JP4907399B2 - 血中腸型脂肪酸結合蛋白測定による急性腸炎の検出方法 - Google Patents
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Description
したがって、医療現場においては、急性腸炎を迅速かつ簡便に判定する方法の確立が望まれている。
しかしながら、いずれの場合も正常時のI−FABP濃度に比べて著しく高いI−FABP濃度を示す場合の病態を観察しており、血中I−FABPの濃度変化と疾患の重篤度が関連付けられたものではない。また、急性腸炎の発症によって血液中のI−FABP濃度が上昇することは開示されていない。
また、本発明者らは、急性腸炎とは診断されない腹痛や下痢の患者の血中I−FABP濃度は健常人の血中のI−FABP濃度と差が認められないことを明らかにした。更に、血中のI−FABP濃度は、急性腸炎患者において既存の炎症の診断マーカーであるCRPや白血球数よりも高い有病正診率を示すことを明らかにした。これらの結果、およびI−FABPが小腸粘膜上皮にしか存在しないという臓器特異性から、血中のI−FABP濃度を測定することにより迅速かつ簡便に、そして正確に急性腸炎を判定することができることを見出して、本発明を完成した。
[1]急性腸炎の検出及び急性腸炎の重症度の定量的な評価のための方法であって、哺乳動物から分離された血液中の腸型脂肪酸結合蛋白(I−FABP)の濃度を測定し、該I−FABPの濃度が急性腸炎の重症度の指標となることを特徴とする方法、
[2]哺乳動物がヒトである上記[1]記載の方法、
[3]血液中のI−FABPの検出を免疫化学的方法により行なう上記[1]または[2]記載の方法、
[4]免疫化学的方法が酵素免疫化学的方法、ラテックス凝集法または免疫クロマト法のいずれかである上記[3]記載の方法、
[5]免疫化学的方法が酵素免疫化学的方法である上記[4]記載の方法、
[6]酵素免疫化学的方法がサンドイッチ型酵素免疫測定法である上記[5]記載の方法、
[7]急性腸炎が感染性の急性腸炎または薬剤の影響による急性腸炎である上記[1]〜[6]のいずれかに記載の方法、
[8]上記[1]〜[7]のいずれか1項に記載の方法を実施するための抗I−FABP抗体を含む急性腸炎の判定用試薬、
[9]請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法を実施するための固相化抗I−FABP抗体及び酵素標識抗I−FABP抗体を含む急性腸炎の判定用試薬、
[10]抗体が抗ヒトI−FABP抗体である上記[8]または[9]記載の急性腸炎の検出及び急性腸炎の重症度の定量的な評価用試薬、
[11]抗体がモノクローナル抗体である上記[8]〜[10]のいずれかに記載の急性腸炎の判定用試薬、
[12]急性腸炎が感染性の急性腸炎または薬剤の影響による急性腸炎である上記[8]〜[11]のいずれかに記載の急性腸炎の判定用試薬、
[13]上記[8]〜[12]のいずれかに記載の急性腸炎の判定用試薬及び該試薬に関する記載物を含む商業パッケージであって、該記載物および/または該パッケージに、該試薬は急性腸炎の判定の用途に使用できる、または使用すべきであることが記載されている商業パッケージ。
以下に具体例を挙げて詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの具体例により何ら制限されるものではない。
(A)[ウサギ抗ラットI−FABPポリクローナル抗体の取得]
以下の手順で抗ラットI−FABPポリクローナル抗体を取得した。
60匹のSDラット(雄)より小腸粘膜を採取し、1mmol/L EDTAを含む0.1mol/L トリス塩酸緩衝液(pH7.4)にてホモジネート抽出後、Sephadex G−75,DEAE−cellulose及びHydroxyapatiteカラムで精製し、15mgの精製ラットI−FABPを得た。これを抗原とし、ウサギに免疫した。使用抗原量は、初回は100μg、2回目以降は50μgであり、Freund’s adjuvantに懸濁して使用した。ゲル二重免疫拡散法で当該ウサギ血清の抗体力価を確認した後、全採血を行い、3000rpm×10分間の遠心分離により抗血清を得た。
前項(A)で取得した抗ラットI−FABPポリクローナル抗体を用いてサンドイッチ型酵素免疫測定法によるラット血中I−FABP濃度測定を行った。
以下の手順により、ラットI−FABP測定の標準曲線を作成した。
精製ラットI−FABPを適宜希釈して、各種濃度のラットI−FABP溶液を調製した。そして、この希釈した標準溶液をそれぞれ100μLずつ固相化抗ラットI−FABP抗体結合ウェルに加えてから、ミキサーにて攪拌し、37℃で一定時間インキュベーションを行った。その後、ELISA用ウォッシャーを用いて各ウェルから反応液を除去するとともに、各ウェルに洗浄原液を希釈して調製した洗浄液0.3mLを加えて洗浄した。この洗浄の操作を3回繰り返した後、ウェル中に残った洗浄液をペーパータオル等により除去した。
[急性腸炎ラット実験モデルにおける血液中のI−FABPの測定]
SDラット(雄)を麻酔下に開腹し、15cmの空腸結紮ループを作製した。そして、コントロール群(n=8)、V.cholerae群(n=8)、Cl.difficile群(n=8)の3群に分け、V.cholerae群にはCholerae毒素30μgを、Cl.difficile群にはDifficileA毒素5×219CU(Cytotoxic Unit)をそれぞれ生理食塩水に溶解し、ループ内に注入した。閉腹後2、4、6、8時間後に採血し、血清中のI−FABP値を実施例1記載の抗ラットI−FABPポリクローナル抗体を用いたサンドイッチ型酵素免疫測定法で測定した。
測定結果を図1に示す。血清中のI−FABP値は、コントロール群では全経過を通じ10ng/mL程度であったのに対し、腸炎群では時間の経過とともに上昇し、8時間値はV.cholerae群で68.2ng/mL、Cl.difficile群で82.4ng/mLと有意な上昇を示した。
(A−1)[ウサギ抗ヒトI−FABPポリクローナル抗体の取得]
ヒトI−FABP遺伝子をバキュロウィルスにて発現させることにより得た組換え体I−FABP(recombinant I−FABP:rI−FABP)を初回のみ100μg/rabbit、二回目以降50μg/rabbitでNZWウサギ(雄)に2週間間隔で免疫した。免疫後、部分採血を行い、抗体力価上昇度を、固相化したrI−FABPとの反応性を指標に確認した。そして、麻酔下、頚動脈より全採血を行い、得られた血液を3000rpm×10分遠心分離し、血球画分を除去して抗血清を得た。得られた抗血清を硫安塩析、DEAE−cellulose精製、アフィニティ精製を行うことにより、ウサギ抗ヒトI−FABPポリクローナル抗体を取得した。
ヒトI−FABP遺伝子をバキュロウィルスにて発現させることにより得たrI−FABPを生理食塩水に溶解後、Freund’s Adjuvantに懸濁して使用した。初回のみ100μg/mouse、二回目以降50μg/mouseでBALB/cマウス(雌)に2週間間隔で免疫した。免疫後、部分採血を行い、抗血清レベルでの力価上昇度を、固相化したrI−FABPとの反応性を指標に確認した。
つぎに、抗体力価が十分に上昇したマウスの脾臓細胞を採取した。予め培養しておいたマウスミエローマと脾臓細胞を1:2〜1:10の比率となるよう混合し、PEG法により細胞融合を行った。そして、限界希釈法により融合細胞を希釈し、培養プレートに播種した。その後、37℃の炭酸ガスインキュベーター内で7〜20日間培養した。
つぎに、ハイブリドーマ培養上清を採取し、固相化したrI−FABPとの反応性を指標に力価を確認した。そして、陽性クローンの細胞を継代培養し、限界希釈法によりクローニングを行った。得られた単一コロニー由来の細胞を抗ヒトI−FABPモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとした。
つぎに、得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを大量培養した。予め腹腔内に1mLのプリスタンを投与し、2週間以上予備飼育したBALB/cマウス(雌)に対し、5×106〜2×107cells程度のハイブリドーマを投与した。そして、10〜25日飼育し、腹水の貯留を待った。その後、腹水を採取し、得られた腹水抗体を硫安塩析、DEAE−cellulose精製、アフィニティ精製を行うことにより、マウス抗ヒトI−FABPモノクローナル抗体を取得した。
以下の試薬で構成したキットを用いて、サンドイッチ型酵素免疫測定法による酵素免疫測定を行った。なお、ここでは、前項(A−2)で得たモノクローナル抗体を用いているが、(A−1)で得たポリクローナル抗体でも代用可能である。なお、以下の各試薬の内容は当該分野において使用される通常のものである。
(2)検体希釈溶液:中性付近での緩衝能を持つ蛋白性の溶液からなる。そのまま使用する。
(3)固相化抗I−FABP抗体結合ウェル:抗ヒトI−FABPモノクローナル抗体を結合させたポリスチレン製96穴マイクロプレートウェルからなる。そのまま使用する。一回の測定では1ウェルを使用する。
(4)酵素標識抗体液:西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識された酵素標識抗ヒトI−FABPモノクローナル抗体を、中性付近での緩衝能を持ち、防腐剤等を添加した蛋白性の溶液にて使用濃度に希釈したものからなる。そのまま使用する。一回の測定では希釈前の原液を10μL使用する。
(5)洗浄液:緩衝液成分からなる。洗浄効果を高めるため、界面活性剤が適宜添加されている。
(6)基質液:テトラメチルベンジジン(TMB)を含む溶液からなる。基質液はそのまま使用する。一回の測定では基質液を100μL使用する。
(7)反応停止液:硫酸を含む溶液からなる。そのまま使用する。一回の測定では反応停止液を100μL使用する。
酵素標識抗体液100μLを反応ウェルに加え、室温で一定時間インキュベーションを行った後、上述と同様の洗浄操作を行った。そして、基質液100μLを加え、室温、暗所で正確に30分間インキュベーションを行った。その後、反応停止液100μLを加えて素早くミキサーにて攪拌することで、酵素反応を停止させた。各ウェルについて450nmの吸光度を測定し、標準曲線を作成した。
実際に、2例のI−FABP添加検体を順次希釈し、希釈率と測定値をプロットしたところ、ほぼ原点を通る直線が得られ、希釈直線性は良好であった。
また、2例のI−FABP添加検体と標準溶液を一定比率で混和し、添加濃度に対する回収率を算出したところ、ほぼ90〜110%となり、添加回収率は良好であった。
さらに、3例のI−FABP添加検体について、8回繰り返しによる同時再現性試験を行ったところ、その変動係数(CV%)は0.9〜3.9%であった。また、同検体について、4回繰り返しによる測定間再現性試験を行ったところ、その変動係数(CV%)は3.1〜4.9%であり、いずれも再現性は良好であった。
以上のとおり、希釈直線性、添加回収率、再現性のいずれの試験結果も良好であり、本実施例の抗ヒトI−FABPモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法が高い信頼性を有することが確認された。
[臨床例における血液中のI−FABPの測定]
患者から約1mLの血液を採取し、血清を分離した。得られた血清を検体として、実施例3に記載の抗ヒトI−FABPモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定を行った。下記の各臨床例に示すように、急性腸炎患者においてI−FABP濃度が高い値を示した。
したがって、臨床例において、血液中のI−FABPの濃度を測定することにより、急性腸炎を客観的に正確に、そして迅速かつ簡便に判定することができる。また、経時的な血中濃度のモニタリングを行うことにより、急性腸炎の病勢推移や治療効果の判定が可能となる。
なお、本評価系のヒト血清のI−FABP濃度の検出限界は0.1ng/mLであり、実施例5における健常人のI−FABP濃度は1ng/mL前後であった。
これに対し、実施例2に示す動物実験では、コントロール群の値が10ng/mL程度となり、高い値を示した。この相違の理由としては、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の違いにより検出感度が相違すること、ヒトとラットでは正常値が異なる可能性があること、ラット実験では開腹して閉鎖小腸ループを作製しているのでその影響が出ていること、などが考えられる。
78歳女性。夜間より腹痛が出現し、腹痛は徐々に強くなり、下痢、嘔吐、発熱を伴うようになった。翌日、救急車により搬送され入院となった。入院時検査では白血球増多(11,700/mm3)と軽度の代謝性アシドーシス(BE,-1.9)が認められた。臨床的に中等症の急性腸炎と診断され、禁食のもと点滴による補液が行われた。その後、症状は徐々に寛解し、入院の2日後に退院となった。
抗ヒトI−FABPモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定を行ったところ、入院時のI−FABP値は10ng/mLであり、退院日では0.8ng/mLであった。健常人I−FABP値は1ng/mL前後であるため、有症状時の血清中のI−FABP値の上昇と症状の推移に対応した値の変化が認められた。
56歳女性。腹痛と下痢が出現し、症状が改善せず、症状が出現した2日後に外来受診した。外来受診時の血液検査ではCRP高値(4.67)以外には異常が認められなかった。臨床的に軽症の急性腸炎と診断され、整腸薬と鎮痙薬が処方され、数日後には症状は消失した。
抗ヒトI−FABPモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定を行ったところ、外来受診時のI−FABP値は2.2ng/mLであり、1ng/mL前後である健常人と比較してやや高値を示していた。臨床例1に比べてその症状が軽いことは、I−FABP濃度の上昇の程度が比較的小さいことに相関している。従って、本発明の方法によれば、急性腸炎の病勢推移や、治療効果の経時的な変化を正確に知ることが可能となる。
[健常人におけるI−FABP分布および腹痛・下痢との関係]
I−FABPの健常人血清中濃度範囲を調べることを目的として健常人ボランティア血清59例の測定を行った。健常人の選別は6項目(1.糖尿病でない、2.腎機能が正常である、3.高脂血症でない、4.小腸切除歴がない、5.活動性の小腸疾患を持たない、6.肝機能が正常である)を基準とした。加えて、採血当日に過去3日間の腹痛または下痢の発症に関する調査を実施し、これらの症状が血中I−FABP濃度に与える影響を調べた。健常人ボランティア59名は、男性41名(25〜50歳、37.3±6.2歳)、女性18名(28〜58歳、39.8±8.1歳)より構成された。これらのうち、過去3日間に腹痛または下痢の症状を経験した被験者は、腹痛のみ2名、下痢のみ3名および腹痛と下痢の両方2名であった。
健常人ボランティアより約5mL採血し、遠心分離操作により血清画分を得た。得られた血清中のI−FABP濃度を、実施例4と同様にして抗ヒトI−FABPモノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定法にて定量した。
腹痛、下痢を含む全例のI−FABP測定値と分布を表1に示す。表に示すように、59例の血中I−FABP濃度平均値±S.D.は1.02±0.53ng/mL(男性:1.03±0.53ng/mL、女性:0.97±0.52ng/mL)となった。これらについて、性別および年齢の影響を統計的に調べた結果、いずれの要素も血中I−FABP濃度に影響を及ぼさなかった(表2)。
[急性腸炎患者における有病正診率の比較]
臨床的に急性腸炎と診断された症例10例について、抗ヒトI−FABPモノクローナル抗体を用い、血清中I−FABP濃度の測定を行った。同一検体について、一般的な炎症マーカーであるC反応性蛋白(CRP)および白血球数(WBC)の測定も行い、急性腸炎診断における効率を比較した。
その結果、表4に示すように、従来の炎症マーカーであるCRPおよびWBCでの有病正診率はCRPが70%、WBCが50%であったのに対し、I−FABPでは90%と非常に高い診断感度を示した。なお、本実験でI−FABPの診断に用いた基準値(2.0ng/mL未満)は、実施例5に示す健常人血中I−FABP濃度の95%信頼区間より算出している。
従って、血中のI−FABP濃度測定による急性腸炎の診断は、一般的な炎症の診断マーカーであるCRPや白血球数に比べて、小腸に対する臓器特異性があるだけでなく、高い有用性を示すことが判明した。
Claims (13)
- 急性腸炎の検出及び急性腸炎の重症度の定量的な評価のための方法であって、哺乳動物から分離された血液中の腸型脂肪酸結合蛋白(I−FABP)の濃度を測定し、該I−FABPの濃度が急性腸炎の重症度の指標となることを特徴とする方法。
- 哺乳動物がヒトである請求項1記載の方法。
- 血液中のI−FABPの検出を免疫化学的方法により行なう請求項1または2記載の方法。
- 免疫化学的方法が酵素免疫化学的方法、ラテックス凝集法または免疫クロマト法のいずれかである請求項3記載の方法。
- 免疫化学的方法が酵素免疫化学的方法である請求項4記載の方法。
- 酵素免疫化学的方法がサンドイッチ型酵素免疫測定法である請求項5記載の方法。
- 急性腸炎が感染性の急性腸炎または薬剤の影響による急性腸炎である請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法を実施するための抗I−FABP抗体を含む急性腸炎の判定用試薬。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法を実施するための固相化抗I−FABP抗体及び酵素標識抗I−FABP抗体を含む急性腸炎の判定用試薬。
- 抗体が抗ヒトI−FABP抗体である請求項8または9記載の急性腸炎の判定用試薬。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項8〜10のいずれかに記載の急性腸炎の判定用試薬。
- 急性腸炎が感染性の急性腸炎または薬剤の影響による急性腸炎である請求項8〜11のいずれかに記載の急性腸炎の判定用試薬。
- 請求項8〜12のいずれかに記載の急性腸炎の判定用試薬及び該試薬に関する記載物を含む商業パッケージであって、該記載物および/または該パッケージに、該試薬は急性腸炎の判定の用途に使用できる、または使用すべきであることが記載されている商業パッケージ。
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