JPS62502284A - 抗原的に活性な蛋白質及び淋病の診断におけるその使用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 抗原的に活性な　白質及び淋病の診断におけるその発明の背景 １、発明の分野 本発明は淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　）から抽出しう る抗原的に活性な蛋白質及びヒト患者の臨床的淋病の診断法でのその使用に関す る。

２、従来技術の説明 淋病の原因物質は淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　）である 。

ナイセリア属は粘膜細胞にくっつく双球菌である。Ｓ菌及び流行性小脳を髄熱と しても知られている髄膜炎菌性髄膜炎の病原である＆ｉ膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎ 　１ｔｉｄｉｓ）の２種が重要な病原物質である。その属には他の非病原性の種 もある。

特に女性において淋病の診断はいつも簡単に行われるわけではなく、細胞株の検 査や蛍光抗体法を用いても信頼できる結果は得られない。

Ｎ、Ｊ、ＰａｒＳＯｎＳら（Ｊｏｒｕｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｉｃｏ ｂｉｏｌｏｇｙ　ＩＨｔ　。

５２３〜５２７　（１９８０））は淋菌株の免疫型の多様性の評価を試みた。

評価した２１株で、少なくとも８個の異なる免疫型があると思われた。従って、 淋菌の診断の改良における問題は臨床的に最も多い株に対して共通の抗原又は抗 体を見出すことである。

粘膜組織に侵入する淋菌に、食作用によりそれらを殺そうとする白血球が迅速に くっつく。しかしながら、淋菌のいくらかは食細胞の細胞内で生存し増殖する。

食細胞による殺菌作用に抵抗する淋菌のこの能力に関する決定因子を同定するた めに、数年間、英国のバーミンガム大学で研究が続けられた。最初、食細胞によ る細菌作用に対するこの抵抗性には毛状化の程度（細菌細胞表面の毛状のパイル の量）が関係すると思われた。

次に、ヒトの食ＩＩＢ胞による細菌作用に対する淋菌８８４株（寒天）の抵抗性 の決定因子は毛ではなく、精製した外層膜小胞（ｏｕｔｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ 　ｖｅｓｉｃｌｅ、　ＯＭ　Ｖ　）中にあることが示された。

この結論は、ＯＭＶはＢＳ４　（寒天）株の全体の生存した淋菌に対する抗血清 を中和し、このことによりヒトの食細胞による細胞内での殺菌作用に対するこの 株の抵抗性を破壊すること：及びＢＳ４　（寒天）株のＩＢ胞内の抵抗性を同様 に破壊する、ＯＭ　Ｖに対する抗血清の能力（ＩＩ、　Ｊ、　ｐａｒｓｏｎｓら 、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＧｅｎｅｒａｌ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏａｙ　１２７． １０３〜１１２　（１９８１）参照）に基いて得た。ＢＳ４　（寒天）から精製 したＯＭＶ中の３つの蛋白質Ａ。

Ｂ及びＣは食ｉｌｌ胞による殺菌作用に対する抵抗性に関係すると考えられた。

何故ならば、それらは非常に近い関係にある食細胞感受性株、Ｂ５５ＨからのＯ ＭＶ中には存在しなかったからである（　Ｎ、Ｊ、ＰａｒｓｏｎＳら、Ｊｏｕｒ ｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１２８　、３０７７ 〜３０８１　（１９８２）　）　、　３ツ（７）蛋白質の分子量は約３５゜４７ 及び７４ｋＤａ　Ｉであった。

本明細露中で参照するＢＳ４株は、ヒト食Ｉ胞による殺菌作用に耐性である。こ れは実験変株ＢＳ（にｅ＋＋ｏｇｇ２型、小コロニー形成、毛状）から、食１８ 胞中で生存し増殖する淋菌を選択し、これら淋菌のコロニーを増殖させ、モルモ ットの皮下に移植したプラスチックのチャンバー内を４回通過させ、次に寒天上 の最小培養で増殖させることにより得た。ＢＳ４は以前より英国のバーミンガム 大学微生物学教室のＨ，５ｗ１ｔｈ教授から入手でき、培養が研究者に提供され てきた。菌株の長期間の利用を確実にするために、特許手続上の微生物寄託の国 際的承認に関するブタベスト条約に基き、１９８５年１０月　７日に、Ｎａｔｉ ｏｎａｌ　Ｃｏｔｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、１７５ 　Ｃｏ１１ｎｄａｌｅ　Ａｖｅｎｕｅ、Ｌｏｎｄｏｎ。

８１４９　ＳＩＴ　、英国にこの菌株が寄託されている。寄託番号はＮＣＴ　Ｃ １１９２２である。

本明細書中で言及する株Ｂ５５Ｈはヒト食細胞による殺菌作用に対し感受性であ る。これは、同じ実験苗株ＢＳから食細胞で殺される淋菌（これらは大多数を占 め、単一のハイライトとして知られている光学的特性によりｇ　Ｈできる。生存 様は２つのハイライトを示した。）を選択し、寒天上でコロニーを増殖させるこ とにより得た。

最近、Ｊ、　Ｇ、　Ｃａｎｎｏｎらは、「５ａｒｋｏｓｙｌ　Ｊ　（表面活性剤 ）又は酢酸リチウムを用いて淋菌から外層膜画分を抽出し、両分に対するハイブ リドーマを作った（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　４３．　 ９９４〜９９９　（１９８４））。モノクローナル抗体「Ｈ８」は病原性のナイ セリア種、淋菌、髄膜炎菌及びＮ、　ＩａＣｔａｍｔｅａには結合するが、非病 原性のナイセイア種には結合しなかった。Ｈ８抗体は分子量約２０ｋＤａｌの外 膜蛋白質に結合することが示された。

Ｒ１１１１旦」Ｌｌ 本発明者らは、食細胞耐性株ＢＳ４の外層膜小胞から蛋白質様物質を単離し、そ れが食細胞耐性生物に対する抗血清と強く反応することを示した。

本発明の目的のため、該蛋白質様物質はヒト食細胞による殺菌作用に対し耐性の 淋菌８８４株（ＮＣＴＣ１１９２２）が得られるものと定義され得、前記蛋白質 様物質はｐＨ９，５のコール酸ナトリウム１０ｇ＃水溶液バッファ中で外層膜小 胞（ＯＭＶ）を抽出し、未溶解のＯＭＶを除去し、抽出物を分画化し、相対分子 量約２０ｋＤａ　ｌで食細胞殺菌作用に耐性の淋菌の８３４株に対する抗血清を 中和する蛋白質様物質からなる（それのみからなる又はそれを含む）画分を選択 することにより得られる（しかし必ずしもそうして得る必要はない）。これは蛋 白質様物質自体の定義であり、実際どのようにして得るかには無関係であり、例 えばコール酸ナトリウムとは異なる表面活性物質による抽出により得てもよい。

実際、この物質は相対分子量約２０ｋＤａ　ｌの、ＢＳ４に対する抗血清を中和 する８８４株の蛋白質であると定義するのが適当であると考えられる。

上記に定義した蛋白質様物質は臨床的な淋病の診断のための免疫テストにおいて 抗原的に活性な成分として有用である。

（本発明の目的では該疾患に伴う症状を与える淋菌による全ての感染を臨床的な 淋病とみなす）。テストでは患者の血清と蛋白質様物質との反応により、全く疑 陽性又は疑陽性なしに、臨床的な淋病患者からの血清が非常に高度に特異的に中 和されることが示された。

従って、本発明はヒトの臨床的淋病のアッセイ法も提供し、その方法は（１）ヒ ト患者の体液からの、淋菌又は淋菌に対する抗体を含有していることが疑われる サンプルを、　（ａ）上述の蛋白質様物と、又は（ｂ）前記蛋白質様物質に対す る抗体と共にそれぞれインキュベートし、■蛋白質様物質と抗体との間の中和が 起ったかどうかを検出することからなる。好ましくはＥＬＩＳＡを使う。

もちろん本発明はこのような診断法に使用するキットも含んでおり、このキット は１つの成分としての（ａ）蛋白質様物質又は（ｂ）それに対する抗体及び第２ 成分としての、通常は不溶化した、標識抗体からなる。キットには同相として又 は標識等と共に使用する物質、例えばＥＩＡ、蛍光又はＰＴＡ診断キット中に通 常に存在する任意の物質を含んでもよい。

・本発明の驚くべき点は、蛋白質様物質は多くの異なる患者からの血清と相互作 用し、誤った読み取りはなかったということである。このことは、２０ｋＤａ　 ｌの蛋白質は淋菌の多くの異なる株に対し共通の抗原であり、単にＢＳ４に特異 的な抗原であるばかりではないことを示している。この共通の抗原性は予想でき なかった。

更に、疑陽性が発生しないので、２０ｋＤａ　ｌの蛋白質はｕｉＩｉ！炎菌には 共通のものではありえない。髄膜炎菌に対する抗体は髄膜炎の症状を示さない多 くの人々が保有しており、従って髄膜炎菌に対する抗体は本発明の蛋白質様物質 を用いて淋菌のテストを行った対照群の患者にも存在したことが予想される。対 照群はこのような相互作用を示さなかったので、２０ｋＤａ　ｌの蛋白質は淋菌 に特異的であると考えられる。従って、上記のＣａｎｎｏｎらのゲル上に載置し た２０ｋＤａ　Ｉの蛋白質とは異なっていることを示しているものであり、これ はこの２０ｋＤａ　ｌの蛋白質に対するモノクローナル抗体が淋菌と同様に髄膜 炎菌とも相互作用したからで第１図はコール酸塩抽出物の分画化で得た蛋白質の 量の測定値とその物質とに関するグラフを表わし、第２図はＯＭ　Ｖ　、コール 酸ナトリウム抽出物及びコール酸ナトリウム抽出物の種々の画分の５レーンでの ５ＤＳ−ＰＡＧＥ蛋白質様物質を含む好ましく選択された両分を本明ａ＠中で以 後は１ｂと表わし、これはゲルー過によるコール酸塩抽出物の連続的分画化にお いて２７９ｎｎ＋でのＵｖ吸収ピークの低分子量側に肩部を示す画分と定義され る。画分１ｂは、所望の２０ｋＤａ　Ｉの生成物と同様に約３５ｋＤａ　ｌ及び ６０ｋＤａ　ｌの蛋白質及びリポポリサッカライドを含んでいる。２０ｋＤａ　 ｌの生成物はゲル濾過、及び必要であればイオン交換により更に精製することが 出来、従って本発明には同様に抗血清中和活性を示すこのように更に精製した画 分１ｂ及び画分１ｂの成分も包含する。

２０ｋＤａ　Ｉの蛋白質のみが食１胞による殺菌作用に耐性の抗原を含むことが 示されているので、他の蛋白質を除外し、このような他の蛋白質が全蛋白質様物 質のく例えば）５又は１０重量％以上にならないようにすることが好ましく、こ れはゲル濾過（１回又は数回）により達成しうる。

蛋白質様物質又はそれに対する抗体は淋病の診断の任意の便利なアッセイ（検出 又は測定）法に使用しうる。蛋白質様物質を同相抗原として用いてサンドイッチ アッセイを行なうのが便利であるが、勿論競合及び阻害アッセイとしてもよい。

ホースラディツシュのパーオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼのようなこ のような目的に普通使用される任意の酵素で標識するのが好ましいが、適当な場 合には放射活性標識や蛍光標識も可能である。

例えば、マウスのミエローマ細胞のようなミエローマとマウスの牌細胞を融合す るような現在よく知られている方法により、本発明の蛋白質様物質に対するモノ クローナル抗体が製造できる。淋菌由来のバイプリドーマは新規ではないが、本 発明の蛋白質様物質に対する抗体を分泌するハイブリドーマは新規であると考え られ、それらは本発明の一部分である。もちろん、このようなハイブリドーマは 、例えばウェスターンブロッティングにより所望の抗体を検出するために本発明 の蛋白質様物質を用いる通常のスクリーニング法により容易に得られる。

本発明アッセイの好ましい形態はサンドイッチアッセイであり、この方法では、 蛋白質様物質又はそれに対する抗体を不溶化し、液体サンプルと共にインキュベ ートした後に、相互作用の生成物を標識した抗ヒトイムノグロブリンと共にイン キュベートし、非結合ラベルを不溶性物質から分離し、全ての標識不溶性物質を 検出又は測定する。サンドイッチアッセイを下記に図示する。

（ＰＲ＝上記に定義した蛋白質様物質、ＭＣＡ−マウスで生成したそれに対する モノクローナル抗体、。−酵素、放射活性。

蛍光又は冷光標識） 不溶化抗原　検知所望　標識第２抗体 抗体 不溶化抗体　検知所望　標識抗体 抗体 （このアッセイでは蛋白質自身を製造する必要はなく、それに対する抗体だけで あるという利点を有している。）アッセイのもう１つの形態は競合又は置換アッ セイであり、この方法では（１）蛋白質様物質又は■それに対する抗体を不溶化 し、（ａ）液体サンプルと共に及び（ｂ　）　（１）不十分な標識抗体又は■不 十分な標識蛋白質様物質と共にそれぞれインキュベートし、不溶性物質から非結 合標識を分離し、標識を検出又は測定する。

「競合」という用語は競合相手同士を同時にインキュベートすることを意味し、 「置換」又は一方が他方の前に反応するが、それらの間での平衡は他方を次に添 加することにより置換されることを意味する。上記と同じシンボルを用いてこの 型のアッセイを下記に図示する。

不溶化抗原及び競合で　限定量の標識した２重抗体検出すべき抗原　（好ましく は予めそのように準備したもの） 不溶化抗体及び競合で　限定量の標識抗原、例えば検出すべき抗原　ＰＲ−ピオ チン−ストレプトアビジン１ 免疫アッセイの分野でよく知られている多くの上記の図式の変性が使用できる。

本発明のキットは通常、適当な標準と共に、サンプル以外の上述の成分を全て含 んでいる。通常の欠点はあるが、勿論モノクローナル抗体をポリクローナル抗体 で置換できる。

２０ｋＤａｌの蛋白質様物質はワクチンの成分としても有用である。

従って、この目的のために例えば水酸化アルミニウム、特に［＾ｌｈｙｄｒｏｇ ｅｌＪ　（登録商標）又はリン酸アルミニウムのような担体又はアジュバントと 共に製剤化しうる。投与量としては２０ｋＯａ　ｌの蛋白質を５〜５００埒投与 し得る。

次の実施例は本発明を説明している。実施例１は蛋白質様物質［画分１１）Ｊの 製造と特性を示している。実施例２は診断におけるその使用を説明している。実 施例３は上記のｃａｎｎｏｎらのモノクローナル抗体（Ｈ８）が食細胞により殺 菌作用に対する耐性の決定因子に対するものではないことを示している。実施例 ４は画分１ｂをさらに精製することを示している。実施例５は本発明の２０ｋＤ ａｌ蛋白質は食細胞による殺菌作用の決定因子からなるということの証拠を更に 提供する。実施例６はハイプリドーマセルラインのＩＩを記載している。

実　施　例　１ コール酸ナトリウムによる粗外層膜小胞（ＯＭＶ）の既述（Ｐａｒｓｏｎｓら、 １９８２、上記）のように１Ｍの塩化リチウム中Ｌ７Ｂ　８４ａ　（１ｊ天）　 （１００ｄ　：　１０”ＩＩ／ｄ）　ｔｆｉうＯＭＶヲ抽出した。沈澱したＯＭ Ｖを、コール酸ナトリウム（１χ／Ｗ／Ｖ）含有の０．１Ｍ５ｐＨ９，５のグリ シン／ＮａＯＨバッファ（約２０ｍ　）に再懸濁し、旋回シェーカー（６０サイ クル／分）上でガラスピース（直径３ｍｌｌ１：　２ｔ：’−ス／ａｔりを含有 する５０ｍのエーレンマイヤーフラスコ中、３７℃で１時間撹拌した。遠心（１ ００，０００ｇ、１時間、４℃）により未溶解ＯＭＶを除去し、直ちに抽出物を リン菌５Ｘ１０１１／ａｔ！から得た蛋白質を約１０００埒／　ａｄ金含有る抽 出物（３〜Ａｍ＞を「５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ７５Ｊ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　） のカラム（長ざ１ＴｒＬ、直径１５Ｍ）にかけ、抽出に用いたものと同じバッフ ァで溶出したく流速１０ｄ／時）。２７９　ｎｍでの吸光度Ａ２７９をモニター することにより溶出を追跡した。適当な画分（各２ａｄりを集め、カラムにかけ た抽出物の最初の容量まで負圧透析して濃縮した。

リポ　糖（ＬＰＳ）の抽出 Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５． ８３〜８９　（１９６５）の０、　Ｗｅｓｔｐｈａｌ及びに、　Ｊａｎｎの方法 を用いた。湿潤重最約４９の８８４株（寒天）　（約１×１０１３菌）を２０１ ｄの４．８Ｍフェノールに懸濁し、２０個のカラスビーズと共に室温で１０分間 渦巻状に混合し、次に１０分間６０℃に加熱した。混合物を４℃に冷却し、遠心 （１０，０００ｇ、１０分間、４℃）により細菌を除去した。上部の水層は保存 し、中間層及び下層を除去した水層と等量の蒸溜水で再抽出した。水層を合せて 溜め、遠心しく２０，０００ｇ、１０分間、４・’Ｃ）、空Ｗで２〜３日流水に 対し透析した。保留物を３容の水冷ドライアセトンで処理した。ＬＰＳ沈澱（約 ５０！６）を遠心（４０００ｇ、１０分間、空温）テ集メ、２×１０１１淋菌／ ＃１１！に等しい濃度で蒸溜水中に再懸濁し、空温で１４〜ｉｓｉ間、蒸溜水に 対して透析した。生成物はそれ以上精製しなかった。これは蛋白質をいくらかと 多分少量の核酸とペプチドグリカンを含有してＵ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｉ、　 Ｎａｔｕｒｅ　２２７　、６８０〜６８５　（１９７０）の方法を、ＰａｒＳＱ ｎＳら（１９８２、上記）が記載した通りに変更して使用した。

蛋白質プロフィールのために、５Ｘ１０１１淋菌／−に等しい濃度のサンプル（ ５０／Ｉ１１＞を適用したものであり、同じ濃度又はその単純な倍数を乗じた濃 度で行なった生物学的テストの結果と関係している。蛋白質の大体の分子ａを示 す標準としてチトクロームＣ１馬のミオグロビン、牛のキモトリプシノーゲン、 オボアルブミン、ＢＳＡ及びオポトランスフェリン（各々１２．１７゜２６、４ ５．６６及び７７ｋＤａ　ｌ　）を使用した。画分１ｂの成分を分離するために 、Ｐａｒｓｏｎｓら（上記（１９８２））により記載のように、１２．５％（Ｗ ／Ｖ）ポリアクリルアミドゲルの７つのチャンネルの各々で、２×１０１２菌に 等しい５０ρの両分のアリコートを電気泳動した。

２０及び６０ｋＤａ　ｌの蛋白質に大体対応するゲルの２つの領域（約２１Ｊ） 及び主要な外ＭＲ蛋白質（３５ｋＤａｌ付近）に対応する領域は前の分析用ゲル を参照して位置決定した。又、ゲルの２つのチャンネルを染色して３つの領域の 位置を確認した。残りの５つのチャンネルからのこれらの領域を切り出し、等量 （２〜３ｍ＞のリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に乳鉢内で浸して乳棒で柔かくし た。遠心（２０００９，５分間、空温）によりゲルを除去し、ゲルにかけた最初 の沿（５Ｘ　５０ρ）まで負圧透析して抽出物を濃縮した。従って、全容量は１ Ｘ１０１３菌に等しく、１／１ｏを淋菌全体に対する抗血清の吸収に使用した（ 下記参照）。対照のために、標識染色の前のゲルの２ｃＩＲの部分を同様に処理 した。

２−ケト−３−−オキシオクト　−ト　Ｋ　Ｏ−１炭水化物のアッセイ ＰａｒＳＯｎＳら（上記（１９８２））の２級のようにＫＤＯ及び蛋白質（標準 としてＢＳＡを使用して）をアッセイした。標準としてグルコースを用いるアン スロン法で炭水化物を評価した。

に・する・性の゛　因子のための間接試験：１の　び　収　血°によるＢＳ４株 （寒天）の前処理 要約すると、ＢＳ４　（寒天）生菌に対する抗血清はこの菌株がヒト食細胞の細 胞内で生存する能力を非常に減少させるが、ＷＪ連の抗体は、抽出物又は細胞内 殺菌作用に対する耐性の推定決定因子を含むＯＭＶを前もって吸収することによ り中和された（　ＰａｒＳＯｎＳら、上記、１９８１．１９８２）。

Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ　Ｓｏｙ　Ｂｒｏｔｈ中の生菌を数回静脈内注射すること によりＢＳ４株（寒天）に対するウサギの抗血清を得た。粗ＯＭＶの吸収のため に（第１表）、同日の抗血清とｏＭｖｌ濁液（５×１０１１淋菌／ｄに等しい） を混合し、４℃に一装置いた。

ＬＰＳｉｉ製物による吸収も２×１０１２淋菌／ＩＩｌ！！に等しい濃度で同様 に実施した。ＯＭＶのコール酸塩抽出物と「セファデックス」カラムからの画分 （第１図、第１表）とを５Ｘ１０１１淋菌／ｄに等しい濃度で等量の抗血清と混 合し、４℃に５時装置いて、遊離のコール酸ナトリウムを除去するためにＰＢＳ に対し４℃で一晩透析した。５Ｏ３−ＰＡＧＥゲル（第２務）の各部分からの濃 縮溶出物（２５ｍ、　１　ｘ　１０”’淋菌に等しい）と抗血清（１００／１１ １！りとを混合し、−晩４℃に置いた。

デフリビネートした血液から得た１０％（Ｖ／Ｖ）の加熱した（５６℃、３０分 間）ヒト血清（ＨＨ３）と、ＢＳ４株（寒天）の生菌に対するＩＸ（ｖ／ｖ）　 、のウサギ抗血清又は対応する濃度の吸収抗血清（上記参照）を含有するＰａｒ ｋｅｒ培地１９９中で淋菌［Ｂ５４（寒天）、２Ｘ１０７／ｍｌをインキュベー トした（１時間、３７℃）。対照サンプルからは抗血清を除いた。インキュベー トした後に、次に遠心（２０００ｇ、３分間、空温）により培地を除去し、抗血 清を含まない新しい培地（１ｄ　）で３回洗浄した後、レイトン管内の食細胞と 混合するために、ＨＨ３（１０％、Ｖ／Ｖ）を含有するＰａｒｋｅｒ培地１９９ 中に２Ｘ１０６／ｄの濃度で淋菌を懸濁した。

前述の如（（ｐａｒｓｏｎｓら、上記、１９８１．１９８２）　、食作用試験に は、推定の決定因子を含む画分の単一の１１８度に吸収された抗血清で予処理し たＢＳ４株（寒天）を用いた。この濃度は、抽出した菌の標準数（５Ｘ１０”） に等しかった。食作用試験では多数の反復が必要であり、１点を確立するために は各実験を数回繰り返す必要がある（　Ｐａｒｓｏｎｓら、上記、１９８１　） ので、標準の濃度のいくつかの希釈について通常の試験は省略した。まれに、希 釈物をテストし、手順中に、例えばＬＰＳ及びゲル溶出物の製造において物質が 失われたときには時々、標準の濃度の２〜４倍の濃度で物質を検査した（上記参 照）。

細胞内殺菌作用に対する耐性の決定因子についてのその他の試験は推定の決定因 子に対する抗血清を作り、生物全体に対する抗血清の場合のように（Ｐａｒｓｏ ｎｓら、上記、１９８１．１９８２）されずＢＳ４株の細胞内で生存する能力を 破壊するかどうかを見ることであった。以下のようにして、この目的のために５ ｅｐｈａｄｅｘカラムからの画分１ｂ（第１図）に対する抗血清を得た。１０日 間隔でウサギに画分１ｂを３回皮下注射した（各々、１０１０淋菌に等しい）。

最初の２回は等量のフロイント完全アジュバントで乳化して投与したｅ３回目の 注射の１４日後に、血液を集め血清を調製した。淋菌全体に対する抗血清用に、 この抗血清を用いて８８４株（寒天）を予処理した。

細胞内殺菌作用に対する淋菌の耐性の試験上述のように抗血清で処理した後、に 、　ＷｉｔｔらがＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆＭｅｄｉｃａｌ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏ ｇｙ　９　、１〜１２　（１９７６）に記載したように処理したもの及び対照の 淋菌の懸濁液（（１，５ｍ！！、２Ｘ１０６／ｄ、〉６０％生存しうる）を新鮮 なヒト末梢血から調製したヒト食細胞の懸濁液（２Ｘ１０／ｄ、約８０％ＰＭＮ 食細胞）の同量とレイトン管内で混合し、ＨＨ８（１０％Ｖハ）含有のＰａｒｋ ｅｒ培地１９９中に懸濁した。３７℃で１時間インキュベートした後、培地を捨 て、感染した食細胞沈澱をＢＳＡ含有（０，１％ｗ／ｖ）ＰＢＳで３回洗浄した 。感染した食細胞について次の測定を行った。レイトン管の平らな表面上に置い たカバースリップ上の染色フィルムに顕微鏡で見える食細胞当りの淋菌数（食細 胞指数）を測定した。レイトン管からの沈澱部中の食細胞数はそのＤＮＡ含量か ら決定した（Ｐａｒｓｏｎｓら、上記、１９８１）。洗浄した沈澱を先にゴムの ついたガラス棒で掻いて取り、ＰＢＳ中の０．１％（Ｗ／Ｖ）Ｂ　Ｓ　Ａ　７５ ／１１１に懸濁した。３つの管からの懸濁液を集め、２０ＩＪｉを取って直ちに 淋菌の生存数をカウントした（下記参照）。集めた食細胞懸濁液の残りを３７℃ で１時間、５ＭＮａＯＨ（５０ｍ）で５！！を理し、次に１００℃で１０分間イ ンドール試薬（ＳＭＨＣｊ中インドール０．０２％　ｗ／ｖ　、２５０．ｄ）で 処理した。冷却したサンプルを旋回混合（３０８）してクロロホルム（ｌｄ　） で抽出し、インドール試薬との反応後のＰＢＳ中０．１％（ｗハ）Ｂ　Ｓ　Ａの ブランクに対して、遠心して（３０００ｇ、１０分間、室温）で得た水層の４９ ０　ｎａ＋での吸光度Ａ　４ｇＯ（ｐｙｅ−ｕｎｉｃａｍ　ｓｐ　１８００分光 光度計）を読み取った。レイトン管表面上の食細胞の数（はとんどのテストで４ 〜２０Ｘ１０’　）は、１２名の異なる提供者から得た食細胞の数に関係するＡ ４９゜の標準曲線から得た（　Ｐａｒｓｏｎｓら、上記、１９８１　）。食細胞 沈澱中の生存する淋菌数は、ＤＮＡアッセイ（上記参照）に使用した懸濁液の２ ０４のサンプルをブレーティングすることにより得た。食細胞を含まない対照の 管での低い生存カウント（食細胞含有管中のものの１０％未満）を差し引くこと により、生存カウントを修正し細胞非随伴淋菌を決定した。

結果（第１表及び第２表）は生存している細胞を随伴淋菌全部に対するパーセン テージ（食細胞指数と食細胞の全数との積）で表わした。

細胞内生存決定因子についてのこれらの間接的な食作用試験はに、　Ｗｉｔｔら 、（上記）により既述の理由により完全には定量的ではないが、種々の処理の後 の８３４株（寒天）の細胞内での生存の大きな差異を示す。試験により種々の結 果が得られ、多くの物質のバッチについて試験を繰り返すことによってのみ明確 な結果が得られた。示した結果は代表的な実験からのものである。種々の日に種 々の提供者から得た食細胞沈澱中の淋菌の生存率が変動するので、平均値及び標 準偏差は表示しなかつ性であり、画分１ｂが画分１ａよりわずかにより活性であ るときた。

結　果 コール酸ナトリウム（１％　Ｗ／Ｖ）にょるＯ　Ｍ　Ｖがらの　血と分の抽出 第１表の実験１及び２の結果は、抗血清中和活性を有する実質的な物質が方法に 記載した手順でＢＳ４　（寒天）の粗ＯＭＶから抽出されたことを示している。

コール酸塩抽出部の蛋白質、炭水化物及びＫＤＯ含量は、ＯＭＶがほぼ完全に溶 解することを示した。粗ＯＭＶのものと対比して抽出しうる蛋白質が高い数値で あることは粗ＯＭＶの蛋白質全部はアッセイ中に反応しなかったという事実によ るものであろう。

５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ７５におけるコール酸ナトリウム抽出物の分画化第１図は 「５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ７５Ｊ上でのコール酸ナトリウム（１＄Ｗ／Ｖ）抽出物 の分離のプロフィールを示している。このプロフィールは１１の同様の実験の典 型的なものである。蛋白質濃度を吸光度Ａ２７９で縦軸に、画分を横軸に示す。

１７回の実験のうち２つの典型的な実験について、コール酸抽出物と画分１ａ、 １ｂ、２及び３の抗血清中和活性を第１表に示す（実験３及び４）。１１の実験 全部の結果は、画分１ａと１ｂの抗血清中和活性がほぼ等しいことを示した。従 って、２つの両分の両方とも全ての実験で活１．７及び２．８であった。従って 、画分１ｂをさらに研究した。

４、（ＣＰ）　−１７，０ ＋　］−ル酸　９％　６２５　Ｎ［１１７，５塩抽出物 十　画分１ａ　５３５　７３　ＮＤ　１１．０＋　画分１ｂ　５ｍ　ｉｏ９　Ｎ Ｏ１３，０＋　画分２　２０　１８５　ＮＯ２，３＋　画分３　２０　１０６　 ＮＯ２，０＋　コール酸　１４００　Ｎｏ　７２０　２８．１塩抽出物 ＋　画分１ｂ　２５１　Ｎｉｌ　１５５　１３．４ＮＯ３１１１定せず ＢＳ４　（寒天）から調製したＬＰＳ中の抗血清中和活性の不在画分１ｂ中にＬ ＰＳが存在することによりＬＰＳ自身が耐性の決定因子であるかについての研究 を進めた。従って、Ｂ５４（寒天）の同じバッチから製造したコール酸塩抽出物 とＬＰＳ調製物の抗血清中和活性である。抽出過程によりＬＰＳが完全に回収さ れることは期待できなかったため、淋菌の標準濃度（５Ｘ１０”／ｄ）の４倍の コール酸抽出物濃度で後者をテストした。ＬＰＳ調製物は蛋白質を含有したが、 コール酸塩抽出物中のものよりはるかに少なかった。しＰＳｍ製物は抗血清中和 活性を示さず、このことは画分１ｂの蛋白質成分が食細胞による殺菌作用に対す る耐性の決定因子を含有することを示していた。

５ＯＳ−ＰＡＧＥ上でのＯＨＶ、コール酸塩抽出物全体及びその画　中の白質の 比較 第２図は、ＯＭＶ　（レーン１）、コール酸抽出物全体（レーン２）及び「５ｅ ｐｈａｄｅｘ　Ｇ７５Ｊカラムからの画分１ａ（レーン３）及びＩｂ（レーン４ ）についての５Ｏ３−ＰＡＧＥの蛋白質パターンを示す。生物学的テストに関し て、同数の淋菌に対応する口（２，５ｘ１０　／ａｉり−１，２５ｘ１０”−標 準数５ｘ　１０”より４０倍少ない量を含有する５０ＩＩＲ）でレーン１〜４の 物質を検査した。従つて、いくつかのチャンネルでは過剰負荷であり、他では過 少負荷であった。レーン５では、画分１ｂはレーン４量の５倍負荷した。ＯＭ　 Ｖ　、コール酸抽出物全体及び画分１ａは、以前には食細胞の殺菌作用耐性に関 連すると思われていた（　Ｐａｒｓｏｎｓら、上記、１９８２）蛋白質Ａ、Ｂ及 びＣ（各々、約３５．４７及び７４ｋＤａｌ　；第２因参照）を含む全域の蛋白 質を示した。対照的に、５倍琶の物質を調べても、画分１ｂの全蛋白質及び各蛋 白質はずっと少なかった。淋菌の主要な膜蛋白質（約３５ｋＤａｌの大きさ）は 、ＯＭＶ、コール塩抽出物及び画分１ａに比べて画分１ｂで非常に少なく、この ことはそれらが食細胞耐性と関連しないことを示していた。同様に、生物学的に 活性な画分１ｂでは蛋白質Ａ、Ｂ及びＣがずっと少ないかあるいは検出されなか った。同様に生物学的に活性な画分１ａ、ＯＭＶ及びコール酸塩抽出物中に同じ 様なって存在すると思わ机る画分１ｂの蛋白質は６０ｋＤａ　ｌ領ＶＸ、（第２ 図中Ｘで示した）の蛋白質群と２０ｋＤａ　ｌ付近の拡散帯（第２図中Ｙで示し た）の１つ以上の蛋白質であった。

ＢＳ４　（寒天）について記載したと同じ方法で食細胞に感受性のＢ５５Ｈ株か ら得た画分１ｂを標準濃度と、その５倍の濃度とで調べた２つの実験中では、抗 血清中和作用を有する蛋白質群（第２図のＸ及びＹ）は検出されなかった。

５−ＰＡＧＥによる画　１ｂの　白質の抗血清中和作用調製的実験において、生 物学的活性を有する、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより画分１ｂ中に示された蛋白質は、 大体６０字及び２０ｋＯａ　ｌに対応するゲルの領域（約２α）（第２図でＸと Ｙで示した領域）と３５ｋＤａ　ｌ付近の主要な外層膜蛋白質領域から溶出され た。

濃縮した溶出物を使用して、ゲルの対照部分からの溶出物と共にＢＳ４　（寒天 ）に対する抗血清を吸収した。４つの実験の結果を第２表に纏める。明らかに抗 血清中和活性は２０ｋＤａｌ領域の蛋白質の所にある。

＋　ｆｒａｃｔｉｏｎｌｂ　１５．１　７．０　５．８　ＮＯ＋　６０ｋＤａ　 ｌ領　域　１．６　１．４　１．１　２．７＋　３５ｋＤａｌ　ｎ　３．６　Ｇ 、１　２．３　２．４＋　２０ｋＤａｌ　〃１９．１　１２．９　１３．９．　 １４．０＋　対照ゲル　１．０　１．１　２．６　２．０章第１表と同様 ４第１表と同様 ！−１−五一一１ この実施例は本発明の蛋白質様物質の診断への使用を説明している。

先ず、ＢＳ４株（寒天）に対する高度免疫のウサギ血清の対数希釈物（１／１０ 〜１／１０７）に対し対数希釈した画分１ｂ（１０層〜０．００１　／１１！ｇ １１層／−）を反応させて、愚者の血清の検査に抗原として使用する画分１ｂの 最適ｆｆ１（０，５馬／＋ｌｌｉ！蛋白質）を得た。

慣用の方法で、画分１ｂを［ＴｉｔｅｒｔｅｋＪマルチウェルプレートのプラス チックウェル上に塗膜した。１００μの容量を使用した。

ウェルに、アルカリ性フォスファターゼで標識した羊抗−ヒトＩＱＧとヒト患者 血清とを加えた。インキュベートし、洗浄した後、固相の酵素活性を測定して中 和の程度を決定した。抗原として画分１ｂを０．５Ｒ／１ａｌｌ　（蛋白質）を 用いて、１９例の淋病患者と淋病の病歴を持たない１１例からの血清の２つの同 様な比較において、１／１０．１／１００及び１／１０００の希釈で２つの型の 血清が容易に区別された（　１／１０の希釈は血清１０成：希釈剤９０／ｆを示 す）。従って、各血清の希釈について測定した閾値（陰性の血清群の平均＋２Ｓ Ｄ、陽性：陰性比は１．００　）について、１／１０及び１／１００希釈を調べ たときには正常な血清の１つだけが閾値以上だった。このサンプルを除外すると 、陽性群のＥＬＩＳＡでの平均の吸光度は陰性群より３倍高かった。１／１００ ０希釈の血清では、全ての患者の血清は閾値以上であり、対照の血清はそれ以下 であった。これらの結果は非常に有望なものである。

実　施　例　３ Ｃａｎｎｏｎら（上記）のＨ８抗原に対するモノクローナル抗体が、食細胞によ る殺菌作用に対する淋菌（ＢＳ４株）の耐性を中和するかを確認するために試験 を実施した。実施例１のテストにおけるヒトの食細胞と混合する前に、抗体を含 有する組織培養培地中でＢＳ４淋菌を（１時間、３７℃で）インキュベートした 。

５つのこのような実験の全部で、８倍に濃縮したときでさえ、モノクローナル抗 体により、食゛細胞による殺菌作用に対するＢ５４（寒天）の耐性は全く中和さ れなかった。一方、Ｂ５４（寒天）生物全体に対する抗血清は耐性を非常に減少 させた。

実　施　例　４ 実施例１に記載のように調製した画分１ｂ（８〜１０ａ！！　：　５ｘ　１０１ １淋菌／１＋１１！から得たもので約１１１１ｙ／ｒｉｒｉの蛋白質を含有して いる）を「５ａｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５Ｊのカラム（１ｍＸ２．５ｍ）で再び分画 化し、コール酸ナトリウムＩＸ（ｗ／ｖ）を含有するグリシン／Ｎａ０Ｈ（０， １Ｍ、　ｐＨ９，５９）で溶出した。２０ｋＤａ　ｌの成分が溶出される領域か ら適当な画分を採取した。次の標識物質：リボヌクレアーゼＡ、キモトリプシノ ーゲンＡ、オボアルブミン、牛血清アルブミン及びブルーデキストラン（それぞ れ１３．７．１５．０．４３．０゜６７．１及び２０００ｋＤａｌ）により、淋 菌画分と同じ条件下で、カラムを予め較正することによりこの領域が示した。最 終物質を凍結乾燥し、水を溶出液とする「５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５Ｊカラム（ １ｍ、　１５ｍｍ）上で脱塩した。溶出液を凍結乾燥し、リン酸塩で緩衝した食 塩水、ｐＨ７，２（画分１ｂの最初の溶液の量の１７２５の量）に溶解し、−２ ０℃に保持した。これは１〜１．５　Ｉｎｇ／ｌｄの蛋白質を含有した。

１−１−■−−玉 実験において、前述のテスト中の食細胞と混合する前に生成した２０ｋＤａ　ｌ の蛋白質（５ｏ　〜７５埒／　１１！１！−’組織培養培地）の能力を調べた。

対照生物は、同じ株のものであるが２０ｋＤａｌの蛋白質を含まない組織培養培 地中でインキュベートした（１時間、３７℃、）ものであった。典型的な実験で は、処理した淋菌は対照生物と比較して２倍の生存の増加を示した。

１−１−五一一１ この実話例はバイプリドーマセルラインの［ｉを記載している。

雌性Ｂａ１ｂＣマウスに生理食塩水中の精製した２０ｋＤａ　ｌの蛋白質を注射 した（約１η蛋白質／　ｒＪ！　）。同量の完全／不完全７０インドアジユバン ト（ＣＦＡ／ＦＡ）で乳濁液を作り、次のスケジュールに従ってマウスに腹腔内 注射した：第Ｏ日月　第１回　ＣＦＡ　５０Ｉ４　蛋白質第１４８目　第２回　 ＦＡ　７５層　蛋白質第２１８目　第３回　ＦＡ　７５埒　蛋白質第２８８目　 第４回　アジュバントなし　１００／１１１９　蛋白質最後に、融合の４日前に 食塩水（０，０５ｄ　）中の１０ｏｎ蛋白質を静注しく尾の静脈ブースト）、融 合の１日前に抗体用にマウスを試験的に出面させた。不動態化した２０ｋＤａｌ 蛋白質、マウスの血清及び酵素標識したウサギの抗−マウスＩＣＩＧを用いてサ ンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。テストは、マウスが蛋白質に対する抗体を作 ったことを示した。

次に：　ＢＲＬ　（ＵＫ）社が「Ｈｙ　ＢＲＬ　Ｐｒｅｐ、　ＫｉｔＪに添附し たマニュアル（「Ｒｅａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎｓ　ｆｏ ｒ　Ｉ（ｙｂｒｉｄｏｍａ　ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＪ　、１９８２　ＢＲＬ（Ｕ に）　Ｌｔｄ、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｃ３Ａ　４ＢＥ、英国）に記載の方法 により、但し、マニュアルに記載のＮＰ−３の代りにＮ５−１をミエローマ細胞 として用いて、マウスからの牌細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合してハイ ブリドーマを調製した。プレート当り９６ウエルのマイクロタイタープレート５ 枚中で８５ウエルが、ＥＬＩＳＡにより画分１ｂの反応を示すハィブリドーマを 含有していた。これらのうち９つではＥＬＩＳＡにより２０ｋＤａ　ｌの蛋白質 に対する反応を示した。

この手順により得たハイブリドーマはウェスターンブロッティングにより画分１ ｂに対しスクリーニングして、それに対する抗体を産生ずるｌｌｌ胞を検出でき 、陽性ＩＢ胞を更に２０ｋＤａ　ｌの蛋白質に対してテストした。

♂７奈番号 １　２　°　３　４　５ 国際調査報告 ｊｐｌ＠、、ｌｌｌｍＭＩ　Ａｅｅｌａ’　ｋａＰ口″ｒ／ＧＢ　８６１０Ｏ１ ４４Ａ−’ＪＮＥＸ　Ｔｏ　’ＬｒｆＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡ ＲＣＨＲＥ：’ＯＲＴ　ＯＮ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．（１）ヒト患者の体液からの、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ）又は淋菌 （Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ）に対する抗体を含有していると思われるサンプル と（ａ）相対分子量が約２０ｋＤａｌであり、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ ）ＢＳ４株（ＮＣＴＣ１１９２２）に対する抗血清を中和するＢＳ４株の蛋白質 様物質又は（ｂ）前記蛋白質様物質に対する抗体のそれぞれとインキュベートし 、（２）蛋白質様物質と抗体との間の中和が起ったかどうかを検出することから なるヒトの臨床的淋病のアッセイ方法。
2. ２．（１）ヒト患者の体液からの、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ）又は淋菌 （Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ）に対する抗体を含有していると思われるサンプル と（ａ）淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ）ＢＳ４株（ＮＣＴＣ１１９２２）か ち得られる蛋白質様物質又は（ｂ）前記蛋白質様物質に対する抗体のそれぞれと インキュベートし、（２）蛋白質様物質と抗体との間の中和が起ったかどうかを 検出することからなるヒトの臨床的淋病のアッセイ方法であって、淋菌（Ｎｅｉ ｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＢＳ４株（ＮＣＴＣ１１９２２）はヒト の食細胞による殺菌作用に耐性であり、前記蛋白質様物質はｐＨ９．５の水性バ ッファ中１０ｇ／ｌのコール酸ナトリウム中で外層膜小胞（ＯＨＶ）を抽出し、 非溶解ＯＭＶを除去し、抽出物を分画化し、分子量約２０ＫＤａｌで、前記の食 細胞による殺菌作用に耐性な淋菌（Ｈｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ）のＢＳ４株に対する抗血清を中和する蛋白質様物質からなる面分を選択するこ とにより得られるものである（しかし必ずしもそうして得なければならないもの ではない）前記方法。
3. ３．蛋白質様物質が実質に他の相対分子量の蛋白質を全く含まない請求の範囲２ に記載の方法。
4. ４．抽出物の連続的ゲル分画化において２７９ｎｍでのＵＶ吸収のピークの低分 子量側に肩部を示す面分が選択された面分である規定の方法により蛋白質様物質 が得られる請求の範囲２に記載の方法。
5. ５．蛋白質様物質又はそれに対する抗体を不溶化し、液体サンプルとインキュベ ートした後で、相互作用の生成物を標識した抗ーヒトイムノグロブリンとインキ ュベートし、不溶性物質から非結合標識を分離し、標識された不溶性物質を全て 検出又は測定するサンドイッチアッセイの形の請求の範囲１〜４のいずれかに記 載の方法。
6. ６．（１）蛋白質様物質又は（２）それに対する抗体を不溶化し、（ａ）液体サ ンプル及び（ｂ）（１）不十分な標識抗体又は（２）不十分な標識した蛋白質様 物質のそれぞれとインキュベートし、不溶性物質から非結合標識を分離し、標識 を検出又は測定する競合又は置換アッセイの形の請求の範囲１〜４のいずれかに 記載の方法。
7. ７．請求の範囲１から４のいずれかに定義した蛋白質様物質と、標識した抗−ヒ トイムノグロブリン抗体又は蛋白質様物質に対する標識した抗体とからなるヒト の臨床的淋病のアッセイ方法に使用するためのキット。
8. ８．請求の範囲１から４のいずれかに定義した蛋白質様物質に対する抗体と標識 した抗ーヒトイムノグロブリン抗体又は標識した蛋白質様物質とからなるヒトの 臨床的淋病の診断法に使用するキット。
9. ９．請求の範囲１から４のいずれかに定義した蛋白質様物質に対する抗体。
10. １０．請求の範囲１から４のいずれかに定義した蛋白質様物質に対する抗体を分 泌するハイブリドーマセルライン。
11. １１．請求の範囲１から４のいずれかに定義した蛋白質様物質のワクチン成分と しての使用。