JPH10339731A - 腸管出血性大腸菌感染の検出方法 - Google Patents
腸管出血性大腸菌感染の検出方法Info
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- JPH10339731A JPH10339731A JP9148917A JP14891797A JPH10339731A JP H10339731 A JPH10339731 A JP H10339731A JP 9148917 A JP9148917 A JP 9148917A JP 14891797 A JP14891797 A JP 14891797A JP H10339731 A JPH10339731 A JP H10339731A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 腸管出血性大腸菌感染の簡便な検出方法を提
供する。 【解決手段】 腸管出血性大腸菌由来リポポリサッカラ
イドを担体粒子上に担持させ、この担持されたリポポリ
サッカライドと、試料中の抗リポポリサッカライド抗体
とを反応せしめ、該反応混合物の凝集の程度を測定する
ことを特徴とする方法。
供する。 【解決手段】 腸管出血性大腸菌由来リポポリサッカラ
イドを担体粒子上に担持させ、この担持されたリポポリ
サッカライドと、試料中の抗リポポリサッカライド抗体
とを反応せしめ、該反応混合物の凝集の程度を測定する
ことを特徴とする方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は腸管出血性大腸菌感
染の検出方法及びそれに用いる試薬キットに関する。
染の検出方法及びそれに用いる試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】腸管出血性大腸菌は、出血性下痢を惹起
させるベロ(Vero)毒素を産生することを特徴とするた
め、ベロ毒素産生大腸菌とも呼ばれる。この大腸菌に感
染すると、出血性大腸炎のみでなく一部の患者には続発
症として溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）による急性腎不
全や血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）を起こし、特
に幼児や老齢者にしばしば死をもたらす。
させるベロ(Vero)毒素を産生することを特徴とするた
め、ベロ毒素産生大腸菌とも呼ばれる。この大腸菌に感
染すると、出血性大腸炎のみでなく一部の患者には続発
症として溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）による急性腎不
全や血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）を起こし、特
に幼児や老齢者にしばしば死をもたらす。
【０００３】腸管出血性大腸菌の血清型は、Ｏ１５７：
Ｈ７、Ｏ１５７：ＮＭ、Ｏ２６：Ｈ１１、Ｏ９１：Ｈ２
１、Ｏ１１１：ＮＭ、Ｏ１１３：Ｈ２１、Ｏ１４５：Ｎ
Ｍ等が知られている。中でもＯ１５７：Ｈ７は、我が国
で分離頻度が最も高く、また病原性も強力であることか
ら特に重要視されている。腸管出血性大腸菌の検出率
は、抗生剤投与後ではかなり低下する。それ故、治療が
遅れると下痢症状から腎不全を呈し、そのうち１〜１０
％は溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）を続発し、そのため
透析や血漿交換などの高度医療を必要とし３〜４％は血
管の破綻等で死亡する。
Ｈ７、Ｏ１５７：ＮＭ、Ｏ２６：Ｈ１１、Ｏ９１：Ｈ２
１、Ｏ１１１：ＮＭ、Ｏ１１３：Ｈ２１、Ｏ１４５：Ｎ
Ｍ等が知られている。中でもＯ１５７：Ｈ７は、我が国
で分離頻度が最も高く、また病原性も強力であることか
ら特に重要視されている。腸管出血性大腸菌の検出率
は、抗生剤投与後ではかなり低下する。それ故、治療が
遅れると下痢症状から腎不全を呈し、そのうち１〜１０
％は溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）を続発し、そのため
透析や血漿交換などの高度医療を必要とし３〜４％は血
管の破綻等で死亡する。
【０００４】従って、腸管出血性大腸菌の感染の有無を
早期に診断し、的確な治療により溶血性尿毒症症候群
（ＨＵＳ）等の重篤な症状への移行を抑制するために
は、先ず、感染の有無を、短時間で、正確に測定するこ
とが必要である
早期に診断し、的確な治療により溶血性尿毒症症候群
（ＨＵＳ）等の重篤な症状への移行を抑制するために
は、先ず、感染の有無を、短時間で、正確に測定するこ
とが必要である
【０００５】腸管出血性大腸菌の同定には、分離株のベ
ロ毒素産生性を調べることが不可欠であるが、該大腸菌
は患者の便からのみ検出されるので、便培養がもっとも
重要な検査となる。しかし、病日がたつにつれその検出
率は低下するので、病初期のしかも抗生剤投与以前にタ
イミング良く便を採取しておくことが大切である。とこ
ろが溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）などの重症になった
時点では、便培養で１０％程度しか腸管出血性大腸菌が
分離できない。さらにベロ毒素に対する抗体は溶血性尿
毒症症候群（ＨＵＳ）に進展した患者ではなかなか高力
価では検出できない。
ロ毒素産生性を調べることが不可欠であるが、該大腸菌
は患者の便からのみ検出されるので、便培養がもっとも
重要な検査となる。しかし、病日がたつにつれその検出
率は低下するので、病初期のしかも抗生剤投与以前にタ
イミング良く便を採取しておくことが大切である。とこ
ろが溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）などの重症になった
時点では、便培養で１０％程度しか腸管出血性大腸菌が
分離できない。さらにベロ毒素に対する抗体は溶血性尿
毒症症候群（ＨＵＳ）に進展した患者ではなかなか高力
価では検出できない。
【０００６】一方、腸管出血性大腸菌由来リポポリサッ
カライド（ＬＰＳ）に対する抗体（抗ＬＰＳ抗体）は病
日７〜１０日で検出されるようになり、その抗体価は約
１ヶ月間持続する。またこの抗ＬＰＳ抗体価の上昇は、
腸管出血性大腸菌Ｏ１５７にのみ特異的である。
カライド（ＬＰＳ）に対する抗体（抗ＬＰＳ抗体）は病
日７〜１０日で検出されるようになり、その抗体価は約
１ヶ月間持続する。またこの抗ＬＰＳ抗体価の上昇は、
腸管出血性大腸菌Ｏ１５７にのみ特異的である。
【０００７】血中の抗腸管出血性大腸菌由来ＬＰＳ抗体
を測定する方法として、Bitzan M.ら(Bitzan M. and Ka
rch H., J. Clin. Microbiol., 30, 1174-1178, 1992)
により赤血球凝集法が報告されている。腸管出血性大腸
菌Ｏ１５７由来ＬＰＳをヒツジ赤血球に被覆させ、溶血
性尿毒症症候群（ＨＵＳ）の診断を行おうとするもので
ある。しかし、この方法では判定までに３時間を要すと
いう問題点がある。またGreatorx, J.ら(Greatorx, J.
and G. M.Thorne, J. Clin. Microbiol., 32,1172-117
8,1994)により酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が報告さ
れているが、操作が煩雑であること、判定までに数時間
を必要とすること、カットオフの設定が明確でないな
ど、反応、測定に関して問題を有している。
を測定する方法として、Bitzan M.ら(Bitzan M. and Ka
rch H., J. Clin. Microbiol., 30, 1174-1178, 1992)
により赤血球凝集法が報告されている。腸管出血性大腸
菌Ｏ１５７由来ＬＰＳをヒツジ赤血球に被覆させ、溶血
性尿毒症症候群（ＨＵＳ）の診断を行おうとするもので
ある。しかし、この方法では判定までに３時間を要すと
いう問題点がある。またGreatorx, J.ら(Greatorx, J.
and G. M.Thorne, J. Clin. Microbiol., 32,1172-117
8,1994)により酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が報告さ
れているが、操作が煩雑であること、判定までに数時間
を必要とすること、カットオフの設定が明確でないな
ど、反応、測定に関して問題を有している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、分析時間が
短く、簡便で、正確かつ感度の高い腸管出血性大腸菌感
染の検出方法の提供を目的としてなされたものである。
短く、簡便で、正確かつ感度の高い腸管出血性大腸菌感
染の検出方法の提供を目的としてなされたものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく検討を重ねた結果、腸管出血性大腸菌由来
のリポポリサッカライドを担持させたラッテクス粒子の
凝集反応を用いれば、迅速、正確で高感度に腸管出血性
大腸菌感染が検出可能なことを見いだし、本発明を完成
するに至った。
を解決すべく検討を重ねた結果、腸管出血性大腸菌由来
のリポポリサッカライドを担持させたラッテクス粒子の
凝集反応を用いれば、迅速、正確で高感度に腸管出血性
大腸菌感染が検出可能なことを見いだし、本発明を完成
するに至った。
【００１０】即ち、本発明は、腸管出血性大腸菌由来リ
ポポリサッカライドを担体粒子上に担持させ、この担持
されたリポポリサッカライドと、試料中の抗リポポリサ
ッカライド抗体とを反応せしめ、該反応混合物の凝集の
程度を測定することを特徴とする腸管出血性大腸菌感染
の検出方法である。この発明の好ましい態様によれば、
担体粒子がラテックス粒子である上記方法が提供され
る。
ポポリサッカライドを担体粒子上に担持させ、この担持
されたリポポリサッカライドと、試料中の抗リポポリサ
ッカライド抗体とを反応せしめ、該反応混合物の凝集の
程度を測定することを特徴とする腸管出血性大腸菌感染
の検出方法である。この発明の好ましい態様によれば、
担体粒子がラテックス粒子である上記方法が提供され
る。
【００１１】また、本発明の別の態様により、少なくと
も、腸管出血性大腸菌由来リポポリサッカライドが担持
された担体粒子よりなり、この担持されたリポポリサッ
カライドと、試料中の抗リポポリサッカライド抗体とを
反応せしめ、該反応混合物の凝集の程度を測定すること
を特徴とする腸管出血性大腸菌感染の検出に用いるため
の試薬キットが提供される。
も、腸管出血性大腸菌由来リポポリサッカライドが担持
された担体粒子よりなり、この担持されたリポポリサッ
カライドと、試料中の抗リポポリサッカライド抗体とを
反応せしめ、該反応混合物の凝集の程度を測定すること
を特徴とする腸管出血性大腸菌感染の検出に用いるため
の試薬キットが提供される。
【００１２】更に、本発明の別の態様により、腸管出血
性大腸菌由来リポポリサッカライドが担持された担体粒
子が提供される。
性大腸菌由来リポポリサッカライドが担持された担体粒
子が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明す
る。本発明で用いる担体粒子としては、リポポリサッカ
ライドを担持しうるものであれば特に制限されないが、
通常、試料溶液に不溶性の有機高分子物質又は無機物質
よりなる微粒子が使用される。かかる有機高分子物質よ
りなる微粒子としては、ポリスチレン、スチレン−マレ
イン酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、ア
クリル酸−スチレンの共重合体、スチレン−アクリル酸
−アクリルアクリレート共重合体、酢酸ビニル−アクリ
ル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリア
クリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル等の合成
ポリマーよりなるラテックス粒子が例示できる。また、
無機物質よりなる微粒子としては、ガラス、シリカ、ア
ルミナ、シリカ−アルミナ、活性炭、カーボン等よりな
るものが例示できる。これらの中で、特にポリスチレン
ラッテクス粒子が好ましい。また、担体粒子の直径は、
０．１〜１０μｍのものが使用可能であるが、通常、
０．１〜１μｍの範囲内が好ましい。
る。本発明で用いる担体粒子としては、リポポリサッカ
ライドを担持しうるものであれば特に制限されないが、
通常、試料溶液に不溶性の有機高分子物質又は無機物質
よりなる微粒子が使用される。かかる有機高分子物質よ
りなる微粒子としては、ポリスチレン、スチレン−マレ
イン酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、ア
クリル酸−スチレンの共重合体、スチレン−アクリル酸
−アクリルアクリレート共重合体、酢酸ビニル−アクリ
ル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリア
クリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル等の合成
ポリマーよりなるラテックス粒子が例示できる。また、
無機物質よりなる微粒子としては、ガラス、シリカ、ア
ルミナ、シリカ−アルミナ、活性炭、カーボン等よりな
るものが例示できる。これらの中で、特にポリスチレン
ラッテクス粒子が好ましい。また、担体粒子の直径は、
０．１〜１０μｍのものが使用可能であるが、通常、
０．１〜１μｍの範囲内が好ましい。
【００１４】上記担体粒子に担持するリポポリサッカラ
イド（ＬＰＳ）としては、腸管出血性大腸菌由来のもの
であり、感染者の血清中に存在する抗腸管出血性大腸菌
リポポリサッカライド抗体と反応しうるものであれば特
に制限はない。このリポポリサッカライド（ＬＰＳ）
は、腸管出血性大腸菌から、例えば、Westphal, V.らの
フェノールホットウォーター法（Westphal, V. and K.
Jaun. Methos Carbohydr. Chem. 5 : 83-91, 1965）に
より次の通り調製することができる。
イド（ＬＰＳ）としては、腸管出血性大腸菌由来のもの
であり、感染者の血清中に存在する抗腸管出血性大腸菌
リポポリサッカライド抗体と反応しうるものであれば特
に制限はない。このリポポリサッカライド（ＬＰＳ）
は、腸管出血性大腸菌から、例えば、Westphal, V.らの
フェノールホットウォーター法（Westphal, V. and K.
Jaun. Methos Carbohydr. Chem. 5 : 83-91, 1965）に
より次の通り調製することができる。
【００１５】上記大腸菌の乾燥菌体あるいは湿菌体を約
６５〜６８℃の温水に浮かべ、これに約６８℃に加温し
た９０％フェノールを等量加え、約３０分攪拌する。約
４℃に冷却後、遠心し、水層を分離する。フェノール層
に再び純水を加えて約６０℃に加温、約３０分攪拌し、
冷却後遠心し水層を分離する。２回の水層をあわせ流水
で一晩透析する。透析後、遠心し、上清を採取する。こ
れに少量（５〜１０ｍｇ）の酢酸ソーダを添加後、エタ
ノールを加えることにより、白色の沈殿物を得る。沈殿
物をエタノールで、ついでアセトンでそれぞれ洗浄を行
い、さらに沈殿物を１％の割合で純粋に溶解して超遠心
を行い、沈さとして粗毒素（リポポリサッカライド）を
得る。
６５〜６８℃の温水に浮かべ、これに約６８℃に加温し
た９０％フェノールを等量加え、約３０分攪拌する。約
４℃に冷却後、遠心し、水層を分離する。フェノール層
に再び純水を加えて約６０℃に加温、約３０分攪拌し、
冷却後遠心し水層を分離する。２回の水層をあわせ流水
で一晩透析する。透析後、遠心し、上清を採取する。こ
れに少量（５〜１０ｍｇ）の酢酸ソーダを添加後、エタ
ノールを加えることにより、白色の沈殿物を得る。沈殿
物をエタノールで、ついでアセトンでそれぞれ洗浄を行
い、さらに沈殿物を１％の割合で純粋に溶解して超遠心
を行い、沈さとして粗毒素（リポポリサッカライド）を
得る。
【００１６】上記リポポリサッカライドの担体粒子への
担持は、それ自体既知の通常用いられる方法、例えば、
担体粒子とリポポリサッカライドとを混合することによ
って起こる物理的な吸着を用いる物理吸着法、カルボジ
イミドなどのカップリング剤により、ラテックス粒子表
面のカルボキシル基やアミノ基とリポポリサッカライド
とを化学的に結合させる化学結合法等により容易に行え
る。また、リポポリサッカライドをスペーサー分子を介
してラテックス粒子に結合させてもよい。さらに、アル
ブミンなどのタンパク質に化学結合法を用いて結合させ
た後に、そのタンパク質を担体粒子に結合させても良
い。
担持は、それ自体既知の通常用いられる方法、例えば、
担体粒子とリポポリサッカライドとを混合することによ
って起こる物理的な吸着を用いる物理吸着法、カルボジ
イミドなどのカップリング剤により、ラテックス粒子表
面のカルボキシル基やアミノ基とリポポリサッカライド
とを化学的に結合させる化学結合法等により容易に行え
る。また、リポポリサッカライドをスペーサー分子を介
してラテックス粒子に結合させてもよい。さらに、アル
ブミンなどのタンパク質に化学結合法を用いて結合させ
た後に、そのタンパク質を担体粒子に結合させても良
い。
【００１７】担体粒子へのリポポリサッカライドの担持
量に特に制限はないが、ラッテクス粒子の場合、通常、
ラッテクス１ｍｌに対して０．０２〜２ｍｇ、好ましく
は０．０７５〜０．４ｍｇが適当である。
量に特に制限はないが、ラッテクス粒子の場合、通常、
ラッテクス１ｍｌに対して０．０２〜２ｍｇ、好ましく
は０．０７５〜０．４ｍｇが適当である。
【００１８】かくして得られるリポポリサッカライドを
担持させた担体粒子と、血液や血清等の試料溶液とを混
合し、試料中の抗腸管出血性大腸菌由来リポポリサッカ
ライド抗体と担体粒子に担持されたリポポリサッカライ
ドとを反応せしめ、反応によって生じる担体粒子の凝集
の程度を測定し、試料中の上記抗体の存在又は濃度を検
出し、腸管出血性大腸菌の感染の有無を判定する。
担持させた担体粒子と、血液や血清等の試料溶液とを混
合し、試料中の抗腸管出血性大腸菌由来リポポリサッカ
ライド抗体と担体粒子に担持されたリポポリサッカライ
ドとを反応せしめ、反応によって生じる担体粒子の凝集
の程度を測定し、試料中の上記抗体の存在又は濃度を検
出し、腸管出血性大腸菌の感染の有無を判定する。
【００１９】上記反応は、通常、スライド板上、又はプ
ラスチックセル若しくはガラスセル内で行われる。スラ
イド板上で反応を行う場合、担体粒子の凝集程度は目視
により測定すれば良い。セル内での反応の場合、セル外
部より可視光から近赤外域の光、例えば、通常４００〜
２４００ｎｍ、好ましくは６００〜１０００ｎｍの波長
の光を照射し、吸光度変化又は散乱光の強度変化を検出
して担体粒子の凝集の程度を測定する。この場合、予め
作成した検量線を用いれば、試料内の抗体量（濃度）が
算出できる。
ラスチックセル若しくはガラスセル内で行われる。スラ
イド板上で反応を行う場合、担体粒子の凝集程度は目視
により測定すれば良い。セル内での反応の場合、セル外
部より可視光から近赤外域の光、例えば、通常４００〜
２４００ｎｍ、好ましくは６００〜１０００ｎｍの波長
の光を照射し、吸光度変化又は散乱光の強度変化を検出
して担体粒子の凝集の程度を測定する。この場合、予め
作成した検量線を用いれば、試料内の抗体量（濃度）が
算出できる。
【００２０】このような凝集測定を行う装置として、三
菱化学株式会社のＬＰＩＡ−Ｓ５００ラテックス凝集全
自動測定器、ロシュ・ダイアグノスティック・システム
ズ社のＣＯＢＡＳ ＦＡＲＡ装置及びＣＯＢＡＳ ＭＩ
ＲＡ装置、及び日立製作所の日立７０７０分析装置等が
あげられる。
菱化学株式会社のＬＰＩＡ−Ｓ５００ラテックス凝集全
自動測定器、ロシュ・ダイアグノスティック・システム
ズ社のＣＯＢＡＳ ＦＡＲＡ装置及びＣＯＢＡＳ ＭＩ
ＲＡ装置、及び日立製作所の日立７０７０分析装置等が
あげられる。
【００２１】また、上記担体粒子の凝集反応は、通常、
生理的食塩水、ｐＨ５．０〜１０．０程度の適当な緩衝
液、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝
液等の溶液中で行われる。また、担体粒子と試料中のタ
ンパク質との非特異的結合を抑制するために、適当な界
面活性剤、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅ
ｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０等の吸着抑制剤を反応液に添加
してもよい。
生理的食塩水、ｐＨ５．０〜１０．０程度の適当な緩衝
液、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝
液等の溶液中で行われる。また、担体粒子と試料中のタ
ンパク質との非特異的結合を抑制するために、適当な界
面活性剤、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅ
ｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０等の吸着抑制剤を反応液に添加
してもよい。
【００２２】上記反応及び測定工程等を含む腸管出血性
大腸菌感染の検出に用いるための試薬キットは、それ自
体既知の通常用いられる方法により調製できる。このよ
うなキットは、通常の免疫凝集反応を利用したキットと
同様の構成によって提供される。すなわち、本発明の試
薬キットは、少くとも、腸管出血性大腸菌由来リポポリ
サッカライドが担持された担体粒子を含み、さらに任意
の要素として、試料希釈液、標準物質等を含む。
大腸菌感染の検出に用いるための試薬キットは、それ自
体既知の通常用いられる方法により調製できる。このよ
うなキットは、通常の免疫凝集反応を利用したキットと
同様の構成によって提供される。すなわち、本発明の試
薬キットは、少くとも、腸管出血性大腸菌由来リポポリ
サッカライドが担持された担体粒子を含み、さらに任意
の要素として、試料希釈液、標準物質等を含む。
【００２３】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。実施例１ 大腸菌Ｏ１５７由来ＬＰＳ結合ラテックス試
薬の調製 ＜１＞大腸菌Ｏ１５７由来ＬＰＳの調製 腸管出血性大腸菌の中でも、患者からの検出率が最も高
かったベロ毒素産生大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株由来ＬＰＳ
を用いて検討を行った。大腸菌Ｏ１５７由来ＬＰＳは、
Westphal, V.ら（Westphal, V. and K. Jaun. Methos C
arbohydr. Chem. 5 : 83-91, 1965）のフェノールホッ
トウォーター法に従って次の通り調製した。
説明する。実施例１ 大腸菌Ｏ１５７由来ＬＰＳ結合ラテックス試
薬の調製 ＜１＞大腸菌Ｏ１５７由来ＬＰＳの調製 腸管出血性大腸菌の中でも、患者からの検出率が最も高
かったベロ毒素産生大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株由来ＬＰＳ
を用いて検討を行った。大腸菌Ｏ１５７由来ＬＰＳは、
Westphal, V.ら（Westphal, V. and K. Jaun. Methos C
arbohydr. Chem. 5 : 83-91, 1965）のフェノールホッ
トウォーター法に従って次の通り調製した。
【００２４】湿菌体４０ｇを約６８℃の温水３５０ｍＬ
に浮かべ、これに６８℃に加温した９０％フェノールを
等量加え、約３０分攪拌する。４℃に冷却後、遠心し、
水層を分離する。フェノール層に再び３００ｍＬの純水
を加え、６０℃に加温、約３０分攪拌する。同様に４℃
に冷却、遠心し、水層を分離する。２回の水層をあわせ
て、透析膜に入れ、流水で一晩透析する。透析後、遠心
し、上清を採取する。これに少量（５〜１０ｍｇ）の酢
酸ソーダを添加後、エタノールを１０倍量加えることに
より、白色の沈殿物を得る。沈殿物は遠心で回収し、さ
らにエタノールで、ついでアセトンでそれぞれ１回ずつ
遠心洗浄を行い、粗毒素（ＬＰＳ）を得る。この粗毒素
は、かなりの量の核酸が混入しているので、それを除去
するために粗毒素を１％の割で純水にとかし、超遠心
（１００，０００×ｇ、１時間）にて沈さを得る。沈さ
を再度純水に溶解し、遠心する。得られた沈さは少量の
純水にとかし、凍結乾燥を行って精製内毒素（収量２〜
５％）を得る。この方法で得られた大腸菌Ｏ１５７由来
ＬＰＳを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて透析
して以下のラテックス試薬の調製に用いた。
に浮かべ、これに６８℃に加温した９０％フェノールを
等量加え、約３０分攪拌する。４℃に冷却後、遠心し、
水層を分離する。フェノール層に再び３００ｍＬの純水
を加え、６０℃に加温、約３０分攪拌する。同様に４℃
に冷却、遠心し、水層を分離する。２回の水層をあわせ
て、透析膜に入れ、流水で一晩透析する。透析後、遠心
し、上清を採取する。これに少量（５〜１０ｍｇ）の酢
酸ソーダを添加後、エタノールを１０倍量加えることに
より、白色の沈殿物を得る。沈殿物は遠心で回収し、さ
らにエタノールで、ついでアセトンでそれぞれ１回ずつ
遠心洗浄を行い、粗毒素（ＬＰＳ）を得る。この粗毒素
は、かなりの量の核酸が混入しているので、それを除去
するために粗毒素を１％の割で純水にとかし、超遠心
（１００，０００×ｇ、１時間）にて沈さを得る。沈さ
を再度純水に溶解し、遠心する。得られた沈さは少量の
純水にとかし、凍結乾燥を行って精製内毒素（収量２〜
５％）を得る。この方法で得られた大腸菌Ｏ１５７由来
ＬＰＳを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて透析
して以下のラテックス試薬の調製に用いた。
【００２５】＜２＞大腸菌Ｏ１５７由来ＬＰＳのラテッ
クスへの担持 得られた大腸菌Ｏ１５７由来ＬＰＳを平均粒径０．４７
μｍのポリスチレンラテックス（セラダイン社製）表面
に以下の方法により固定（担持）し、ラテックス試薬と
した。１％、１ｍＬのラテックス溶液にカップリング剤
として４ｍｇのカルボジイミドを加え３０分間室温にて
反応を行った。遠心後、沈さを０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に懸濁し、ここに０．１ｍｇの大腸菌Ｏ
１５７由来ＬＰＳを加え室温にて１時間反応を行った。
遠心後、０．３％ウシアルブミンにて３０分間ブロッキ
ングを行い、遠心後、蒸留水に懸濁させラテックス試薬
とした。
クスへの担持 得られた大腸菌Ｏ１５７由来ＬＰＳを平均粒径０．４７
μｍのポリスチレンラテックス（セラダイン社製）表面
に以下の方法により固定（担持）し、ラテックス試薬と
した。１％、１ｍＬのラテックス溶液にカップリング剤
として４ｍｇのカルボジイミドを加え３０分間室温にて
反応を行った。遠心後、沈さを０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に懸濁し、ここに０．１ｍｇの大腸菌Ｏ
１５７由来ＬＰＳを加え室温にて１時間反応を行った。
遠心後、０．３％ウシアルブミンにて３０分間ブロッキ
ングを行い、遠心後、蒸留水に懸濁させラテックス試薬
とした。
【００２６】実施例２ 抗大腸菌Ｏ１５７由来ＬＰＳ抗
体のスライド判定法 生理食塩水もしくは正常ヒト血清とウサギ抗ＬＰＳ抗血
清をＢＳＡ含有トリス−塩酸緩衝液にて２０倍希釈し、
それぞれ陰性コントロールと陽性コントロールとした。
被検体としては患者血清を用いＢＳＡ含有トリス−塩酸
緩衝液にて同様に希釈した。
体のスライド判定法 生理食塩水もしくは正常ヒト血清とウサギ抗ＬＰＳ抗血
清をＢＳＡ含有トリス−塩酸緩衝液にて２０倍希釈し、
それぞれ陰性コントロールと陽性コントロールとした。
被検体としては患者血清を用いＢＳＡ含有トリス−塩酸
緩衝液にて同様に希釈した。
【００２７】スライド板上に、上記コントロールもしく
は被検体１００μＬを滴下し、実施例１で得られたラテ
ックス試薬３５μＬを加えスライド板上で混和し、３分
後にラテックス粒子凝集塊の生成を肉眼により観察し
た。
は被検体１００μＬを滴下し、実施例１で得られたラテ
ックス試薬３５μＬを加えスライド板上で混和し、３分
後にラテックス粒子凝集塊の生成を肉眼により観察し
た。
【００２８】被検体はさらに酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）
にて測定を行った。酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）は以下の
ように実施した。９６穴イムノプレート（ｐｏｌｙｓｏ
ｒｐ、ＮＵＮＣ社）にＰＢＳで１μｇ／ｍＬ希釈した大
腸菌Ｏ１５７由来ＬＰＳを１００μＬずつ分注し、３７
℃で２時間インキュベーションを行った。０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、０．
１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３７℃１時間ブロッキン
グを行った。３回の洗浄後、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ
にて４００倍に希釈した検体を１００μＬずつ添加し、
３７℃で１時間インキュベーションを行った。３回の洗
浄後、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴにて２５００倍希釈し
たＨＲＰ標識抗ＩｇＭ抗体を１００μＬずつ分注し３７
℃で３０分インキュベーションを行った。３回の洗浄
後、基質溶液（ＯＰＤ錠／クエン酸緩衝液／過酸化水素
水）を１００μＬずつ分注し、室温で５分間インキュベ
ーションを行った。反応停止液（２Ｎ硫酸溶液）１００
μＬを分注した後、イムノリーダー（波長４９２ｎｍ）
にて吸光度の測定を行った。
にて測定を行った。酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）は以下の
ように実施した。９６穴イムノプレート（ｐｏｌｙｓｏ
ｒｐ、ＮＵＮＣ社）にＰＢＳで１μｇ／ｍＬ希釈した大
腸菌Ｏ１５７由来ＬＰＳを１００μＬずつ分注し、３７
℃で２時間インキュベーションを行った。０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、０．
１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３７℃１時間ブロッキン
グを行った。３回の洗浄後、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ
にて４００倍に希釈した検体を１００μＬずつ添加し、
３７℃で１時間インキュベーションを行った。３回の洗
浄後、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳＴにて２５００倍希釈し
たＨＲＰ標識抗ＩｇＭ抗体を１００μＬずつ分注し３７
℃で３０分インキュベーションを行った。３回の洗浄
後、基質溶液（ＯＰＤ錠／クエン酸緩衝液／過酸化水素
水）を１００μＬずつ分注し、室温で５分間インキュベ
ーションを行った。反応停止液（２Ｎ硫酸溶液）１００
μＬを分注した後、イムノリーダー（波長４９２ｎｍ）
にて吸光度の測定を行った。
【００２９】大腸菌Ｏ１５７感染の疑われた患者血清１
７検体を測定した結果、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
とラテックススライド法のいずれも陽性を示したのは１
６検体、いずれも陰性を示したものは１検体であり、１
００％の一致率を示した。
７検体を測定した結果、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
とラテックススライド法のいずれも陽性を示したのは１
６検体、いずれも陰性を示したものは１検体であり、１
００％の一致率を示した。
【００３０】実施例３ 抗大腸菌Ｏ１５７由来ＬＰＳ抗
体の自動測定 上記患者血清１７検体を用いて検討を行った。生理食塩
水で４０倍に希釈された検体１０μＬ、ＢＳＡ含有トリ
ス−塩酸緩衝液１８０μＬ、実施例１で得られたラテッ
クス試薬８０μＬを混合し反応キュベットに自動分注
後、近赤外（８００ｎｍ）の吸収の増加を１０分間測定
することにより免疫反応を観察した。測定はラテックス
凝集全自動測定装置ＬＰＩＡ−Ｓ５００を用いて行っ
た。
体の自動測定 上記患者血清１７検体を用いて検討を行った。生理食塩
水で４０倍に希釈された検体１０μＬ、ＢＳＡ含有トリ
ス−塩酸緩衝液１８０μＬ、実施例１で得られたラテッ
クス試薬８０μＬを混合し反応キュベットに自動分注
後、近赤外（８００ｎｍ）の吸収の増加を１０分間測定
することにより免疫反応を観察した。測定はラテックス
凝集全自動測定装置ＬＰＩＡ−Ｓ５００を用いて行っ
た。
【００３１】実施例２で行った酵素免疫測定法（ＥＬＩ
ＳＡ）とラテックス試薬（ＬＰＩＡ−Ｓ５００）にて患
者血清１７検体を測定した結果を図１に示す。横軸にＥ
ＬＩＳＡの吸光度を、縦軸にＬＰＩＡ−Ｓ５００の吸光
度の単位時間あたりの変化率をプロットすると、２法の
間に正の相関が認められた。
ＳＡ）とラテックス試薬（ＬＰＩＡ−Ｓ５００）にて患
者血清１７検体を測定した結果を図１に示す。横軸にＥ
ＬＩＳＡの吸光度を、縦軸にＬＰＩＡ−Ｓ５００の吸光
度の単位時間あたりの変化率をプロットすると、２法の
間に正の相関が認められた。
【００３２】
【発明の効果】本発明方法によれば、血清中の抗腸管出
血性大腸菌リポポリサッカライド抗体の存在の有無を短
時間、簡便、かつ正確に測定することができ、その結果
に基づき腸管出血性大腸菌感染の有無を検出できる。上
記特徴を有する本発明の方法は、従来の菌培養検出法の
ように患者の糞便を試料とするのとは異なり、患者の血
清を試料とするために検体も扱いやすく、特に優れた腸
管出血性大腸菌の検出方法であるといえる。
血性大腸菌リポポリサッカライド抗体の存在の有無を短
時間、簡便、かつ正確に測定することができ、その結果
に基づき腸管出血性大腸菌感染の有無を検出できる。上
記特徴を有する本発明の方法は、従来の菌培養検出法の
ように患者の糞便を試料とするのとは異なり、患者の血
清を試料とするために検体も扱いやすく、特に優れた腸
管出血性大腸菌の検出方法であるといえる。
【００３３】
【図１】酵素免疫測定法にて抗体価を測定した腸管出血
性大腸菌感染患者血清１７検体について、該検体を生理
食塩水にて４０倍希釈し、全自動凝集測定装置ＬＰＩＡ
−Ｓ５００にて測定した結果を示す図である。
性大腸菌感染患者血清１７検体について、該検体を生理
食塩水にて４０倍希釈し、全自動凝集測定装置ＬＰＩＡ
−Ｓ５００にて測定した結果を示す図である。
Claims (4)
- 【請求項１】 腸管出血性大腸菌由来リポポリサッカラ
イドを担体粒子上に担持させ、この担持されたリポポリ
サッカライドと、試料中の抗リポポリサッカライド抗体
とを反応せしめ、該反応混合物の凝集の程度を測定する
ことを特徴とする腸管出血性大腸菌感染の検出方法。 - 【請求項２】 担体粒子がラテックス粒子である請求項
１に記載の方法。 - 【請求項３】 少なくとも、腸管出血性大腸菌由来リポ
ポリサッカライドが担持された担体粒子よりなり、この
担持されたリポポリサッカライドと、試料中の抗リポポ
リサッカライド抗体とを反応せしめ、該反応混合物の凝
集の程度を測定することを特徴とする腸管出血性大腸菌
感染の検出に用いるための試薬キット。 - 【請求項４】 腸管出血性大腸菌由来リポポリサッカラ
イドが担持された担体粒子。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9148917A JPH10339731A (ja) | 1997-06-06 | 1997-06-06 | 腸管出血性大腸菌感染の検出方法 |
| PCT/JP1998/002483 WO1998055871A1 (en) | 1997-06-06 | 1998-06-04 | METHOD FOR DETECTING INFECTION WITH ENTEROHEMORRHAGIC $i(ESCHERICHIA COLI) |
| EP98923129A EP0990902A4 (en) | 1997-06-06 | 1998-06-04 | METHOD FOR DETECTING INFECTION WITH ENTEROHAEMORAGIC ESCHERICHIA COLI |
| US09/445,090 US20010044125A1 (en) | 1997-06-06 | 1998-06-04 | Method for detecting infection with enterohemorrhagic escherichia coli |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9148917A JPH10339731A (ja) | 1997-06-06 | 1997-06-06 | 腸管出血性大腸菌感染の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10339731A true JPH10339731A (ja) | 1998-12-22 |
Family
ID=15463556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9148917A Pending JPH10339731A (ja) | 1997-06-06 | 1997-06-06 | 腸管出血性大腸菌感染の検出方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20010044125A1 (ja) |
| EP (1) | EP0990902A4 (ja) |
| JP (1) | JPH10339731A (ja) |
| WO (1) | WO1998055871A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007256214A (ja) * | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Akita Univ | 下痢原性大腸菌感染症の判別に用いられる固相等 |
| JP2008304275A (ja) * | 2007-06-06 | 2008-12-18 | Denka Seiken Co Ltd | 新規な免疫凝集測定法 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU4186701A (en) * | 2000-03-01 | 2001-09-12 | Binax Inc | Method for detecting the presence of target bacteria or a target component carbohydrate antigen thereof |
| US6689572B1 (en) | 2000-10-13 | 2004-02-10 | Executive Yuan, Council Of Agriculture | E. coli agglutination assay |
| GB0321508D0 (en) * | 2003-09-13 | 2003-10-15 | Secr Defence | Antibody-based identification of bacterial phenotypes |
| US7387883B2 (en) * | 2003-12-09 | 2008-06-17 | Biomerieux, Inc | Methods for detecting bacterial pathogens |
| US7429464B2 (en) * | 2003-12-09 | 2008-09-30 | Biomerieux, Inc. | Methods for detecting bacterial pathogens |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI69639C (fi) * | 1982-07-02 | 1986-03-10 | Orion Yhtymae Oy | Preparat foer anvaendning vid klamydia-diagnostik |
| JPH0810223B2 (ja) * | 1987-03-17 | 1996-01-31 | 日東電工株式会社 | 診断薬用ラテツクス、その製法および該ラテツクスを用いてなる診断薬 |
| JP2922325B2 (ja) * | 1991-03-29 | 1999-07-19 | 三井化学株式会社 | 診断薬用担体ラテックス |
| JP2545707B2 (ja) * | 1995-01-04 | 1996-10-23 | 日東電工株式会社 | 免疫学的診断試薬 |
-
1997
- 1997-06-06 JP JP9148917A patent/JPH10339731A/ja active Pending
-
1998
- 1998-06-04 WO PCT/JP1998/002483 patent/WO1998055871A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1998-06-04 US US09/445,090 patent/US20010044125A1/en not_active Abandoned
- 1998-06-04 EP EP98923129A patent/EP0990902A4/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007256214A (ja) * | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Akita Univ | 下痢原性大腸菌感染症の判別に用いられる固相等 |
| JP2008304275A (ja) * | 2007-06-06 | 2008-12-18 | Denka Seiken Co Ltd | 新規な免疫凝集測定法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0990902A1 (en) | 2000-04-05 |
| EP0990902A4 (en) | 2002-07-31 |
| US20010044125A1 (en) | 2001-11-22 |
| WO1998055871A1 (en) | 1998-12-10 |
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