JP2000516805A - ＣＳ４―ＣＦＡ／Ｉファミリータンパク質を有するＥ．ｃｏｌｉを凝集させるモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 以下の式のコンセンサスペプチドに対するモノクローナル抗体：VEKNITVTASVDPTIDLLQADGSALPSAVALTYSPA。本発明のモノクローナル抗体は、排他的に配列SAVALTYSに結合し、そしてCF4-CFA/Iファミリーのタンパク質を産生するE．coliから生じる病気に対する診断薬としての、およびそれに対する予防のための、ならびにそれから生じる疾患の処置のための用途を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 CS4-CFA/Iファミリータンパク質を有するE．coliを凝集させる モノクローナル抗体発明の分野 本発明は、以下の式のコンセンサスペプチドに対するモノクローナル抗体に関 する： VEKNITVTASVDPTIDLLQADGSALPSAVALTYSPA。 本発明のモノクローナル抗体は、排他的に配列SAVALTYSに結合する。発明の背景 哺乳動物におけるE．coliの効果は、生物の特定の株に依存する。多くの有益 なE．coliが腸内に存在する。E．coliの下痢病との最初の関連付け以来、以下の ５つの範疇の下痢原性（diarrheagenic）E．coliが同定され、そして現在認識さ れている：腸毒素産生性（ETEC）、腸病原性（EPEC）、腸管出血性（EHEC）、腸 凝集性（enteroaggregative）（EAggEC）、および腸侵襲性（enteroinvasive） （EIEC）。これらの範疇は、毒素および集落形成因子の加工、ならびに／または 腸上皮細胞との特定の型の相互作用のような特徴的な菌力特性に従って分類され る。ETECは、下痢原性E．coliの中で最も一般的であり、そして旅行者を最大の 危険にさらす。ファミリーCS4-CFA/IのE．coliは、より一般的な腸毒素産生性E ．coliのいくつかである。CS4-CFA/Iファミリーのより一般的なメンバーと交差 反応し、そしてそれに対して交差防御する抗体を起こさせる、このクラスのE．c oliに対して特異的なワクチンの必要性が存在する。ETEC線毛タンパク質のこの ファミリーの６つのメンバーは、CFA/I、CS1、CS2、CS4、CS17、およびPCF 0166 である。ETECは発展途上国における高い幼児死亡率の原因であり、推定で１年あ たりほぼ800,000の死亡がこれらの生物に起因する。これらの生物はまた、この 疾患が風土病である地域への成人旅行者に病気を引き起こす。 ETECの集落形成因子抗原（CFA）は、集落形成および細菌の腸上皮への接着の 最初の段階において重要である。下痢を有する成人および小児の疫学的研究にお いて、CSF/Iは、ETECの原因である病的状態の高い割合において見出される。CFA /Iは、ピリ線毛（線毛）の形態で細菌の表面上に存在し、これは、反復するピリ ンサブユニットから構成される堅固な直径７nmのタンパク質繊維である。CFA/I 抗原は、見かけのシアル酸感受性を有する、ヒト刷子縁へのマンノース耐性付着 を促進する。 CS4-CFA/Iファミリーに属するE．coliにおけるタンパク質の研究は、このタン パク質のＮ末端領域が、この群のメンバー間で高度の配列同一性を維持している という知見をもたらした。免疫学的証拠は、交差反応が、ファミリーCS4-CFA/I のメンバー間に存在することを示す。 Casselらは、E．coliファミリーCS4-CFA/Iの全てのメンバーのタンパク質に対 する抗体を惹起する免疫原として作用する36アミノ酸のコンセンサスペプチドを 同定した。サブユニット中に示されるタンパク質の領域は、CFA/Iの既知の直鎖 状Ｂ細胞およびＴ細胞エピトープを包含する。コンセンサスペプチドは、６つの 異なる集落形成因子を有する株に対する高レベルの相同性を有する。コンセンサ スペプチドは以下の式のものである： VEKNITVTASVDPTIDLLQADGSALPSAVALTYSPA。発明の説明： 本発明の目的は、Casselsのコンセンサスペプチドに対して惹起され、そしてC S4-CFA/Iファミリータンパク質を有する全ての細菌を凝集させるモノクローナル 抗体を同定することである。免疫原の調製： Ａ：破傷風類毒素のヨードアセチル化： 18.9mg/ml（12mg）の破傷風類毒素（TT）（SmithKline Beechamから得た）を 含有する組成物0.64mlに、５×HEPES緩衝液（75μｌの0.75M HEPES、５mM EDTA （pH7.3））を添加した。TTを、40倍モル過剰のN-ヒドロキシスクシンイミジル ヨードアセテート（ジメチルホルムアミド中0.1mMを32μｌ）で標識した。２時 間後、タンパク質をHEPES緩衝液（0.15M HEPES、1mM EDTA（pH7.3））で平衡化 した、直列の２つのP6カートリッジ（BioRad）で脱塩した。Macrosep 50デバイ ス（Filtron Corp）を使用して、空隙容量画分を約0.7mlに濃縮した。 Ｂ：ペプチドの還元： 式CVEKNITVTASVDPTIDLLQADGSALPSAVALTYSPAのペプチドコンセンサスペプチド 約10mgを、100μｌのアセトニトリルを含有するHEPES緩衝液1.1ml中に可溶化し 、そして固体ジチオトレイトールの0.5Mの最終濃度の添加によって還元した。１ 時間後、ペプチドを、２つに分けて、酢酸緩衝液（10mM酢酸ナトリウム、0.1M N aCl、２mM EDTA、および0.02％アジ化ナトリウム（pH5））で平衡化し、そして １ml/分で流した１×50cm G10カラム（Pharmacia）で脱塩した。空隙容量画分を プールした。エルマン試薬（G.L．Ellman，Arch Biochem & Biophys.，82:70(19 59)）を使用して、ペプチドがチオールに還元されたことを決定した。 Ｃ：ペプチドの破傷風類毒素へのカップリング： ６mlの還元ペプチドを、N-ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテートで標 識したTT 0.3mlおよび１mlの５×HEPES緩衝液に添加した。４℃での一晩のイン キュベーション後、結合体をMacrosep 50デバイスを使用して約１mlに濃縮し、 次いでP6カートリッジを使用してHEPES緩衝液中に脱塩し、再度濃縮し（Macrose p 50）、そして最後に0.45ミクロンMillex HVフィルター（Millipore）を通して 濾過した。BioRadアッセイを使用するタンパク質含量の評価によって、総タンパ ク質含量が約2.6mg/mlであることが示された。モノクローナル抗体産生： Ａ：抗コンセンサスペプチドモノクローナル抗体の調製： 8378番〜8383番として同定される６匹のBALB/cマウスを、コンセンサスペプチ ド−TT結合体で免疫した。指定の１日目に、各々のマウスに、60％完全フロイン トアジュバント中に乳化した0.2ml中の25μｇの結合体を、皮下注射した。23日 目に、血清サンプルを各々のマウスから得た。35日目に、8382番以外の全てのマ ウスに、0.2mlの60％不完全フロイントアジュバント中の10μｇのコンセンサス ペプチド結合体の追加免疫を与えた。マウス8382番には、0.1mlのリン酸緩衝化 生理食塩水（PBS）中のペプチドの結合体10μｇを与えた。 37日目に、マウス8382番を融合（96-104）のために使用した。この融合は、モ ノクローナル抗コンセンサスペプチドの産生を生じなかった。 82日目に、マウスに、60％不完全フロイントアジュバント中に乳化した0.2ml 中のコンセンサスペプチド結合体10μｇの追加免疫を与えた。 85日目に、マウス8383番由来の脾臓を、FOX-NYミエローマと融合し、ここで、 ミエローマ集団生存率は97.4％であった。1.36×10⁸の脾臓細胞を、PEG（分子量 1400）を融合誘導物質（fusogen）として使用して、１.37×10⁷のミエローマ細 胞と融合した。ハイブリドーマに培養物番号96-109を割り当てた。 ハイブリドーマを、10％熱不活化ウシ胎児血清、10％ハイブリドーマ無血清培 地（SFM）、100μＭヒポキサンチン、および16μＭチミジン（ヒポキサンチンお よびチミジンの組み合わせを、本明細書中でHTという）を補充したRPMI 1640中 で、100μｌ/ウェルで８つの96ウェル組織培養ディッシュ中に播いた。８つのウ ェルにまた、コントロールとしてFOX-NYミエローマ細胞のみ（ハイブリドーマな し）を播いた。全てのサンプルを、37℃で、空気中５％CO₂の加湿雰囲気下でイ ンキュベートした。24時間後、全てのウェルに10％熱不活化ウシ胎児血清、10％ ハイブリドーマSFM、200μＭヒポキサンチン、0.8μＭアミノプテリン、および3 2μＭチミジンを補充したRPMI 1640 100μｌを与えた。（ヒポキサンチン、アミ ノプテリン、およびチミジンの組み合わせを、本明細書中でHATという。） 融合の約96時間後に、コントロールウェル中のFOX-NYミエローマは死滅したよ うであった。多くの他のウェルは、融合の７日後に、ハイブリドーマの増殖中の コロニーを含んでいた。増殖中の細胞を、10％熱不活化ウシ胎児血清、10％ハイ ブリドーマSFM、およびHTを補充したRPMI 1640の添加によって供給した。その後 ４日で、上清を、抗コンセンサスペプチド抗体の存在について試験した。 ペプチド結合の分析のために、ELISAを使用した。Nunc Maxisorpストリップウ ェルを、一晩、室温で、１μｇ/ml PBSのコンセンサスペプチド100μｌ/ウェル でコートした。次いでウェルを0.05％Tween-20を含有するPBS（PBS-T）で４回洗 浄して、非結合物質を除去した。次いで各々のウェルに50μｌのPBS-Tを与えた 。次いで、50μｌの上清を細胞培養プレートから、イムノアッセイディッシュの 対応するウェルに移した。細胞培養物の移動の前に、ウェルを顕微鏡でスクリー ニングして、ハイブリドーマを含まないウェルを同定した。培養上清をPBS-Tま たは培地に置換することによって、各々のプレートからの１つのそのようなウェ ルをバックグラウンドコントロールとして使用した。次いでプレートを密封し、 そし て30〜60分間、室温で、暗所で、無通風環境下でインキュベートした。その後ウ ェルをPBS-Tで４回洗浄して、非結合物質を除去した。次いで各々のウェルに、P BS-T中で1:10000希釈したヒツジ抗マウスIgG-HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ ）95μｌを与えた。30分間のインキュベーション後、ウェルを再度洗浄し、そし て各々のウェルに100μｌのテトラメチルベンジジン（TMB）基質溶液を与えた。 次いでプレートを暗所で15分間室温でインキュベートし、その後反応を、80μｌ のTMB停止溶液の添加によって停止した。各々のウェルの吸光度を、Molecular D evicesマイクロプレートリーダーを使用して450mnで決定した。 増殖中のハイブリドーマを含むウェルからの32の上清の吸光度値は、0.200ユ ニットよりも大きかった。これらの中で、CA8（1.743）およびFE8（1.092）で示 された２つのウェルだけが、1.000よりも大きい吸光度値を有した。32の培養物 全てを、24ウェル培養ディッシュへの移動によって拡大し、そして10％のFBSを 含むRPMI 1640上で増殖させた。再試験において、コロニーFE8のみがコンセンサ スペプチドと反応する抗体を産生し続けた。この培養物を、T75培養フラスコ中 での増殖に拡大し、そしてサンプルを凍結保存した。 96-109FE8から分泌される抗体のアイソタイプを、Zymed isotypeキットを使用 して決定した。結果は、抗体がκ軽鎖を有するIgMであることを示した。96-109F E8培養物を、細胞を20％のFBSおよび10％のハイブリドーマSFMを有するRPMI 164 0中に4.5〜５細胞/mlの濃度に希釈することによって、96ウェル培養ディッシュ 中にクローニングした。各ウェルに、200μｌの細胞懸濁物を与えた。各ウェル を、増殖中のハイブリドーマの単一のフォーカスの存在についてチェックした。 各々のこのようなウェル由来の上清を、コンセンサスペプチドエピトープに対す る抗体の結合について試験した。全ての上清が活性であり、このことは、元の培 養物中の全ての生存している細胞が目的の抗体の分泌細胞（secretor）であった こと、および遺伝子型が安定であったことを示唆する。96-109FE8 IH11で示され る１つのクローンを拡大し、凍結保存し、そして腹水の産生に使用した。凝集活性についてのハイブリドーマ組織培養上清の試験： 細菌の培養：集落形成因子CFA/I、CS1、CS2、およびCS4を保有するETEC株を、 集落形成因子抗原寒天［10gカザミノ酸、１％（Difco Laboratories，Detroit， MI）；1.5g酵母エキス（Difco）、0.15％；0.1g MgSO₄・7H₂O)、0.005％（Sigma ，St．Louis）；0.008g MnCl₂、0.0005％ MnCl₂（Sigma）；20g寒天（Difco）； 脱イオン水で１リットルにする］上で一晩、37℃にて増殖させた。集落形成因子 CS17およびPCF 0166を保有するETEC株もまた、0.15％の胆汁酸塩（胆汁酸塩＃３ 、Difco）も補充した集落形成因子抗原寒天上で増殖させた。細菌を、リン酸緩 衝化生理食塩水（PBS）溶液中で採集し、そして細菌懸濁物濃度を20の光学密度 （1/20希釈する場合に600nmで1.00＋/-0.005のODを生じる）に調整した。細菌培 養物の上清を完全な強度で、またはPBSで1:2に段階希釈して試験した。 以下のアッセイを使用した：８μｌの細菌懸濁物と等量の組織培養上清希釈物 とを、ガラス製の顕微鏡スライド（25×75mm）上で室温で混合した。同じスライ ド上の別の場所に、８μｌのPBSを含む細菌懸濁物からなるコントロール（自己 凝集コントロール）をおく。混合物を、連続的に前後に振盪し、そして凝集を、 10秒、30秒、１分、および２分で観察する。結果を、以下のように可視的にスコ アする： ４＝大きな凝集塊をともなう10秒未満での凝集 ３＝大きな凝集塊をともなう30秒未満での凝集 ２＝中程度の凝集塊をともなう60秒未満での凝集 １＝小さな凝集塊をともなう２分未満での凝集 ０＝２分以内には凝集しない。結果： 未希釈の組織培養上清（１μｇ/mlの抗体と概算される）では、細菌株は凝集 しなかった。組織培養上清の20倍の濃度への濃縮（YM100 centrifugal ultrafil ter，Amicon，Danvers，Massachusetts）後、CFA/Iを発現する細菌株のみが凝集 した（H10407NM）。次いで、モノクローナル抗体の上清を元の強度から130倍に 濃縮し、そして試験した。これらの状況では、抗体は、CS4-CFA/Iファミリータ ンパク質を保有する全ての細菌を凝集させた。 96-109FE8 IH11と同定されたハイブリドーマは、Rockville，MarylandのAmeri can Type Culture Collectionに寄託されており、そして名称ATCC HB-12163が与 えられている。 上記のように、抗体を、CS4-CFA/Iタンパク質ファミリーを保有するE．coliを 同定する目的のために使用し得る。CS4-CFA/Iタンパク質のE．coliを含むと疑わ れるサンプルを、臨床研究室で通常の方法によって増殖させ得る。次いで、生物 のコロニーを、先に開示された方法によって懸濁し得る。次いで、懸濁した生物 を少なくとも30μｇ/mlの抗体を含有する組成物に曝露する。好ましい実施態様 において、懸濁した生物を、100〜130μｇ/mlの抗体濃度を含む組成物に曝露す る。適切なサンプルは、下痢を罹患している患者由来であり、そしてETEC E．co li生物の混入について食物および環境サンプルを試験するための糞便を含む。 モノクローナル抗体（MAB）は、培養物中のCS4-CFA/Iファミリーのメンバーを 同定するために有用である。MABを含有するアッセイキットを調製し得、そして これは、本発明のMABに加えて、MAB/抗原複合体の同定を容易にするためのタグ 化のための薬剤を含み得る。このようなタグは、放射性同位元素、蛍光発生薬剤 、および比色定量用指示薬（colorometric indicator）を含む。このような薬剤 は、固体支持体に付着され得る。例えば、ELISA試験キットシステムを、MAB/抗 原複合体の同定のために使用し得る。 本発明のMABを含有する組成物を、増殖培地の添加に適切なキャリアとして使 用して調製し得る。生理食塩水および当該分野で公知の他の緩衝化溶液が、MAB のためのキャリアとして適切である。 本発明のMABをまた、薬学的に受容可能なキャリア溶液中で調製し得、そしてC S4-CFA/Iタンパク質を保有する細菌の凝集のために、感染した領域に投与し得る 。投与は、組成物を生物に接触させるための手段を提供する。例えば、組成物を 、胃および十二指腸中での破壊から抗体を保護するカプセル中で、経口投与し得 る。この組成物は、薬学的組成物のETEC E．coli凝集有効量の投与による、ETFC E．coli感染の、短期間の予防および処置の両方の使用に適切である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 カッセルス，フレデリック アメリカ合衆国 メリーランド 21043, エリコット シティ，ウッドクレスト ド ライブ 6317 (72)発明者 リーズ，アンドリュー アメリカ合衆国 メリーランド 20910, シルバー スプリング，グレン ロス ロ ード 1910 (72)発明者 シューマン，リチャード アメリカ合衆国 メリーランド 20878, ガイザースバーグ，ナイト ホーク ウェ イ 14317

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ハイブリドーマ96-109FE8 IH11によって産生されるモノクローナル抗体であ って、CS4-CFA/Iファミリータンパク質を有する細菌を凝集させ、排他的および 特異的に配列SAVALTYSに結合する、モノクローナル抗体。 ２．ハイブリドーマ96-109FE8 IH11によって産生される、請求項１に記載のモノ クローナル抗体。 ３．細菌含有増殖培地への適用のために適切なキャリア中に請求項１に記載のモ ノクローナル抗体を含む物質の組成物。 ４．前記モノクローナル抗体が抗体／CS4-CFA/Iファミリータンパク質複合体の 同定を補助するためにタグを有する、請求項３に記載の組成物。 ５．前記タグが蛍光発生薬剤である、請求項４に記載の組成物。 ６．前記タグが比色定量用タグである、請求項４に記載の組成物。 ７．CS4-CFA/Iファミリータンパク質を有する生物の存在を検出するためのアッ セイであって： １．生物の培養物を請求項１に記載の組成物と接触させる抗体、 ２．請求項１に記載の組成物中のモノクローナル抗体が微生物と相互作用する ように時間を経過させる工程、および ３．工程２の相互作用の後に培養物を検査して、CS4-CFA/Iファミリータンパ ク質／抗体複合体が形成されているかどうかを決定する工程、 を包含する、アッセイ。 ８．薬学的に受容可能なキャリア中に請求項１に記載の抗体を含む組成物。 ９．前記キャリアが生理食塩水である、請求項８に記載の組成物。 １０．細菌凝集有効量の請求項８に記載の組成物の投与による、CF4-CFA/Iファ ミリータンパク質を有する細菌での感染から生じる病気を処置する方法。 １１．細菌凝集有効量の請求項８に記載の組成物の投与による、CF4-CFA/Iファ ミリータンパク質を有する細菌での感染から生じる病気に対して予防する方法。