JPS63503545A - ワクチン及び診断マーカーとして有用なネイセリア・ゴナリーア・レクチン及びこのレクチンの製法 - Google Patents
ワクチン及び診断マーカーとして有用なネイセリア・ゴナリーア・レクチン及びこのレクチンの製法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ワクチン及び診断マーカーとして有用なネイセリア・ゴナリーア・レクチン及び
このレクチンの製法(関連出願の引用文献)
この出願は、1986年6月18日提出の米国特許出願番号第875.477号
の一部継続出願である。
(技術分野)
本発明は、ネイセリア・ゴナリーア(Neisseria gonorrhoe
ae)に対する接種物又はワクチンに用いるのに適するレクチン、そのレクチン
を含むワクチン及び淋病の診断法に関するものである。さらに特に、この発明は
、淋菌から得られるネイセリア・ゴナリーア(Neisseria gonor
rhoeae)のレクチン、そのレクチンの単離法、それらから調製した接種物
、そして、又はワクチン及びそのようなレクチンの製法に関連している。
(技術的背景)
ネイセリア・ゴナリーア(Neisseria gonorrhoeae) (
N 、 g 、 )による報告された感染の年間の発生率は、約2百分件である
と見積られている0通常男性への淋菌感染は、比較的単純な性尿器怒染である。
普及した淋菌感染は淋病を者の1〜3%の率で発生すると報告されており、一方
、現在の治療によりこの病気の症状は軽いものである。
一方、淋病に感染した女性において、卵管炎が10〜20%の割で発生し、そし
て、うまく処理したときでさえ、卵管炎再発、異所性妊娠及び不妊などをもたら
す。アメリカにおいて卵管炎は毎年180万件の医師の診療があり、22万件の
病院収容がある。
今日までの公的健康診断による淋病の管理は、難かしい点がある。
死んだ淋菌の全菌体を含むワクチンは有効である。グリーンバーブ(Green
burg)等、(1971年)、プレチン、オン、ワールド、ヘルス、オーガニ
ゼーション([1u11.l1ld、 111th、 Org、>45巻、53
1頁“淋菌ワクチンの開発の予備研究”。
淋菌のペニシリン及びテトラサイクリン耐性病も発生している。
淋菌感染は、その細菌による粘膜のコロニー化、その表面膜へのコロニー化細胞
の粘着に仲介される過程を含んでいる。“粘着”という語は、表面への細菌の比
較的安定した付着を意味している。そのような粘着活性に寄与する構造を、アト
へシンと呼ぶ。
淋菌のピリは、反復する同一サブユニット(ビリン)を含む繊維状構造を有する
アトへシンである。N、 g、0M5II株において、各ピリンは、およそ18
.000ダルトンの分子量をもつ。淋菌の上皮表面への付着は、抗ピリ抗体で防
ぐことができる。細胞付着の防止に加えて、ビリタンパク質に対して生じた抗体
もオンソニン性である。
すなわち、それらは、血液中の食細胞により、侵入細菌を死滅することを仲介す
る。しかし、ワクチンとして、ビリ免疫原を用いることは、異種株のN、g、で
作られたピリの血清学的交差反応性の欠除のために、実際的ではない。
我々は、真核細胞表面のスフィンゴ糖脂質、例えば、ラクトシルセラミド、イソ
グロボトリオシルセラミド、ガングリオトリオシルセラミド及びガングリオトリ
オシルセラミドは、N、g、の認識及び粘着に関連し、そして、細菌のタンパク
質が、特異的な糖配列(炭水化物構造)を認識し、そしてこれに結合する能力を
有することから、糖脂質指向認識は、これまで報告されていない細菌性レクチン
により仲介されていることを発見した。接種物、ワクチンの構成物として又は診
断法において、この細菌性レクチンを用いると、ビリ免疫原のこれまで述べられ
てきた短所は考えなくて済む。
(発明の概要)
本発明は、GC>1と命名した、細菌性レクチン単離物を考えている。このレク
チンは淋菌から得られ、真核性炭水化物に結合し、そして、約22.400ダル
トンの相対分子量を有している。このレクチンの等電点は、約6.1から約6.
4の範囲にある。このレクチンは、ガングリオテトラシルセラミドに特異的に結
合する能力を有し、そして、淋病に対する接種物もしくはワクチンの構成物とし
ても有用である。このレクチンは、単離された形もしくは、薬学的に許容された
その塩として用いることができる。
さらに、本発明は、先に述べた単離レクチン又は、薬学的に許容されたその塩及
びそれらのための薬学的に許容されたキャリヤーから構成される接種物及びワク
チンについても考えている。また、薬学的に許容されたキャリヤー又は希釈物中
の効果的量の単離レクチン又はその先に述べた塩を、患者に投与することによる
淋菌感染に対する免疫法についても考えている。
さらに、本発明は、GCL−ルクチンをコードする単離されたDNA断片、生物
学的宿主内に存在する同DNA断片、前述生物学的宿主が発現ベクター中に存在
するGCL−1コード遺伝子の発現に適した生育培地に存在するか、適当な発現
培地中に含まれる培養物について考えている。
(図面の簡単な説明)
本発明の公開の一部は図式で行っている。
図1は、分子量マーカータンパク質の位置及びその右に1000ダルトン単位で
示した各々のそれらの相対的分子ffiを付けた、銀染色した12%5DS−P
AGEゲルの写真である。
レーンAは、約18.000ダルトンの相対分子量をもつ、精製したピリンタン
パク質を含んでいる。
レーンBは、実施例1で生じた粗GCL−1抽出物から、本発明のレクチン(G
CL−1)でアフィニティー吸着した後に残るタンパク質の試料を含んでいる。
GCL−1は検出法の限界内のレベルで存在しないことが示されている。しかし
、ピリンタンパク質は、18.000の分子量位置に見ることができる。
レーンCは、22.400ダルトンの位置に存在するアフィニティーで単離した
GCL−1を含んでいる。ピリン又はピリン関連のタンパク質は実質的に存在し
なかった。
レーンDは、実施例1に述べられているように、グロボシド・アフィニティー、
#離にかけた粗GCL−1抽出溶液の溶出液を含んでいる。この溶液は、糖脂質
アフィニティー・マトリクスへの非特異的結合を検出する、コントロールとして
用いた。本レーンに、GCL−1の有意な量が存在しなかったことは、ガングリ
オテトラシルセラミド・アフィニティー・マトリクスへのGCL−1の結合は、
特異的なレクチン・リガンド相互作用であることを示している。
レーンEは、次の分子量マーカータンパク質を含んでいる。α−ラクトアルブミ
ン、14;ソイビーン・トリプシン・インヒビター、20;トリプシノーゲン、
24;カルボニック アンバイトラーゼ、29;グリセルアルデヒド−3−ホス
フェート・デヒドロゲナーゼ、36;エフグ・アルブミン、45;及びウシ・ア
ルブミン、66(1000ダルトン単位で示しである)。
図2は、アフィニティー単離したGCL−1で生じた、ウサギ抗GCL−1抗体
を用いた、GCL−1含有溶液のウェスタン・プロット分析の写真である。指示
した相対分子量を有する(1000ダルトン単位で示した)タンパク質の予想位
置をプロントの左に示した。
レーンAは、実施例1で生した粗GCL−1抽出物の試料を含んでいる。GCL
−1は、約22,400ダルトンの相対分子量を有する主要タンパク質バンドで
ある。ピリン関連レクチンであると考えられている、2つのマイナータンパク質
バンドは、約29,000ダルトン及び約36.000ダルトンの位置にあるよ
うだ。
レーンBは、実施例1で作られたビリンクンバク質含有ベレントの試料を含んで
いる。GCL−1は、実質的に存在する一方、他のピリン及びピリン関連タンパ
ク質も実質的に存在する。
レーンCは、他のピリン関連タンパク質を実質的に含まない、アフィニティー単
離したGCL−1を含んでいる。
図3は、ウサギの抗GCL−1抗体が、N、g、により生じたGCL−1と同じ
相対的分子量をもつモレゼラ・ボビス(Morexella boνis)によ
り生産されたタンパク質と交差反応することを示すウェスタンプロットの写真で
ある。レーンAは、N、g。
MSII株ピリなし変異体B2の実施例1に従って調製した粗GCL−1抽出物
を含んでいる。レーンBは、モノゼラ・ボビス(Morex−ella boν
is)から同様の方法で二層製した抽出物を含んでいる。
図4は、pH勾配を応用したモノPクロマトフオーカシングカラムからの溶出に
よる実施例の粗GcL−1抽出物の精製を説明するグラフである。その溶出液を
、線型減少pH勾配で溶出してきた画分の、280ナノメーターの吸光度での光
学密度(0,D、280)での測定により、タンパク質をモニターした。GCL
−1を含むピーク画分は、約6.1から6.4よりわずかに高いpH範囲でクロ
マトフオーカシングカラムから溶出して来た。これを矢印で示す。
図5は、クロマトフオーカシングカラムで単離したGCL−1で生じたウサギの
抗GCL−抗体を用いた、GCL−1含有溶液のウェスタンプロット分析の写真
である。指示した相対分子量を有する(1000ダルトン単位で示した)タンパ
ク質の予想される位置をプロットの左に示した。
レーンAは、実施例5で述べるプラスミドpH3s6を含むが、淋菌DNA挿入
物を欠いている大腸菌(Escherichia coli)の培養試料を含ん
でいる。この試料は、実施例5で述べるように、5DS−PAGE試料バッファ
中で分解し、電気泳動及びウェスタンプロットにかけた。
レーンBは、実施例1で生じ、レーンAで述べたように分析した粗GCL−1抽
出物の試料を含んでいる。GCL−1は、約22.400ダルトンの相対分子量
をもつ主要タンパク質バンドである。
レーンCは、次に示す再染色した分子量マーカータンパク質(MD州、ゲイサー
スバーグ(Gaithersburg) 、ヘセスダ・リサーチ8ラボラドリー
ス(Bethesda Re5earch Laboratonis))を含ん
でいる。ミオシン、200;ホスホリラーゼb、97.4;ウシ血清アルブミン
、68;オバルブミン、43;モモトリブシンノーゲン、25.7.β−ラクト
グロブリン、1B、4;リゾチーム、14.3(すべて1000ダルトン単位で
示した)。
レーンDから0は、実施例5で述べるように、その中に淋菌DNAを挿入したプ
ラスミドpH3s6を含む大腸菌の各培養物由来の試料を含み、それらは、レー
ンAで述べたように分析した。
(発明の詳細な記述)
(定 義)
ここで用いている、種々の文法型の“抗体”という語は、抗原を特異的に結合す
る生物学的に活性のある抗体結合部位を含む、免疫グロブリン又は、その断片を
指す。
ここで用いている“複合体”という語は、レクチンがリガンドに特異的に結合し
たときに形成される生産物を指す。
ここで用いている“免疫反応物”という語は、免疫学的反応の生産物、すなわち
、抗原が抗体と免疫学的に結合したときに生じる実体を指す。
レクチンに関し、ここで用いられている“単離(された)″という語句は、他の
淋菌タンパク質を実質的に含まないレクチンを指す。
この語句が本発明の抗体調製物に関して用いられたときは、この語句は他の抗淋
菌タンパク質抗体を実質的に含まない抗GCL−1抗体を指している。
“リガンド”という語は、レクチンと特異的に結合する炭水化物構造を存する分
子を指している。
ここで用いている“薬学的に許容された塩”とは、単離されたレクチンの無毒性
のアルカリ金属、アルカリ土類金属又はアンモニウム塩を指している。このよう
な塩は一般に薬学的工業で用いられており、当分野でよく知られている方法で調
製される、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム及びア
ンモニウム及びそれに類するものを含んでいる。またこの語は、−iに、本発明
のレクチンを、適当な有機又は無機酸と反応させることにより調製する、無毒の
酸付加塩も含んでいる。代表的塩には塩酸塩、臭酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、酢
酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリル酸塩、ホウ酸塩、安息香
酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、
フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩及びそれに類するものが含まれる。
本発明で考えられている単離された淋菌炭水化物結合タンパク質又はレクチンは
、比較分子量標準物質としてα−ラクトアルブミン、ソイビーン・トリプシン・
インヒビター、トリプシノーゲン、カーボニック・アンバイトラーゼ、グリセル
アルデヒド−3−ホスフェート・デバイドロゲナーゼ、エラグ・アルブミン及び
ウシ・アルブミンを用いた、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲ
ル電気泳動(SDS−PAGE) によ、7測定され、約22,400ダルトン
の相対分子量を有していた。すなわち、本発明のレクチン(CGL−1)の電気
泳動移動度は、ソイビーン・トリプシン・インヒビターとトリプシノーゲンの間
である。5DS−PAGEによる分子量決定の技術及び信頼性は当業者にはよく
知られている。
ウニバー(Weber)等、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー
(J、 Biol、 Chew、) 244巻、4406−4412頁(196
9年)、ズワーン(Zwaan)、ジャーナル・オン・アナリティカル・バイオ
ケミストリー(Anal、 Bioche+w、) 21巻、155−168頁
(1967年)。
GCL−1は、約6.1から約6.4の等電pH値をもっと特性づけられている
。タンパク質の等電pn又は等電点は、そのタンパク等が正味の電荷をもたない
p)I値のことである。このように、等電点においては、そのタンパク質は、電
場で移動しない。ポリアクリルアミドゲルを用いた、タンパク質の等1ipH値
の測定法は、この分野ではよく知られている。アレン(AIien) R、C、
及びマウラー(Manrer)H,R,、(1984年)、ニューヨーク、ウオ
ルター・デ・グルイタ−(Waiter de Gruyter)、′ポリアク
リルアミドゲル中の電気泳動と等霊的フォーカシング;アーバスノフト(Arb
uthnot)J、P、及びビーリー(Becley) 、J、A、(1975
年)ロンドン、バターワース(Butter worths) 、“等霊的フォ
カシング。
GCL−1もスフィンゴ糖脂質、ガングリオトリオシルセラミド及びガングリオ
トリオシルセラミドに特異的に結合する。
レクチンが炭水化物リガンドに特異的に結合する能力を測定する方法は、この分
野では、よく知られている。これらの方法は、関係するレクチンによる、赤血球
細胞凝集の結合阻害研究又は、多I!類の沈殿化を含んでいる。アフィニティー
吸着剤としてレクチン又は、炭水化物リガンドを用いた、アフィニティー・クロ
マトグラフィーも本目的に使用することができる。
典型的には、既知量のGCL−1を、予め既知量のスフィンゴ糖脂質と混合する
。その混合物を、GCL−1が、そのスフィンゴ糖脂質リガンドと複合体を形成
するのに十分な時間である、約10分から約16−20時間までの、分から時間
に及ぶ予め決められた時間、生物学的検定条件下に維持する。
生物学的検定条件は、本発明の単離されたレクチン及びその目標リガンドの生物
学的活性を維持する条件である。そのような検定条件には、約4℃から約45℃
の温度範囲、約5から約9のpH値範囲、及び蒸留水から、約1モル濃度の塩化
ナトリウムの範囲のイオン強度を含んでいる。これらの条件を至適化する方法は
、この分野では、よく知られている。
形成したGCL−1含有複合体の存在を、この分野でよく知られている検定技術
により直接的又は間接的に検定した。GCL−1が特異的に結合するスフィンゴ
糖脂質を提供する方法は、この分野では、よく知られている。たとえば、ハンソ
ン(Hanson)等、FEBS。
170巻、15−18頁(1984年)、ブルイマ−(Breimer)等、ジ
ャーナル・オン・バイオケミストリー(J、 Bioche+++、) 90巻
、589−609頁(1981年)、カールソン(Marlsson)及びラー
ソン(Larson) 、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー(
J、 Biol、 Chew、) 257巻、557−568頁(1982年)
;フ″レイマー(Breimer )等、バイオメディカル・マス・スペクトロ
メトリー(Biomed、 Mass、Spectrom、 ) 6巻、231
−241頁(1979年)、ハンソン(Hanson)等、バイオケム・バイオ
フィズ・アクタ(Biochem、 Biophys、 Acta) 750巻
、214−216頁(1983年)。
本発明の他の特長はGCL−1を単離する方法に関するものである。この方法は
、上述の性質を利用した、このレクチンを含む溶液の分画を特徴とする
特に、GCL−1を含む溶液を、まず、N、g、からの表面タンパク質の抽出で
得られる。最後は、−S的には、等張、非変性バッファ溶液中で、N、g、を撹
拌することにより、その表面タンパク質をN、g、から切り離す。残香細胞及び
分解物を、遠心により、得られた溶液から分離した。生じた上清液は、GCL−
1を含み、そこからこのタンパク質を回収する。
タンパク質の分画に知られているゲル口過、ゲルクロマトグラフィー、クロマト
フオーカシング、限外口過、電気泳動移動度、イオン交換及びそれに類するもの
の種々の方法を、存在する他のタンパク質から、上述の特性をもつタンパク質を
分離するのに用いることができる。
たとえば、2種の異なる電気泳動技術を含む二次元ポリアクリルアミドゲル電気
泳動(2D−PAGE)法を、複雑な生物学的物質から再現的にタンパク質をj
11離することができることは、この分野ではよく知られている。溶液中のタン
パク質は、1次元目の等電フォーカシング(IEF)により、各等電点に従って
分離され、そしてさらに、二次元口で、5DS−PAGEにより分子量に従って
分離される。そのタンパク質の分離は、各次元で、無関係の特性に基づいている
ので、二つの次元のゲルにわたり、別々のタンパク質スボフトの実質的に均一な
分布が得られる。先に述べた、等電点及び分子量をもつ1つのタンパク質に対応
する分離スポフトは、レクチンGCL−1として単離され、従来法によりそのゲ
ルから回収される。
別に、GCL−1は、液体クロマトグラフィー・クロマトフオーカシングにより
、先に述べた上滑液中に存在する他のタンパク質から分離される。この方法は、
それらの等電点の差に従ってタンパク質の分離を行う。カラムを通して流れるp
++勾配により、それらのタンパク質は、フォーカスされ、それらの等電点の順
に溶出してくる。
先に述べた等電点範囲に対応する両分を採集し、そしてそのGCL−1を、従来
の方法により、採取した両分から回収した。
また、アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティー吸着及びそれに類す
るもののような、あるリガンドを特異的に吸着することができるタンパク質を単
離するための1つ以上の方法に、このタンパク質を含む溶液を適用することによ
り、GCL−1を単離した。単離のための、この方法を用いるとき、GCL−1
を含む溶液を、ガンクリオテトラオシルセラミドのような固体マトリックス固定
リガンドと混合する。得られた混合物を、GCL−1が固体マトリックス固定リ
ガンドと特異的に結合し、固相複合体を形成するのに十分な時間、生物学的検定
条件に維持する。それから、非特異的に結合したタンパク質を、通常、バッファ
で洗浄することにより、固相複合体から分離する。その後、GCL−1を固相固
定リガンドから解離し、単離型として溶出する。
加えて、レクチンを含む溶液から、GCI−1を単離するのに、以下に示すよう
に抗体を用いた免疫学的な方法を使うこきができる。
たとえば、免疫アフィニティー、免疫吸着及びそれに類するもののような方法は
、糖脂質リガンドに基づくアフィニティー精製に対して先に述べられたのき同様
の方法で行なわれた。
またGCI、−1は、よく知られている組換えDNA技1ホiを用いて、その単
離型を生成することができる。簡単に言うと、N、g、がらDNAを単離し、そ
れを剪断応力又は制限酵素により断片化する。
その断片をpHss6又はファージベクター・ラノ、ダのようなプラスミドベク
ターに挿入する。挿入物を含むそのベクターを、適合宿主に導入し、そこで増殖
させる。つづいて、そのベクター含有宿主をクローン化し、そのクローンについ
て、GCL−fil伝子を含むプラスミドの存在を検定する。
それから、GCL−1遺伝子を含むクローン化ベクターを、直接GCL−1遺伝
子産物を発現する、1つの発現ベクターとして用いることができる。ある場合に
は、さらに、別のベクター又は、別の生物学的宿主中での発現を可能にするGC
L−1遺伝子の処理が望ましい。
さらに、そのGCL−1遺伝子を、その遺伝子を含むプラスミドから単離し、適
当なヌクレオチド配列と組換え、転写−翻訳発現ベクターを形成する。それから
、そのGCL−1発現ベクターを、細菌宿主のような1つの適当な転写−翻訳原
核性発現媒体、イースト又は哺乳類宿主のような真核性発現媒体〔例えば、チャ
イニーズ・ハムスター・オバリー(CHO)細胞〕、又はデブリース(DcVr
1es)及びズバイ (Zuhay)により、プロシーディンゲス・イン・ナ
ショナル・アカデミー−iブ・サイエンス(Proc、 Na1l、 Acad
、 Sci、)USA、57巻:267頁(1967年)に報告されたようなイ
ンヒ) 口(in vitro)の媒体に導入した。
本発明の別の待はとして、本発明のレクチン又はその塩は、薬学的に許容された
希釈剤又はキャリヤーと共に、その効果量患者に投与したとき、N、g、の表面
上のGCI、−1と免疫反応を起こし、それにより、表面の膜に付着する抗体を
誘導することができる、接種物又はワクチンを作るのに用いられる。
種々の文法型で用いられている“接種物”という語はGCI−1に対する抗体の
誘導に用いる活性成分としての本発明のレクチンを含む組成物のことを示しでい
る。
接種物は、GCL−1を発現するN、 g、細胞を検出する診断法に使用するた
めに、マウス、ウサギ、ヤギ、馬及びそれに類するもののような哺乳類における
抗体の産生に用いることができる。また接種物は、本発明のレクチンの効果的量
を含むワクチンとして、淋菌による感染をワクチン化した人を予防し、そして淋
菌感染を防ぐのに用いることができる。もし必要なら二次接種も行なわれる。
種々の文法型の“ワクチン”という語は、ヒトの予防に関してここでは用いてい
る。またここで用いている種々の文法型の“接種物”止いう語は、淋菌GCI、
−1に免疫学的に結合する抗体の生成のために用いる活性成分としての、本発明
のタンパク質を含む組成物を示している。このように、ワクチン及び接種物は、
同一の成分を含んでいる。しかし、最終的な用途として異なるものが意図されて
いる。
単位投与当りの単離されたGCL−1の効果量は、他の事項の中で、接種された
動物種、その動物の体重及び選ばれた接種法に依存することが、この分野ではよ
く知られている。典型的には、接種物は、接種(投与)当り、約10マイクログ
ラムから約500ミリグラム、好ましくは、接種当り約100マイクログラムか
ら約100ミリグラムのGCL、−1を含んでいる。
“単位投与”という語は、動物に対する単一投与に適した物理的に分備の単位を
示し、各単位は、必要とされる希釈剤、すなわち、キャリヤー又は媒介物と共に
、望ましい治療効果を生ずるのに必要であると計算された活性物質の予め決定さ
れた量を含む。本発明の新しい単位投与に対する説明は、(a)その活性物質の
独自の特性及び遂行される特別な免疫学的効果、及び(b)明細書に詳しく公開
されているヒトへの免疫学的使用のための、そのような活性物質をユ1j合する
ための、この分野において基本的な制限、により示され、そしてこれらに直接依
存しており、これらは、本発明の特徴にもなっている。
典型的には、接種物は、レクチンを、水、食塩水又は、リン酸パンフ1食塩水(
PBS)のような、生理的に許容される希釈剤中にサスペンドすることにより、
本発明の単離された細菌性レクチンから調製する。もし必要なら、ワクチン又は
、接種物中に通常用いられている添加剤も用いる。そのような添加剤の実例とし
ては、ラクトース又はソルビトールなどのような安定化剤、及び水酸化、硫酸又
はリン酸アルミニウム、ミョウバン又は、アルギン酸塩などのような補助剤など
がある。沈殿化リン酸アルミニウム(ANPO4)は、ワクチンに対しては、特
に適した補助剤であり、一方、完全フロイント・補助剤(CFA)及び完全フロ
イント・補助剤(IFA)は、接種物に用いるのが望ましい。
本発明のワクチン及び接種物は、通常、腹膜内又は、静脈内、腸用カプセル又は
錠剤、生薬として、鼻スプレーとして、経口的注入により、そして、その他の経
路の投与法により投与される。
単離型の本発明の細菌性レクチンで誘導された抗体は、本発明のまた別のB様を
構成している9本発明の単離された抗体調製物は、GCL−1に対する実質的な
抗淋菌活性を示すのみである。
単離型のGCL−1に対する抗体は、これまでに述べてきた接種物を用いた免疫
化により、ウサギ、ヤギ、馬及びそれに類するもののような哺乳類に生ずる。ま
た単離された抗体調製物は、この分野でよく知られている方法により、本発明の
単離された細菌性レクチンを用いた免疫アフィニティー精製により作ることがで
きる。
単離した抗GCL−1抗体調製物も、参考文献に組み込んである、ナイマン(N
iman)等のプロシーディンゲス・イン・ナショナル・アカデミ−・オン・サ
イエンス(Pro、 Nath、 Acad、 Sci、) U S A。
7924−7928頁(1985年)に述べられている、ハイプリドーマ技術を
用いて調製できる。
モノクローナル抗体が生ずるハイブリドーマを作るために、ミエローマ又は、自
己増殖細胞系列を、GCL−1で高度免疫化したホ乳類の腹水から得たリンパ細
胞と融合する。
そのミエローマ細胞系列は、リンパ細胞と同じ種由来のものが望ましい、129
GfiX”株のマウスは好ましい哺乳類である6本発明で用いるのに通したマウ
ス・ミエローマには、ハイポキサンチン・アミノプテリン・チミジン−感受性(
HAT)細胞系列P3X63−−Ag8.653 (ATCCCRL 1508
0)及びSp210Ag14(ATCCCRL 1581)がある。
典型的に、肺細胞をポリエチレングリコール(PEG)1500を用いて、ミエ
ローマ細胞と融合する、融合したハイブリッドを、HAT感受性により選択する
0本発明の抗体を生産するハイブリドーマを、ここで述べる抗GCL−1酵素結
合免疫吸着検定法(ELISA)を用いて同定した。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清からのみでなく、望ましいハイ
プリドーマが導入される哺乳類の腹水液からも、−m的により高濃度な形で得る
ことができる。腹水液を用いたモノクローナル抗体の産生は、この分野ではよく
知られており、ここでさらに説明する必要はない。
本発明の単離された細菌性レクチンは、血液、血清又は血孕中の抗GCL−1抗
体の存在及び量を測定するのに特に有用である。
1つの態様において、本発明は、次のステップを含む生体試料中の抗GCL−1
抗体の存在を確認する方法も考えている。
(al 検定する生体試料を準備する。典型的な試料としては、既知量の血液、
及びより好ましくは、血清又は血漿として提供される。
血液、血清及び血漿試料を提供する方法は、この分野では、よく知られている。
山)次に、予め測定された量の本発明の単離された細菌性レクチンを準備する。
(C1その後、その生体試料を、単離された細菌性レクチンと混合し、免疫反応
混合物を作る。
fd+ 得られた混合物を、分から時間の予め決められた時間、生物学的検定条
件に維持する。試料中に存在する抗GCL−1抗体が、免疫学的にレクチンに結
合し、免疫反応物を作るのに、通常、約10分から約16〜20時間で十分であ
る。
免疫反応のための生物学的検定条件とは、レクチン−リガンド結合検定法に述べ
られているものと同じである。
tel それから、その生物学的検定条件に維持した混合物について先に述べた
維持時間に形成した免疫反応物の存在を検定した。免疫反応物の存在は、抗GC
I−1抗体が試料中に存在することを示している。
抗GCL−1抗体を含む免疫反応物の存在を検定は、直接的に、あるいは間接的
に、この分野でよく知られている検定法を用いて行なった。例えば、米国特許1
1h 4,536,479.隘4,233,401゜NQ 4,233,402
.隘3,996,345で述べられている均一検定システムが用いられた。
好ましい態様において、レクチンに結合した抗GCL−1抗体の存在は、次に示
すステップで検定された。
(i)生体試料を、生体中に存在するヒト免疫グロブリンと結合し、免疫反応物
を作る、生物学的に活性な、標識抗体と混合する。その標識抗体は、免疫反応物
中に、その抗体が存在するという信号を発することができる。
(ii >そのように作った標識抗体/生体液試料混合物を、その抗体が、第1
の免疫反応物として存在する抗GCL−1抗体との免疫反応物を作るのに十分な
、予め決められた時間、生物学的検定条件に維持する。免疫反応は、ステップ(
d)に述べた方法と同様に行なわれる。
特に好ましい検定法において、本発明のレクチン及び標識抗体は生体液体試料中
に存在する抗GCL−1抗体と免疫学的に結合し、その一部に結合した標識を含
むサンドインチ免疫反応物を形成する。すなわち、標識を含むサンドインチ免疫
反応物は、抗GCL−1抗体1分子が、(11抗体として、本発明のレクチンと
、(2)抗原として標識抗体と免疫反応を起こしたとき形成する。好ましい態様
において、その免疫反応物の一部を形成しない標識抗体(すなわち、抗GCL−
1抗体と免疫的に結合しないもの)は、13iTh抗体の存在を検定する前に、
好ましくは、洗浄により、免疫反応物から分離される。
(iii )それから、抗GCL−1抗体を含む免疫反応物の一部として結合し
ている標識抗体の存在を検定した。これは、生体試料における抗GCL−1抗体
の存在の検定である。免疫反応物の一部として結合した標識抗体量を測定し、そ
して、その測定は、その試料中の抗GCL−1抗体量を定量するのに用いた。そ
の量がゼロのこともあり、もちろん、それは、検出限界内で、その試料中に抗G
CL−1抗体が存在しないことを示している。標識した第2の抗体の存在及びそ
の量の検定方法は、用いられるiiiに依存し、その標識及び方法は、この分野
ではよく知られているものである。
タンパク質性抗体の標識法もよく知られている。たとえば、ハイブリドーマによ
り産生された抗体は、その組織培養培地中の一成分として提供された放射性同位
元素を含むアミノ酸の代謝的取込みにより1にすることができる0例えば、ガル
フレ(Galfre) 、G及びミルスタイン(Milstein) c、l
メソッド・イン・エンザイモロジー(Meth、Enzymol、 ) 73巻
、3−46頁(1981年)参照、活性官能基を介してのタンパク質結合技術も
特に有効である。例えば、オーラミース(Aurameas)等、スカンジナビ
アン・ジャーナル・オン・イムノロジー(Scand、 J、 Is+muno
1.) 8巻、付録7 : 7−23頁(1978年)及び米国特許It 4,
493,795 (両方とも参考文献に掲げである)参照。
加えて、部位特異的結合反応も行なわれ、それによって、その標識は、第2の抗
体と、その目標抗原との免疫反応は、実質的に妨害されることはない。例えば、
ロッドウェル(Ro’dwe11)等、バイオテクノロジー(Biotech、
) 3を189−894頁(1985年)参照。
標識手段には、それらを変性することなく、抗体又は抗原に化学的に結合し、有
効な免疫蛍光性トレーサーとなる蛍光団(色素)を形成する蛍光標識試薬がある
。適当な蛍光標識試薬には、フルオレセイン・イソシアネート(F I C”)
、フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)、5−ジメチルアミノ−
1−ナフタレンスルホニルクロライド(DANSC) 、テトラメチルローダミ
ン・イソチオシアネー)(TRITC)、リサミン、ローダミン8200スルホ
ニル クロライド(RB200SC)及びそれに類する蛍光色素がある。免疫蛍
光分析技術の説明は、参考文献に掲げた、デル力(DeLuca)の“免疫蛍光
分析”、道具としての抗体、マーカロニス(Marchalonis )等編、
N、Y、ニーニーヨーク、ウィリーアンド・サン刊(Wiley & 5on
s Ltd、) 、 (1982年)、189−231頁にみることができる。
好ましい態様において、指示団は、ホースラディツシュ・パーオキシダーゼ(H
RP)、グルコース・オキシダーゼ又はそれに類するものである。基本的な指示
団がホースラディツシュ・バーオキシダーゼ(HRP)又は、グルコース・オキ
シダーゼである場合、抗体リガンド複合体(免疫反応物)が生成した事実を視覚
化するのに、付加的試薬が必要である。HRPに対する、そのような付加的試薬
には、過酸化水素及び、ジアミノベンジジンのような酸化色素前駆体が含まれる
、グルコース・オキシダーゼに有効な付加的試薬は、2.2′−アジノージ−(
3−エチルーヘンズチアジンンーG−スルホニンクアシンド) (ABTS)で
ある。
放射性元素も有用な標識試薬となる。
代表的放射性標識試薬は、ガンマ線放出を行なう放射性元素である。 +2J、
+25■、+2J、III l、+3J及び51(rのような、それ自身、ガン
マ線を放出する元素は、ガンマ線放出性放射活性元素指示団の1つを代表する。
特にIfJは好ましい。別の有効な指示団には、それ自身、陽電子を放出するI
’C,”F、ISO及び13Nのような元素がある。放出した陽電子は、動物の
体に存在する電子と衝突して、ガンマ線を生ずる。II+インジウムのようなベ
ータ線放出を行うものも有効である。
本発明の検定法及びシステムは、固体マトリックスに固定し、固体サポートを形
成している本発明のレクチン又は、抗レクチン抗体を利用することができる。
典型的には、レクチン又は抗レクチン抗体は、他のモードの固定と同様、当業者
にはよく知られている、いくつかのモードの吸着が用いられているけれども、水
性媒体からの吸着により固体マトリックスに固定している。典型的なモードは、
網状デキストロース又はセルロースのようなグルコース含有マトリックスと、シ
アノゲンブロマイドとの反応で生成した反応性カルボニル官能基と、レクチンも
しくは、抗レクチン抗体との反応である。
結合体としてのグルタルアルデヒドは、ラテックス粒子及びそれに類するものと
共に、後に議論される。
有効な固体マトリックスは、この分野においてよく知られている。
それらの物質には、NJ州、ビス力タウエイ (Piscataway )ファ
ルマシア・ファインケミカル社から、登録商標セファデックスとして市販されて
いる網状デキストラン、アガロース、IL州、北シカゴのアボット・ラボラトリ
−(Abbott Laboratories)から市販されている直径約1ミ
クロンから約5ミリメートルのポリスチレンビーズ、ポリ塩化ビニル、ポリスチ
レン、網状ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、膜、片又はヘラ状のナイロ
ン織物、ポリスチレン又はポリ塩化ビニルでできたマイクロプレートのウェル、
チューブ、板、及びそれに類するものが含まれる。
凝集型検定法に有用なラテックス粒子も固体マトリクスとして有効である。その
ような物質は、日本・東京の日本合成ゴム社から市販されており、アニオン住方
ケン中に分散されたカルボキシ官能性粒子として説明されている。これらの粒子
の典型的ロフトは、0.308ミクロンの平均直径をもっており、またカルボキ
シ基当り、約15から約30オングストローム角の、平均カルボキシ官能基の分
布をもっている。
使用前に、粒子を、1.3−ジアミノ−2−プロパツールのようなジアミンと反
応させ、フリーのアミノ基を維持したまま、粒子のカルボキシ基との多くのアミ
ド結合を形成する。その後、フリーのアミンを、グルタルアルデヒドのようなジ
アルデヒド及び抗体又は抗原と反応させ、シッフ塩基反応生成物を作る。その後
、そのシッフ塩基反応生成物をホウ素化水素ナトリウノ・のような水溶性還元剤
で還元し、有用な固体サポートを作る。
当業者は、ここで利用できる、多くの固相免疫検定法があることが理解できるで
あろう。典型的な有効固相検定法には、酵素増rIJ免疫検定技術(EMIT)
及び蛍光免疫検定法などが、特に議論したELISAのほかに含まれる。しかし
、本発明のレクチンと、抗GCL−1抗体との反応で与えられる信号を示す方法
なら、どれでもよい。これらの検定法の各々は、その免疫反応、及びそれによる
本発明のレクチンと、検定すべき抗体との結合を合図するのに1つの指示手段を
用いた、単−又は2つの抗体技術を採用できる0代表的な技術は、マジオ(Ma
ggio)の、OH州、クリーブランド(C1eveland)、CRCプレス
(Press)版、“酵素イムノアフセイゝ(1981年)、及びゴールドマン
(Goldman)の、NY州、ニューヨーク、アカデミツク・プレス(Aca
demic Press )版、′蛍光抗体法”に説明されている。
抗GCL−1抗体について生体液体試料を検定する特異的方法の1つの態様は、
免疫反応を連続して行なう非競合イライザ法である。
その検定法においては、本発明のレクチンの部分標本(例えば、一般に約1から
約500μg)を、マイクロプレートのウェルの内壁に固定し、固体サポートを
作る。
提供された生体試料中に存在する抗GCL−1抗体を、固相レクチンと免疫反応
させる。これは、マイクロプレートのウェル中の血′清又は血景のような試料(
予め希釈したもの)約10から約200−の部分標本を、固相固定レクチンと混
合し、固/液相混合物を作ることにより行う。その混合物を、試料中に存在する
抗GCL−1抗体が免疫学的にレクチン分子と結合し、そして、固相免疫反応物
を作るのに十分な、予め決められた時間維持する。さらに、その固及び液相を洗
浄し、非特異的に結合した物質を除去する。
固相免疫反応物として存在する抗GCL−1抗体(すなわち、固相固定レクチン
に結合した抗(1,CL−1)を、酵素標識第二抗体と免疫反応させる。このこ
とは、例えば水性バッファ溶液中、酵素標識第二抗体、約0.1から約10μg
等の部分標本、好ましくはHRP−標識ヤギ抗ヒト1g抗体を混合し、第二の固
/液混合物を作ることにより行なわれる。この第2の混合物を、上述のとおり維
持し、レクチン、抗GCL−1抗体、及び酵素標識抗体からなる固相免疫反応物
“サンドイッチ”を形成させる。
先に述べたように、固相から液相を分離した後、HRPに対する過酸化水素の存
在化、0−フェニレンジアミン(OPD)のような色素原的な基質の部分標本を
、固相免疫反応物を含むマイクロプレートのウェル中に加え、第三の固/液混合
物を作った。この混合物を免疫反応物として存在する酵素が、基質の相対量を生
産物に転換するのに十分な、予め決められた時間維持する。それから、生成した
発色液の光学濃度を測定し、そして、既知量の試薬を含む溶液を用いて得られた
結果と比較した。
好ましくは、キット型の、本発明の抗GCL−1抗体法を実行するのに有用な診
断システムは、別に包装しであるが組合せて用いる、(81本発明の単離された
レクチン及びfbl抗GCL、−1抗体とレクチンとの免疫反応を知らせる標識
抗体を含んでいる。好ましくは、標識抗体は、酵素に抗体そのものが結合したも
のである。
好ましい態様において、そのシステムは、レクチンが固定し、固体サポートを作
る固体マトリックスを含んでいる。有用な固体マトリックスはすでに述べてきた
。しかし、好ましくは、その固体マトリックスとして、マイクロプレートのウェ
ルが適している。
さらに好ましい態様において、そのシステムは、ポジティブ コントロールとし
て、本発明のレクチンに対して生しる抗体も含んでいる。
既知量のレクチン及び標識抗体を準備する。この量は少なくとも1回の検定を行
うのに十分なものである。典型的には、そのレクチン及び標識抗体は、この分野
ではよく知られているように、水、食塩水又は、バッフ1で、決った体積に希釈
するよう設計された型及び量で与えられる。
そのシステムには、その他にもパッケージが含まれている。それらのパッケージ
には、(i)乾燥状態もしくは、液状のバッファ塩、(ii)O−フェニレンジ
アミンのような酵素基質及びそれに類するものが含まれている。
生体試料中のG CL −1の存在を検定する方法もここでは考えられている。
一般に、頚管又は性尿器の試料のような、検定すべき生体試料を準備し、それを
、本発明のレクチンにより誘導される抗体結合部位を含む抗体と混合する。その
混合物を、その抗体分子が、生体試料中に存在するGCL−1と免疫反応するの
に十分な、予め決めた時間、生物学的検定条件に維持する。それから、その免疫
反応量を、その検定生体試料中の、GCL−1分子の存否を決定することで測定
する。
その1つの典型的態様は、頚管又は性尿器試料を平板な顕微鏡スライド′にアセ
トンで固定する、免疫蛍光検定法である。本発明に従って、例えばウサギ中で生
じた、一般的には、約10マイクログラムから約5000マイクログラムの抗体
の部分標本を、よく知られた方法により、そのスライド上で、インキュベートし
た。
未免疫反応の抗体を洗いおとし、そして、スライド上の非特異的結合部位を、B
SAのようなりンバク質でブロックした後、ヤギの抗ウサギ抗体のような第2の
抗体を、そのテストスライド上でインキュベートする。その第2の抗体は、フル
オレセイン・イソチオシアネート(FITC)のような蛍光色素に結合させるこ
とにより、標識化する。
この第2のインキュベージタン後、このテストスライド上の第1の抗体に結合し
7た、FITC標mしたヤギの抗ウサギ抗体とはそのままに、過剰の第2の抗体
を洗いおとず。FITC標識した抗体の存在を、蛍光顕微鏡を用いて検出し、そ
れにより、N、ゴナ−リア(N、 Gonorrhoeae )感染の存在を知
ることができる。
この指示手段は、本発明の抗体に直接結合していない場合は、抗体とは別に包装
される。アセトン固定した頚管又は性尿器試料のような生体試料と混合したとき
、その抗体は、GCL−1と免疫反応を起こし、免疫反応物を作る。そして、そ
こに存在する指示手段が免疫反応産物の形成を知らせる。
さらに本発明を、次に掲げる実施例により説明する。
実施例I GCL−1の生成と単離
N、g、の09株同fiN、g、MS 11株のビリ化透明及び非ビリ化透明変
異体を、GCBCリプレート上育させた(29g GCメディアム・ベース(デ
ィフコ)、1gバタトアガー(ディフコ)、8−サブルメントA(400gグル
コース、10gL−グルタミン、20■コカルポキシラーゼ/リフドル)、及び
0.8 W11サブルメントB (1,25g Fe(NO3/ 250+d)
/総体積soo震g)、ビリ化及び透明の発現型は、ジェームス(James
)等〔インフエクト・イムノ・(Jnfect、 7mmun、 ) 19巻8
332−340頁(1978))及びスワンソン(Swanson)、(J、イ
ンフエクト・イムノ(Infect。
Immun、) 19巻、320−331頁(1978年)〕により述べられた
システムで区別される。
プレートに接種し、それを35℃で5%CO,雰囲気下で18時間インキュベー
トする。得られた細菌層を、まず、各プレートに1.25M1の50mM)リス
バッファ 〔トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、MO州、セントルイス
、シグマ・ケミカル社(pH9、5> )を加えることにより収穫した。それか
ら、収穫した層中の細胞を分散させ、パスツールピペットを用いて、50m1の
ポリカーボネート製遠心管に移し、0℃で保存した。
つづいて、その保存株を3分間ミキザーで撹拌し、細菌の表面タンパク質を切り
離した。さらに、生じたリスベンジョンを、ベックマンJA−20D−ターを用
い、10.000rpm 、 4℃、20分間の遠心を行ない、ビリンタンパク
質含有ペレット及びG CL、 −1含有上清を作った。その上清を、タンパク
質を凝集及び沈殿化するために、6.000からa、 ooo分子量排除透析膜
を用い(NJ州、スプリングフィールド、フィッシャー・サイエンティフィック
社(Fischer 5centific (:O,、) 、スペクトロボア(
Spectropor> )、4℃で24時間、ビリ・バッファ(150mM)
リス、150 mMNaC!、pH7,5)に対し、透析した。その沈殿したタ
ンパク質を先に述べたように遠心後のベレットとして収穫した。そのペレットを
、10mNの50mM)リス(pl+9.5 )に懸濁し、これにより、粗GC
i−−1抽出物を得た。この粗GCL−1抽出物は、−20℃で保存した。
GCL−1を精製するだめのアフィニティー吸着体は、ガングリオテトラオシル
セラミドを固体マトリックスに固定して調製した。
ポリ塩化ビニル製の96穴マイクロプレートの各ウェルに、200ナノグラムの
ガングリオテトラオシルセラミド(PA州、ベルホンテ(Belle font
e) 、スペルコ社(5upelco lne、))を含むメタノール50マイ
クロリツトルを加えた、それからそのメタノールを蒸散させ、各ウェルにガング
リオテトラオシルセラミドのたい積物を残した。ウェル中の非特異的結合部位は
、各ウェルに、2%のウシ血清アルブミン(BSA)50マイクロリツトルを加
え、その混合物を室温で4時間維持し、それから、逆さにして振るこきにより、
過剰のブロッキング溶液を除くことにより、ブロックを行った。
固定したガングリオテトラオシルセラミドを有するマイクロプレートのウェルに
、50マイクロリツトルの粗抽出物を導入することにより、上述の粗抽出物から
アフィニティー吸着によって、GCL−1を単離した。生成した調製物を約8時
間維持し、それにより、粗抽出物中に存在するGCL−1をガングリオテトラオ
シルセラミドに結合した。未結合のタンパク質はウェルを逆さにし、振ることに
より取除いた。それからそのウェルを50マイクロリットルづつのPBSで5回
洗浄した。
特異的に結合したGCL−1は、各ウェルに50マイクロリツトルの2%ラウリ
ル硫酸ソーダ(SDS)を含むPBSを加えて溶出した。このようにしてできた
調製物を室温に30分維持し、それにより、存在するGCL−1を溶解した。そ
れから、得られたGCL−1含有溶液をウェルから取り出し、そして、−20℃
で保存した。
アフィニティーで単離したGCL−1およそ1マイクログラムが各マイクロプレ
ートのウェルから得られる。
加えて、G CL −1は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(F P
L C)によっても上述の粗抽出液から単離された。非ピリ化N、g、MS11
株B2変異体から生成した粗GCL−1抽出物を、まず、クロマトフオーカシン
グのためのGCL−1抽出物を調製するため、前述の透析膜を用い、4℃で24
時間、FPLC平衡バッファ(25mMアミジゾール、pH7,4>に対して透
析した。透析したGCL−1抽出物をFPLC平衡バッファで予め平衡化したモ
ノPクロマトフオーカシングカラム(NJ州、ビス力タウェイ(Piscata
way) 、ファルマシア社(Pharmacia Inc、) F P L
Cシステム〕にかけ、そして1対8に滅菌水で希釈し、pH4,0に調整した、
ポリバッフ774(MO州、セントルイス、シグスケミカル社(Sigma C
he+R3cal Co−+) )で溶出した。
そのよ゛うなりロマ1−フォーカシングカラムでの、粗G CL−17+t+出
物の典型的運転の溶出曲線を図4に示す。溶出画分は、280ナノメータでの溶
出物の光学密度(0,0,280)を測定することにより、タンパク質をモニタ
ーし、またそのρ11を測定した。タンパク質を含む、PI(約6.1から6.
4までの間で溶出してきた両分を回収し、それを−20℃で保存した。
実施例2 5DS−PAGEによる単離された細菌性レクチンの分子量測定
実施例1で生成した、精製細菌性レクチンの相対分子量を、リムリ (Laem
mli)、υ、K、、〔ネイチ十−(Natureン、227巻、680−68
4頁(1970年)〕ノ方法に従ッテ、5DS−PAGEにより測定した。最終
的に、12%及び15%ポリアクリルアミドゲルを鋳込み、そして、レーン当り
の全タンパク質をおよそ、25がら200マイクログラムで運転した。次に掲げ
る分子量マーカータンパク質及びダルトン(d)で表したおよその分子量は、コ
ントロール又は標準1ノーンに示した:α−ラクトアルブミン、14.200;
ソイビーン トリプシン・インヒビター、20.100 ; )リブシノーゲン
、24、000 ;カーボニック アンバイトラーゼ、29.000 ;グリセ
ルアルデヒド−3−ホスフェ−1−デヒドロゲナーゼ、36.000 ;−Tツ
ブ・7 )Izブミ:’ ; 45.000 ; ’) シ・”rJ+zブミン
、66.000 (スヘrMO州、セントルイス、シグマケミカルがら入手した
)。電気泳動後、タンパク質のバンドを、コマージブリリアント・ブルー(シグ
マ)による染色、又は、CΔ州、リッチモンド(Richmond 、バイオラ
ドから入手した、シルバースティンを用い、メリル(MrHrriり等〔(アナ
リティカル・バイオケミストリー(八〇al、 Biochem、月(]5@、
36】頁(1980年)〕の銀染色法により、視覚化した。
ゲルの分析により、試料レーン中に、トリプシノーゲンよりも人きいが、ソイビ
ーン・トリプトシン・インヒビターよりも小すい移動度で、相対分子M22.4
00ダルトンを有する1つの主要バンドが明らかになった。図1に示し7たよう
に、このバンドは、アフィンティー精製した細菌性レクチンGCL−1であった
。
ある場合には、染色する前にこのタンパク質バンドを、電気泳動的にニトロセル
ロース(NH州キーン(Keene) * シュレイチャー・アンド・シュエル
(Sehleieher & 5chuell)、カタログ番号、BA85〕に
固定し、トウビン(Towbin)等〔プロシーディンゲス・イン・ナショナル
・アカデミ−・オン・サイエンス(Proc、 Nath。
Acad、 Sei、) U S A、76巻、4350−4354頁(197
9年))で述べられているような、ウェスタンプロットを作った。ニトロセルロ
ースに固定したGCL−1タンパク質は、まず、そのプロットを、実施例1で述
べた粗G CL −I抽出物でウサギを免疫化することにより調製したウザギ抗
GCL−1抗体と免疫反応を起こさせることにより検出した。ニトロセルロース
に固定化したGCL−1に免疫学的に結合したウサギ抗GCL−1抗体を、アル
カリ・ホスファターゼ標識したヤギ抗つサギ抗Igと免疫反応させ、た、標識の
存在、及びそれによるGCL−1の存在は、wr州、マジソン(Madison
)、プロメガ・バイオチク、(Promega Biotech)社製(カタロ
グ番号P3930)のプロトプロット(ProtoBlot)免疫プロンティン
グシステムを用いて視覚化した。
実施例1に述べたアフィニティー操作の種々の単離ステップから得られた生産物
のウェスタンプロットを図2に示す。これらのプロットの解析は、アフィニティ
ー単離したGCL−1は実質的に他の淋菌ビリン関連タンパク質を含まないこと
を明らかにしている。
実施例1で述べたN、g、粗抽出物と同様にして調製した、モレクセラ・ボビス
(Morexella bovis )の粗タンパク質抽出物のウェスタンプロ
ットを図3に示す、そのプロットの解析で、モレクセラ・ボビス(Morexe
lla bovis )は、抗GCL−1抗体と免疫反応を起こし、そして、約
22.400ダルトンの見が番ノ上の相対分子量をもつことが分った。
実施例3 2DPAC;Eによる、単離と特性化実施例1で生成したGCL−1
を含む、粗、非アフィニティー・精製化細菌表面タンパク質抽出物を、CA州、
ザンフランシスコのボーファー・サイエンティフィノクィンスッルメント(Ho
eferSctentifie Instruments)のシステム2−D二
次元ゲルシステムを用いた2D−PAGEにより単離、特性化を行った。635
%ポリアクリルアミドと、1つは3から10のpH勾配を作ることができるもの
と、他の1つは、4から6.5のpH勾配を作ることができる2組のアンホライ
ト(MD州、ガイサースバーグ(Ga i thersburg)、LKBイン
スッルメント社〕を含む、アイソエレクトリンク・フォーカシング(IEF)ゲ
ルを130x3ミリメーターの酸洗浄ガラス管内に調製した。そのゲルに、およ
そ25マイクログラムのタンパク質を含むGCL−1含有溶液又は、実施例2で
述べた分子量マーカータンパク質を含むコントロール溶液を重層した。さらに、
ゲル上に、試料重層溶液[9Mウレア、2%の両アンフオライト及び10%のポ
リエチレン(9)オクチル フェニルエーテル(ノニデフトP40))を重層し
た。つづいて、そのタンパク質を、400ボルト定圧で12時間及び800ボル
ト定圧で1時間電気泳動した。
チューブからフォカスしたゲルを取り出し、処理バッファ(0,0625M)!
/X塩は、pH6,8,2%SOS、10%グTJ セリン、5%2メルカプト
エタノール)で30分間2度洗浄し、それにより、その等電pH値に従って分離
したタンパク質を含むIEFゲルができる。
アイソエレクトリック・フォーカシングしたタンパク質を、5DS−PAGEに
より、その相対分子量に従って分離する。I E 1”ゲルを15%5DS−P
AGEゲルの先端に固定し、0.1%フェノールレッドをトラッキング色素とし
て用い、約30ミリアンペア定電流で運転した。トラッキング色素がゲルの底に
ついたとき、電気泳動を止めた。つづいてそのゲルを、コ7ツシー・ブリリアン
ト・ブルー又は、実施例2で述べた銀染色で染色するか、又は先に述べたように
、タンパク質をゲルから、トウビン(Towbin)等が述べたニトロセルロー
スに移した。
ゲルの解析は、約22.400ダルトンの相対分子量、すなわち、GCL−1の
相対分子量をもつタンパク質に対応する単一のタンパク質スポットを明らかにし
た。この22.400ダルトンのタンパク質の等電pH値は約6.1から約6.
4である。
実施例4 マウス小腸からの純粋なガングリオテトラオシルセラミドの調製
マウス小腸からの純粋なガングリオテトラオシルセラミドの調製のため、次のよ
うな一連の抽出及びクロマトグラフィー分離が行なわれた。溶媒は使用前に乾煙
及び再蒸留したものを使用した。
(抽 出)
小腸をマウスから外科的に取り出し、小片に切ったのら、乾燈するまで凍結乾怪
する。凍結乾燥物質約130グラムを、この分野でよく知られているソックスレ
ー装置を用い、2ステツプの抽出にかけた。第1に、2リツトル丸瓶中、約1リ
ツトルのクロロホルム/メタノール(2対1、体積比)と凍結乾燥物質とを混合
し、約24時間、アスベスト絶縁した電熱装置中70℃に加熱した。溶媒をデカ
ンテーションした後、1.5リツトルのクロロホルム/メタノール(1対9、体
積比)を用いて、その物質の第2回目の抽出を同様に行った。そして、その溶媒
をデカンテーションし、第1回目のものと合せた。合せた溶媒抽出物を窒素気流
下、乾燥するまで蒸発させた。
(アルカリ分解)
その後、乾燥した腸抽出物を、500ミリリフドルの0.2 MKO)Iメタノ
ール溶液に溶かすことによりアルカリ分解した。そして、その溶解抽出物を、時
々振とうして、乾燥抽出物を分散させる5個のガラスピーズを含むガラス瓶中、
室温に3時間維持した。その後、得られた混合物を氷酢酸10ミリリツトルで中
和し、1リツトルのクロロホルム/水(3: 2.体積比)を加え、そして、流
水に対し、4日間透析した。それからアルカリ分解抽出物は、それにまず500
ミリリツトルのトルエンを加え、それからロータリーエバポレーターを用い、得
られた混合物を乾燥することにより、70’Cで蒸発した。その乾燥試料を約5
00ミリリツトルのクロロホルム/メタノール(2対1、体積比)に再溶解し、
濾過して、不溶物質を取り除いた。濾過装置は約500ミリリツトルのメタノー
ルを用い、残存する抽出物を洗い出した。それから濾液を合せ、窒素気流中で蒸
発し、それから約50ミリリツトルのクロロホルムに再溶解した。
(ケイ酸クロマトグラフィー)
アルカリ分解腸抽出を、ケイ酸カラムでクロマトグラフし、糖脂質及びアルカリ
耐性リン脂質から、コレステロール及び脂肪酸メチルエステルを除いた。
100メツシユ、試薬級のケイa (MO州、セントルイス、マリンクO,ト・
ケム・ワークス(Malinckrodt Chew、 Works))を三種
の粒子サイズに分けた二級44ミクロン以下、約44〜74μm1及び約74μ
m以上。約44μm以下の画分をメタノールに懸濁(31に1kg)L、ついで
、30分後メタノール層を吸引して、次の操作で使うカラムの底の焼結ガラスフ
ィルターを通る非常に小さい粒子を除くことにより洗浄した。
約44から約74μmのサイズに分画されたケイ酸粒子を、クロロホルムを用い
、50グラムカラムに充填した。そして、先にクロロホルムに溶解した、アルカ
リ分解抽出物をそのカラムにかけた。
そのカラムに、500ミリリツトルのクロロホルム、ついで500ミリリツトル
のクロロホルム/メタノール(98:2 体積比)を加え、i!遇させた。それ
から、500ミリリツトルのクロロホルム/メタノール(1:3 体積比)、つ
いで500ミリリツトルのメタノールを加え、その2つの添加からの溶出液を集
め、その合せた溶出液の液体部分を窒素気流中で蒸発し、乾燥抽出物を作った。
(イオン交換クロマトグラフィー)
ケイ酸カラムからの乾燥抽出物を約10ミリリツトルのクロロホルム/メタノー
ル(2: l、体積比)に溶解し、クロロホルム/メタノール(2:1、体積比
)を用いて、酢酸型でパンクした20グラムのDEAEセルロース(NJ州、ク
リフトン(C11fton)、ワットマン(What+++an Inc、)+
D E 23 )のカラムにかけた。室温における約1日から2日のカラム平
衡時間の後、その試料を、400ミリリンドルのクロロホルム/メタノール(2
:1、体積比)、ついで400ミリリツトルのメタノールで溶出した。その2つ
の溶出液を合わせ、その液体部分を窒素気流中で蒸発し、乾燥抽出物を得た。
(アセチル化)
DEAEカラム溶出及び乾燥した抽出物を10ミリリツトルのクロロホルムに溶
かし、各10ミリリツトルのピリジン及び酢酸無水物をそれに加え、その混合物
を、暗所、室温に約12から18時間維持することにより、アセチル化を行った
。アセチル化反応の後、各25ミリリツトルのメタノール及びトルエンを加え、
その試料をまず窒素気流中で、約60℃に維持しながらエバポレートし、ついで
ロータリーエバポレーターを用いて乾燥するまで蒸発し、アセチル化した腸抽出
物を作った。
(アセチル化抽出物のケイ酸クロマトグラフィー)アセチル化膿抽出物を約50
ミリリツトルのクロロホルムに溶がし、約44μm以下のサイズに分別され、ク
ロロホルム/メタノール(98:2、体積比)でパンクした50グラムのケイ酸
粒子を含むカラムにかけた。500ミリリツトルのクロロホルム/メタノール(
95:5、体積比)、ついで500ミリリツトルのクロロホルム/メタノール(
90:10、体積比)をカラムに加え、そして、溶出液を集め、その液体部分を
窒素気流中で蒸発し、乾燥したアセチル化抽出物を得た。
(脱アセチル化)
ケイ酸クロマトグラフ及びアセチル化した抽出物を約20ミリリツトルのトルエ
ン/メタノール/ 0.2 M K OHメタノール溶液(]:1:2、体積比
)に溶解し、脱アセチル化を行うため、室温に30分間、時々振り混ぜながら維
持した。反応時間の後、それに2ミリリツトルの氷酢酸を加え、そして、生じた
混合物を80ミリリフドルのクロロホルム/水(1:1、体積比)中に移し、流
水に対し、4日間透析した。その後、脱アセチル化した抽出物を、まず、約10
0ミリリツトルのトルエンを加え、その混合物をロータリーエバポレーターを用
いて乾燥することにより、70℃で蒸発し、脱アセチル化乾燥抽出物を得る。
(DEAEセルロースカラムを用いたクロマトグラフィー)アセチル化乾燥抽出
物を約10ミリリツトルのクロロホルム/メタノール(2:1体積比)に溶かし
、DEAEセルロースの10グラムカラムにかけ、そして、先に述べたように平
衡化させた。そのカラムに250ミリリツトルのクロロホルム/メタノール(2
:1、体積比)、ついで、250ミリリツトルのメタノールを加えた。
生じた溶出液を合わせ、その液体部分を窒素気流中でエバポレートし、糖脂質含
有残香を得た。
(ケイ酸クロマトグラフィー)
上で生成した残香の部分標本を500ミリリツトルのクロロホルム/メタノール
(98:2、体積比)に溶解し、同溶媒でパンクした、ケイ酸の25グラムカラ
ムにかけた。500ミリリツトルのクロロホルム/メタノール(98:2、体積
比)をそのカラムに加え、通過させた。それから、250ミリリツトルのクロロ
ホルム/メタノール(1:3、体積比)、ついで250ミリリツトルのメタノー
ルをそのカラムに加え、その溶出液を合せて、そして、その液体部分を窒素気流
中でエバポレートした。生じた乾燥物質は実質的に純粋なガングリオテトラオシ
ルセラミドである〔ハンソン(Hansso、n)等、FEBSレターズ、13
9巻、291頁(1982年)〕。
実施例5
GCL−1コード遺伝子をクローニングすることによる単離されたGCL−1の
産生及び組換えDNAベクターにおける発現N、g、0M5II株の非ビリ化B
2変異体由来の淋菌DNA中に含まれるGCL−1をコードする遺伝子を当分野
でよく知られており、マニアチス(Maniatis)等のモレキュラー・クロ
ーニング(Molecular Cloning) ニラボラトリーマニュアル
、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−(Cold Spring
)Iarbor Laborato−ries) (1982年)により詳しく
述べられている操作を用い、発現ベクター中にクローニング化した。
最終的に、上述のN、g、変異体由来のDNAを羊離し、Mbolで部分的に制
限切断し、セイファート(Seifert)等のプロシーディング・イン・ナシ
ョナル・アカデミ−・オン・サイエンス(Proc。
Natl、 Acad、 Sci、) USA、83巻、735頁(1986年
)に述べられている、クローニングベクターp)Is S 6のBag HI部
位に挿入した。生じた組換えプラスミドを生物学的宿主としての大腸菌H810
1株[MD州、ゲイサースバーグ(Gaithersburg )、ベセスダ
リザーチ、ラボラトリーズ〕中で増殖した9種々のプラスミド含有大腸菌の大部
分を、GCL−1遺伝子を含むプラスミドを含んでいるそれらの細菌に対するラ
イブラリーとしてスクリーニングした。
挿入されたGCL−1遺伝子をもつプラスミドを含む細菌を同定するスクリーニ
ング法は、発現のためのGCL−1遺伝子自身の天然のプロモーターを用いて、
大腸菌中で、C,CL−1遺伝子産物が発現できることを利用して行なわれる。
発現したGCL−1は、G CL−1遺伝子をもつプラスミドを含むそれらの細
菌コロニーにおいて、実施例1で述べたようにクロマトフオーカシングにより単
離したGCL−1に対し、ウサギ中で生じた抗匍清を用いた細菌コロニーのライ
ブラリーのイムノスクリーニングにより検出した。
この抗血清の産生のために、10〜20マイクログラムの単離されたGCL−1
を、ウサギの首に皮下接種した。第1の接種は完全フロイント補助剤、ついで2
週間隔で2回、同様の接種を不完全フロイント補助剤で行った。陽性反応抗血清
は、実施例2で述べたように、ウェスタン・ブロンl−における粗抽出物中のG
C1,、−1を認識する能力により同定した。
GCL−1を発現するライブラリー中のこれらの大腸菌を同定するためのイムノ
スクリーニング操作は、下にリストしたいくつかの例外とともに参考文献に組込
んだ、ヘルツマン(1e1fman)等のフズーーカス(Focus) 6巻、
1−5頁(1984年)の操作に従って行った。これらの例外としては、これも
参考文献に組込んであるが、ジョンソン(Johnson)等の、ジーン・アナ
リティカル・チク二フク(Gene Anal、 Techn、) 1巻、3−
8頁(1984)に述べられている、ブロッキング試薬としてのウシ血清アルブ
ミン(B S A)の代りに脱脂粉乳への置換及び指示手段としての12J標識
第二抗体の代りに、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗つザギ免疫グロブリンへ
の置換がある。標識の存在及び、それによるG CL−1の存在は、Wl州、マ
ジソン(Madison)、プロメガ バイオチク(PromegaBiote
eh)、(カタログ番号、P3930)のプロトプロット・イムノブロッティン
グ・システムを用いて視覚化した。
先に述べたイムノスクリーニング操作によりGCL−1を含むと決定された個々
の陽性反応細菌コロニーを、独立して回収し、均一性を保証するため、少なくと
も1回コロニー精製を行った。それから、各単離物について、実施例1で述べた
ウェスタン・プロットによるG C1,、−1の発現を分析した。最終的に、個
々の細菌単離物の小規模培養を、5DS−PAGE試料パフファ中で直接分解し
、クロマトフオーカシングにより単離したGCL−1に対して生じた、先に述べ
た抗血清を用いて展開した、ウェスタン・プロットについて解析した。そのよう
に分析し、GCL−1を発現する代表的細菌培養物を、図5に示す。
大腸菌において発現したG CL −1の見かけの移動度は、N、g。
培養抽出物から直接単離したレクチンよりわずかに大きい相対分子量に対応して
いる。大腸菌宿主内の発現媒体は、発現タンパク質由来のリーダー配列をプロセ
ッシング及び切断せず、それにより、本来の起源、すなわちN、g、宿主でみら
れるものより、相対的に大きいタンパク質産物が生ずると考えられている。
さらに、これらの代表的な培養物を分析し、酵素Not Iでの制限酵素消化を
含む、よく知られている技術による、存在するプラスミドベクター内に含まれる
GCL−1発現DNA挿入物のおよそのサイズを測定した。約2.8から約4.
0キロベース(kb)のサイズの挿入物が検出された。
観測されたデータから、生成した非染色体プラスミドベクターの多くの構造配列
特性の存在がこの分野でよく知られている構造配列の一般的性質であることから
IFすることができる。例えば、レウィン(Lewin)、ジーンズ(Gene
s)、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社(John Wiley & 5o
ns、 Ltd、+)N Y州、ニューヨーク(1983)参照。より特別な場
合には、原核性細菌タンパク質は、間にある非コード配列(すなわち、イントロ
ン)のような、真核生物中でみられる中断以外、その同族ヌクレオチド配列とコ
リニア−である。それ故、GCL−1をコードするヌクレオチド塩基対数のラフ
な見積りは、アミノ酸残基当り、約110ダルトン及びアミノ酸残基当り、3個
のヌクレオチド塩基対の転換因子を用いることにより、5DS−PAGEを用い
て解析したそのレクチンのみがけ上の分子量から直接行うことができる。この転
換により、約22.400ダルトンのサイズをもつ、GCL−1は約204個の
アミノ酸を含み、そして、約612ヌクレオチド塩基対によりコードされる。
細菌中の遺伝子の発現は、転写及び翻訳の開始及び停止信号に依存している。こ
れらの信号も、それらが、タンパク質コード配列の発現を制限する、その配列内
に含まれる信号であることがら、発現制御信号と呼ばれる。それらの信号は、プ
ラスミドベクターpass6のBaIIHIクローニング部位のまわりには存在
しないことがら、これらの配列は、GCL−1をコードする領域の末端部又は付
近の、それらの通常の位置内のDNA挿入により提供される。このように、その
挿入DNA断片は、DNA挿入物のための生物学的宿主に対し、外来のものであ
る、細菌性レクチンの発現のためのコード領域に通ずる、上流及び下流(隣接)
領域と機能的に結合した発現制御信号同様、コード領域を含む。
膜と会合するタンパク質又は、分泌されるタンパク質に対して、通常みられるリ
ーダーペプチドの存在は、本来の生物学的宿主の代りの大腸菌中で発現したとき
、わずかに長い、みかけ」−のGCL−1の分子量により証明された。
加えて、その発現制御信号の特異的要素はGCL−1遺伝子の転写の開始に必要
なプロモーターである。このプロモーター配列は、通常、コード配列の始めの5
′側に位置する。そのプロモーター配列は、他の細菌遺伝子において特徴づけら
れているので、そのGCL−1プロモーターも、コード配列の5′末端位置のリ
ーダー配列に相対的に近接して結しており、リーダー配列から約612ヌクレオ
チド塩基対内に存在すると考えられている。
従って、先に特徴づけられた、代表的GCL−1遺伝子挿入物は、約2.8から
約4.Okbのサイズ範囲をもち、約22.400ダルトンのレクチンタンパク
質をコードするコード配列を含んでいる一方、そのような挿入物は、より大きな
もの、例えば約10kbのオーダー、好ましくは、約6kbのものであろう。リ
ーダー配列、プロモーターを含む適当な開始及び停止信号、及び種々の■”の、
その遺伝子の各両末端に位置する付加的で余分な隣接配列が、本発明で考えられ
ているクローン化され、そして単離されたDNA断片中、GCL−1遺伝子その
ものに加えて、存在する。
挿入されたGCL−1遺伝子をもつ、発現ベクターとしてのpl(556ブラス
ミドを含む代表的大腸菌単離物及び図5に示したようなGCL−1を発現するも
のを参照のためpcct、−iと命名した。
この細菌培養物をATCC受理番号67.198号として、メリーランド(Ma
ryland) 、ロックビル(Rockville) 、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(ATCC)に保管した。
その保管期間は、保管期日から30年間又は、保管所における保管の要請後5年
間、又は、米国特許の出願からの存効期間のなかのより長いものでなければなら
ないというプダベスト・トリーティー・必要事項に従かい保管がなされた。組換
えプラスミド含有細胞は、保管所で生育不能となったとき、補充されるであろう
。
従って、−面において、本発明は、単離された形の、又は先に述べたような細菌
性レクチンをコードする、生物学的宿主中、その宿主に対しては外来性のもので
ある複製可能DNA断片としての、DNA断片を考えている。このDNA断片は
、そのDNA断片中に存在するレクチンをコードする領域に機能的に結合した、
その考案された細菌レクチンの発現に必要な制御信号を含みうる。これらの発現
制御信号が生物学的宿主にとって外来性ではあるが、その信号は、その宿主によ
り認識される。本発明のこの特別な特色の、好ましい態様において、このコード
領域は、N、g、に存在するレクチンをコードする天然の領域である。より好ま
しくは、そのDNA断片中に存在する、その発現制御信号又は信号塩基対配列は
、レクチンに対するN、g、のコード領域に関連している天然のN、g、発現制
御信号である。
ここで考えられている細菌性レクチンのコード領域は約650塩基対しか含んで
おらず、そして、その両端に結合する隣接領域と会合している。コード領域とと
もに、その隣接領域は、約10kb、好ましくは、約6kbLか含んでいない。
さらに本発明の方法的局面は、適当な条件下、転写−翻訳培地中でのDNAの増
殖に対して先に述べた非染色体プラスミドベクターを含有するバクテリアを含む
細菌培養及びその後の、よく知られたタンパク質収穫技術を利用した培養物から
の発現された細菌性レクチンの収穫のステップを利用した、細菌性レクチンの生
産方法を考えている。
特別な態様を含むこれまでの説明は本発明を説明するためのものであり、それを
制限するものではない。多くの、その他の変化や修正は、本発明の真の精神及び
範囲から逸脱することなしに行うことが可能である。
AS
0.0.、、。xlo−31−1
】
手続補正書(方式)
%式%
3、補正をする者
事件との関係 出願人
6、補正の対象 明細書及び請求の範囲の翻訳文国際調査報告
FCT/じ5E7/zHム90
p(τ/I;58710!490
PCT10587101490
エエL CLa工!lls 14−23 drawn tOprcduc釦g
bacte;工aIL@1ctln VL& genet=c engxr+e
erihg。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.淋菌から得られ、ラウリル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳 動により約22,400ダルトンの相対分子量をもつと測定され、そして、約6 .1から約6.4の範囲の等電pH値を有し、特異的にガングリオテトラオシル セラミドに結合することができる単離された細菌性レクチン。 2.薬学的に許容できる塩の形の請求項1の細菌性レクチン。 3.薬学的に許容できるキャリヤーとともに請求項1記載の単離された細菌性レ クチンを含む接種物。 4.請求項3記載の、かつ、レクチンが約10マイクログラムから約500ミリ グラム存在する単位投与型の接種物。 5.請求項3記載の、かつ、そのレクチンが約100マイクログラムから約50 0ミリグラム存在する単位投与型の接種物。 6.薬学的に許容できるキャリヤー中の、請求項1記載の、効果量のレクチンを ヒトに投与することを含む、淋菌に対するヒトの免疫化方法。 7.レクチンの約100マイクログラムから約100ミリグラムをヒトに投与す る、請求項6記載の方法。 8.(a)ヒトから生体試料を得ること、(b)免疫反応混合物を形成するため に、その得られた生体試料を、GCL−1に対する抗体と合せること、(c)そ の抗GCL−1抗体が、上記生体試料中に存在するGCL−1と結合するのに十 分な時間、生物学的検定条件にその形成された免疫反応混合物を維持し、それに より、免疫反応物を形成すること、 (d)その維持した混合物について、免疫反応物の存在を検定すること、 の(a)〜(d)のステップを含むヒト生体試料中のレクチンGCL−1の存在 を測定する方法。 9.(a)ヒトから生体試料を得ること、(b)免疫反応混合物を形成するため に、その得られた生体試料を、請求項1で定義した単離された細菌性レクチンの 部分標本と合せること、 (c)その単離された細菌性レクチンが、生体試料中に存在する抗GCL−1抗 体に結合するのに十分な時間、生物学的検定条件に形成された混合物を維持し、 それにより免疫反応物を形成すること、 (d)その維持された混合物について、免疫反応物の存在を検定すること、 の(a)〜(d)のステップを含むヒトの生体試料中の抗GCL−1抗体の存在 を測定する方法。 10(a)請求項1記載のレクチンGCL−1に対する抗体及び(b)上記抗体 と上記レクチンGCL−1の免疫反応を知らせることができる指示手段を組合せ て含む、ネイセリア・ゴナーリア(Neisseria gonorrhoea e)レクチンGCL−1を検定するのに適した診断システム。 11(a)請求項1記載の、単離された細菌性レクチン、(b)そのレクチンと の、上記抗体の免疫反応を知らせることができる指示手段、 を組合せて含む生体試料中の抗GCL−1抗体の存在を測定するのに適した診断 検定システム。 12.薬学的に許容できるキャリヤー中の、効果量の上記レクチンを含む接種物 を、動物に投与することを含む、請求項1記載の、レクチンGCL−1と免疫反 応を起こす抗体の産生を、温血動物中で誘導する方法。 13.接種物が補助剤も含む請求項12記載の方法。 14.発現ベクター中に含まれるとき請求項1の細菌性レクチンを発現できる単 離されたDNA断片で、約650塩基対ほどの、上記レクチンコード領域と、そ の両端に結合した隣接領域をもち、その隣接領域とコード領域が合せて10キロ 塩基対程度のものであるもの。 15.請求項14記載の、かつ、約6k塩基対程度の単離されたDNA断片。 16.請求項1記載の細菌性レクチンをコードする複製可能なDNA断片を含み 、かつ、この断片が外来性のものである生物学的宿主。 17.上記DNA断片がさらに、上記コード領域に隣接する、上記レクチンの発 現のための制御信号を含み、その制御信号が、その生物学的宿主にとって外来性 のものであるが、その生物学的宿主により認識されるものである、請求項16記 載の生物学的宿主。 18.上記コード領域の上記レクチンに対する、ネイセリアゴナーリア(Nei sseria Gonorrhoeae)の天然のコード領域である、請求項1 記載の生物学的宿主。 19.上記DNA断片がさらに、上記天然のコード領域に隣接して、上記レクチ ンの発現のための、天然のネイセリアゴナーリア(Neisseria Gon orrhoeae)の発現制御信号を含む、請求項16記載の生物学的宿主。 20.請求項1記載の細菌性レクチンを発現できるDNA断片で、そのDNA断 片の複製及び発現を制御する塩基対配列に機能的に結合したもの含み、かつ、そ の断片が、約650塩基対程度の上記レクチンコード領域と、それに結合した隣 接領域を有し、両方合せても約10キロ塩基程度しかないものである、転写−翻 訳培地中でDNAを複製するための非染色体プラスミドベクター。 21.請求項20記載のプラスミド・ベクターを含む細菌、及びそこに含まれる DNA断片によりコードされるレクチンの発現に適した培地を含む細菌培養物。 22.上記細菌培養物が、ATCC受理番号67,198号と同一のものである 、請求項21記載の細菌培養物。 23(1)培養により、細菌性レクチンを発現するのに適した生育条件下、複製 及び発現を制御する塩基対配列と機能的に結合している、細菌性レクチンを発現 することができるDNA断片を含む、転写−翻訳培地中で、DNAを増殖させる ための非染色体プラスミドベクターを含む細菌を含む細菌培養物を生育させるこ と、(2)その細菌培養物から、発現した細菌性レクチンを収穫すること、 の(1)、(2)のステップを含む細菌性レクチンの産生方法。
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