのサーク
ルに移した。対照ラテックスの１滴を一方のサークル
(対照のサークル)に加え、試験ラテックスの１滴(抗体
で感受性化した)を他方のサークル(試験のサークル)に
加えた。当該内容物を爪楊枝でなすり、１ないし２分間
ゆるやかに前後に動かした。対照サークル中では凝集が
見られないが、試験サークル中では凝集が観察される試
験は、陽性であった。試験サークル中で凝集が見られな
かった場合、試験は陰性とした。対照サークルと試験サ
ークルの両方において、自己凝集(autoagglutinatio
n)、すなわち凝集を生ずる数株が見られた。これらの株
は、試験結果の算出から除き、表１には含めなかった。
【００１５】感受性および特異性 感受性は、陽性結果(実質的に陽性)を示したE. coli株
の数を全試験細菌株数で割った数として定義した。特異
性は、陰性結果(実質的に陰性)を示した非E. coli株の
数を全試験細菌株数で割った数として定義した。
の数を全試験細菌株数で割った数として定義した。特異
性は、陰性結果(実質的に陰性)を示した非E. coli株の
数を全試験細菌株数で割った数として定義した。
【００１６】イムノブロッティング 尿素抽出細胞表面抗原の分子量を測定するため、Hu et
al., J. Immunol. Methods 202: 113-121, 1997により
記載されたウエスタンブロッティング技術を、下記の修
飾をして用いた。当該尿素抽出抗原を、ドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡ
ＧＥ)で分離し、ニトロセルロースメンブレン(Hybond E
CLTM, Amersham Pharmacia Biotech)にブロッティング
した。ブロッティング後、タンパク質分子量マーカーの
レーンを切り出し、０．１％アミノブラックで染色し、
次いで脱色した。残り部分のメンブレンを、一夜、４℃
で、ブロッキング溶液(５％非脂質乾燥ミルクおよび１
％Ｔｗｅｅｎ２０)中でブロッキングした。洗浄後、当
該ブロットを、上記のように作成した親和性精製抗体
(０．５μｇ／ｍｌ)と共にインキュベーションし、次い
で、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗ウサ
ギＩｇＧ(Sigma Chemical Co., 1:1,500 希釈)と共にイ
ンキュベーションした。洗浄後、当該メンブレンを、基
質溶液(４-クロロ-１-ナフトール３０ｍｇおよび１０ｍ
ｌメタノール中の３０％Ｈ2Ｏ2 ３０μｌ)中で展開し、
１次抗体により認識される抗原を現われさせた。
al., J. Immunol. Methods 202: 113-121, 1997により
記載されたウエスタンブロッティング技術を、下記の修
飾をして用いた。当該尿素抽出抗原を、ドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡ
ＧＥ)で分離し、ニトロセルロースメンブレン(Hybond E
CLTM, Amersham Pharmacia Biotech)にブロッティング
した。ブロッティング後、タンパク質分子量マーカーの
レーンを切り出し、０．１％アミノブラックで染色し、
次いで脱色した。残り部分のメンブレンを、一夜、４℃
で、ブロッキング溶液(５％非脂質乾燥ミルクおよび１
％Ｔｗｅｅｎ２０)中でブロッキングした。洗浄後、当
該ブロットを、上記のように作成した親和性精製抗体
(０．５μｇ／ｍｌ)と共にインキュベーションし、次い
で、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗ウサ
ギＩｇＧ(Sigma Chemical Co., 1:1,500 希釈)と共にイ
ンキュベーションした。洗浄後、当該メンブレンを、基
質溶液(４-クロロ-１-ナフトール３０ｍｇおよび１０ｍ
ｌメタノール中の３０％Ｈ2Ｏ2 ３０μｌ)中で展開し、
１次抗体により認識される抗原を現われさせた。
【００１７】結果 本研究の始めでは、２０から９０ｋＤａの範囲の分子質
量を有する４つの表面抗原を、準備されたＳＤＳ-ＰＡ
ＧＥより、E. coli(CCRC 15481)の全尿素抽出抗原から
精製した。４種の抗原のそれぞれを用い、ウサギにおい
て抗体を生じさせ、各抗原に対する精製各抗体を用い、
E. coliの同定用ラテックス試薬を調製した。しかし、
４つの抗原のうちの何れか１つに対する抗体を用いる
と、７０％未満の比較的低いＬＡＴ感受性となった。こ
れは、特異的なVibrio parahaemolyticus表面抗原を用
いる同様のＬＡＴによれば９０％を十分超える特異性が
生じるとすると驚くべきことであった(米国特許番号
５，４１８，１４０)。従って、他の細菌では成功する
ことが従来から知られているＬＡＴストラテジーをE. c
oliに適用してうまく行かなかったことは、病原性細菌
が異なると成功するストラテジーが異なってくるのであ
り、あるストラテジーがある細菌で成功しても、同じス
トラテジーを用いて他の細菌でも成功するという合理的
予想を導くことはできない。この予測されなかったが明
らかとなった発見の観点から、他のストラテジーが検討
された。全尿素抽出E. coli抗原に対し生ずる抗体が、
高感度のＬＡＴに必要であることが判明した。
量を有する４つの表面抗原を、準備されたＳＤＳ-ＰＡ
ＧＥより、E. coli(CCRC 15481)の全尿素抽出抗原から
精製した。４種の抗原のそれぞれを用い、ウサギにおい
て抗体を生じさせ、各抗原に対する精製各抗体を用い、
E. coliの同定用ラテックス試薬を調製した。しかし、
４つの抗原のうちの何れか１つに対する抗体を用いる
と、７０％未満の比較的低いＬＡＴ感受性となった。こ
れは、特異的なVibrio parahaemolyticus表面抗原を用
いる同様のＬＡＴによれば９０％を十分超える特異性が
生じるとすると驚くべきことであった(米国特許番号
５，４１８，１４０)。従って、他の細菌では成功する
ことが従来から知られているＬＡＴストラテジーをE. c
oliに適用してうまく行かなかったことは、病原性細菌
が異なると成功するストラテジーが異なってくるのであ
り、あるストラテジーがある細菌で成功しても、同じス
トラテジーを用いて他の細菌でも成功するという合理的
予想を導くことはできない。この予測されなかったが明
らかとなった発見の観点から、他のストラテジーが検討
された。全尿素抽出E. coli抗原に対し生ずる抗体が、
高感度のＬＡＴに必要であることが判明した。
【００１８】抗血清の力価 連続して行った５種の免疫の後、E. coli 15481の尿素
抽出細胞表面抗原に対する抗血清の力価を、ＥＬＩＳＡ
により測定すると１０7であった。
抽出細胞表面抗原に対する抗血清の力価を、ＥＬＩＳＡ
により測定すると１０7であった。
【００１９】免疫ブロッティング 親和性精製抗体は、E. coli CCRC 15481の複数の表面抗
原を認識した。これら抗原は、７７．８、６７、３８、
３６、３１、２６および２１ｋＤａの分子質量を有する
と評価された。ポリクローナル抗体が、E. coliの複数
抗原に対して生ずるため、他の種由来の抗原との交差反
応は避けがたいと予想された。例えば、Enterobacter s
akazakiiおよびKlebsiella pneumoniaeから精製した２
６と２１ｋＤａの抗原はまた、全尿素抽出E. coli抗原
に対する抗体と交差反応した。それにもかかわらず、以
下に示すように、高レベルの特異性が達成するという事
実により、他の予測できない結果が生じた。
原を認識した。これら抗原は、７７．８、６７、３８、
３６、３１、２６および２１ｋＤａの分子質量を有する
と評価された。ポリクローナル抗体が、E. coliの複数
抗原に対して生ずるため、他の種由来の抗原との交差反
応は避けがたいと予想された。例えば、Enterobacter s
akazakiiおよびKlebsiella pneumoniaeから精製した２
６と２１ｋＤａの抗原はまた、全尿素抽出E. coli抗原
に対する抗体と交差反応した。それにもかかわらず、以
下に示すように、高レベルの特異性が達成するという事
実により、他の予測できない結果が生じた。
【００２０】ラテックス凝集試験 １８３８細菌株の、ＬＡＴ、インドール生成、およびラ
クトース発酵の結果を表１に列挙する。試験したE. col
iの１０２８単離株のうち、１０２１株(９９．３％)
が、ＬＡＴ反応陽性であり、１０１１株(９８．３％)が
インドール生産に陽性であり、そして、９８６株(９
５．９％)がラクトース発酵した。偽陽性ＬＡＴを生ず
る細菌は、主に、Citrobacter、Enterobacter、Klebsie
lla、Morganella、Proteus、Serratia、およびShiglell
aの幾つかの単離株であった(表１)。
クトース発酵の結果を表１に列挙する。試験したE. col
iの１０２８単離株のうち、１０２１株(９９．３％)
が、ＬＡＴ反応陽性であり、１０１１株(９８．３％)が
インドール生産に陽性であり、そして、９８６株(９
５．９％)がラクトース発酵した。偽陽性ＬＡＴを生ず
る細菌は、主に、Citrobacter、Enterobacter、Klebsie
lla、Morganella、Proteus、Serratia、およびShiglell
aの幾つかの単離株であった(表１)。
【００２１】
【表１】
【表２】
【００２２】ＬＡＴ、インドール産生およびラクトース
発酵に基づいたE. coliの同定の感受性を表２に示す。
ＬＡＴのみに基づけば、感受性は９９.３％であった。
ＬＡＴをインドール産生アッセイ、ラクトース発酵アッ
セイまたは両方のアッセイと組合わせて使用した場合、
感受性は各々９８、９５.７および９４.４％に減少し
た。約５％の感受性が、E. coliの同定のためにＬＡＴ
と二つの更なる生理学的アッセイを統合することにより
犠牲となった。
発酵に基づいたE. coliの同定の感受性を表２に示す。
ＬＡＴのみに基づけば、感受性は９９.３％であった。
ＬＡＴをインドール産生アッセイ、ラクトース発酵アッ
セイまたは両方のアッセイと組合わせて使用した場合、
感受性は各々９８、９５.７および９４.４％に減少し
た。約５％の感受性が、E. coliの同定のためにＬＡＴ
と二つの更なる生理学的アッセイを統合することにより
犠牲となった。
【００２３】
【表３】
【００２４】ＬＡＴ、インドール産生およびラクトース
発酵に基づいたE. coliの同定の特異性を表３に示す。
ＬＡＴのみに基づけば、特異性は、比較に使用した具体
的な非E. coli株に応じて、７９.３から１００％であっ
た。相対的に低い特異性となる株は、Shigella(７９.３
％)、Proteus(８３.３％)、Serratia(８３.３％)、およ
びCitrobacter(８８.２％)であった。グルコース非発酵
細菌(例えば、Acinetobacter、PseudomonasおよびSteno
trophomonas maltophilia)およびシトクロムオキシダー
ゼ陽性細菌(例えば、VibrioおよびAeromonas)はラテッ
クス試薬と低い交差反応性を示した。E. coliの同定の
ためのＬＡＴの全体的特異性は９３.３％であった(表
３)。E. coliの同定のために、インドールの産生、ラク
トースの発酵または両方のアッセイをＬＡＴと組合わせ
て使用した場合、全体的特異性は各々９８.８、９８.７
および９９.７％に増加した。
発酵に基づいたE. coliの同定の特異性を表３に示す。
ＬＡＴのみに基づけば、特異性は、比較に使用した具体
的な非E. coli株に応じて、７９.３から１００％であっ
た。相対的に低い特異性となる株は、Shigella(７９.３
％)、Proteus(８３.３％)、Serratia(８３.３％)、およ
びCitrobacter(８８.２％)であった。グルコース非発酵
細菌(例えば、Acinetobacter、PseudomonasおよびSteno
trophomonas maltophilia)およびシトクロムオキシダー
ゼ陽性細菌(例えば、VibrioおよびAeromonas)はラテッ
クス試薬と低い交差反応性を示した。E. coliの同定の
ためのＬＡＴの全体的特異性は９３.３％であった(表
３)。E. coliの同定のために、インドールの産生、ラク
トースの発酵または両方のアッセイをＬＡＴと組合わせ
て使用した場合、全体的特異性は各々９８.８、９８.７
および９９.７％に増加した。
【００２５】
【表４】 ａ 以下の細菌を含む(株の数)：Alcaligenes spp.
(３)、Edwardsiella tarda(３)、Kurthia sp.(１)、Pas
turella spp.(１)、Moraxella spp.(２)、Plesiomonas
shigelloides(２)、Shingomonas paucimobilis(３)およ
びYersinia enterocolitica(３)。 ｂ 非E. coli種。
(３)、Edwardsiella tarda(３)、Kurthia sp.(１)、Pas
turella spp.(１)、Moraxella spp.(２)、Plesiomonas
shigelloides(２)、Shingomonas paucimobilis(３)およ
びYersinia enterocolitica(３)。 ｂ 非E. coli種。
【００２６】ＬＡＴおよびインドール陽性反応の両方を
示す株はEscherichia fergusonii、Morgenella morgani
iならびにCitrobacterおよびKlebsiellaからの数個の単
離株を含んんでいた(表１および３)。ＬＡＴおよびラク
トース陽性反応をもたらす株は、Acinetobacter calcoa
ceticus、Morgenella morganiiならびにCitrobacterお
よびKlebsiellaからの数個の単離株を含んでいた(表１
および３)。この実験において、Klebsiella oxytocaの
株の１０％(３／３０)、Citrobacter freundiiの株の
３.５％(２／５７)、およびCitrobacter diversusの株
の４.３％(１／２３)がＬＡＴ、インドールおよびラク
トース陽性であった。
示す株はEscherichia fergusonii、Morgenella morgani
iならびにCitrobacterおよびKlebsiellaからの数個の単
離株を含んんでいた(表１および３)。ＬＡＴおよびラク
トース陽性反応をもたらす株は、Acinetobacter calcoa
ceticus、Morgenella morganiiならびにCitrobacterお
よびKlebsiellaからの数個の単離株を含んでいた(表１
および３)。この実験において、Klebsiella oxytocaの
株の１０％(３／３０)、Citrobacter freundiiの株の
３.５％(２／５７)、およびCitrobacter diversusの株
の４.３％(１／２３)がＬＡＴ、インドールおよびラク
トース陽性であった。
【００２７】結論として、疑われるグラム陰性大腸菌
は、各々９４.４および９９.７％の全体的な感受性およ
び特異性である凝集を使用して正確に同定できる。
は、各々９４.４および９９.７％の全体的な感受性およ
び特異性である凝集を使用して正確に同定できる。
【００２８】他の態様 本発明はその詳細な記載に関連して記載しているが、前
記の記載は説明を意図するものであり、本発明の範囲を
限定するものではなく、それは特許請求の範囲の定義に
より定義される。他の態様、利点および修飾は本発明の
範囲内である。
記の記載は説明を意図するものであり、本発明の範囲を
限定するものではなく、それは特許請求の範囲の定義に
より定義される。他の態様、利点および修飾は本発明の
範囲内である。
Claims (10)
- 【請求項１】 下記工程を含むことを特徴とする、大腸
菌（Escherichia coli）の検出方法：大腸菌を含む疑い
のある試料を用意する；当該試料を、大腸菌の一種また
はそれ以上の表面抗原に特異的な抗体の混合物または抗
血清で被覆したビーズと接触させる（ただし、上記一種
またはそれ以上の表面抗原の各々は、次ぎの分子量から
成るグループから選択されたいずれかの分子量を有する
ものである：21±2 KDa、26±2 KDa、31±2 KDa、36±2
KDa、38±2 KDa、67±2 KDa、および77.8±2 KDa）；
および当該ビーズの凝集を観察する（凝集の存在は、試
料中における大腸菌の存在を示す）。 - 【請求項２】 ビーズがラテックスを含む、請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】 さらに、試料中の微生物がインドールを
産生するか否かを決定することを含む、請求項１または
２記載の方法。 - 【請求項４】 さらに、試料中の微生物がラクトースを
発酵するか否かを決定することを含む、請求項１〜３の
いずれか記載の方法。 - 【請求項５】 次ぎのものを含むことを特徴とする、試
料中の大腸菌（Escherichia coli）の検出用キット：ビ
ーズ；および大腸菌の一種またはそれ以上の表面抗原に
特異的な抗体の混合物または抗血清（ただし、上記一種
またはそれ以上の表面抗原の各々は、次ぎの分子量から
成るグループから選択されたいずれかの分子量を有する
ものである：21±2 KDa、26±2 KDa、31±2 KDa、36±2
KDa、38±2 KDa、67±2 KDa、および77.8±2 KDa）。 - 【請求項６】 ビーズがラテックスを含む、請求項５記
載のキット。 - 【請求項７】 さらに、エオシン−メチレンブルーを含
む組成物を含む、請求項５または６記載のキット。 - 【請求項８】 さらに、ｐ−ジメチルアミノシンナムア
ルデヒドを含む組成物を含む、請求項５〜７のいずれか
記載のキット。 - 【請求項９】 さらに、抗体の混合物で被覆されたビー
ズを凝集させることが期待される陽性抑制剤を含む、請
求項５〜８のいずれか記載のキット。 - 【請求項１０】 さらに、抗体の混合物で被覆されたビ
ーズを凝集させることが期待されない陰性抑制剤を含
む、請求項５〜９のいずれか記載のキット。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/687,626 US6689572B1 (en) | 2000-10-13 | 2000-10-13 | E. coli agglutination assay |
| JP2000317790A JP2002119297A (ja) | 2000-10-13 | 2000-10-18 | 大腸菌凝集アッセイ |
| EP00309191A EP1199567B1 (en) | 2000-10-13 | 2000-10-18 | E. coli agglutination assay |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/687,626 US6689572B1 (en) | 2000-10-13 | 2000-10-13 | E. coli agglutination assay |
| JP2000317790A JP2002119297A (ja) | 2000-10-13 | 2000-10-18 | 大腸菌凝集アッセイ |
| EP00309191A EP1199567B1 (en) | 2000-10-13 | 2000-10-18 | E. coli agglutination assay |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002119297A true JP2002119297A (ja) | 2002-04-23 |
Family
ID=32397521
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000317790A Pending JP2002119297A (ja) | 2000-10-13 | 2000-10-18 | 大腸菌凝集アッセイ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6689572B1 (ja) |
| EP (1) | EP1199567B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002119297A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| FR2928655B1 (fr) | 2008-03-14 | 2010-02-26 | Biomerieux Sa | Procede de detection en temps reel de microorganismes dans un milieu de culture liquide par lyse cellulaire. |
| FR2928656B1 (fr) | 2008-03-14 | 2011-08-26 | Biomerieux Sa | Procede de detection en temps reel de microorganismes dans un milieu de culture liquide par agglutination. |
| US9678005B1 (en) | 2008-12-03 | 2017-06-13 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Devices and methods for detection of microorganisms |
| US9562855B1 (en) | 2009-12-03 | 2017-02-07 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Devices and methods for detection of microorganisms via MIE scattering |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55115484A (en) * | 1979-02-28 | 1980-09-05 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Heterogeneous sensitizer for photosensitized oxidation |
| US5076950A (en) | 1985-12-20 | 1991-12-31 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Magnetic composition for particle separation |
| US5418140A (en) | 1993-08-10 | 1995-05-23 | Food Industry Research And Development Institute | Rapid identification of Vibrio parahaemolyticus from foods |
| US6096563A (en) * | 1996-03-29 | 2000-08-01 | Strategic Diagnostics Inc. | Dual particle immunoassay method and kit |
| JP2000516805A (ja) | 1996-08-02 | 2000-12-19 | デパートメント オブ ザ アーミー，ユー．エス．ガバメント | ＣＳ４―ＣＦＡ／Ｉファミリータンパク質を有するＥ．ｃｏｌｉを凝集させるモノクローナル抗体 |
| JPH10339731A (ja) | 1997-06-06 | 1998-12-22 | Mitsubishi Chem Corp | 腸管出血性大腸菌感染の検出方法 |
| JP3609240B2 (ja) * | 1997-08-07 | 2005-01-12 | 日東電工株式会社 | 免疫学的検査法および免疫学的検査用キット |
| US6235494B1 (en) * | 1999-02-08 | 2001-05-22 | The Scripps Research Institute | Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates |
-
2000
- 2000-10-13 US US09/687,626 patent/US6689572B1/en not_active Expired - Fee Related
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- 2000-10-18 EP EP00309191A patent/EP1199567B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP1199567B1 (en) | 2006-08-09 |
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