JPS6244199A - 糖蛋白質に対するモノクロ−ン抗体およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、糖蛋白質に対して特異性を有するモノクロー
ン抗体およびその製法に関する。かかるモノクローン抗
体は、細胞、組織および血液中の糖蛋白質の検査、診断
の分野に利用される。

（従来の技術） 一般にモノクローン抗体は、抗原で免疫した動物の抗体
産生細胞と無限増殖性を持つ腫瘍細胞株、例えば骨髄腫
細胞株とを融合させたハイブリドーマをクローニングす
ることにより製造される［例えば、ジー・ケーラーおよ
びシー・ミルスタインＣＧ、　Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　
Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ）
２５６　、４９５　（１９７５）を参照］。

このハイブリドーマは抗体産生細胞から抗体産生能力を
他方の腫瘍細胞株から無限増殖性をそれぞれ受は継いで
いる。個々の抗体産生細胞は抗原決定基に対して特異性
を有する抗体（モノクローン抗体）を産生ずるので、こ
れから得られるハイブリドーマもモノクローン抗体をフ
ラスコ内の培地あるいは宿主動物の腹水または血液中に
産生ずる。

このようにして製造されたモノクローン抗体は、その均
質性と高い特異性のために検査、診断用に特に重要であ
る。

一方、最近、種々の糖蛋白質、例えば、アルファー！−
酸性糖蛋白質（ａｌ−ａｃｉｄ　　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ　；以下、α、−ＡＧＰと略称する）、カルジノ
エンブリオニック・アンティジエン（Ｃａｒｃｉｎｏｅ
ｍｂｒｙｏｎｉｃＡｎｔｉｇｅｎ　；以下、ＣＥＡと略
称する）などの細胞、組織または血液中の濃度が癌など
の各種疾患と関係していることが知られてきた。例えば
、ヒトのα、−ＡＧＰは分子量約４４，０００　の急性
相反芯物質であり、各種疾患や重症の感染症等で血液中
の濃度が上昇することが知られている。さらに、ａ、−
ＡＱｐはイン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）において免
疫反応（リンパ球の幼若化反応等）を抑制することが報
告されている。［例えば、エム・ベネットほか（Ｍ、　
Ｂｅｎｎｅｔｔ、　ｅｔ　ａｌ）、プロシーディングズ
・オブ・ナショナル・アカデミツク・サイエンス・ニー
・ニス・ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　）、７７（１０）６１０９（１９８
０）を参照］。

また、最近では、特に癌患者の血液中に見出される免疫
抑制物質として注目されており、石田らは［例えば、山
村ほか（Ｋ、　Ｔａｍｕｒａ　、　ｅｔ　ａｌ）。

キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）、　
４１　。

３２４４（１９８２）］、癌患者腹水中のα、−ＡＧＰ
の中で等電点ガ３，０付近のものを分取し、これをイム
ノサプレッシブ・アシディック・プロティン（Ｉｍｍｕ
ｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ　Ａｃ１ｄｉｃ　Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ　：ＩＡＰと略す）と命名し、ウサギに免疫して
得られた抗血清を用いて、ヒトの血液中のＩＡＰｉ度を
測定し、ＩＡＰが腫瘍マーカーとして使えることを報告
した。しかしながら、石田らのＩＡＰは臓器に非特異的
な腫瘍マーカーとして一般に使用されているが、その検
査に用いられている抗ｒＡＰ抗血清は種々の特異性を持
った抗体の混合物（ポリクローン抗体）であり、特異性
の高いものではなかった。しかも免疫される動物の個体
により、抗血清の抗体価や特異性が異なるなどの問題が
あった。

また、一方癌診断、検査の分野で、膵臓癌に特異的な抗
原ＣＡ−１９−９とこれに対するモノクローン抗体が注
目されている。後に、この抗原は、糖鎖抗原の代表的な
ものであるルイス（Ｌｅｗｉｓ）式血液型抗原の一種で
あることが明らかになり、糖鎖に対する抗体の重要性が
認識されつつある。しかしながら、現時点では血液型抗
原のように赤血球膜あるいは細胞膜上に存在する糖鎖の
みでしか得られておらず、それ以外の糖鎖に対しては実
用的な抗体を得ることは困難であった。

（発明が解決しようとする問題点） 上述のように、α、−ＡＧＰ等の糖蛋白質（ペプチド鎖
および／または糖鎖）に対して特異性を有するモノクロ
ーン抗体を高効率で得ることか要求されるが、単に糖蛋
白質で免疫された抗体産生動物細胞を用いて細胞融合を
行ったハイブリドーマ細胞株では、目的とするモノクロ
ーン抗体を得ることはできない。したがって糖蛋白質（
ペプチド鎖および／または糖！りに対して特異性を有す
るモノクローン抗体の産生のためのハイブリドーマ細胞
株およびこれにより産生されるモノクローン抗体を効率
よく得ることがきわめて重要な課題となっている。

（問題点を解決するための手段） 本発明音らは上記問題点を解決するために鋭意検討を行
った結果、糖蛋白質の糖鎖の非還元末端のシアル酸部分
を除去した糖蛋白質を用いて動物を免疫することにより
免疫原性が高められ、かかる免疫動物細胞を細胞融合に
付すことにより所期の目的を達し得ることを見出し、本
発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、（イ）
脱シアル酸処理が施された糖蛋白質によって免疫された
抗体産生動物細胞を新形成細胞と融合し、得られるハイ
ブリドーマ細胞株を用いて糖蛋白質に対して特異性を有
するモノクローン抗体を製造することを特徴とするモノ
クローン抗体の製造方法および（ロ）該方法により得ら
れるモノクローン抗体を提供するものである。

特に、α、−酸性糖蛋白質に対して特異性を有するモノ
クローン抗体および後述の糖鎖Ｉに含まれる抗原決定基
に対して特異性を有するモノクローン抗体は本発明によ
ってはじめて得られたものである。

本発明における糖蛋白質はペプチド鎖と糖鎖を有する物
質であれば何でも良い。糖含量は、糖蛋白質１分子の重
さに対する糖鎖の重さの割合が０゜５％以上、７０％以
下のものを言う。一般に知られている糖蛋白質としては
プレアルブミン（糖含ｆｆｉ：１．３％）や免疫グロブ
リン（糖含量：３〜１２％）などの血漿蛋白質、カゼイ
ン（糖含量二０．９〜２．５％）などの乳蛋白質、コラ
ーゲンなどの構造蛋白質、リボヌクレアーゼなどの酵素
、細胞膜蛋白質などがあげられる。本発明の方法は、糖
蛋白質のすべてのＭ鎖の非還元末端がシアル酸のオリゴ
マーである場合に特に有効である。

このような糖蛋白質としては、α、−ＡＧＰ（糖含量：
約４２％）、フェトウィン（Ｐｅｔｕｉｎ）、トランス
フェリン（Ｔ　ｒａｎｓｒｅｒｒｉｎ）等があげられる
。

さらに、本発明の方法は糖蛋白質の１部の糖鎖の非還元
末端がシアル酸である場合にも有効であり、その有効性
はシアル酸が占存する割合とほぼ比例する。

このような糖蛋白質としては、ＣＥＡ（糖含量：４０〜
６０％）、ＡＦＰ、ＨＣＧ［ヒユーマン・コリオニック
・ゴナドトロピン（Ｈｕｍａｎ　ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ−
ｇｏｎａｄｏｔ　ｒｏｐ　ｒ　ｎ）、糖含量＝３０％］
、セルロブラスミン（ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ）等
があげられる。　その他の本発明の対象となる糖蛋白質
としては、ＰＣＡ［パンクレアス・キャンサー・アソシ
エイテツドｅアンティンエン（Ｐａｎｃｒｅａｓ　Ｃａ
ｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ａ　ｎｔｉｇｅｎ）
　、糖含量：約２％］、ａｔ　　ＰＡＧ［プレグナンソ
ー・アソシエイテッド・アルファー２−グリコプロティ
ン（Ｐ　ｒｅｇｎａｎｃｙ　−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａ
　、　−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）　、糖含ｆｉ：１
０％コなどの癌マーカー物質や、α−１β−１γ−・・
・インターフェロン（Ｉ　ｎｔｅｒｆｅｒｒｏｎ）や、
Ｉ　Ｔ、−１、−２，−３、−。

ＢＣＧＦ’、ＢＣＤＦ’、ＢＧＤＦ、ＴＲＦ等のリンホ
カイン類等（なかでも、α、−ＡＧＰ）が本発明の対象
として重要である。本発明においては、とくに糖蛋白質
の糖鎖、なかでも、次式 （式中、Ｇａｌはガラクトース、Ｇ　ＩｃＮ　ＡｃはＮ
−アセチルグルコサミン、Ｍａｎはマンノース、Ｆｕｃ
はフコースを意味し、ｎは０またはｌを表わす）で表わ
される糖鎖（以下、糖鎖■と略す）に含まれる抗原決定
基に対して特異的なモノクローン抗体の産生のためのハ
イブリドーマ細胞株を得る糖蛋白質としては、かかる糖
鎖を有するヒトのα１−ＡＧＰ、フェトウィン、セルロ
ブラスミン、ＣＥＡなどが望ましい。これらの糖蛋白質
のなかで、α、−ＡＧＰ、セル口ブラスミン、ＣＥＡに
ついてはフコースが結合した糖鎖（上記式においてれが
１のもの）とフコースが結合していない糖鎖（上記式に
おいてｎか０のもの）の存在が報告されている。

フェトウィンについてフコースが結合した糖鎖の存在は
報告されていない。

これらの糖蛋白質の脱シアル酸化処理は、一般に知られ
ている方法、すなわち、′酵素、例えばシアリデース（
Ｓ　１ａｌｉｄａｓｅ）類による加水分解、あるいは酸
による加水分解で行なわれる。脱ソアル酸化に用いる酵
素はできるだけ蛋白質分解酵素（プロテアーゼ類）を含
まない、純度の高いものが好ましい。純度の低いシアリ
デースはプロテアーゼを含んでおり、シアル酸だけでな
くペプチド鎖部分も分解してしまうので好ましくない。

酸による加水分解は、ペプチド鎖を分解せず、しかもシ
アル酸をできるだけ除去するような必要最小限度の条件
で行なうことが好ましい。例えば、希硫酸などの希薄鉱
酸を用いて加温下に数時間処理することにより達せられ
る。

動物細胞の免疫は脱シアル酸化処理を施した糖蛋白質を
フロイントのコンプリート・アジュバン）（Ｆｒｅｕｎ
ｄ’ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合
したエマルジョンを注入することにより行なわれる。

フロイントのコンプリート・アジュバントは免疫をより
確実にするために混合するものであり、池の方法でらさ
しつかえない。

免疫する動物種としては、種々の動物が用いられ得るが
、ハイブリドーマのパートナ−である適当な新形成細胞
が多く得られるネズミ種属のものが好ましい。ネズミ種
属の中でも適当な新形成細胞が多いＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃ
マウスが特に好ましく使用される。

抗体産生細胞としては、上記ＢＡＬＢ／Ｃマウスの牌細
胞が最ら好ましいが、これ以外にも、例えば、ラットの
評細胞、ウサギのリンパ球、羊のリンパ球なども使用で
きる。

新形成細胞はハイブリドーマに無限増殖性を与え得るも
のであれば良いが、特に骨髄腫細胞が良い結果を与える
ので好ましい。本発明に使用可能な骨髄種細胞株として
はＰ３−Ｘ　６３−Ａｇ８　　［ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、　　２５６．４９５．　１９７５］、Ｐ３−Ｘ
６３−Ａｇ８　　・６５３（ＡＴＣＣ番号、ＣＲＬ−１
５８０、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、）、１２３．１５４８．１９７９）、Ｐ３−
ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１［ヨーロツピアン・ジャーナル
・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ、　Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、）、　６．５１１．　１９７６］、５Ｉ９４、Ｙ
３．５Ｐ２１０［ＡＴＣＣ番号、ＣＲＴ−１５８１１ネ
イチヤー（Ｎａｔｕｒｅ）、２７６．２６９，１９７８
］、ＭＰＣ−１１［ＡＴＣＣ番号、ＣＣＬ、−１６７、
ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイスン（
Ｊ　、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、）、上ｌ上、５１５゜＋９７０
］およびこれらの変異株が挙げられるが、これらはサル
ベージ回路による核酸合成能が欠除しており、のちに述
べるハイブリドーマの選択においてら好ましい。これら
の中でもＰ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１が増殖性と抗体
産生能が高く特に好ましく用いられる。

抗体産生細胞と新形成細胞との融合は公知の方法で行う
ことができ、例えばＨＶ　Ｊ　［ヘマグルチニン・ウィ
ルス・オブ・ジャパン（Ｉｌｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ
Ｖｉｒｕｓ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ）、別名センダイ・ウィ
ルス：岡田善雄著、細胞融合と細胞工学、講談社刊、１
９７５年、１９頁を参照〕、ポリエチレングリコール［
ブイ・ティ・オウイ、エル・エイ・ヘルツエンバーグ（
Ｖ、Ｔ、Ｏｈｊ、Ｌ、Ａ、Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ）著、
セレクテッド・メソッド・イン・セルラー・イムノロジ
ー（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ
ｕｌａｒ　　Ｉ　ｍｍｕ−ｎｏｌｏｇｙ）　、　ビー・
ビー・ミツシェル（Ｂ、Ｂ、Ｍｉｃｈｅｌｌ）ほか編、
ダブリュ・エイチ・フリーマン（Ｗ　、　Ｈ。

Ｆｒｅｅｍａｎ）社刊、第１７章を参照］、電気融合法
などによって行なわれる。

先に例示したようなマウスの骨髄腫細胞は、サルベージ
回路による核酸合成能力が欠除しているので、もう一方
の核酸合成回路であるデ・ノーボ（ｄｅ　ｎｏｖｏ）回
路によってのみ核酸を合成できる。

ハイブリドーマ細胞株は抗体産生細胞由来のサルベージ
回路による核酸合成能力を備えているので、デ・ノーボ
回路を阻害するヒボキサンチンーアミノプテリンーヂミ
ジン（ＨＡＴ）含有培地（通常ｌＯ〜１５％の牛胎児血
清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭｌ−１６４０培地が用い
られる）で選択的に増殖する。

ハイブリドーマが糖蛋白質に特異的な抗体を産生じてい
ることの確認は、脱シアル酸化した糖蛋白質あるいは未
処理の糖蛋白質を結合した羊赤血球を用いる血球凝集反
応で行なわれる。また脱シアル酸化した糖蛋白質あるい
は未処理の糖蛋白質を固相化した酵素免疫測定法（エン
ザイム・リンクド・イムノソーベント・アッセイ、　Ｅ
ｎｚｙｍｅＬ　１ｎｋｅｄ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅ
ｎｔ　Ａｓ５ａｙ、　Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ）でも確認で
きる。

糖蛋白質に対する抗体を産生じているハイブリドーマは
限界希釈法によりクローニングされる。

こうして得られたハイブリドーマ細胞株はイン・ビトロ
（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で、適切な培地（通常、１０〜１
５％のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地が用い
られる）を用いることにより抗体産生を行なわせながら
増殖させることができる。さらに融合に用いた新形成細
胞と同種の動物の体内でハイブリドーマ細胞株を増殖さ
せることにより、腹水および血液中に高濃度のモノクロ
ーン抗体を産生させることができる。

抗体は、上記培養上清や腹水、血清等のままでも、細胞
あるいは血清に存在する糖蛋白質の検出に使用し得るが
、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフイー等の方法で精製したものも使用
され得る。精製された抗体はそのまま、あるいは公知の
方法で、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、ビオチン標
識等がなされたものら上記目的に使用され得る。

検出方法としては、公知の放射性免疫測定法、蛍光免疫
測定法、酵素免疫測定法、血球凝集反応等により行なわ
れる。血清中の糖蛋白質の検出には、血球凝集反応、放
射性免疫測定法、酵素免疫測定法が好ましく使用される
。細胞、組織等の糖蛋白質の検出には蛍光免疫測定法、
酵素免疫測定法が好ましく使用される。しかしながら、
本発明のモノクローン抗体の使用は、これらの検出法に
限定されるものではない。

（効果） 脱シアル酸処理が施された糖蛋白質によって抗体産生動
物細胞を免疫し、免疫された抗体産生動物細胞と新形成
細胞とを融合させることにより、糖蛋白質に対して特異
性を有するモノクローン抗体産生のためのハイブリドー
マ細胞株を得ることができ、これによりモノクローン抗
体を効率よく産生ずることができろ。かかるモノクロー
ン抗体は、細胞、組織および血液中の糖蛋白質の検査、
診断の分野（とくに、癌の診断）に利用することができ
る。

なかでも、α、−ＡＧＰに対して特異性を有するモノク
ローン抗体および糖鎖１に含まれる抗原決定基に対して
特異性を有するモノクローン抗体は新規かつ有用ならの
である。

（実施例） 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

（１）脱シアル酸化α、−ＡＧＰの調整法ｌ−硫酸処理 プールされたヒト血清より公知の方法（例えば、ダブリ
ュ・ブルジおよびケイ・シュミット（Ｗ。

Ｂｕｒｇｉ　ａｎｄ　Ｋ、Ｓｃｈｍｉｄ）、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ　、Ｂ　ｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）。

２３６．１０６６．１９６１）により精製されたａ、−
ＡＧＰｌｏｍｇを１０ｍ、９の０．１規定硫酸水溶液に
溶解し、８０℃で１時間加熱攪拌した。冷却後、３規定
ＮａＯＨ水溶液で中和し、４℃で水に対して透析した。

これを凍結乾燥して約４ｍｇの脱シアル酸化α、−ＡＧ
Ｐを得た。

（２）脱シアル酸化フェトウィンの調製法−硫酸処理 市販のフェトウィン（Ｆ　ｅｔｕｉｎＸシグマ社製。

Ｔｙｐｅ　ＩＶ、牛胎児血清より精製）を（１）と同様
に処理して脱シアル酸化フェトウィンを得た。

（３−１）脱シアル酸化αＩ−ＡＧＰの調製法２−酵素
処理 （１）と同様のａｔ　　ＡＧＰ　Ｉ　Ｏｍｇをｌｏ　ｍ
ｆｌのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液、ｐＨ７，４）に溶解
し、シアリデース（Ｓｉａｌｉｄａｓｅ）［Ｅ、　Ｃ，
３，２，１゜１８］０．２５ｕｎｉｔを加え、３７℃で
３０分間攪拌した。４℃で水に対して透析したのち、凍
結乾燥して約４ｍｇの脱シアル酸化α、−ＡＧＰを得た
。

（３−２）　　脱シアル酸化セルロプラスミンの調製法
−酵素処理 市販のセルロプラスミン（ミドリ十字製）を（３−１）
と同様に処理して脱シアル酸化セルロブラスミンを得た
。

（４）抗体産生細胞の取得 上記（１）で得られた脱シアル酸化α、−ＡＧＰを生理
食塩液に溶解し、シ濾過滅菌したのち、フロイントのコ
ンプリート・アジュバントと混合し、これを、脱シアル
酸化α１−ＡＧＰ　５００μｇ／匹の割合でマウス（Ｂ
ＡＬＢ／Ｃ）の腹腔内注入することにより免疫を行った
。３週間後、同量の脱シアル酸化α１−ＡＧＰの滅菌生
理食塩溶液とリン酸アルミニウム水溶液との混合物でブ
ーストを行った。

ブースト後３臼目に、牌臓細胞を取り出し、これを抗体
産生細胞として用いた。

（５）細胞融合 ６．５Ｘ１０８個の抗体産生細胞と、３．３ｘ１０８個
の新形成細胞（Ｐ３−ＮＳ　ｒ／１−Ａｇ４−１）を、
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ＃、１５００）により
融合した。ＨＡ　Ｔ選択培地（ＨＡＴ含有１５％ＦＣＳ
添加ＲＰＭＩ−１６４０培地）によりハイブリドーマの
みを選択的に増殖させ、融合後ＩＯ日目位より、抗原感
作羊赤血球を用いた血球凝集反応で特異抗体産生の有無
をテストした。

特異抗体を産生ずるハイブリドーマを限界希釈法により
クローニングして、α、−ＡＧＰに特異的なモノクロー
ン抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞株５種（これらの
細胞株および各々の細胞株より産生されるモノクローン
抗体をそれぞれＨＡ−２、ＨＡ−３，ＨＡ−５，ＨＡ−
７および）（Ａ−１Ｏと名付けた）および糖１’ｌｌに
含まれる抗原決定基の１つに特異的なモノクローン抗体
を産生ずるハイブリドーマ細胞株１種（この細胞株およ
びこの細胞株より産生されるモノクローン抗体をＩ（Ａ
−１３と名付けた）を得た。これらのハイブリドーマ細
胞株はいずれも、イン・ヒドロ（１５％ＦＣＳ添加ＲＰ
ＭＩ−１６４０培地）でも、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔
中でも、無限に増殖し、培養上清および腹水からモノク
ローン抗体を得ることができた。

（６）ウェスタン・プロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ　
Ｂｌ。

ｔｔｉｎｇ）による抗体の特異性の検定（ｉ）　　ハイ
ブリドーマ細胞株、ＨＡ−２，Ｉ（Ａ−３、ＨＡ−５，
、ＨＡ−７およびＩ（Ａ−１０につい　。

て α、−ＡＧＰと脱シアル酸化α、　−Ａ　Ｇ　Ｉ）とヒ
ト血清のラウリル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル０度１０％）を
行ない、電気プロッティングにより、電気泳動後のゲル
からナイロン膜［ゼータ−・プローブ（Ｚ　ｅｔａ　−
Ｐ　ｒｏｂｅ）　、バイオランド（株）製コにブロッテ
ィングした。

このナイロン膜をｌＯ％羊血清含ＰＢＳで処理したのち
、抗α、−ＡＧＰモノクローン抗体産生ハイブリドーマ
細胞株の培養上清と反応させた。

さらに、西洋ワサビペルオキシターセ（ＨＲＰ）−抗マ
ウスＩｇ抗体を反応させたのち、Ｈ２０ｔの存在下にノ
アミノベンジジンを作用させて特異的染色を行った。

その結果いずれのハイブリドーマ細胞株の培養上清によ
っても、α、−ＡＧＰ（未処理または脱シアル酸化され
たもの）のバンドのみが特異的に染色され、本発明のモ
ノクローン抗体がα、−ＡＧＰのみと特異的に反応する
ことが証明された。

（ｉｉ）　　ハイブリドーマ細胞株ＨＡ−１３について
α、−ＡＧＰと脱シアル酸化α、−、ＡＧＰ、フェトウ
ィン、脱シアル酸化フェトウィン、セルロブラスミンお
よび脱シアル酸化セルロブラスミンのラウリル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ、ゲル濃度１０％）を行ない、電気プロッティン
グにより、電気泳動後のゲルからナイロン膜［ゼータ−
・プローブ、バイオラッド（株）製］にブロッティング
した。

このナイロン膜を１０％羊血清含ＰＢＳで処理したのち
、抗糖鎖■モノクローン抗体産生ハイブリドーマ細胞株
（Ｉ（Ａ−１３）の培養上清と反応させた。さらに、西
洋ワサビペルオキシターゼ（ＨＲＰ）−抗マウスＩｇ抗
体を反応させたのち、Ｈ３０□の存在下にジアミノベン
ジジンを作用させて特異的染色を行った。

その結果脱シアル酸化α、−ＡＧＰ、脱シアル酸化フェ
トウィンおよび脱シアル酸化セルロブラスミンか特異的
に染色され、未処理のα、−ＡＧＰ１フェトウィンおよ
びセルロプラスミンは全く染色されず、ＨＡ−１３が、
脱シアル酸化したこれらの糖蛋白質に共通の糖鎖Ｉに含
まれる抗原決定基の１つと特異的に反応することが証明
された。

（７）抗体の性状および精製 （ｉ）抗体のクラス オクタミニ−（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法［ウー・オ
フタロ二一、プログレス・オブ・アレルギー（６，０ｕ
ｃｈｔｅｒｌｏｎｙ、　Ｐｒｏｇ、ＡＩＩｅｒｇｙ）、
　５　、　ｌ　、　ｌ　９５８］により、本発明のハイ
ブリドーマ細胞株が産生ずる免疫グロブリンは、それぞ
れｒｇＧ、（１−ｆＡ−３，ＨＡ−７，ＨＡ−１０）、
ＩｇＭ　（ＨＡ−２，ＨＡ−５、ＨＡ−１３）型である
ことがわかった。

（ｉｉ）　　硫安塩析による精製 本発明のハイブリドーマ細胞株の培養上清あるいは腹水
のいずれも、５０％硫酸アンモニウム飽和による沈殿操
作を２回繰り返したのち、４℃で水に対して透析し、さ
らに凍結乾燥することによりモノクローン抗体のＩｇ分
画を得た。

（ｉｉＤアフィニティクロマトグラフィによる精製本発
明のハイブリドーマ細胞株の培養上清あるいは腹水をそ
のまま、あるいはＩｇ分画のＰＢＳ溶液を、脱シアル酸
化α、−，ＡＧＰを結合したセフ７０−ス（Ｓ　ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ）　（ファルマシア社製ＣＮＢｒ−セファロ
ースと脱シアル酸化α、−ＡＧＰより常法により調製）
に特異的に結合させたのち、グリシン−ＨＣ１緩衝液（
ｐＨ２、５）により結合していたモノクローン抗体を溶
出し、中和後、４℃で水に対して透析した。透析終了後
、凍結乾燥してアフィニティ精製モノクローン抗体を得
た。

（８）　　１ｆＩｌ清中のα、−ＡＧＰおよび糖鎖Ｉに
含まれる抗原決定基の検出 （ｉ）　　ビオチン化モノクローン抗体の調製アフィニ
ティ精製モノクローン抗体２ｍｇを０゜１ｍＭのＮ　ａ
　Ｉ４　ＣＯ３水溶液２Ｊに溶解し、ＮＨ３−ピオチン
（ピアス社製）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液
（Ｉｍｇ／Ｊ）　２００　μｍ１を加え、に室温で４時
間反応させたのち、４°ＣでＰＢＳに対して透析してビ
オチン化モノクローン抗体を得た。（ｉｉ）ＥＬＩＳＡ
による血清中のα１−人ＧＰの検出法−■ アフィニティ精製モノクローン抗体のＰＢＳ溶液（０，
０５ｍｇ／ｍｆ）を５０μｌ／ウエル（ｗｅｌｌ）ずつ
フアシヨン（Ｆａｌｃｏｎ）３９１２マイクロテストプ
レートに分注したのち、室温で１夜静置し、抗体を固相
化した。次に、５％ＦＣ８含育ＰＢＳを３００μ夕／ｗ
ｅｌｌずつ分注し、３７℃で２時間静置し、非特異的吸
着サイトを飽和さけた。これに、被験血清と、検量線を
作成するための既知濃度のα、−ＡＧＰの５％ＦＣ５含
有ＰＢＳ溶液を２５μ、Ｊ／ｗｅｌｌずつ加えて、３７
℃で１時間静置した。次に、ウサギ抗α、−ＡＧＰ抗血
清のＩｇＧ分画（ダコー社製）の５％ＦＣ８含有ＰＢＳ
溶液（ｏ、ｏ　１ｍｇ／ｍｉ）を５０　ｔｔ　Ｊ２．／
ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で１時間静置した。さらに
、ＨＲＰ標識抗ウサギ［ｇＧ抗血清（アマジャム社製）
の５．０％ＦＣ８含有ＰＢＳ溶液（０、ＯＯ２ｍｇ／ｎ
＋ｆ、）を５０μ、９／ｗｅｌｌずつ分注し、３７℃で
１時間静置した。

次に、Ｈ，０２存在下で１ｍＭの２．２°−アノノービ
ス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸ＸＡ
ＢＴＳ）を加えて発色させ、４０９ｎｍの透過度を測定
した 既知濃度のα、−ＡＧＰを加えたウェルの透過度と濃度
とから検量線を作成し、この検量線を用いて被験血清中
のα、−ＡＧＰｉ度を求めた。

このようにして得られた検量線の１例ＣＨＡ−７使用）
を第１図に示す。

ＨＡ　−７を用いた場合のα、−ＡＧＰの濃度は、正常
者（Ｎ＝ＩＯ）で１．１±０．１（Ｓ、Ｅ、）μｇ／ｒ
Ｊｌ、癌也者（Ｎ＝１３）で２．２±０．７（Ｓ、Ｅ、
）μｇ／ｍ（！であった。明らかに癌Ｇ者では血清中の
α、−Ａ、ＧＰの濃度が正常者より高く、その状態によ
り濃度が異なるので、値の分布が幅広かった。

（ｉｉｉ）　ＥＬ　Ｉ　ＳＡによる血清中のα、−ＡＧ
Ｐの検出法−２ ウサギ抗α、−ＡＧＰ抗血清のＩｇＧ分画（ダコー社製
）のＰＢＳ溶液（０、１ｍｇ／　ｍｌ）を上記（８）（
百）と同様の方法でプレートに固相化した。（８）（ｉ
ｉ）と同様に非特異的吸着サイトの飽和を行ない、次に
、被験血清と既知濃度のα、−ＡＧＰを加えて反応させ
た。さらに、（８Ｘｉ）で調製したビオチン化モノクロ
ーン抗体の５％ＦＣ５含有ＰＢＳ溶液（０、ＯＯ５ｍｇ
／Ｊ）を加え、次に、ＨＲＰ標識アビジン（ヴエクター
社製）のＴＢＳ（トリス緩衝食塩液、ｐ［＋７．４）溶
液（０、００２ｍｇ／ｍｆ）を加えて、３７℃で１５分
間反応させたのち、（８Ｘｉｉ）と同様にＡＢＴＳを加
えて発色させ・た。

この場合にも第１図と同様の検量線が得られ、この検量
線より被験血清中のα、−ＡＧＰａ度を求めた。１−Ｉ
　Ａ　−２を用いた場合のα、−ＡＧＰの濃度は正常者
（Ｎ＝ＩＯ）で、１．６８＝０．５０（Ｓ、Ｅ、）μｇ
／ｍ児、癌叡者（Ｎ＝１３）で、１．５８±０．７３（
Ｓ、Ｅ、）μｇ／ｍｆｆ１であった。

この結果から、ＨＡ　−２は正常音と癌も者の区別をす
ることは難しいものの、血清中のα、−ＡＧＰを検出す
ることかできることがイつかる。

（ｉｖ）ＥＬＩＳＡによる血清中α＝ＡＧＰの検出法−
３ （８Ｘｉｉ）と同様にアフィニティ精製モノクローン抗
体をプレートに固相化したのち、非特異的吸着サイトの
飽和、次いで被験血清と既知温度のα、−ＡＧＰを反応
さ仕た。これに、（８）（ｉｉｉ）と同様に、ビオチン
化モノクローン抗体を加えたのち、ＨＲＰ標識アビジン
を結合させ、Ａｌ３Ｔ　Ｓを加えて発色させた。検量線
から被験血清中のα、−ＡＧＰａ度を求めた。

１（Ａ−７を固相化し、ビオチン化ＨＡ−５を次に反応
さけた場合の検量線を第２図に示す。ＨＡ−７とビオチ
ン化ＨＡ−５を用いた場合のα、−ＡＧＰの濃度は正常
者（Ｎ＝１０）で０．３７±０゜０４　（Ｓ　、　Ｅ　
、）μｇ／ｍｌ、癌患者（Ｎ＝１３）で、０．８４±０
．１６（Ｓ、　Ｅ、）μｇ／ｄであった。

（Ｖ）ＥＬＩＳＡによる血清中の糖鎖■に含まれる抗原
決定基の検出法 アフィニティ精製モノクローン抗体（ＨＡ−１３）のＰ
ＢＳ溶液（０、０５ｍｇ／Ｊ）を５０μｆ／ｗｅｌｌず
つファルコン３９１２マイクロテストブレートに分注し
たのち、室温で１夜静置し、抗体を固相化した。次に、
５％ＦＣ８含有ＰＴ３Ｓを３００μえ／ｗｅｌｌずつ分
注し、３７°Ｃで２時間静置し、非特異的吸着サイトを
飽和させた。これに、被験血ｌＮと、検量線を作成する
ための既知濃度の脱シアル酸化α、−ＡＧＰの５％Ｉ”
　ＣＳ含有ＰＵ３Ｓ溶液とを２５　ｕ　ｊｉｂ／ｗｅｌ
ｌずつ加えて、３７°Ｃて１時間静置した。次に、（８
）（ｉ）で調製したビオチン化モノクローン抗体（ＨＡ
−１３）の５％ＦＣＳ含有ＰＢＳ溶液（０、ＯＯ５ｍｇ
／ｍ４）を加え、さらに、ＨＲＰ　を悪戯アビジン（ヴ
エクター製）のＴＢＳ（）リス緩衝食塩液、ｐＨ７，４
）溶液（０，００２ｍｇ／ｍｆＬ）を加えて、３７°Ｃ
で１５分間反応させたのち、ｒ−１２０、存在下で１ｍ
Ｍの２．２′−アノノーヒス（３−エチルベンゾチアゾ
リン−６−スルホン酸ＸＡＢＴＳ）を加えて発色させ、
４０９ｎｍの透過度を測定した。

既知濃度の脱シアル酸化α、−ＡＧＰを加えたウェルの
透過度と濃度とから検量線を作成し、この検量線を用い
て被験血清中の糖鎖Ｉに含まれる抗原決定基の相対濃度
を求めた。

この場合の検量線の１例を第３図に示す。血ｌｎ中の糖
鎖■に含まれる抗原決定基の相対濃度は、正常者（Ｎ　
＝　１０）で１２．２±３　、４　（ｓ　Ｅ）μｇ／ｍ
ｆｆ１、癌患者（Ｎ　＝　１３）で４．８±＋　、４（
ｓ　Ｅ）μｇ／ｍｌであり、明らかに、癌患者では血ｔ
Ｎ中の糖鎖■に含まれる抗原決定基の濃度が低く、癌患
者における糖代謝の異常が検知可能であることが示され
た。

（９）細胞のα、−ＡＧＰおよび糖鎖Ｉに含まれる抗原
決定基の検出 １０６個のヒトリンパ球を遠心分離（１２００ｒｐｍ、
　　５分間）し、ＰＢＳで洗浄したのち、（８Ｘｉ）で
調製したビオチン化モノクローン抗体のＰＢＳ溶液（５
ｕ　ｇ／Ｊ）　５　ｍｆｌを加え、４°Ｃて２時間反応
させた。次に、フルオレセイン標識アビジン（ヴエクタ
ー社製）のＮａＨＣ０３援衝食塩液（ｐｌ−１８、２）
溶液（５μｇ／ｍ４）０．２５Ｊを加え、４°Ｃで３０
分間反応させた。水冷したＰＢＳで洗浄後、５０％グリ
セリン／　Ｐ　Ｂ　Ｓに分散し、蛍光顕微鏡で観察した
ところ、特定のリンパ球の細胞膜に特異的にフルオレセ
インの蛍光が観測された。

（ｌＯ）組織中のα１−ＡＧＰおよび糖鎖Ｉに含まれる
抗原決定基の検出 染色する組織はブアン液（Ｂｏｕｉｎ）あるいはカルノ
ー液（Ｃａｒｎｏｙ）にて固定後、脱水して、パラフィ
ン包埋した。パラフィン包埋組織をマイクロドームで薄
切りしてスライドグラスに貼りつけた。キシレン−アル
コール系列で脱パラフィンをした後、ＰＩ３５に１０分
間浸漬して洗浄した。

新鮮凍結切片では、−２０°Ｃのアセトンで固定後、直
ちにＰ［３Ｓで洗浄した。

５０％山羊血清含ＰＢＳを組織切片と室温で３０分間反
応させて非特異的結合サイトをブロッキングした後、５
〜２５７１ｇ／ｍｌの（７）に記載した方法で精製した
モノクローン抗体の１％山羊血清含ＰＢＳ溶液あるいは
モノクローン抗体産生細胞の培養上？ｉ＋７と室温で１
時間反応さＵｏた。ＰＢＳに１０分間浸漬して洗浄した
後、ヒト血清で吸収済のＨＲＰ標識山羊抗マウスＴｇＣ
抗体の５０％山羊血清含ＰＢＳ溶液（１（１−２５μｇ
／ｍｌ）と室温で３０分間反応さ仕た。さらにＰＩ３５
に１０分間浸漬して洗浄した後、Ｈ２Ｏ２の存在下にジ
アミノヘンジノンを作用させて特異染色を行った。さら
にＰＢＳにＩＯ分間浸、責して洗浄した後、メチレンブ
ルーでカウンター染色を行い、水洗、脱水後、アルコー
ル−キシレン系列で脱水し、市販の包埋剤でマウントし
、顕微鏡観察した。

このようにして得られた組織染色の結果の一部を以下に
示す。

ＨＡ　−２、ＨＡ−５では、胃、胆のう、食道の上皮細
胞および肝臓の実質細胞の細胞質部分（Ｃｙｔｏｐｌａ
ｓｍ）が主に染色され、ａ、−ＡＧＰがこれらの組織の
細胞質に分布していることがわかる。

１−ＴＡ−１３では、これらの組織の除土皮細胞の細胞
膜部分（Ｂ　ｒａｓｈ　　ｂｏｒｄｅｒ）が特異的に染
色され、糖鎖■に含まれる抗原決定基の１つがこれらの
部分に特異的に存在することがわかる。Ｉ（Ａ−７では
、５例中２例の乳癌組織の癌細胞か染色されたが、良性
の乳腺腫（３例）では全く染色されなかった。さらに腎
癌、卵巣癌、子宮癌でら染色されたが、消化器系癌、肺
癌、甲状腺腫ては全く染色されなかった。このようにＩ
−ＩＡ−７は特定の癌組織を特異的に染色することが可
能であり、癌の検査に有効である。

（比較例） 未処理のα、−Ａｃｐを用いて、面記実施例の（４）と
同様の方法でマウスに免疫し、抗体産生細胞を取り出し
た。

２．５ＸＩ０６個の抗体産生細胞と１．１ｘ１０８個の
新形成細胞（ＰＪ−ＮＳ　Ｉ／１−Ａｇ４−１）を、実
施例の（５）と同様の方ｆ去で融合し、ハイブリトーマ
の」二清中の特異抗体のａ無をα、−ＡＧ■〕を固相化
した酵素免疫測定法でテス）・シた。細胞を分注した３
４８ウエルのすへて（１００％９にハイブリドーマの増
殖が認められ、このうち、２５ウエル（７％）に酵素免
疫測定法により抗体価を認めた。しかしながら、このう
ち１０株のハイブリドーマはクローニングまでに抗体価
か消失した。

限界吊択法によりクローニングした１５Ｐ１８から得ら
れたコロニーの１へてか酵素免疫測定法で抗体価が認め
られず、未処理のα、−ＡＧＰで免疫した場合には安定
な抗体産生ハイブリドーマ細胞株を得ることは困難であ
ることがわかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のモノクローン抗体ＨＡ−７を固相化し
たＥＬＩＳＡの検量線図、第２図は本発明のモノクロー
ン抗体ＨＡ　−７を固相化し、ビオチン化ＨＡ−５をさ
らに反応させたＥＬＴＳＡの検量線図、第３図は本発明
のモノクローン抗体ＨＡ−１３を固相化し、ビオチン化
ＨＡ−１３をさらに反応させたＥＬＩＳＡの検量線図で
ある。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）脱シアル酸処理が施された糖蛋白質によって免疫
   された抗体産生動物細胞と新形成細胞とを融合し、得ら
   れるハイブリドーマ細胞株を用いて糖蛋白質に対して特
   異性を有するモノクローン抗体を製造することを特徴と
   するモノクローン抗体の製造方法。
2. （２）該糖蛋白質がヒトのα＿１−酸性糖蛋白質である
   特許請求の範囲第（１）項記載のモノクローン抗体の製
   造方法。
3. （３）該糖蛋白質の次式で表わされる糖鎖 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−ア
   セチルグルコサミン、Ｍａｎはマンノース、Ｆｕｃはフ
   コースを意味し、ｎは０または１を表わす）に含まれる
   抗原決定基に対して特異性を有する抗体を産生する特許
   請求の範囲第（１）項または第（２）項記載のモノクロ
   ーン抗体の製造方法。
4. （４）ｎが０である特許請求の範囲第（３）項記載のモ
   ノクローン抗体の製造方法。
5. （５）該抗体産生動物細胞がネズミ起源のものである特
   許請求の範囲第（１）項記載のモノクローン抗体の製造
   方法。
6. （６）該抗体産生動物細胞がＢＡＬＢ／Ｃマウスの脾臓
   細胞である特許請求の範囲第（５）項記載のモノクロー
   ン抗体の製造方法。
7. （７）該新形成細胞が骨髄腫細胞である特許請求の範囲
   第（１）項記載のモノクローン抗体の製造方法。
8. （８）該新形成細胞がＰ＿３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１
   である特許請求の範囲第（７）項記載のモノクローン抗
   体の製造方法。
9. （９）ヒトのα＿１−酸性糖蛋白質に対して特異性を有
   するモノクローン抗体。
10. （１０）次式で表わされる糖鎖 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−ア
    セチルグルコサミン、Ｍａｎはマンノース、Ｆｕｃはフ
    コースを意味し、ｎは０または１を表わす）に含まれる
    抗原決定基に対して特異性を有するモノクローン抗体。
11. （１１）ｎが０である特許請求の範囲第（１０）項記載
    のモノクローン抗体。