JPS63503545A

JPS63503545A - ワクチン及び診断マーカーとして有用なネイセリア・ゴナリーア・レクチン及びこのレクチンの製法

Info

Publication number: JPS63503545A
Application number: JP62504111A
Authority: JP
Inventors: ディール　キャロリン　ディー; ソー　マグダリン　ワイ　エイチ; サイファート　エイチ　スティーヴン
Original assignee: スクリップス　クリニック　アンド　リサーチ　ファウンデーション
Priority date: 1986-06-18
Filing date: 1987-06-18
Publication date: 1988-12-22
Also published as: AU7643387A; CN87104828A; EP0251554A3; EP0251554A2; DK84888D0; PT85116B; DK84888A; WO1987007840A1; PT85116A; FI880752A0; NZ220730A; FI880752A; AU614718B2; US4786592A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ワクチン及び診断マーカーとして有用なネイセリア・ゴナリーア・レクチン及びこのレクチンの製法（関連出願の引用文献）この出願は、１９８６年６月１８日提出の米国特許出願番号第８７５．４７７号の一部継続出願である。

（技術分野）本発明は、ネイセリア・ゴナリーア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）に対する接種物又はワクチンに用いるのに適するレクチン、そのレクチンを含むワクチン及び淋病の診断法に関するものである。さらに特に、この発明は、淋菌から得られるネイセリア・ゴナリーア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のレクチン、そのレクチンの単離法、それらから調製した接種物、そして、又はワクチン及びそのようなレクチンの製法に関連している。

（技術的背景）ネイセリア・ゴナリーア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）　（Ｎ　、　ｇ　、　）による報告された感染の年間の発生率は、約２百分件であると見積られている０通常男性への淋菌感染は、比較的単純な性尿器怒染である。

普及した淋菌感染は淋病を者の１〜３％の率で発生すると報告されており、一方、現在の治療によりこの病気の症状は軽いものである。

一方、淋病に感染した女性において、卵管炎が１０〜２０％の割で発生し、そして、うまく処理したときでさえ、卵管炎再発、異所性妊娠及び不妊などをもたらす。アメリカにおいて卵管炎は毎年１８０万件の医師の診療があり、２２万件の病院収容がある。

今日までの公的健康診断による淋病の管理は、難かしい点がある。

死んだ淋菌の全菌体を含むワクチンは有効である。グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ）等、（１９７１年）、プレチン、オン、ワールド、ヘルス、オーガニゼーション（［１ｕ１１．ｌ１ｌｄ、　１１１ｔｈ、　Ｏｒｇ、＞４５巻、５３１頁“淋菌ワクチンの開発の予備研究”。

淋菌のペニシリン及びテトラサイクリン耐性病も発生している。

淋菌感染は、その細菌による粘膜のコロニー化、その表面膜へのコロニー化細胞の粘着に仲介される過程を含んでいる。“粘着”という語は、表面への細菌の比較的安定した付着を意味している。そのような粘着活性に寄与する構造を、アトへシンと呼ぶ。

淋菌のピリは、反復する同一サブユニット（ビリン）を含む繊維状構造を有するアトへシンである。Ｎ、　ｇ、０Ｍ５ＩＩ株において、各ピリンは、およそ１８．０００ダルトンの分子量をもつ。淋菌の上皮表面への付着は、抗ピリ抗体で防ぐことができる。細胞付着の防止に加えて、ビリタンパク質に対して生じた抗体もオンソニン性である。

すなわち、それらは、血液中の食細胞により、侵入細菌を死滅することを仲介する。しかし、ワクチンとして、ビリ免疫原を用いることは、異種株のＮ、ｇ、で作られたピリの血清学的交差反応性の欠除のために、実際的ではない。

我々は、真核細胞表面のスフィンゴ糖脂質、例えば、ラクトシルセラミド、イソグロボトリオシルセラミド、ガングリオトリオシルセラミド及びガングリオトリオシルセラミドは、Ｎ、ｇ、の認識及び粘着に関連し、そして、細菌のタンパク質が、特異的な糖配列（炭水化物構造）を認識し、そしてこれに結合する能力を有することから、糖脂質指向認識は、これまで報告されていない細菌性レクチンにより仲介されていることを発見した。接種物、ワクチンの構成物として又は診断法において、この細菌性レクチンを用いると、ビリ免疫原のこれまで述べられてきた短所は考えなくて済む。

（発明の概要）本発明は、ＧＣ＞１と命名した、細菌性レクチン単離物を考えている。このレクチンは淋菌から得られ、真核性炭水化物に結合し、そして、約２２．４００ダルトンの相対分子量を有している。このレクチンの等電点は、約６．１から約６．４の範囲にある。このレクチンは、ガングリオテトラシルセラミドに特異的に結合する能力を有し、そして、淋病に対する接種物もしくはワクチンの構成物としても有用である。このレクチンは、単離された形もしくは、薬学的に許容されたその塩として用いることができる。

さらに、本発明は、先に述べた単離レクチン又は、薬学的に許容されたその塩及びそれらのための薬学的に許容されたキャリヤーから構成される接種物及びワクチンについても考えている。また、薬学的に許容されたキャリヤー又は希釈物中の効果的量の単離レクチン又はその先に述べた塩を、患者に投与することによる淋菌感染に対する免疫法についても考えている。

さらに、本発明は、ＧＣＬ−ルクチンをコードする単離されたＤＮＡ断片、生物学的宿主内に存在する同ＤＮＡ断片、前述生物学的宿主が発現ベクター中に存在するＧＣＬ−１コード遺伝子の発現に適した生育培地に存在するか、適当な発現培地中に含まれる培養物について考えている。

（図面の簡単な説明）本発明の公開の一部は図式で行っている。

図１は、分子量マーカータンパク質の位置及びその右に１０００ダルトン単位で示した各々のそれらの相対的分子ｆｆｉを付けた、銀染色した１２％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。

レーンＡは、約１８．０００ダルトンの相対分子量をもつ、精製したピリンタンパク質を含んでいる。

レーンＢは、実施例１で生じた粗ＧＣＬ−１抽出物から、本発明のレクチン（ＧＣＬ−１）でアフィニティー吸着した後に残るタンパク質の試料を含んでいる。

ＧＣＬ−１は検出法の限界内のレベルで存在しないことが示されている。しかし、ピリンタンパク質は、１８．０００の分子量位置に見ることができる。

レーンＣは、２２．４００ダルトンの位置に存在するアフィニティーで単離したＧＣＬ−１を含んでいる。ピリン又はピリン関連のタンパク質は実質的に存在しなかった。

レーンＤは、実施例１に述べられているように、グロボシド・アフィニティー、＃離にかけた粗ＧＣＬ−１抽出溶液の溶出液を含んでいる。この溶液は、糖脂質アフィニティー・マトリクスへの非特異的結合を検出する、コントロールとして用いた。本レーンに、ＧＣＬ−１の有意な量が存在しなかったことは、ガングリオテトラシルセラミド・アフィニティー・マトリクスへのＧＣＬ−１の結合は、特異的なレクチン・リガンド相互作用であることを示している。

レーンＥは、次の分子量マーカータンパク質を含んでいる。α−ラクトアルブミン、１４；ソイビーン・トリプシン・インヒビター、２０；トリプシノーゲン、２４；カルボニック　アンバイトラーゼ、２９；グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、３６；エフグ・アルブミン、４５；及びウシ・アルブミン、６６（１０００ダルトン単位で示しである）。

図２は、アフィニティー単離したＧＣＬ−１で生じた、ウサギ抗ＧＣＬ−１抗体を用いた、ＧＣＬ−１含有溶液のウェスタン・プロット分析の写真である。指示した相対分子量を有する（１０００ダルトン単位で示した）タンパク質の予想位置をプロントの左に示した。

レーンＡは、実施例１で生した粗ＧＣＬ−１抽出物の試料を含んでいる。ＧＣＬ −１は、約２２，４００ダルトンの相対分子量を有する主要タンパク質バンドである。ピリン関連レクチンであると考えられている、２つのマイナータンパク質バンドは、約２９，０００ダルトン及び約３６．０００ダルトンの位置にあるようだ。

レーンＢは、実施例１で作られたビリンクンバク質含有ベレントの試料を含んでいる。ＧＣＬ−１は、実質的に存在する一方、他のピリン及びピリン関連タンパク質も実質的に存在する。

レーンＣは、他のピリン関連タンパク質を実質的に含まない、アフィニティー単離したＧＣＬ−１を含んでいる。

図３は、ウサギの抗ＧＣＬ−１抗体が、Ｎ、ｇ、により生じたＧＣＬ−１と同じ相対的分子量をもつモレゼラ・ボビス（Ｍｏｒｅｘｅｌｌａ　ｂｏνｉｓ）により生産されたタンパク質と交差反応することを示すウェスタンプロットの写真である。レーンＡは、Ｎ、ｇ。

ＭＳＩＩ株ピリなし変異体Ｂ２の実施例１に従って調製した粗ＧＣＬ−１抽出物を含んでいる。レーンＢは、モノゼラ・ボビス（Ｍｏｒｅｘ−ｅｌｌａ　ｂｏν ｉｓ）から同様の方法で二層製した抽出物を含んでいる。

図４は、ｐＨ勾配を応用したモノＰクロマトフオーカシングカラムからの溶出による実施例の粗ＧｃＬ−１抽出物の精製を説明するグラフである。その溶出液を、線型減少ｐＨ勾配で溶出してきた画分の、２８０ナノメーターの吸光度での光学密度（０，Ｄ、２８０）での測定により、タンパク質をモニターした。ＧＣＬ −１を含むピーク画分は、約６．１から６．４よりわずかに高いｐＨ範囲でクロマトフオーカシングカラムから溶出して来た。これを矢印で示す。

図５は、クロマトフオーカシングカラムで単離したＧＣＬ−１で生じたウサギの抗ＧＣＬ−抗体を用いた、ＧＣＬ−１含有溶液のウェスタンプロット分析の写真である。指示した相対分子量を有する（１０００ダルトン単位で示した）タンパク質の予想される位置をプロットの左に示した。

レーンＡは、実施例５で述べるプラスミドｐＨ３ｓ６を含むが、淋菌ＤＮＡ挿入物を欠いている大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の培養試料を含んでいる。この試料は、実施例５で述べるように、５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファ中で分解し、電気泳動及びウェスタンプロットにかけた。

レーンＢは、実施例１で生じ、レーンＡで述べたように分析した粗ＧＣＬ−１抽出物の試料を含んでいる。ＧＣＬ−１は、約２２．４００ダルトンの相対分子量をもつ主要タンパク質バンドである。

レーンＣは、次に示す再染色した分子量マーカータンパク質（ＭＤ州、ゲイサースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）　、ヘセスダ・リサーチ８ラボラドリース（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｎｉｓ））を含んでいる。ミオシン、２００；ホスホリラーゼｂ、９７．４；ウシ血清アルブミン、６８；オバルブミン、４３；モモトリブシンノーゲン、２５．７．β−ラクトグロブリン、１Ｂ、４；リゾチーム、１４．３（すべて１０００ダルトン単位で示した）。

レーンＤから０は、実施例５で述べるように、その中に淋菌ＤＮＡを挿入したプラスミドｐＨ３ｓ６を含む大腸菌の各培養物由来の試料を含み、それらは、レーンＡで述べたように分析した。

（発明の詳細な記述）（定　義）ここで用いている、種々の文法型の“抗体”という語は、抗原を特異的に結合する生物学的に活性のある抗体結合部位を含む、免疫グロブリン又は、その断片を指す。

ここで用いている“複合体”という語は、レクチンがリガンドに特異的に結合したときに形成される生産物を指す。

ここで用いている“免疫反応物”という語は、免疫学的反応の生産物、すなわち、抗原が抗体と免疫学的に結合したときに生じる実体を指す。

レクチンに関し、ここで用いられている“単離（された）″という語句は、他の淋菌タンパク質を実質的に含まないレクチンを指す。

この語句が本発明の抗体調製物に関して用いられたときは、この語句は他の抗淋菌タンパク質抗体を実質的に含まない抗ＧＣＬ−１抗体を指している。

“リガンド”という語は、レクチンと特異的に結合する炭水化物構造を存する分子を指している。

ここで用いている“薬学的に許容された塩”とは、単離されたレクチンの無毒性のアルカリ金属、アルカリ土類金属又はアンモニウム塩を指している。このような塩は一般に薬学的工業で用いられており、当分野でよく知られている方法で調製される、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム及びアンモニウム及びそれに類するものを含んでいる。またこの語は、−ｉに、本発明のレクチンを、適当な有機又は無機酸と反応させることにより調製する、無毒の酸付加塩も含んでいる。代表的塩には塩酸塩、臭酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリル酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩及びそれに類するものが含まれる。

本発明で考えられている単離された淋菌炭水化物結合タンパク質又はレクチンは、比較分子量標準物質としてα−ラクトアルブミン、ソイビーン・トリプシン・インヒビター、トリプシノーゲン、カーボニック・アンバイトラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デバイドロゲナーゼ、エラグ・アルブミン及びウシ・アルブミンを用いた、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）　によ、７測定され、約２２，４００ダルトンの相対分子量を有していた。すなわち、本発明のレクチン（ＣＧＬ−１）の電気泳動移動度は、ソイビーン・トリプシン・インヒビターとトリプシノーゲンの間である。５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量決定の技術及び信頼性は当業者にはよく知られている。

ウニバー（Ｗｅｂｅｒ）等、ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　２４４巻、４４０６−４４１２頁（１９６９年）、ズワーン（Ｚｗａａｎ）、ジャーナル・オン・アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗ、）　２１巻、１５５−１６８頁（１９６７年）。

ＧＣＬ−１は、約６．１から約６．４の等電ｐＨ値をもっと特性づけられている。タンパク質の等電ｐｎ又は等電点は、そのタンパク等が正味の電荷をもたないｐ）Ｉ値のことである。このように、等電点においては、そのタンパク質は、電場で移動しない。ポリアクリルアミドゲルを用いた、タンパク質の等１ｉｐＨ値の測定法は、この分野ではよく知られている。アレン（ＡＩｉｅｎ）　Ｒ、Ｃ、及びマウラー（Ｍａｎｒｅｒ）Ｈ，Ｒ，、（１９８４年）、ニューヨーク、ウオルター・デ・グルイタ−（Ｗａｉｔｅｒ　ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ）、′ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動と等霊的フォーカシング；アーバスノフト（Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ）Ｊ、Ｐ、及びビーリー（Ｂｅｃｌｅｙ）　、Ｊ、Ａ、（１９７５年）ロンドン、バターワース（Ｂｕｔｔｅｒ　ｗｏｒｔｈｓ）　、“等霊的フォカシング。

ＧＣＬ−１もスフィンゴ糖脂質、ガングリオトリオシルセラミド及びガングリオトリオシルセラミドに特異的に結合する。

レクチンが炭水化物リガンドに特異的に結合する能力を測定する方法は、この分野では、よく知られている。これらの方法は、関係するレクチンによる、赤血球細胞凝集の結合阻害研究又は、多Ｉ！類の沈殿化を含んでいる。アフィニティー吸着剤としてレクチン又は、炭水化物リガンドを用いた、アフィニティー・クロマトグラフィーも本目的に使用することができる。

典型的には、既知量のＧＣＬ−１を、予め既知量のスフィンゴ糖脂質と混合する。その混合物を、ＧＣＬ−１が、そのスフィンゴ糖脂質リガンドと複合体を形成するのに十分な時間である、約１０分から約１６−２０時間までの、分から時間に及ぶ予め決められた時間、生物学的検定条件下に維持する。

生物学的検定条件は、本発明の単離されたレクチン及びその目標リガンドの生物学的活性を維持する条件である。そのような検定条件には、約４℃から約４５℃ の温度範囲、約５から約９のｐＨ値範囲、及び蒸留水から、約１モル濃度の塩化ナトリウムの範囲のイオン強度を含んでいる。これらの条件を至適化する方法は、この分野では、よく知られている。

形成したＧＣＬ−１含有複合体の存在を、この分野でよく知られている検定技術により直接的又は間接的に検定した。ＧＣＬ−１が特異的に結合するスフィンゴ糖脂質を提供する方法は、この分野では、よく知られている。たとえば、ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）等、ＦＥＢＳ。

１７０巻、１５−１８頁（１９８４年）、ブルイマ−（Ｂｒｅｉｍｅｒ）等、ジャーナル・オン・バイオケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、）　９０巻、５８９−６０９頁（１９８１年）、カールソン（Ｍａｒｌｓｓｏｎ）及びラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）　、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　２５７巻、５５７−５６８頁（１９８２年）；フ″レイマー（Ｂｒｅｉｍｅｒ　）等、バイオメディカル・マス・スペクトロメトリー（Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｍａｓｓ、Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、　）　６巻、２３１ −２４１頁（１９７９年）、ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）等、バイオケム・バイオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）　７５０巻、２１４−２１６頁（１９８３年）。

本発明の他の特長はＧＣＬ−１を単離する方法に関するものである。この方法は、上述の性質を利用した、このレクチンを含む溶液の分画を特徴とする特に、ＧＣＬ−１を含む溶液を、まず、Ｎ、ｇ、からの表面タンパク質の抽出で得られる。最後は、−Ｓ的には、等張、非変性バッファ溶液中で、Ｎ、ｇ、を撹拌することにより、その表面タンパク質をＮ、ｇ、から切り離す。残香細胞及び分解物を、遠心により、得られた溶液から分離した。生じた上清液は、ＧＣＬ− １を含み、そこからこのタンパク質を回収する。

タンパク質の分画に知られているゲル口過、ゲルクロマトグラフィー、クロマトフオーカシング、限外口過、電気泳動移動度、イオン交換及びそれに類するものの種々の方法を、存在する他のタンパク質から、上述の特性をもつタンパク質を分離するのに用いることができる。

たとえば、２種の異なる電気泳動技術を含む二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）法を、複雑な生物学的物質から再現的にタンパク質をｊ１１離することができることは、この分野ではよく知られている。溶液中のタンパク質は、１次元目の等電フォーカシング（ＩＥＦ）により、各等電点に従って分離され、そしてさらに、二次元口で、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量に従って分離される。そのタンパク質の分離は、各次元で、無関係の特性に基づいているので、二つの次元のゲルにわたり、別々のタンパク質スボフトの実質的に均一な分布が得られる。先に述べた、等電点及び分子量をもつ１つのタンパク質に対応する分離スポフトは、レクチンＧＣＬ−１として単離され、従来法によりそのゲルから回収される。

別に、ＧＣＬ−１は、液体クロマトグラフィー・クロマトフオーカシングにより、先に述べた上滑液中に存在する他のタンパク質から分離される。この方法は、それらの等電点の差に従ってタンパク質の分離を行う。カラムを通して流れるｐ＋＋勾配により、それらのタンパク質は、フォーカスされ、それらの等電点の順に溶出してくる。

先に述べた等電点範囲に対応する両分を採集し、そしてそのＧＣＬ−１を、従来の方法により、採取した両分から回収した。

また、アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティー吸着及びそれに類するもののような、あるリガンドを特異的に吸着することができるタンパク質を単離するための１つ以上の方法に、このタンパク質を含む溶液を適用することにより、ＧＣＬ−１を単離した。単離のための、この方法を用いるとき、ＧＣＬ−１を含む溶液を、ガンクリオテトラオシルセラミドのような固体マトリックス固定リガンドと混合する。得られた混合物を、ＧＣＬ−１が固体マトリックス固定リガンドと特異的に結合し、固相複合体を形成するのに十分な時間、生物学的検定条件に維持する。それから、非特異的に結合したタンパク質を、通常、バッファで洗浄することにより、固相複合体から分離する。その後、ＧＣＬ−１を固相固定リガンドから解離し、単離型として溶出する。

加えて、レクチンを含む溶液から、ＧＣＩ−１を単離するのに、以下に示すように抗体を用いた免疫学的な方法を使うこきができる。

たとえば、免疫アフィニティー、免疫吸着及びそれに類するもののような方法は、糖脂質リガンドに基づくアフィニティー精製に対して先に述べられたのき同様の方法で行なわれた。

またＧＣＩ、−１は、よく知られている組換えＤＮＡ技１ホｉを用いて、その単離型を生成することができる。簡単に言うと、Ｎ、ｇ、がらＤＮＡを単離し、それを剪断応力又は制限酵素により断片化する。

その断片をｐＨｓｓ６又はファージベクター・ラノ、ダのようなプラスミドベクターに挿入する。挿入物を含むそのベクターを、適合宿主に導入し、そこで増殖させる。つづいて、そのベクター含有宿主をクローン化し、そのクローンについて、ＧＣＬ−ｆｉｌ伝子を含むプラスミドの存在を検定する。

それから、ＧＣＬ−１遺伝子を含むクローン化ベクターを、直接ＧＣＬ−１遺伝子産物を発現する、１つの発現ベクターとして用いることができる。ある場合には、さらに、別のベクター又は、別の生物学的宿主中での発現を可能にするＧＣＬ−１遺伝子の処理が望ましい。

さらに、そのＧＣＬ−１遺伝子を、その遺伝子を含むプラスミドから単離し、適当なヌクレオチド配列と組換え、転写−翻訳発現ベクターを形成する。それから、そのＧＣＬ−１発現ベクターを、細菌宿主のような１つの適当な転写−翻訳原核性発現媒体、イースト又は哺乳類宿主のような真核性発現媒体〔例えば、チャイニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞〕、又はデブリース（ＤｃＶｒ　１ｅｓ）及びズバイ　（Ｚｕｈａｙ）により、プロシーディンゲス・イン・ナショナル・アカデミー−ｉブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、５７巻：２６７頁（１９６７年）に報告されたようなインヒ）　口（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）の媒体に導入した。

本発明の別の待はとして、本発明のレクチン又はその塩は、薬学的に許容された希釈剤又はキャリヤーと共に、その効果量患者に投与したとき、Ｎ、ｇ、の表面上のＧＣＩ、−１と免疫反応を起こし、それにより、表面の膜に付着する抗体を誘導することができる、接種物又はワクチンを作るのに用いられる。

種々の文法型で用いられている“接種物”という語はＧＣＩ−１に対する抗体の誘導に用いる活性成分としての本発明のレクチンを含む組成物のことを示しでいる。

接種物は、ＧＣＬ−１を発現するＮ、　ｇ、細胞を検出する診断法に使用するために、マウス、ウサギ、ヤギ、馬及びそれに類するもののような哺乳類における抗体の産生に用いることができる。また接種物は、本発明のレクチンの効果的量を含むワクチンとして、淋菌による感染をワクチン化した人を予防し、そして淋菌感染を防ぐのに用いることができる。もし必要なら二次接種も行なわれる。

種々の文法型の“ワクチン”という語は、ヒトの予防に関してここでは用いている。またここで用いている種々の文法型の“接種物”止いう語は、淋菌ＧＣＩ、 −１に免疫学的に結合する抗体の生成のために用いる活性成分としての、本発明のタンパク質を含む組成物を示している。このように、ワクチン及び接種物は、同一の成分を含んでいる。しかし、最終的な用途として異なるものが意図されている。

単位投与当りの単離されたＧＣＬ−１の効果量は、他の事項の中で、接種された動物種、その動物の体重及び選ばれた接種法に依存することが、この分野ではよく知られている。典型的には、接種物は、接種（投与）当り、約１０マイクログラムから約５００ミリグラム、好ましくは、接種当り約１００マイクログラムから約１００ミリグラムのＧＣＬ、−１を含んでいる。

“単位投与”という語は、動物に対する単一投与に適した物理的に分備の単位を示し、各単位は、必要とされる希釈剤、すなわち、キャリヤー又は媒介物と共に、望ましい治療効果を生ずるのに必要であると計算された活性物質の予め決定された量を含む。本発明の新しい単位投与に対する説明は、（ａ）その活性物質の独自の特性及び遂行される特別な免疫学的効果、及び（ｂ）明細書に詳しく公開されているヒトへの免疫学的使用のための、そのような活性物質をユ１ｊ合するための、この分野において基本的な制限、により示され、そしてこれらに直接依存しており、これらは、本発明の特徴にもなっている。

典型的には、接種物は、レクチンを、水、食塩水又は、リン酸パンフ１食塩水（ＰＢＳ）のような、生理的に許容される希釈剤中にサスペンドすることにより、本発明の単離された細菌性レクチンから調製する。もし必要なら、ワクチン又は、接種物中に通常用いられている添加剤も用いる。そのような添加剤の実例としては、ラクトース又はソルビトールなどのような安定化剤、及び水酸化、硫酸又はリン酸アルミニウム、ミョウバン又は、アルギン酸塩などのような補助剤などがある。沈殿化リン酸アルミニウム（ＡＮＰＯ４）は、ワクチンに対しては、特に適した補助剤であり、一方、完全フロイント・補助剤（ＣＦＡ）及び完全フロイント・補助剤（ＩＦＡ）は、接種物に用いるのが望ましい。

本発明のワクチン及び接種物は、通常、腹膜内又は、静脈内、腸用カプセル又は錠剤、生薬として、鼻スプレーとして、経口的注入により、そして、その他の経路の投与法により投与される。

単離型の本発明の細菌性レクチンで誘導された抗体は、本発明のまた別のＢ様を構成している９本発明の単離された抗体調製物は、ＧＣＬ−１に対する実質的な抗淋菌活性を示すのみである。

単離型のＧＣＬ−１に対する抗体は、これまでに述べてきた接種物を用いた免疫化により、ウサギ、ヤギ、馬及びそれに類するもののような哺乳類に生ずる。また単離された抗体調製物は、この分野でよく知られている方法により、本発明の単離された細菌性レクチンを用いた免疫アフィニティー精製により作ることができる。

単離した抗ＧＣＬ−１抗体調製物も、参考文献に組み込んである、ナイマン（Ｎｉｍａｎ）等のプロシーディンゲス・イン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏ、　Ｎａｔｈ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ。

７９２４−７９２８頁（１９８５年）に述べられている、ハイプリドーマ技術を用いて調製できる。

モノクローナル抗体が生ずるハイブリドーマを作るために、ミエローマ又は、自己増殖細胞系列を、ＧＣＬ−１で高度免疫化したホ乳類の腹水から得たリンパ細胞と融合する。

そのミエローマ細胞系列は、リンパ細胞と同じ種由来のものが望ましい、１２９ＧｆｉＸ”株のマウスは好ましい哺乳類である６本発明で用いるのに通したマウス・ミエローマには、ハイポキサンチン・アミノプテリン・チミジン−感受性（ＨＡＴ）細胞系列Ｐ３Ｘ６３−−Ａｇ８．６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５０８０）及びＳｐ２１０Ａｇ１４（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１）がある。

典型的に、肺細胞をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００を用いて、ミエローマ細胞と融合する、融合したハイブリッドを、ＨＡＴ感受性により選択する０本発明の抗体を生産するハイブリドーマを、ここで述べる抗ＧＣＬ−１酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて同定した。

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清からのみでなく、望ましいハイプリドーマが導入される哺乳類の腹水液からも、−ｍ的により高濃度な形で得ることができる。腹水液を用いたモノクローナル抗体の産生は、この分野ではよく知られており、ここでさらに説明する必要はない。

本発明の単離された細菌性レクチンは、血液、血清又は血孕中の抗ＧＣＬ−１抗体の存在及び量を測定するのに特に有用である。

１つの態様において、本発明は、次のステップを含む生体試料中の抗ＧＣＬ−１抗体の存在を確認する方法も考えている。

（ａｌ　検定する生体試料を準備する。典型的な試料としては、既知量の血液、及びより好ましくは、血清又は血漿として提供される。

血液、血清及び血漿試料を提供する方法は、この分野では、よく知られている。

山）次に、予め測定された量の本発明の単離された細菌性レクチンを準備する。

（Ｃ１その後、その生体試料を、単離された細菌性レクチンと混合し、免疫反応混合物を作る。

ｆｄ＋　得られた混合物を、分から時間の予め決められた時間、生物学的検定条件に維持する。試料中に存在する抗ＧＣＬ−１抗体が、免疫学的にレクチンに結合し、免疫反応物を作るのに、通常、約１０分から約１６〜２０時間で十分である。

免疫反応のための生物学的検定条件とは、レクチン−リガンド結合検定法に述べられているものと同じである。

ｔｅｌ　それから、その生物学的検定条件に維持した混合物について先に述べた維持時間に形成した免疫反応物の存在を検定した。免疫反応物の存在は、抗ＧＣＩ−１抗体が試料中に存在することを示している。

抗ＧＣＬ−１抗体を含む免疫反応物の存在を検定は、直接的に、あるいは間接的に、この分野でよく知られている検定法を用いて行なった。例えば、米国特許１１ｈ　４，５３６，４７９．隘４，２３３，４０１゜ＮＱ　４，２３３，４０２．隘３，９９６，３４５で述べられている均一検定システムが用いられた。

好ましい態様において、レクチンに結合した抗ＧＣＬ−１抗体の存在は、次に示すステップで検定された。

（ｉ）生体試料を、生体中に存在するヒト免疫グロブリンと結合し、免疫反応物を作る、生物学的に活性な、標識抗体と混合する。その標識抗体は、免疫反応物中に、その抗体が存在するという信号を発することができる。

（ｉｉ　＞そのように作った標識抗体／生体液試料混合物を、その抗体が、第１の免疫反応物として存在する抗ＧＣＬ−１抗体との免疫反応物を作るのに十分な、予め決められた時間、生物学的検定条件に維持する。免疫反応は、ステップ（ｄ）に述べた方法と同様に行なわれる。

特に好ましい検定法において、本発明のレクチン及び標識抗体は生体液体試料中に存在する抗ＧＣＬ−１抗体と免疫学的に結合し、その一部に結合した標識を含むサンドインチ免疫反応物を形成する。すなわち、標識を含むサンドインチ免疫反応物は、抗ＧＣＬ−１抗体１分子が、（１１抗体として、本発明のレクチンと、（２）抗原として標識抗体と免疫反応を起こしたとき形成する。好ましい態様において、その免疫反応物の一部を形成しない標識抗体（すなわち、抗ＧＣＬ− １抗体と免疫的に結合しないもの）は、１３ｉＴｈ抗体の存在を検定する前に、好ましくは、洗浄により、免疫反応物から分離される。

（ｉｉｉ　）それから、抗ＧＣＬ−１抗体を含む免疫反応物の一部として結合している標識抗体の存在を検定した。これは、生体試料における抗ＧＣＬ−１抗体の存在の検定である。免疫反応物の一部として結合した標識抗体量を測定し、そして、その測定は、その試料中の抗ＧＣＬ−１抗体量を定量するのに用いた。その量がゼロのこともあり、もちろん、それは、検出限界内で、その試料中に抗ＧＣＬ−１抗体が存在しないことを示している。標識した第２の抗体の存在及びその量の検定方法は、用いられるｉｉｉに依存し、その標識及び方法は、この分野ではよく知られているものである。

タンパク質性抗体の標識法もよく知られている。たとえば、ハイブリドーマにより産生された抗体は、その組織培養培地中の一成分として提供された放射性同位元素を含むアミノ酸の代謝的取込みにより１にすることができる０例えば、ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）　、Ｇ及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　ｃ、ｌ　メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）　７３巻、３−４６頁（１９８１年）参照、活性官能基を介してのタンパク質結合技術も特に有効である。例えば、オーラミース（Ａｕｒａｍｅａｓ）等、スカンジナビアン・ジャーナル・オン・イムノロジー（Ｓｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｓ＋ｍｕｎｏ１．）　８巻、付録７　：　７−２３頁（１９７８年）及び米国特許Ｉｔ　４，４９３，７９５　（両方とも参考文献に掲げである）参照。

加えて、部位特異的結合反応も行なわれ、それによって、その標識は、第２の抗体と、その目標抗原との免疫反応は、実質的に妨害されることはない。例えば、ロッドウェル（Ｒｏ’ｄｗｅ１１）等、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈ、）　３を１８９−８９４頁（１９８５年）参照。

標識手段には、それらを変性することなく、抗体又は抗原に化学的に結合し、有効な免疫蛍光性トレーサーとなる蛍光団（色素）を形成する蛍光標識試薬がある。適当な蛍光標識試薬には、フルオレセイン・イソシアネート（Ｆ　Ｉ　Ｃ”）　、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミノ− １−ナフタレンスルホニルクロライド（ＤＡＮＳＣ）　、テトラメチルローダミン・イソチオシアネー）（ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ローダミン８２００スルホニル　クロライド（ＲＢ２００ＳＣ）及びそれに類する蛍光色素がある。免疫蛍光分析技術の説明は、参考文献に掲げた、デル力（ＤｅＬｕｃａ）の“免疫蛍光分析”、道具としての抗体、マーカロニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ　）等編、　Ｎ、Ｙ、ニーニーヨーク、ウィリーアンド・サン刊（Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　Ｌｔｄ、）　、　（１９８２年）、１８９−２３１頁にみることができる。

好ましい態様において、指示団は、ホースラディツシュ・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコース・オキシダーゼ又はそれに類するものである。基本的な指示団がホースラディツシュ・バーオキシダーゼ（ＨＲＰ）又は、グルコース・オキシダーゼである場合、抗体リガンド複合体（免疫反応物）が生成した事実を視覚化するのに、付加的試薬が必要である。ＨＲＰに対する、そのような付加的試薬には、過酸化水素及び、ジアミノベンジジンのような酸化色素前駆体が含まれる、グルコース・オキシダーゼに有効な付加的試薬は、２．２′−アジノージ−（３−エチルーヘンズチアジンンーＧ−スルホニンクアシンド）　（ＡＢＴＳ）である。

放射性元素も有用な標識試薬となる。

代表的放射性標識試薬は、ガンマ線放出を行なう放射性元素である。　＋２Ｊ、＋２５■、＋２Ｊ、ＩＩＩ　ｌ、＋３Ｊ及び５１（ｒのような、それ自身、ガンマ線を放出する元素は、ガンマ線放出性放射活性元素指示団の１つを代表する。

特にＩｆＪは好ましい。別の有効な指示団には、それ自身、陽電子を放出するＩ ’Ｃ，”Ｆ、ＩＳＯ及び１３Ｎのような元素がある。放出した陽電子は、動物の体に存在する電子と衝突して、ガンマ線を生ずる。ＩＩ＋インジウムのようなベータ線放出を行うものも有効である。

本発明の検定法及びシステムは、固体マトリックスに固定し、固体サポートを形成している本発明のレクチン又は、抗レクチン抗体を利用することができる。

典型的には、レクチン又は抗レクチン抗体は、他のモードの固定と同様、当業者にはよく知られている、いくつかのモードの吸着が用いられているけれども、水性媒体からの吸着により固体マトリックスに固定している。典型的なモードは、網状デキストロース又はセルロースのようなグルコース含有マトリックスと、シアノゲンブロマイドとの反応で生成した反応性カルボニル官能基と、レクチンもしくは、抗レクチン抗体との反応である。

結合体としてのグルタルアルデヒドは、ラテックス粒子及びそれに類するものと共に、後に議論される。

有効な固体マトリックスは、この分野においてよく知られている。

それらの物質には、ＮＪ州、ビス力タウエイ　（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ　）ファルマシア・ファインケミカル社から、登録商標セファデックスとして市販されている網状デキストラン、アガロース、ＩＬ州、北シカゴのアボット・ラボラトリ −（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から市販されている直径約１ミクロンから約５ミリメートルのポリスチレンビーズ、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、網状ポリアクリルアミド、ニトロセルロース、膜、片又はヘラ状のナイロン織物、ポリスチレン又はポリ塩化ビニルでできたマイクロプレートのウェル、チューブ、板、及びそれに類するものが含まれる。

凝集型検定法に有用なラテックス粒子も固体マトリクスとして有効である。そのような物質は、日本・東京の日本合成ゴム社から市販されており、アニオン住方ケン中に分散されたカルボキシ官能性粒子として説明されている。これらの粒子の典型的ロフトは、０．３０８ミクロンの平均直径をもっており、またカルボキシ基当り、約１５から約３０オングストローム角の、平均カルボキシ官能基の分布をもっている。

使用前に、粒子を、１．３−ジアミノ−２−プロパツールのようなジアミンと反応させ、フリーのアミノ基を維持したまま、粒子のカルボキシ基との多くのアミド結合を形成する。その後、フリーのアミンを、グルタルアルデヒドのようなジアルデヒド及び抗体又は抗原と反応させ、シッフ塩基反応生成物を作る。その後、そのシッフ塩基反応生成物をホウ素化水素ナトリウノ・のような水溶性還元剤で還元し、有用な固体サポートを作る。

当業者は、ここで利用できる、多くの固相免疫検定法があることが理解できるであろう。典型的な有効固相検定法には、酵素増ｒＩＪ免疫検定技術（ＥＭＩＴ）及び蛍光免疫検定法などが、特に議論したＥＬＩＳＡのほかに含まれる。しかし、本発明のレクチンと、抗ＧＣＬ−１抗体との反応で与えられる信号を示す方法なら、どれでもよい。これらの検定法の各々は、その免疫反応、及びそれによる本発明のレクチンと、検定すべき抗体との結合を合図するのに１つの指示手段を用いた、単−又は２つの抗体技術を採用できる０代表的な技術は、マジオ（Ｍａｇｇｉｏ）の、ＯＨ州、クリーブランド（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ）、ＣＲＣプレス（Ｐｒｅｓｓ）版、“酵素イムノアフセイゝ（１９８１年）、及びゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ）の、ＮＹ州、ニューヨーク、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　）版、′蛍光抗体法”に説明されている。

抗ＧＣＬ−１抗体について生体液体試料を検定する特異的方法の１つの態様は、免疫反応を連続して行なう非競合イライザ法である。

その検定法においては、本発明のレクチンの部分標本（例えば、一般に約１から約５００μｇ）を、マイクロプレートのウェルの内壁に固定し、固体サポートを作る。

提供された生体試料中に存在する抗ＧＣＬ−１抗体を、固相レクチンと免疫反応させる。これは、マイクロプレートのウェル中の血′清又は血景のような試料（予め希釈したもの）約１０から約２００−の部分標本を、固相固定レクチンと混合し、固／液相混合物を作ることにより行う。その混合物を、試料中に存在する抗ＧＣＬ−１抗体が免疫学的にレクチン分子と結合し、そして、固相免疫反応物を作るのに十分な、予め決められた時間維持する。さらに、その固及び液相を洗浄し、非特異的に結合した物質を除去する。

固相免疫反応物として存在する抗ＧＣＬ−１抗体（すなわち、固相固定レクチンに結合した抗（１，ＣＬ−１）を、酵素標識第二抗体と免疫反応させる。このことは、例えば水性バッファ溶液中、酵素標識第二抗体、約０．１から約１０μｇ等の部分標本、好ましくはＨＲＰ−標識ヤギ抗ヒト１ｇ抗体を混合し、第二の固／液混合物を作ることにより行なわれる。この第２の混合物を、上述のとおり維持し、レクチン、抗ＧＣＬ−１抗体、及び酵素標識抗体からなる固相免疫反応物 “サンドイッチ”を形成させる。

先に述べたように、固相から液相を分離した後、ＨＲＰに対する過酸化水素の存在化、０−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）のような色素原的な基質の部分標本を、固相免疫反応物を含むマイクロプレートのウェル中に加え、第三の固／液混合物を作った。この混合物を免疫反応物として存在する酵素が、基質の相対量を生産物に転換するのに十分な、予め決められた時間維持する。それから、生成した発色液の光学濃度を測定し、そして、既知量の試薬を含む溶液を用いて得られた結果と比較した。

好ましくは、キット型の、本発明の抗ＧＣＬ−１抗体法を実行するのに有用な診断システムは、別に包装しであるが組合せて用いる、（８１本発明の単離されたレクチン及びｆｂｌ抗ＧＣＬ、−１抗体とレクチンとの免疫反応を知らせる標識抗体を含んでいる。好ましくは、標識抗体は、酵素に抗体そのものが結合したものである。

好ましい態様において、そのシステムは、レクチンが固定し、固体サポートを作る固体マトリックスを含んでいる。有用な固体マトリックスはすでに述べてきた。しかし、好ましくは、その固体マトリックスとして、マイクロプレートのウェルが適している。

さらに好ましい態様において、そのシステムは、ポジティブ　コントロールとして、本発明のレクチンに対して生しる抗体も含んでいる。

既知量のレクチン及び標識抗体を準備する。この量は少なくとも１回の検定を行うのに十分なものである。典型的には、そのレクチン及び標識抗体は、この分野ではよく知られているように、水、食塩水又は、バッフ１で、決った体積に希釈するよう設計された型及び量で与えられる。

そのシステムには、その他にもパッケージが含まれている。それらのパッケージには、（ｉ）乾燥状態もしくは、液状のバッファ塩、（ｉｉ）Ｏ−フェニレンジアミンのような酵素基質及びそれに類するものが含まれている。

生体試料中のＧ　ＣＬ　−１の存在を検定する方法もここでは考えられている。

一般に、頚管又は性尿器の試料のような、検定すべき生体試料を準備し、それを、本発明のレクチンにより誘導される抗体結合部位を含む抗体と混合する。その混合物を、その抗体分子が、生体試料中に存在するＧＣＬ−１と免疫反応するのに十分な、予め決めた時間、生物学的検定条件に維持する。それから、その免疫反応量を、その検定生体試料中の、ＧＣＬ−１分子の存否を決定することで測定する。

その１つの典型的態様は、頚管又は性尿器試料を平板な顕微鏡スライド′にアセトンで固定する、免疫蛍光検定法である。本発明に従って、例えばウサギ中で生じた、一般的には、約１０マイクログラムから約５０００マイクログラムの抗体の部分標本を、よく知られた方法により、そのスライド上で、インキュベートした。

未免疫反応の抗体を洗いおとし、そして、スライド上の非特異的結合部位を、ＢＳＡのようなりンバク質でブロックした後、ヤギの抗ウサギ抗体のような第２の抗体を、そのテストスライド上でインキュベートする。その第２の抗体は、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）のような蛍光色素に結合させることにより、標識化する。

この第２のインキュベージタン後、このテストスライド上の第１の抗体に結合し７た、ＦＩＴＣ標ｍしたヤギの抗ウサギ抗体とはそのままに、過剰の第２の抗体を洗いおとず。ＦＩＴＣ標識した抗体の存在を、蛍光顕微鏡を用いて検出し、それにより、Ｎ、ゴナ−リア（Ｎ、　Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ　）感染の存在を知ることができる。

この指示手段は、本発明の抗体に直接結合していない場合は、抗体とは別に包装される。アセトン固定した頚管又は性尿器試料のような生体試料と混合したとき、その抗体は、ＧＣＬ−１と免疫反応を起こし、免疫反応物を作る。そして、そこに存在する指示手段が免疫反応産物の形成を知らせる。

さらに本発明を、次に掲げる実施例により説明する。

実施例Ｉ　ＧＣＬ−１の生成と単離Ｎ、ｇ、の０９株同ｆｉＮ、ｇ、ＭＳ　１１株のビリ化透明及び非ビリ化透明変異体を、ＧＣＢＣリプレート上育させた（２９ｇ　ＧＣメディアム・ベース（ディフコ）、１ｇバタトアガー（ディフコ）、８−サブルメントＡ（４００ｇグルコース、１０ｇＬ−グルタミン、２０■コカルポキシラーゼ／リフドル）、及び０．８　Ｗ１１サブルメントＢ　（１，２５ｇ　Ｆｅ（ＮＯ３／　２５０＋ｄ）　／総体積ｓｏｏ震ｇ）、ビリ化及び透明の発現型は、ジェームス（Ｊａｍｅｓ）等〔インフエクト・イムノ・（Ｊｎｆｅｃｔ、　７ｍｍｕｎ、　）　１９巻８３３２−３４０頁（１９７８））及びスワンソン（Ｓｗａｎｓｏｎ）、（Ｊ、インフエクト・イムノ（Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、）　１９巻、３２０−３３１頁（１９７８年）〕により述べられたシステムで区別される。

プレートに接種し、それを３５℃で５％ＣＯ，雰囲気下で１８時間インキュベートする。得られた細菌層を、まず、各プレートに１．２５Ｍ１の５０ｍＭ）リスバッファ　〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＭＯ州、セントルイス、シグマ・ケミカル社（ｐＨ９、５＞　）を加えることにより収穫した。それから、収穫した層中の細胞を分散させ、パスツールピペットを用いて、５０ｍ１のポリカーボネート製遠心管に移し、０℃で保存した。

つづいて、その保存株を３分間ミキザーで撹拌し、細菌の表面タンパク質を切り離した。さらに、生じたリスベンジョンを、ベックマンＪＡ−２０Ｄ−ターを用い、１０．０００ｒｐｍ　、　４℃、２０分間の遠心を行ない、ビリンタンパク質含有ペレット及びＧ　ＣＬ、　−１含有上清を作った。その上清を、タンパク質を凝集及び沈殿化するために、６．０００からａ、　ｏｏｏ分子量排除透析膜を用い（ＮＪ州、スプリングフィールド、フィッシャー・サイエンティフィック社（Ｆｉｓｃｈｅｒ　５ｃｅｎｔｉｆｉｃ　（：Ｏ，、）　、スペクトロボア（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｒ＞　）、４℃で２４時間、ビリ・バッファ（１５０ｍＭ）リス、１５０　ｍＭＮａＣ！、ｐＨ７，５）に対し、透析した。その沈殿したタンパク質を先に述べたように遠心後のベレットとして収穫した。そのペレットを、１０ｍＮの５０ｍＭ）リス（ｐｌ＋９．５　）に懸濁し、これにより、粗ＧＣｉ−−１抽出物を得た。この粗ＧＣＬ−１抽出物は、−２０℃で保存した。

ＧＣＬ−１を精製するだめのアフィニティー吸着体は、ガングリオテトラオシルセラミドを固体マトリックスに固定して調製した。

ポリ塩化ビニル製の９６穴マイクロプレートの各ウェルに、２００ナノグラムのガングリオテトラオシルセラミド（ＰＡ州、ベルホンテ（Ｂｅｌｌｅ　ｆｏｎｔｅ）　、スペルコ社（５ｕｐｅｌｃｏ　ｌｎｅ、））を含むメタノール５０マイクロリツトルを加えた、それからそのメタノールを蒸散させ、各ウェルにガングリオテトラオシルセラミドのたい積物を残した。ウェル中の非特異的結合部位は、各ウェルに、２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）５０マイクロリツトルを加え、その混合物を室温で４時間維持し、それから、逆さにして振るこきにより、過剰のブロッキング溶液を除くことにより、ブロックを行った。

固定したガングリオテトラオシルセラミドを有するマイクロプレートのウェルに、５０マイクロリツトルの粗抽出物を導入することにより、上述の粗抽出物からアフィニティー吸着によって、ＧＣＬ−１を単離した。生成した調製物を約８時間維持し、それにより、粗抽出物中に存在するＧＣＬ−１をガングリオテトラオシルセラミドに結合した。未結合のタンパク質はウェルを逆さにし、振ることにより取除いた。それからそのウェルを５０マイクロリットルづつのＰＢＳで５回洗浄した。

特異的に結合したＧＣＬ−１は、各ウェルに５０マイクロリツトルの２％ラウリル硫酸ソーダ（ＳＤＳ）を含むＰＢＳを加えて溶出した。このようにしてできた調製物を室温に３０分維持し、それにより、存在するＧＣＬ−１を溶解した。それから、得られたＧＣＬ−１含有溶液をウェルから取り出し、そして、−２０℃ で保存した。

アフィニティーで単離したＧＣＬ−１およそ１マイクログラムが各マイクロプレートのウェルから得られる。

加えて、Ｇ　ＣＬ　−１は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）によっても上述の粗抽出液から単離された。非ピリ化Ｎ、ｇ、ＭＳ１１株Ｂ２変異体から生成した粗ＧＣＬ−１抽出物を、まず、クロマトフオーカシングのためのＧＣＬ−１抽出物を調製するため、前述の透析膜を用い、４℃で２４時間、ＦＰＬＣ平衡バッファ（２５ｍＭアミジゾール、ｐＨ７，４＞に対して透析した。透析したＧＣＬ−１抽出物をＦＰＬＣ平衡バッファで予め平衡化したモノＰクロマトフオーカシングカラム（ＮＪ州、ビス力タウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）　、ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、）　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃシステム〕にかけ、そして１対８に滅菌水で希釈し、ｐＨ４，０に調整した、ポリバッフ７７４（ＭＯ州、セントルイス、シグスケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋Ｒ３ｃａｌ　Ｃｏ−＋）　）で溶出した。

そのよ゛うなりロマ１−フォーカシングカラムでの、粗Ｇ　ＣＬ−１７＋ｔ＋出物の典型的運転の溶出曲線を図４に示す。溶出画分は、２８０ナノメータでの溶出物の光学密度（０，０，２８０）を測定することにより、タンパク質をモニターし、またそのρ１１を測定した。タンパク質を含む、ＰＩ（約６．１から６．４までの間で溶出してきた両分を回収し、それを−２０℃で保存した。

実施例２　５ＤＳ−ＰＡＧＥによる単離された細菌性レクチンの分子量測定実施例１で生成した、精製細菌性レクチンの相対分子量を、リムリ　（Ｌａｅｍｍｌｉ）、υ、Ｋ、、〔ネイチ十−（Ｎａｔｕｒｅン、２２７巻、６８０−６８４頁（１９７０年）〕ノ方法に従ッテ、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した。最終的に、１２％及び１５％ポリアクリルアミドゲルを鋳込み、そして、レーン当りの全タンパク質をおよそ、２５がら２００マイクログラムで運転した。次に掲げる分子量マーカータンパク質及びダルトン（ｄ）で表したおよその分子量は、コントロール又は標準１ノーンに示した：α−ラクトアルブミン、１４．２００；ソイビーン　トリプシン・インヒビター、２０．１００　；　）リブシノーゲン、２４、０００　；カーボニック　アンバイトラーゼ、２９．０００　；グリセルアルデヒド−３−ホスフェ−１−デヒドロゲナーゼ、３６．０００　；−Ｔツブ・７　）Ｉｚブミ：’　；　４５．０００　；　’）　シ・”ｒＪ＋ｚブミン、６６．０００　（スヘｒＭＯ州、セントルイス、シグマケミカルがら入手した）。電気泳動後、タンパク質のバンドを、コマージブリリアント・ブルー（シグマ）による染色、又は、ＣΔ州、リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ　、バイオラドから入手した、シルバースティンを用い、メリル（ＭｒＨｒｒｉり等〔（アナリティカル・バイオケミストリー（八〇ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、月（］５＠、３６】頁（１９８０年）〕の銀染色法により、視覚化した。

ゲルの分析により、試料レーン中に、トリプシノーゲンよりも人きいが、ソイビーン・トリプトシン・インヒビターよりも小すい移動度で、相対分子Ｍ２２．４００ダルトンを有する１つの主要バンドが明らかになった。図１に示し７たように、このバンドは、アフィンティー精製した細菌性レクチンＧＣＬ−１であった。

ある場合には、染色する前にこのタンパク質バンドを、電気泳動的にニトロセルロース（ＮＨ州キーン（Ｋｅｅｎｅ）　＊　シュレイチャー・アンド・シュエル（Ｓｅｈｌｅｉｅｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）、カタログ番号、ＢＡ８５〕に固定し、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）等〔プロシーディンゲス・イン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｈ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ、７６巻、４３５０−４３５４頁（１９７９年））で述べられているような、ウェスタンプロットを作った。ニトロセルロースに固定したＧＣＬ−１タンパク質は、まず、そのプロットを、実施例１で述べた粗Ｇ　ＣＬ　−Ｉ抽出物でウサギを免疫化することにより調製したウザギ抗ＧＣＬ−１抗体と免疫反応を起こさせることにより検出した。ニトロセルロースに固定化したＧＣＬ−１に免疫学的に結合したウサギ抗ＧＣＬ−１抗体を、アルカリ・ホスファターゼ標識したヤギ抗つサギ抗Ｉｇと免疫反応させ、た、標識の存在、及びそれによるＧＣＬ−１の存在は、ｗｒ州、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、プロメガ・バイオチク、（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製（カタログ番号Ｐ３９３０）のプロトプロット（ＰｒｏｔｏＢｌｏｔ）免疫プロンティングシステムを用いて視覚化した。

実施例１に述べたアフィニティー操作の種々の単離ステップから得られた生産物のウェスタンプロットを図２に示す。これらのプロットの解析は、アフィニティー単離したＧＣＬ−１は実質的に他の淋菌ビリン関連タンパク質を含まないことを明らかにしている。

実施例１で述べたＮ、ｇ、粗抽出物と同様にして調製した、モレクセラ・ボビス（Ｍｏｒｅｘｅｌｌａ　ｂｏｖｉｓ　）の粗タンパク質抽出物のウェスタンプロットを図３に示す、そのプロットの解析で、モレクセラ・ボビス（Ｍｏｒｅｘｅｌｌａ　ｂｏｖｉｓ　）は、抗ＧＣＬ−１抗体と免疫反応を起こし、そして、約２２．４００ダルトンの見が番ノ上の相対分子量をもつことが分った。

実施例３　２ＤＰＡＣ；Ｅによる、単離と特性化実施例１で生成したＧＣＬ−１を含む、粗、非アフィニティー・精製化細菌表面タンパク質抽出物を、ＣＡ州、ザンフランシスコのボーファー・サイエンティフィノクィンスッルメント（ＨｏｅｆｅｒＳｃｔｅｎｔｉｆｉｅ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のシステム２−Ｄ二次元ゲルシステムを用いた２Ｄ−ＰＡＧＥにより単離、特性化を行った。６３５％ポリアクリルアミドと、１つは３から１０のｐＨ勾配を作ることができるものと、他の１つは、４から６．５のｐＨ勾配を作ることができる２組のアンホライト（ＭＤ州、ガイサースバーグ（Ｇａ　ｉ　ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、ＬＫＢインスッルメント社〕を含む、アイソエレクトリンク・フォーカシング（ＩＥＦ）ゲルを１３０ｘ３ミリメーターの酸洗浄ガラス管内に調製した。そのゲルに、およそ２５マイクログラムのタンパク質を含むＧＣＬ−１含有溶液又は、実施例２で述べた分子量マーカータンパク質を含むコントロール溶液を重層した。さらに、ゲル上に、試料重層溶液［９Ｍウレア、２％の両アンフオライト及び１０％のポリエチレン（９）オクチル　フェニルエーテル（ノニデフトＰ４０））を重層した。つづいて、そのタンパク質を、４００ボルト定圧で１２時間及び８００ボルト定圧で１時間電気泳動した。

チューブからフォカスしたゲルを取り出し、処理バッファ（０，０６２５Ｍ）！／Ｘ塩は、ｐＨ６，８，２％ＳＯＳ、１０％グＴＪ　セリン、５％２メルカプトエタノール）で３０分間２度洗浄し、それにより、その等電ｐＨ値に従って分離したタンパク質を含むＩＥＦゲルができる。

アイソエレクトリック・フォーカシングしたタンパク質を、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、その相対分子量に従って分離する。Ｉ　Ｅ　１”ゲルを１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの先端に固定し、０．１％フェノールレッドをトラッキング色素として用い、約３０ミリアンペア定電流で運転した。トラッキング色素がゲルの底についたとき、電気泳動を止めた。つづいてそのゲルを、コ７ツシー・ブリリアント・ブルー又は、実施例２で述べた銀染色で染色するか、又は先に述べたように、タンパク質をゲルから、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）等が述べたニトロセルロースに移した。

ゲルの解析は、約２２．４００ダルトンの相対分子量、すなわち、ＧＣＬ−１の相対分子量をもつタンパク質に対応する単一のタンパク質スポットを明らかにした。この２２．４００ダルトンのタンパク質の等電ｐＨ値は約６．１から約６．４である。

実施例４　マウス小腸からの純粋なガングリオテトラオシルセラミドの調製マウス小腸からの純粋なガングリオテトラオシルセラミドの調製のため、次のような一連の抽出及びクロマトグラフィー分離が行なわれた。溶媒は使用前に乾煙及び再蒸留したものを使用した。

（抽　出）小腸をマウスから外科的に取り出し、小片に切ったのら、乾燈するまで凍結乾怪する。凍結乾燥物質約１３０グラムを、この分野でよく知られているソックスレー装置を用い、２ステツプの抽出にかけた。第１に、２リツトル丸瓶中、約１リツトルのクロロホルム／メタノール（２対１、体積比）と凍結乾燥物質とを混合し、約２４時間、アスベスト絶縁した電熱装置中７０℃に加熱した。溶媒をデカンテーションした後、１．５リツトルのクロロホルム／メタノール（１対９、体積比）を用いて、その物質の第２回目の抽出を同様に行った。そして、その溶媒をデカンテーションし、第１回目のものと合せた。合せた溶媒抽出物を窒素気流下、乾燥するまで蒸発させた。

（アルカリ分解）その後、乾燥した腸抽出物を、５００ミリリフドルの０．２　ＭＫＯ）Ｉメタノール溶液に溶かすことによりアルカリ分解した。そして、その溶解抽出物を、時々振とうして、乾燥抽出物を分散させる５個のガラスピーズを含むガラス瓶中、室温に３時間維持した。その後、得られた混合物を氷酢酸１０ミリリツトルで中和し、１リツトルのクロロホルム／水（３：　２．体積比）を加え、そして、流水に対し、４日間透析した。それからアルカリ分解抽出物は、それにまず５００ミリリツトルのトルエンを加え、それからロータリーエバポレーターを用い、得られた混合物を乾燥することにより、７０’Ｃで蒸発した。その乾燥試料を約５００ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（２対１、体積比）に再溶解し、濾過して、不溶物質を取り除いた。濾過装置は約５００ミリリツトルのメタノールを用い、残存する抽出物を洗い出した。それから濾液を合せ、窒素気流中で蒸発し、それから約５０ミリリツトルのクロロホルムに再溶解した。

（ケイ酸クロマトグラフィー）アルカリ分解腸抽出を、ケイ酸カラムでクロマトグラフし、糖脂質及びアルカリ耐性リン脂質から、コレステロール及び脂肪酸メチルエステルを除いた。

１００メツシユ、試薬級のケイａ　（ＭＯ州、セントルイス、マリンクＯ，ト・ケム・ワークス（Ｍａｌｉｎｃｋｒｏｄｔ　Ｃｈｅｗ、　Ｗｏｒｋｓ））を三種の粒子サイズに分けた二級４４ミクロン以下、約４４〜７４μｍ１及び約７４μ ｍ以上。約４４μｍ以下の画分をメタノールに懸濁（３１に１ｋｇ）Ｌ、ついで、３０分後メタノール層を吸引して、次の操作で使うカラムの底の焼結ガラスフィルターを通る非常に小さい粒子を除くことにより洗浄した。

約４４から約７４μｍのサイズに分画されたケイ酸粒子を、クロロホルムを用い、５０グラムカラムに充填した。そして、先にクロロホルムに溶解した、アルカリ分解抽出物をそのカラムにかけた。

そのカラムに、５００ミリリツトルのクロロホルム、ついで５００ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（９８：２　体積比）を加え、ｉ！遇させた。それから、５００ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（１：３　体積比）、ついで５００ミリリツトルのメタノールを加え、その２つの添加からの溶出液を集め、その合せた溶出液の液体部分を窒素気流中で蒸発し、乾燥抽出物を作った。

（イオン交換クロマトグラフィー）ケイ酸カラムからの乾燥抽出物を約１０ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（２：　ｌ、体積比）に溶解し、クロロホルム／メタノール（２：１、体積比）を用いて、酢酸型でパンクした２０グラムのＤＥＡＥセルロース（ＮＪ州、クリフトン（Ｃ１１ｆｔｏｎ）、ワットマン（Ｗｈａｔ＋＋＋ａｎ　Ｉｎｃ、）＋　Ｄ　Ｅ　２３　）のカラムにかけた。室温における約１日から２日のカラム平衡時間の後、その試料を、４００ミリリンドルのクロロホルム／メタノール（２：１、体積比）、ついで４００ミリリツトルのメタノールで溶出した。その２つの溶出液を合わせ、その液体部分を窒素気流中で蒸発し、乾燥抽出物を得た。

（アセチル化）ＤＥＡＥカラム溶出及び乾燥した抽出物を１０ミリリツトルのクロロホルムに溶かし、各１０ミリリツトルのピリジン及び酢酸無水物をそれに加え、その混合物を、暗所、室温に約１２から１８時間維持することにより、アセチル化を行った。アセチル化反応の後、各２５ミリリツトルのメタノール及びトルエンを加え、その試料をまず窒素気流中で、約６０℃に維持しながらエバポレートし、ついでロータリーエバポレーターを用いて乾燥するまで蒸発し、アセチル化した腸抽出物を作った。

（アセチル化抽出物のケイ酸クロマトグラフィー）アセチル化膿抽出物を約５０ミリリツトルのクロロホルムに溶がし、約４４μｍ以下のサイズに分別され、クロロホルム／メタノール（９８：２、体積比）でパンクした５０グラムのケイ酸粒子を含むカラムにかけた。５００ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（９５：５、体積比）、ついで５００ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（９０：１０、体積比）をカラムに加え、そして、溶出液を集め、その液体部分を窒素気流中で蒸発し、乾燥したアセチル化抽出物を得た。

（脱アセチル化）ケイ酸クロマトグラフ及びアセチル化した抽出物を約２０ミリリツトルのトルエン／メタノール／　０．２　Ｍ　Ｋ　ＯＨメタノール溶液（］：１：２、体積比）に溶解し、脱アセチル化を行うため、室温に３０分間、時々振り混ぜながら維持した。反応時間の後、それに２ミリリツトルの氷酢酸を加え、そして、生じた混合物を８０ミリリフドルのクロロホルム／水（１：１、体積比）中に移し、流水に対し、４日間透析した。その後、脱アセチル化した抽出物を、まず、約１００ミリリツトルのトルエンを加え、その混合物をロータリーエバポレーターを用いて乾燥することにより、７０℃で蒸発し、脱アセチル化乾燥抽出物を得る。

（ＤＥＡＥセルロースカラムを用いたクロマトグラフィー）アセチル化乾燥抽出物を約１０ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（２：１体積比）に溶かし、ＤＥＡＥセルロースの１０グラムカラムにかけ、そして、先に述べたように平衡化させた。そのカラムに２５０ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（２：１、体積比）、ついで、２５０ミリリツトルのメタノールを加えた。

生じた溶出液を合わせ、その液体部分を窒素気流中でエバポレートし、糖脂質含有残香を得た。

（ケイ酸クロマトグラフィー）上で生成した残香の部分標本を５００ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（９８：２、体積比）に溶解し、同溶媒でパンクした、ケイ酸の２５グラムカラムにかけた。５００ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（９８：２、体積比）をそのカラムに加え、通過させた。それから、２５０ミリリツトルのクロロホルム／メタノール（１：３、体積比）、ついで２５０ミリリツトルのメタノールをそのカラムに加え、その溶出液を合せて、そして、その液体部分を窒素気流中でエバポレートした。生じた乾燥物質は実質的に純粋なガングリオテトラオシルセラミドである〔ハンソン（Ｈａｎｓｓｏ、ｎ）等、ＦＥＢＳレターズ、１３９巻、２９１頁（１９８２年）〕。

実施例５ＧＣＬ−１コード遺伝子をクローニングすることによる単離されたＧＣＬ−１の産生及び組換えＤＮＡベクターにおける発現Ｎ、ｇ、０Ｍ５ＩＩ株の非ビリ化Ｂ２変異体由来の淋菌ＤＮＡ中に含まれるＧＣＬ−１をコードする遺伝子を当分野でよく知られており、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等のモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　ニラボラトリーマニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ−ｒｉｅｓ）　（１９８２年）により詳しく述べられている操作を用い、発現ベクター中にクローニング化した。

最終的に、上述のＮ、ｇ、変異体由来のＤＮＡを羊離し、Ｍｂｏｌで部分的に制限切断し、セイファート（Ｓｅｉｆｅｒｔ）等のプロシーディング・イン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、８３巻、７３５頁（１９８６年）に述べられている、クローニングベクターｐ）Ｉｓ　Ｓ　６のＢａｇ　ＨＩ部位に挿入した。生じた組換えプラスミドを生物学的宿主としての大腸菌Ｈ８１０１株［ＭＤ州、ゲイサースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　）、ベセスダ　リザーチ、ラボラトリーズ〕中で増殖した９種々のプラスミド含有大腸菌の大部分を、ＧＣＬ−１遺伝子を含むプラスミドを含んでいるそれらの細菌に対するライブラリーとしてスクリーニングした。

挿入されたＧＣＬ−１遺伝子をもつプラスミドを含む細菌を同定するスクリーニング法は、発現のためのＧＣＬ−１遺伝子自身の天然のプロモーターを用いて、大腸菌中で、Ｃ，ＣＬ−１遺伝子産物が発現できることを利用して行なわれる。

発現したＧＣＬ−１は、Ｇ　ＣＬ−１遺伝子をもつプラスミドを含むそれらの細菌コロニーにおいて、実施例１で述べたようにクロマトフオーカシングにより単離したＧＣＬ−１に対し、ウサギ中で生じた抗匍清を用いた細菌コロニーのライブラリーのイムノスクリーニングにより検出した。

この抗血清の産生のために、１０〜２０マイクログラムの単離されたＧＣＬ−１を、ウサギの首に皮下接種した。第１の接種は完全フロイント補助剤、ついで２週間隔で２回、同様の接種を不完全フロイント補助剤で行った。陽性反応抗血清は、実施例２で述べたように、ウェスタン・ブロンｌ−における粗抽出物中のＧ　Ｃ１，、−１を認識する能力により同定した。

ＧＣＬ−１を発現するライブラリー中のこれらの大腸菌を同定するためのイムノスクリーニング操作は、下にリストしたいくつかの例外とともに参考文献に組込んだ、ヘルツマン（１ｅ１ｆｍａｎ）等のフズーーカス（Ｆｏｃｕｓ）　６巻、１−５頁（１９８４年）の操作に従って行った。これらの例外としては、これも参考文献に組込んであるが、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）等の、ジーン・アナリティカル・チク二フク（Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、　Ｔｅｃｈｎ、）　１巻、３− ８頁（１９８４）に述べられている、ブロッキング試薬としてのウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）の代りに脱脂粉乳への置換及び指示手段としての１２Ｊ標識第二抗体の代りに、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗つザギ免疫グロブリンへの置換がある。標識の存在及び、それによるＧ　ＣＬ−１の存在は、Ｗｌ州、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、プロメガ　バイオチク（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｅｈ）、（カタログ番号、Ｐ３９３０）のプロトプロット・イムノブロッティング・システムを用いて視覚化した。

先に述べたイムノスクリーニング操作によりＧＣＬ−１を含むと決定された個々の陽性反応細菌コロニーを、独立して回収し、均一性を保証するため、少なくとも１回コロニー精製を行った。それから、各単離物について、実施例１で述べたウェスタン・プロットによるＧ　Ｃ１，、−１の発現を分析した。最終的に、個々の細菌単離物の小規模培養を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料パフファ中で直接分解し、クロマトフオーカシングにより単離したＧＣＬ−１に対して生じた、先に述べた抗血清を用いて展開した、ウェスタン・プロットについて解析した。そのように分析し、ＧＣＬ−１を発現する代表的細菌培養物を、図５に示す。

大腸菌において発現したＧ　ＣＬ　−１の見かけの移動度は、Ｎ、ｇ。

培養抽出物から直接単離したレクチンよりわずかに大きい相対分子量に対応している。大腸菌宿主内の発現媒体は、発現タンパク質由来のリーダー配列をプロセッシング及び切断せず、それにより、本来の起源、すなわちＮ、ｇ、宿主でみられるものより、相対的に大きいタンパク質産物が生ずると考えられている。

さらに、これらの代表的な培養物を分析し、酵素Ｎｏｔ　Ｉでの制限酵素消化を含む、よく知られている技術による、存在するプラスミドベクター内に含まれるＧＣＬ−１発現ＤＮＡ挿入物のおよそのサイズを測定した。約２．８から約４．０キロベース（ｋｂ）のサイズの挿入物が検出された。

観測されたデータから、生成した非染色体プラスミドベクターの多くの構造配列特性の存在がこの分野でよく知られている構造配列の一般的性質であることからＩＦすることができる。例えば、レウィン（Ｌｅｗｉｎ）、ジーンズ（Ｇｅｎｅｓ）、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｌｔｄ、＋）Ｎ　Ｙ州、ニューヨーク（１９８３）参照。より特別な場合には、原核性細菌タンパク質は、間にある非コード配列（すなわち、イントロン）のような、真核生物中でみられる中断以外、その同族ヌクレオチド配列とコリニア−である。それ故、ＧＣＬ−１をコードするヌクレオチド塩基対数のラフな見積りは、アミノ酸残基当り、約１１０ダルトン及びアミノ酸残基当り、３個のヌクレオチド塩基対の転換因子を用いることにより、５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析したそのレクチンのみがけ上の分子量から直接行うことができる。この転換により、約２２．４００ダルトンのサイズをもつ、ＧＣＬ−１は約２０４個のアミノ酸を含み、そして、約６１２ヌクレオチド塩基対によりコードされる。

細菌中の遺伝子の発現は、転写及び翻訳の開始及び停止信号に依存している。これらの信号も、それらが、タンパク質コード配列の発現を制限する、その配列内に含まれる信号であることがら、発現制御信号と呼ばれる。それらの信号は、プラスミドベクターｐａｓｓ６のＢａＩＩＨＩクローニング部位のまわりには存在しないことがら、これらの配列は、ＧＣＬ−１をコードする領域の末端部又は付近の、それらの通常の位置内のＤＮＡ挿入により提供される。このように、その挿入ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ挿入物のための生物学的宿主に対し、外来のものである、細菌性レクチンの発現のためのコード領域に通ずる、上流及び下流（隣接）領域と機能的に結合した発現制御信号同様、コード領域を含む。

膜と会合するタンパク質又は、分泌されるタンパク質に対して、通常みられるリーダーペプチドの存在は、本来の生物学的宿主の代りの大腸菌中で発現したとき、わずかに長い、みかけ」−のＧＣＬ−１の分子量により証明された。

加えて、その発現制御信号の特異的要素はＧＣＬ−１遺伝子の転写の開始に必要なプロモーターである。このプロモーター配列は、通常、コード配列の始めの５ ′側に位置する。そのプロモーター配列は、他の細菌遺伝子において特徴づけられているので、そのＧＣＬ−１プロモーターも、コード配列の５′末端位置のリーダー配列に相対的に近接して結しており、リーダー配列から約６１２ヌクレオチド塩基対内に存在すると考えられている。

従って、先に特徴づけられた、代表的ＧＣＬ−１遺伝子挿入物は、約２．８から約４．Ｏｋｂのサイズ範囲をもち、約２２．４００ダルトンのレクチンタンパク質をコードするコード配列を含んでいる一方、そのような挿入物は、より大きなもの、例えば約１０ｋｂのオーダー、好ましくは、約６ｋｂのものであろう。リーダー配列、プロモーターを含む適当な開始及び停止信号、及び種々の■”の、その遺伝子の各両末端に位置する付加的で余分な隣接配列が、本発明で考えられているクローン化され、そして単離されたＤＮＡ断片中、ＧＣＬ−１遺伝子そのものに加えて、存在する。

挿入されたＧＣＬ−１遺伝子をもつ、発現ベクターとしてのｐｌ（５５６ブラスミドを含む代表的大腸菌単離物及び図５に示したようなＧＣＬ−１を発現するものを参照のためｐｃｃｔ、−ｉと命名した。

この細菌培養物をＡＴＣＣ受理番号６７．１９８号として、メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）　、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）　、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に保管した。

その保管期間は、保管期日から３０年間又は、保管所における保管の要請後５年間、又は、米国特許の出願からの存効期間のなかのより長いものでなければならないというプダベスト・トリーティー・必要事項に従かい保管がなされた。組換えプラスミド含有細胞は、保管所で生育不能となったとき、補充されるであろう。

従って、−面において、本発明は、単離された形の、又は先に述べたような細菌性レクチンをコードする、生物学的宿主中、その宿主に対しては外来性のものである複製可能ＤＮＡ断片としての、ＤＮＡ断片を考えている。このＤＮＡ断片は、そのＤＮＡ断片中に存在するレクチンをコードする領域に機能的に結合した、その考案された細菌レクチンの発現に必要な制御信号を含みうる。これらの発現制御信号が生物学的宿主にとって外来性ではあるが、その信号は、その宿主により認識される。本発明のこの特別な特色の、好ましい態様において、このコード領域は、Ｎ、ｇ、に存在するレクチンをコードする天然の領域である。より好ましくは、そのＤＮＡ断片中に存在する、その発現制御信号又は信号塩基対配列は、レクチンに対するＮ、ｇ、のコード領域に関連している天然のＮ、ｇ、発現制御信号である。

ここで考えられている細菌性レクチンのコード領域は約６５０塩基対しか含んでおらず、そして、その両端に結合する隣接領域と会合している。コード領域とともに、その隣接領域は、約１０ｋｂ、好ましくは、約６ｋｂＬか含んでいない。

さらに本発明の方法的局面は、適当な条件下、転写−翻訳培地中でのＤＮＡの増殖に対して先に述べた非染色体プラスミドベクターを含有するバクテリアを含む細菌培養及びその後の、よく知られたタンパク質収穫技術を利用した培養物からの発現された細菌性レクチンの収穫のステップを利用した、細菌性レクチンの生産方法を考えている。

特別な態様を含むこれまでの説明は本発明を説明するためのものであり、それを制限するものではない。多くの、その他の変化や修正は、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなしに行うことが可能である。

ＡＳ０．０．、、。ｘｌｏ−３１−１】手続補正書（方式）％式％３、補正をする者事件との関係　出願人６、補正の対象　明細書及び請求の範囲の翻訳文国際調査報告ＦＣＴ／じ５Ｅ７／ｚＨム９０ｐ（τ／Ｉ；５８７１０！４９０ＰＣＴ１０５８７１０１４９０エエＬ　ＣＬａ工！ｌｌｓ　１４−２３　ｄｒａｗｎ　ｔＯｐｒｃｄｕｃ釦ｇ　ｂａｃｔｅ；工ａＩＬ＠１ｃｔｌｎ　ＶＬ＆　ｇｅｎｅｔ＝ｃ　ｅｎｇｘｒ＋ｅｅｒｉｈｇ。

Claims

【特許請求の範囲】１．淋菌から得られ、ラウリル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動により約２２，４００ダルトンの相対分子量をもつと測定され、そして、約６．１から約６．４の範囲の等電ｐＨ値を有し、特異的にガングリオテトラオシルセラミドに結合することができる単離された細菌性レクチン。２．薬学的に許容できる塩の形の請求項１の細菌性レクチン。３．薬学的に許容できるキャリヤーとともに請求項１記載の単離された細菌性レクチンを含む接種物。４．請求項３記載の、かつ、レクチンが約１０マイクログラムから約５００ミリグラム存在する単位投与型の接種物。５．請求項３記載の、かつ、そのレクチンが約１００マイクログラムから約５００ミリグラム存在する単位投与型の接種物。６．薬学的に許容できるキャリヤー中の、請求項１記載の、効果量のレクチンをヒトに投与することを含む、淋菌に対するヒトの免疫化方法。７．レクチンの約１００マイクログラムから約１００ミリグラムをヒトに投与する、請求項６記載の方法。８．（ａ）ヒトから生体試料を得ること、（ｂ）免疫反応混合物を形成するために、その得られた生体試料を、ＧＣＬ−１に対する抗体と合せること、（ｃ）その抗ＧＣＬ−１抗体が、上記生体試料中に存在するＧＣＬ−１と結合するのに十分な時間、生物学的検定条件にその形成された免疫反応混合物を維持し、それにより、免疫反応物を形成すること、（ｄ）その維持した混合物について、免疫反応物の存在を検定すること、の（ａ）〜（ｄ）のステップを含むヒト生体試料中のレクチンＧＣＬ−１の存在を測定する方法。９．（ａ）ヒトから生体試料を得ること、（ｂ）免疫反応混合物を形成するために、その得られた生体試料を、請求項１で定義した単離された細菌性レクチンの部分標本と合せること、（ｃ）その単離された細菌性レクチンが、生体試料中に存在する抗ＧＣＬ−１抗体に結合するのに十分な時間、生物学的検定条件に形成された混合物を維持し、それにより免疫反応物を形成すること、（ｄ）その維持された混合物について、免疫反応物の存在を検定すること、の（ａ）〜（ｄ）のステップを含むヒトの生体試料中の抗ＧＣＬ−１抗体の存在を測定する方法。１０（ａ）請求項１記載のレクチンＧＣＬ−１に対する抗体及び（ｂ）上記抗体と上記レクチンＧＣＬ−１の免疫反応を知らせることができる指示手段を組合せて含む、ネイセリア・ゴナーリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）レクチンＧＣＬ−１を検定するのに適した診断システム。１１（ａ）請求項１記載の、単離された細菌性レクチン、（ｂ）そのレクチンとの、上記抗体の免疫反応を知らせることができる指示手段、を組合せて含む生体試料中の抗ＧＣＬ−１抗体の存在を測定するのに適した診断検定システム。１２．薬学的に許容できるキャリヤー中の、効果量の上記レクチンを含む接種物を、動物に投与することを含む、請求項１記載の、レクチンＧＣＬ−１と免疫反応を起こす抗体の産生を、温血動物中で誘導する方法。１３．接種物が補助剤も含む請求項１２記載の方法。１４．発現ベクター中に含まれるとき請求項１の細菌性レクチンを発現できる単離されたＤＮＡ断片で、約６５０塩基対ほどの、上記レクチンコード領域と、その両端に結合した隣接領域をもち、その隣接領域とコード領域が合せて１０キロ塩基対程度のものであるもの。１５．請求項１４記載の、かつ、約６ｋ塩基対程度の単離されたＤＮＡ断片。１６．請求項１記載の細菌性レクチンをコードする複製可能なＤＮＡ断片を含み、かつ、この断片が外来性のものである生物学的宿主。１７．上記ＤＮＡ断片がさらに、上記コード領域に隣接する、上記レクチンの発現のための制御信号を含み、その制御信号が、その生物学的宿主にとって外来性のものであるが、その生物学的宿主により認識されるものである、請求項１６記載の生物学的宿主。１８．上記コード領域の上記レクチンに対する、ネイセリアゴナーリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の天然のコード領域である、請求項１記載の生物学的宿主。１９．上記ＤＮＡ断片がさらに、上記天然のコード領域に隣接して、上記レクチンの発現のための、天然のネイセリアゴナーリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）の発現制御信号を含む、請求項１６記載の生物学的宿主。２０．請求項１記載の細菌性レクチンを発現できるＤＮＡ断片で、そのＤＮＡ断片の複製及び発現を制御する塩基対配列に機能的に結合したもの含み、かつ、その断片が、約６５０塩基対程度の上記レクチンコード領域と、それに結合した隣接領域を有し、両方合せても約１０キロ塩基程度しかないものである、転写−翻訳培地中でＤＮＡを複製するための非染色体プラスミドベクター。２１．請求項２０記載のプラスミド・ベクターを含む細菌、及びそこに含まれるＤＮＡ断片によりコードされるレクチンの発現に適した培地を含む細菌培養物。２２．上記細菌培養物が、ＡＴＣＣ受理番号６７，１９８号と同一のものである、請求項２１記載の細菌培養物。２３（１）培養により、細菌性レクチンを発現するのに適した生育条件下、複製及び発現を制御する塩基対配列と機能的に結合している、細菌性レクチンを発現することができるＤＮＡ断片を含む、転写−翻訳培地中で、ＤＮＡを増殖させるための非染色体プラスミドベクターを含む細菌を含む細菌培養物を生育させること、（２）その細菌培養物から、発現した細菌性レクチンを収穫すること、の（１）、（２）のステップを含む細菌性レクチンの産生方法。