JP2712320B2 - 細胞系及びそれによって産生される抗エピグリカニンモノクローナル抗体 - Google Patents
細胞系及びそれによって産生される抗エピグリカニンモノクローナル抗体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は悪性度の免疫学的診断法に関するものであ
る。
る。
癌の古典的なスクリーニング法は、Ｘ線、生検、物理
的検査、および癌細胞に対する抗体によって形成された
免疫複合体の検出などの免疫学的方法によるものであっ
た。
的検査、および癌細胞に対する抗体によって形成された
免疫複合体の検出などの免疫学的方法によるものであっ
た。
ストレインＡマウスTA3哺乳類癌細胞系の同種移植可
能な腹水亜系細胞は、その表面に多量のエピグリカニン
を発現する。マウスエピグリカニンは、約1300アミノ酸
残基の単一のポリペプチド鎖からなり、500以上の炭水
化物鎖が結合している。炭水化物は分子量500,000であ
る該糖タンパク質のおよそ75〜80％をしめる。コディン
トン（Codington）氏らは、J.Nat′ｌ Cancer Inst.
第73巻，第1029頁（1984）で、該亜細胞系をウサギおよ
びマウスに注射することにより、抗エピグリカニンポリ
クローナル抗体を誘導し、抗エピグリカニンポリクロー
ナル抗体に結合する糖タンパク質が特に転移性癌を持つ
ヒト患者の体液に存在することを報告した。
能な腹水亜系細胞は、その表面に多量のエピグリカニン
を発現する。マウスエピグリカニンは、約1300アミノ酸
残基の単一のポリペプチド鎖からなり、500以上の炭水
化物鎖が結合している。炭水化物は分子量500,000であ
る該糖タンパク質のおよそ75〜80％をしめる。コディン
トン（Codington）氏らは、J.Nat′ｌ Cancer Inst.
第73巻，第1029頁（1984）で、該亜細胞系をウサギおよ
びマウスに注射することにより、抗エピグリカニンポリ
クローナル抗体を誘導し、抗エピグリカニンポリクロー
ナル抗体に結合する糖タンパク質が特に転移性癌を持つ
ヒト患者の体液に存在することを報告した。
概要すると、本発明は細胞系およびそれによって産生
されるエピグリカニンに反応性を持つモノクローナル抗
体に関するものである。好ましい態様ではモノクローナ
ル抗体は標識され、該標識は放射線標識を用いるか、あ
るいは、常磁性イオンと結合させてNMRコントラスト剤
を形成させることである。
されるエピグリカニンに反応性を持つモノクローナル抗
体に関するものである。好ましい態様ではモノクローナ
ル抗体は標識され、該標識は放射線標識を用いるか、あ
るいは、常磁性イオンと結合させてNMRコントラスト剤
を形成させることである。
本発明のモノクローナル抗体はいくつかの診断法で使
用可能であり、従って、哺乳動物における悪性度試験の
ための診断用キットに用いることができる。
用可能であり、従って、哺乳動物における悪性度試験の
ための診断用キットに用いることができる。
該モノクローナル抗体がエピグリカニン様ポリペプチ
ド上の特定のエピトープに対して高い特異性を持ち、エ
ピグリカニン様ポリペプチドを表面上に発現している悪
性細胞が多種存在することにより、本方法は広範囲の悪
性度のスクリーニングに使用可能である。
ド上の特定のエピトープに対して高い特異性を持ち、エ
ピグリカニン様ポリペプチドを表面上に発現している悪
性細胞が多種存在することにより、本方法は広範囲の悪
性度のスクリーニングに使用可能である。
本発明のモノクローナル抗体は、アシアロエピグリカ
ニンを哺乳動物に注射して動物を免疫し、マウス由来脾
臓細胞を骨髄腫細胞と融合させて作成したハイブリドー
マによって産生される。
ニンを哺乳動物に注射して動物を免疫し、マウス由来脾
臓細胞を骨髄腫細胞と融合させて作成したハイブリドー
マによって産生される。
本発明の他の利点および特徴は上述の特許請求の範囲
および下記の望ましい態様の説明から明らかになるであ
ろう。
および下記の望ましい態様の説明から明らかになるであ
ろう。
本発明の望ましい態様の構造、調製法、および使用法
を以下に述べる。
を以下に述べる。
エピグリカニンに対するモノクローナル抗体 本発明のモノクローナル抗体はコーラー（Kohler）氏
とミルスタイン（Milstein）氏｛Nature第256巻第495頁
（1975）｝が開発した方法を基礎にした方法で調製され
た。一般的に、体細胞ハイブリッドすなわちハイブリド
ーマは、連続的に分裂している（“不死の”）腫瘍細胞
培養液由来の細胞を選択したエピトープに対して免役し
た動物から回収した脾臓細胞あるいはリンパ細胞と融合
することにより選択培地中に形成させる。骨髄腫細胞は
選択培地で殺され、脾臓細胞あるいはリンパ球はその元
来の寿命により最終的には死に、ハイブリドーマのみが
残る。各々のハイブリドーマは組織培養での細胞系維持
あるいは注射および生体内腹水形成によって、単一のエ
ピトープに対する抗体を連続的に分泌することのできる
不死細胞系である。エピグリカニンに対するモノクロー
ナル抗体を産生するために、選択されたエピトープはエ
ピグリカニン分子上にある。望ましい態様の調製におい
ては、マウスをアシアロエピグリカニンの皮下（subcut
aneous;“sc"）注射あるいは腹腔内（intraperitoneal;
“ip"）注射の繰り返しによって免疫し、それぞれのマ
ウス由来の脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させ、ハ
イブリドーマを形成させる。次に、ハイブリドーマをク
ローニングし、モノクローナル抗体産生のためにマウス
中の腹水の形で増殖させる。続いて、ゴディング（Godi
ng）氏が「モノクローナル抗体：プリンシプルとプラク
ティス（Monoclonal Antibodies:Principles and Pract
ice）」（アカデミックプエス，ニューヨーク，第２版,
1986）で述べているような既知の方法でモノクローナル
抗体を精製する。
とミルスタイン（Milstein）氏｛Nature第256巻第495頁
（1975）｝が開発した方法を基礎にした方法で調製され
た。一般的に、体細胞ハイブリッドすなわちハイブリド
ーマは、連続的に分裂している（“不死の”）腫瘍細胞
培養液由来の細胞を選択したエピトープに対して免役し
た動物から回収した脾臓細胞あるいはリンパ細胞と融合
することにより選択培地中に形成させる。骨髄腫細胞は
選択培地で殺され、脾臓細胞あるいはリンパ球はその元
来の寿命により最終的には死に、ハイブリドーマのみが
残る。各々のハイブリドーマは組織培養での細胞系維持
あるいは注射および生体内腹水形成によって、単一のエ
ピトープに対する抗体を連続的に分泌することのできる
不死細胞系である。エピグリカニンに対するモノクロー
ナル抗体を産生するために、選択されたエピトープはエ
ピグリカニン分子上にある。望ましい態様の調製におい
ては、マウスをアシアロエピグリカニンの皮下（subcut
aneous;“sc"）注射あるいは腹腔内（intraperitoneal;
“ip"）注射の繰り返しによって免疫し、それぞれのマ
ウス由来の脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させ、ハ
イブリドーマを形成させる。次に、ハイブリドーマをク
ローニングし、モノクローナル抗体産生のためにマウス
中の腹水の形で増殖させる。続いて、ゴディング（Godi
ng）氏が「モノクローナル抗体：プリンシプルとプラク
ティス（Monoclonal Antibodies:Principles and Pract
ice）」（アカデミックプエス，ニューヨーク，第２版,
1986）で述べているような既知の方法でモノクローナル
抗体を精製する。
望ましい態様のモノクローナル抗体を得るための手順
のより詳細な説明を以下に示すが、本分野の技術に熟達
したものは、本発明の範囲に含まれるモノクローナル抗
体がここに示したものと個々に異なるような手順によっ
ても得られることを理解するであろう。
のより詳細な説明を以下に示すが、本分野の技術に熟達
したものは、本発明の範囲に含まれるモノクローナル抗
体がここに示したものと個々に異なるような手順によっ
ても得られることを理解するであろう。
1.アシアロエピグリカニンの産生と精製 表面にエピグリカニンを発現しているマウス腫瘍細胞
は同種の別のマウス（同種異系宿主,allogeneic host）
あるいは他種の動物（異種宿主,xenogeneic host）で活
発に増殖でき、該増殖期間後にエピグリカニンが宿主の
体液内に生じる。望ましい態様においては、クーパー
（Cooper）氏らがJ.Natl.Cancer Inst.第63巻，第163頁
（1979）で記述し、商業的に入手可能なマウスA/WySn株
での連続継代によって維持されているストレインＡマウ
スTA3乳癌のTA3-Ha亜系の腹水細胞をA/WySnマウスの注
射し、エピグリカニンを７日後の宿主腹水から単離し、
クーパーら、（前出の文献）による方法でカラムクロマ
トグラフィーによって精製した。0.05M硫酸中のエピグ
リカニン溶液を80℃で60分熱することにより、精製した
エピグリカニンからシアル酸を除去し、混合液をpH7.0
の血球凝集緩衝液に対して透析した。
は同種の別のマウス（同種異系宿主,allogeneic host）
あるいは他種の動物（異種宿主,xenogeneic host）で活
発に増殖でき、該増殖期間後にエピグリカニンが宿主の
体液内に生じる。望ましい態様においては、クーパー
（Cooper）氏らがJ.Natl.Cancer Inst.第63巻，第163頁
（1979）で記述し、商業的に入手可能なマウスA/WySn株
での連続継代によって維持されているストレインＡマウ
スTA3乳癌のTA3-Ha亜系の腹水細胞をA/WySnマウスの注
射し、エピグリカニンを７日後の宿主腹水から単離し、
クーパーら、（前出の文献）による方法でカラムクロマ
トグラフィーによって精製した。0.05M硫酸中のエピグ
リカニン溶液を80℃で60分熱することにより、精製した
エピグリカニンからシアル酸を除去し、混合液をpH7.0
の血球凝集緩衝液に対して透析した。
2.エピグリカニンに対するモノクローナル抗体の調製と
精製 酸素結合性イムノソーベント アッセイ（enzyme-lin
ked immunosorbent assay,“ELIZA"）で測定して陽性の
クローンが最も多く得られた骨髄腫と脾臓細胞の融合
は、商業的に入手可能なC57BLマウスにアシアロエピグ
リカニンを複数回注射し、該マウスの脾臓細胞をS2/0−
Ag 14マウス（“SP2";ATCCから入手可能）骨髄腫細胞と
の融合によるものである。アシアロエピグリカニンでの
免疫感作はエピグリカニンによるものと比較して、より
増幅された免疫反応を与えた。この融合由来の４種のモ
ノクローナル抗体、AE−1,AE−2,AE−3,およびAE−４
は、50％飽和硫酸アンモニウム沈殿、セファデックスＧ
−200カラムでの分画後、90〜95％の純度で得られた。
精製 酸素結合性イムノソーベント アッセイ（enzyme-lin
ked immunosorbent assay,“ELIZA"）で測定して陽性の
クローンが最も多く得られた骨髄腫と脾臓細胞の融合
は、商業的に入手可能なC57BLマウスにアシアロエピグ
リカニンを複数回注射し、該マウスの脾臓細胞をS2/0−
Ag 14マウス（“SP2";ATCCから入手可能）骨髄腫細胞と
の融合によるものである。アシアロエピグリカニンでの
免疫感作はエピグリカニンによるものと比較して、より
増幅された免疫反応を与えた。この融合由来の４種のモ
ノクローナル抗体、AE−1,AE−2,AE−3,およびAE−４
は、50％飽和硫酸アンモニウム沈殿、セファデックスＧ
−200カラムでの分画後、90〜95％の純度で得られた。
より詳細には、抗エピグリカニン抗体はアシアロエピ
グリカニン（50mg）を０日,14日，および21日目に注射
（ip）することにより６週間のC57BLマウスの雌４匹か
ら誘導された。14日目と21日目は、免疫原を、フロイン
ド完全アジュバントによる懸濁液で投与した。マウスは
各々の注射に先だって交配を行ない、注射した４匹のマ
ウスおよびそれらのマウスと同時に生理食塩水を注射し
た第５のマウスについて１週間おきに相対的な抗体力価
を比較した。最も高い力価のマウスの過剰免疫感作は30
mgのアシアロエピグリカニンの注射（ip）で35日目に行
なった。SP2マウス骨髄腫細胞との融合は38日目に行な
った。骨髄腫細胞を除去し、例えばガルフレ（Galfre）
氏らがMethods Enzymol.第73巻，第３頁（1981）で述べ
ているような既知の方法で、ハイブリドーマをクリーニ
ング、サブクローニングし、培養し、最終的に商業的に
入手可能なマウスCBYB6F1内の腹水の形で増殖させる。
ハイブリドーマ細胞の増殖培地として、20％Nu血清、高
グリコース、グルタミン（0.5g/l）、ペニシリン（100U
/ml）、ストレプトマイシン（100mg/ml）を添加したダ
ルベッコのイーグル修飾培地（Dulbecco′s Modified E
agle medium）を用いた。
グリカニン（50mg）を０日,14日，および21日目に注射
（ip）することにより６週間のC57BLマウスの雌４匹か
ら誘導された。14日目と21日目は、免疫原を、フロイン
ド完全アジュバントによる懸濁液で投与した。マウスは
各々の注射に先だって交配を行ない、注射した４匹のマ
ウスおよびそれらのマウスと同時に生理食塩水を注射し
た第５のマウスについて１週間おきに相対的な抗体力価
を比較した。最も高い力価のマウスの過剰免疫感作は30
mgのアシアロエピグリカニンの注射（ip）で35日目に行
なった。SP2マウス骨髄腫細胞との融合は38日目に行な
った。骨髄腫細胞を除去し、例えばガルフレ（Galfre）
氏らがMethods Enzymol.第73巻，第３頁（1981）で述べ
ているような既知の方法で、ハイブリドーマをクリーニ
ング、サブクローニングし、培養し、最終的に商業的に
入手可能なマウスCBYB6F1内の腹水の形で増殖させる。
ハイブリドーマ細胞の増殖培地として、20％Nu血清、高
グリコース、グルタミン（0.5g/l）、ペニシリン（100U
/ml）、ストレプトマイシン（100mg/ml）を添加したダ
ルベッコのイーグル修飾培地（Dulbecco′s Modified E
agle medium）を用いた。
モノクローナル抗体は一般的に以下の過程を含む、本
分野では既知の方法によって精製した；（１）50％飽和
硫酸アンモニウムでの沈殿；（２）50％飽和硫酸アンモ
ニウムによるペレットの洗浄；および（３）再溶解し、
透析した溶液のDEAEセルロース（シグマ社）での分画、
あるいは、透析しっていない溶液のセファデックスＧ−
200（ファルマシア社）を用いて0.20M NaCl,pH7.5で溶
出する分画。
分野では既知の方法によって精製した；（１）50％飽和
硫酸アンモニウムでの沈殿；（２）50％飽和硫酸アンモ
ニウムによるペレットの洗浄；および（３）再溶解し、
透析した溶液のDEAEセルロース（シグマ社）での分画、
あるいは、透析しっていない溶液のセファデックスＧ−
200（ファルマシア社）を用いて0.20M NaCl,pH7.5で溶
出する分画。
抗体のアイソタイプ化は、ベーリンガー−マンハイム
社のマウス免疫グロブリンサブタイプ同定キットで行な
った。結果はSDSを含むポリアクリルアミドゲル電気泳
動で確認し、Ｈ鎖の泳動度を標準の免疫グロブリンと比
較した。
社のマウス免疫グロブリンサブタイプ同定キットで行な
った。結果はSDSを含むポリアクリルアミドゲル電気泳
動で確認し、Ｈ鎖の泳動度を標準の免疫グロブリンと比
較した。
3.モノクローナル抗体の特徴 β−メルカプトエタノールの存在下でのSDSを含むポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により、90〜95％のタン
パク質はクマシーブルー染色で示されたように免疫グロ
ブリンＨ鎖とＬ鎖とともに泳動するバンドに存在するこ
とが示唆された。Ｈ鎖領域のバンド強度の少なくとも95
％はｍ鎖として存在することが明らかになり、ほとんど
全ての抗体がIgM型であることを示唆している。モノク
ローナル抗体の収量はタンパク質含量で決定したとこ
ろ、４〜9mg/mlの範囲であった。大部分がIgM型抗体で
あることはキットとしてベーリンガー−マンハイム社か
ら供給された抗体を用いたELISAタイプアッセイの結果
からも示された。それぞれの抗体は、ウェルを初めにエ
ピグリカニンかアシアロエピグリカニンのいずれかでコ
ートしておいた場合、ELIZAアッセイで強い陽性の値を
示した。４種のうちの２種の抗体（AE−３およびAE−
４）は125I−エピグリカニンを用いたラジオイムノアッ
セイ（“RIA"）において、不溶性の抗原−抗体複合体を
形成した。AE−３およびAE−４のRIA曲線の勾配はウサ
ギ抗エピグリカニンポリクローナル抗体を用いた標準曲
線と似ているが、５倍感度が低い。AE−１の阻害曲線は
より鋭い勾配を示すが、40ngのみで最大の沈澱量を与え
た。
リアクリルアミドゲル電気泳動により、90〜95％のタン
パク質はクマシーブルー染色で示されたように免疫グロ
ブリンＨ鎖とＬ鎖とともに泳動するバンドに存在するこ
とが示唆された。Ｈ鎖領域のバンド強度の少なくとも95
％はｍ鎖として存在することが明らかになり、ほとんど
全ての抗体がIgM型であることを示唆している。モノク
ローナル抗体の収量はタンパク質含量で決定したとこ
ろ、４〜9mg/mlの範囲であった。大部分がIgM型抗体で
あることはキットとしてベーリンガー−マンハイム社か
ら供給された抗体を用いたELISAタイプアッセイの結果
からも示された。それぞれの抗体は、ウェルを初めにエ
ピグリカニンかアシアロエピグリカニンのいずれかでコ
ートしておいた場合、ELIZAアッセイで強い陽性の値を
示した。４種のうちの２種の抗体（AE−３およびAE−
４）は125I−エピグリカニンを用いたラジオイムノアッ
セイ（“RIA"）において、不溶性の抗原−抗体複合体を
形成した。AE−３およびAE−４のRIA曲線の勾配はウサ
ギ抗エピグリカニンポリクローナル抗体を用いた標準曲
線と似ているが、５倍感度が低い。AE−１の阻害曲線は
より鋭い勾配を示すが、40ngのみで最大の沈澱量を与え
た。
4.抗原決定基 表１は過ヨウ素酸塩あるいはエンド−ａ−Ｎ−アセチ
ル−Ｄ−ガラクトサミニダーゼ〔ジプロコッカス・ニュ
ーモニアエ（Diplococcus pneumoniae）から調製〕によ
る処理後に失われたエピグリカニンの阻害活性の割合を
示している。エンド−ａ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクト
サミニダーゼはエピグリカニンのセリンあるいはスレオ
ニンに結合しているジサッカライド、２−アセタミド−
２−デオキシ−３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
ａ−Ｄ−ガラクトピラノースのみを切断することができ
る。二つの処理のいずれも抗体がエピグリカニンに結合
できる能力を除くことができ、エピトープがGalβ1-3Ga
lNAc鎖を含む糖ペプチド部分であることを示唆してい
る。
ル−Ｄ−ガラクトサミニダーゼ〔ジプロコッカス・ニュ
ーモニアエ（Diplococcus pneumoniae）から調製〕によ
る処理後に失われたエピグリカニンの阻害活性の割合を
示している。エンド−ａ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクト
サミニダーゼはエピグリカニンのセリンあるいはスレオ
ニンに結合しているジサッカライド、２−アセタミド−
２−デオキシ−３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
ａ−Ｄ−ガラクトピラノースのみを切断することができ
る。二つの処理のいずれも抗体がエピグリカニンに結合
できる能力を除くことができ、エピトープがGalβ1-3Ga
lNAc鎖を含む糖ペプチド部分であることを示唆してい
る。
これら３種のモノクローナル抗体はＴ抗原、アシアロ
グリコフォリンＡの免疫原によってRIA（表１）に見ら
れる阻害の程度において顕著に異なっている。125I−エ
ピグリカニンおよびモノクローナル抗体のうちの２種、
AE−１およびAE−３を用いたラジオイムノアッセイでの
アシアログリコフォリンＡの阻害活性は、これらの抗体
の弱い結合性を示唆した。AE−４がエピグリカニンとほ
ぼ同程度に強くアシアログリコフォリンＡと結合すると
いう観察は、二つの糖タンパク質、エピグリカニンとグ
リコフォリンＡはジサッカライド鎖結合部位に共通のア
ミノ酸配列を有することを示す。AE−１およびAE−３は
AE−４が必要とするアミノ酸配列を必要とするが、さら
に別のアミノ酸も認識する可能性がある。エピグリカニ
ンのジサッカライドと同一の多数の糖鎖を有する抗冷凍
糖タンパク質に対する３種のモノクローナル抗体の弱い
結合性は、該抗体は糖鎖とともにペプチド結合も必要と
することを示唆している。
グリコフォリンＡの免疫原によってRIA（表１）に見ら
れる阻害の程度において顕著に異なっている。125I−エ
ピグリカニンおよびモノクローナル抗体のうちの２種、
AE−１およびAE−３を用いたラジオイムノアッセイでの
アシアログリコフォリンＡの阻害活性は、これらの抗体
の弱い結合性を示唆した。AE−４がエピグリカニンとほ
ぼ同程度に強くアシアログリコフォリンＡと結合すると
いう観察は、二つの糖タンパク質、エピグリカニンとグ
リコフォリンＡはジサッカライド鎖結合部位に共通のア
ミノ酸配列を有することを示す。AE−１およびAE−３は
AE−４が必要とするアミノ酸配列を必要とするが、さら
に別のアミノ酸も認識する可能性がある。エピグリカニ
ンのジサッカライドと同一の多数の糖鎖を有する抗冷凍
糖タンパク質に対する３種のモノクローナル抗体の弱い
結合性は、該抗体は糖鎖とともにペプチド結合も必要と
することを示唆している。
診断試験 エピグリカニンに対するモノクローナル抗体を用いた
それぞれの診断法は、悪性度試験として動物の血清中の
免疫反応性エピグリカニン様糖ペプチドの濃度を決定す
るために考案された。望ましい態様においては、該方法
はラジオイムノアッセイおよび酵素結合性イムノソーベ
ントアッセイの技術を用いる。各々の方法で、血清の様
々な希釈率の試料とアフィニティー精製したエピグリカ
ニンの既知の希釈率の試料を試験し、精製エピグリカニ
ンを試験して作成した標準曲線を参考にして血清中の免
疫反応性エピグリカニン様糖タンパク質の濃度を決定す
る。
それぞれの診断法は、悪性度試験として動物の血清中の
免疫反応性エピグリカニン様糖ペプチドの濃度を決定す
るために考案された。望ましい態様においては、該方法
はラジオイムノアッセイおよび酵素結合性イムノソーベ
ントアッセイの技術を用いる。各々の方法で、血清の様
々な希釈率の試料とアフィニティー精製したエピグリカ
ニンの既知の希釈率の試料を試験し、精製エピグリカニ
ンを試験して作成した標準曲線を参考にして血清中の免
疫反応性エピグリカニン様糖タンパク質の濃度を決定す
る。
本発明の免疫診断法の実施に適するように考案された
方法を以下に示す。
方法を以下に示す。
1.アフィニティー精製エピグリカニンの調製 エピグリカニンは生育しているTA3-Ha腹水細胞から回
収し、以下のように精製する。細胞をタンパク質分解酵
素溶液中で適宜インキュベートする。次に、細胞を例え
ば遠心などで溶液から除去し、上清を回収し、低温保存
する。インキュベーションを新しい酵素溶液で繰り返し
行い、各インキュベーションからの上清を回収し、低温
保存する。集めた上清を高速遠心で透明にし、透明な溶
液を凍結乾燥する。各々のインキュベーションで109細
胞をPBS中18mg/mlのTPCK−トリプシン溶液25mlに懸濁
し、０〜４℃で振とうするのが適当であり、細胞につき
３回のインキュベーションを行なうことが望ましい。透
明化は10,000×ｇで30分間遠心することで十分行なわれ
る。
収し、以下のように精製する。細胞をタンパク質分解酵
素溶液中で適宜インキュベートする。次に、細胞を例え
ば遠心などで溶液から除去し、上清を回収し、低温保存
する。インキュベーションを新しい酵素溶液で繰り返し
行い、各インキュベーションからの上清を回収し、低温
保存する。集めた上清を高速遠心で透明にし、透明な溶
液を凍結乾燥する。各々のインキュベーションで109細
胞をPBS中18mg/mlのTPCK−トリプシン溶液25mlに懸濁
し、０〜４℃で振とうするのが適当であり、細胞につき
３回のインキュベーションを行なうことが望ましい。透
明化は10,000×ｇで30分間遠心することで十分行なわれ
る。
回収されたエピグリカニンを含む凍結乾燥した溶液
は、次に、二つのセファデックスカラムと、アフィニテ
ィーカラムに順にかけ、分画化する。第一のカラムは例
えばセファデックスＧ−10からなり、全ての塩を除く。
第二のカラムは例えばセファデックスＧ−150からな
り、エピグリカニン（平均分子量200,000）をタンパク
質分解中に切断された細胞由来の他のタンパク質を除去
する。セファデックスカラムに適した溶出液は0.10M酢
酸ピリジン、pH5.3である。第二のカラムからの最初の
大きなピーク由来の物質を凍結乾燥し、低温で無期限に
保存しておくことができる。最後に、該凍結乾燥した物
質を小麦胚アグルチニンアフィニティーカラムで分画す
ることにより、アフィニティー精製エピグリカニンを得
る。
は、次に、二つのセファデックスカラムと、アフィニテ
ィーカラムに順にかけ、分画化する。第一のカラムは例
えばセファデックスＧ−10からなり、全ての塩を除く。
第二のカラムは例えばセファデックスＧ−150からな
り、エピグリカニン（平均分子量200,000）をタンパク
質分解中に切断された細胞由来の他のタンパク質を除去
する。セファデックスカラムに適した溶出液は0.10M酢
酸ピリジン、pH5.3である。第二のカラムからの最初の
大きなピーク由来の物質を凍結乾燥し、低温で無期限に
保存しておくことができる。最後に、該凍結乾燥した物
質を小麦胚アグルチニンアフィニティーカラムで分画す
ることにより、アフィニティー精製エピグリカニンを得
る。
2.125I−エピグリカニンの調製 実質的にコディントン（Codington）氏ら｛J.Nat′l
Cancer Inst.第63巻,153頁（1979）｝の方法で、腹腔内
にTA3-Haを有するストレインＡマウスの腹水を、コディ
ントン氏らがJ.Nat′l Cancer Inst.第73巻，第1029頁
（1984）で実質的に示しているボルトン−ハンター（Bo
lton-Hunter）試薬を新しく調製したものを用いてヨウ
素化する。ヨウ素化した生成物は、例えばセファロース
4Bのカラムなどで分画して精製する。
Cancer Inst.第63巻,153頁（1979）｝の方法で、腹腔内
にTA3-Haを有するストレインＡマウスの腹水を、コディ
ントン氏らがJ.Nat′l Cancer Inst.第73巻，第1029頁
（1984）で実質的に示しているボルトン−ハンター（Bo
lton-Hunter）試薬を新しく調製したものを用いてヨウ
素化する。ヨウ素化した生成物は、例えばセファロース
4Bのカラムなどで分画して精製する。
3.競合的RIA エピグリカニンの競合的ラジオイムノアッセイは以下
のように行なう。全ての過程で、0.10M酢酸アンモニウ
ム（pH7）を溶媒として使用する。標準曲線用のエピグ
リカニンの試料と、未知の血清試料を同時に行なう。標
準曲線は、緩衝液に異なる濃度のエピグリカニンを含む
試料群の実行によって作成する。適当な試料群として
は、例えば200ng/50mlから0.064ng/50mlの範囲の濃度で
５倍ずつ希釈したものと、緩衝液のみの試料を含むもの
などである。未知の試料は1:2,1:4,1:8などの希釈で試
験し、二重に行なうこともできる。適切なインキュベー
ション法は以下のようである。最初の反応は50mlの試料
と100mlのモノクローナル抗体（適当に希釈）で行な
い、インキュベーションは穏やかに振とうしながら37℃
で60分間行ない、４℃で60分間行なう。50mlの125I−エ
ピグリカニン（2000CPM/チューブ）を加えて混合した
後、試験管を穏やかに振とうしながら０〜４℃で15時間
インキュベートする。溶媒500ml中のアガロース結合ヤ
ギ抗マウスIgGおよびIgMを混合液に加える。混合液を４
℃で５時間穏やかに振とうしながらインキュベートした
のち、試験管を約1000×ｇで10分間遠心する。上清を除
去し、残りを200mlの溶媒で二度洗浄する。上清と固形
残余をガンマカウンターで計測する。標準曲線は、固体
残余中の放射活性のパーセントに対するエピグリカニン
濃度の常用対数をプロットすることによって得る。未知
の試料中の免疫反応性エピグリカニン量は次に、標準曲
線を参考にして決定する。
のように行なう。全ての過程で、0.10M酢酸アンモニウ
ム（pH7）を溶媒として使用する。標準曲線用のエピグ
リカニンの試料と、未知の血清試料を同時に行なう。標
準曲線は、緩衝液に異なる濃度のエピグリカニンを含む
試料群の実行によって作成する。適当な試料群として
は、例えば200ng/50mlから0.064ng/50mlの範囲の濃度で
５倍ずつ希釈したものと、緩衝液のみの試料を含むもの
などである。未知の試料は1:2,1:4,1:8などの希釈で試
験し、二重に行なうこともできる。適切なインキュベー
ション法は以下のようである。最初の反応は50mlの試料
と100mlのモノクローナル抗体（適当に希釈）で行な
い、インキュベーションは穏やかに振とうしながら37℃
で60分間行ない、４℃で60分間行なう。50mlの125I−エ
ピグリカニン（2000CPM/チューブ）を加えて混合した
後、試験管を穏やかに振とうしながら０〜４℃で15時間
インキュベートする。溶媒500ml中のアガロース結合ヤ
ギ抗マウスIgGおよびIgMを混合液に加える。混合液を４
℃で５時間穏やかに振とうしながらインキュベートした
のち、試験管を約1000×ｇで10分間遠心する。上清を除
去し、残りを200mlの溶媒で二度洗浄する。上清と固形
残余をガンマカウンターで計測する。標準曲線は、固体
残余中の放射活性のパーセントに対するエピグリカニン
濃度の常用対数をプロットすることによって得る。未知
の試料中の免疫反応性エピグリカニン量は次に、標準曲
線を参考にして決定する。
4.競合的ELISA 競合的酵素結合性イムノソーベントアッセイは以下の
ように行なう。アッセイプレートのウェルをエピグリカ
ニンでコートし、次にエピグリカニンのコートをオブア
ルブミンとともにインキュベートする。エピグリカニン
に対するモノクローナル抗体を精製エピグリカニン試料
と（標準曲線のため）、また、エピグリカニン様糖ペプ
チドに関して試験するための試料とともにインキュベー
トし、これらの混合液をウェル中でエピグリカニン−オ
ブアルブミンとともにしばらくインキュベートする。適
当な希釈の酵素が結合した抗血清をウェルに加えてしば
らくインキュベートさせる。次に、新しい基質をウェル
に加え、反応が標準溶液中で十分に行なわれるまでイン
キュベートする。続いて、反応を停止させ、相対的酵素
活性を記録する。ウェルはインキュベート段階の合間に
洗浄し、抗原を欠くもの、抗体を欠くもの、酵素が結合
した酵素を含まないもの、そして基質を欠くものを含
む、適当な対照ウェルを個々の実行のために準備する。
ように行なう。アッセイプレートのウェルをエピグリカ
ニンでコートし、次にエピグリカニンのコートをオブア
ルブミンとともにインキュベートする。エピグリカニン
に対するモノクローナル抗体を精製エピグリカニン試料
と（標準曲線のため）、また、エピグリカニン様糖ペプ
チドに関して試験するための試料とともにインキュベー
トし、これらの混合液をウェル中でエピグリカニン−オ
ブアルブミンとともにしばらくインキュベートする。適
当な希釈の酵素が結合した抗血清をウェルに加えてしば
らくインキュベートさせる。次に、新しい基質をウェル
に加え、反応が標準溶液中で十分に行なわれるまでイン
キュベートする。続いて、反応を停止させ、相対的酵素
活性を記録する。ウェルはインキュベート段階の合間に
洗浄し、抗原を欠くもの、抗体を欠くもの、酵素が結合
した酵素を含まないもの、そして基質を欠くものを含
む、適当な対照ウェルを個々の実行のために準備する。
96ウェルのフレキシブルアッセイプレート（0.3Mml/
ウェル）はELISAに適している。ウェルをエピグリカニ
ンでコートするためには、0.10M 酢酸アンモニウム
（0.05％ Tween20を含む）（“AA-TW"）10ml中200mgエ
ピグリカニンを含む溶液100mlをウェルに満たし、０〜
４℃で15〜20時間置き、その後溶液を除去し、ウェルを
AA-TWで４回洗浄する。次に、AA-TW中１％オブアルブミ
ン溶液200mlを各ウェル中で37℃、２時間インキュベー
トし、その後、オブアルブミンを除き、ウェルを２回AA
-TWで洗浄する。調製したアッセイプレートは使用時ま
で水分を保つため、パラフィルムで被う。
ウェル）はELISAに適している。ウェルをエピグリカニ
ンでコートするためには、0.10M 酢酸アンモニウム
（0.05％ Tween20を含む）（“AA-TW"）10ml中200mgエ
ピグリカニンを含む溶液100mlをウェルに満たし、０〜
４℃で15〜20時間置き、その後溶液を除去し、ウェルを
AA-TWで４回洗浄する。次に、AA-TW中１％オブアルブミ
ン溶液200mlを各ウェル中で37℃、２時間インキュベー
トし、その後、オブアルブミンを除き、ウェルを２回AA
-TWで洗浄する。調製したアッセイプレートは使用時ま
で水分を保つため、パラフィルムで被う。
各々調製したウェルは次に、エピグリカニンに対する
モノクローナル抗体を適当に希釈したもの200mlと、エ
ピグリカニン（標準曲線用）あるいは試験用試料のいず
れか100mlとの混合液を、あらかじめ37℃で２時間イン
キュベートしておいたもので100ml、37℃、２時間イン
キュベートする。標準曲線は200ngから0.064ngまでの範
囲の５倍希釈液などの一連のエピグリカニン濃度のシリ
ーズで作成する。試験する試料は、例えば、1:2,1:4,1:
8などの血清の一連の希釈率のシリーズとする。このイ
ンキュベーション後、溶液を除去し、ウェルを200mlのA
A-TWで３回洗浄する。次に、適当な希釈をしたペルオキ
シダーゼ結合抗血清200mlで、37℃、90分インキュベー
トし、その後、溶液を捨てて、ウェルを200mlのAA-TWで
４回洗浄する。
モノクローナル抗体を適当に希釈したもの200mlと、エ
ピグリカニン（標準曲線用）あるいは試験用試料のいず
れか100mlとの混合液を、あらかじめ37℃で２時間イン
キュベートしておいたもので100ml、37℃、２時間イン
キュベートする。標準曲線は200ngから0.064ngまでの範
囲の５倍希釈液などの一連のエピグリカニン濃度のシリ
ーズで作成する。試験する試料は、例えば、1:2,1:4,1:
8などの血清の一連の希釈率のシリーズとする。このイ
ンキュベーション後、溶液を除去し、ウェルを200mlのA
A-TWで３回洗浄する。次に、適当な希釈をしたペルオキ
シダーゼ結合抗血清200mlで、37℃、90分インキュベー
トし、その後、溶液を捨てて、ウェルを200mlのAA-TWで
４回洗浄する。
基質は新しく調製するべきである。ペルオキシダーゼ
結合抗血清の場合、本説明でも示すように、満足し得る
結果は、8mlのクエン酸緩衝液（0.05M,pH4.0）中のABTS
（2,2′−アジノ−ビス−（３−エチルベンズ−チアゾ
リンスルホン酸））ストック溶液（21.9mg/ml水）と32m
lのH2O2とを使用数分前に混合して40mlの溶液を調製し
たものが基質として得られる。各ウェルに100mlの基質
を加え、標準溶液に適当な色がつくまで室温で反応を行
なわせる。反応は50mlの2.5Mフッ化水素酸溶液を各ウェ
ルに加えることにより停止させる。各ウェルの酵素活性
は適当な波長で吸光度を測定することによって決定す
る。
結合抗血清の場合、本説明でも示すように、満足し得る
結果は、8mlのクエン酸緩衝液（0.05M,pH4.0）中のABTS
（2,2′−アジノ−ビス−（３−エチルベンズ−チアゾ
リンスルホン酸））ストック溶液（21.9mg/ml水）と32m
lのH2O2とを使用数分前に混合して40mlの溶液を調製し
たものが基質として得られる。各ウェルに100mlの基質
を加え、標準溶液に適当な色がつくまで室温で反応を行
なわせる。反応は50mlの2.5Mフッ化水素酸溶液を各ウェ
ルに加えることにより停止させる。各ウェルの酵素活性
は適当な波長で吸光度を測定することによって決定す
る。
（寄託） 以下の寄託はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ATCC）にブタペスト条約に基づく国際寄託に
よりなされており、以下の受託番号を得ている。
クション（ATCC）にブタペスト条約に基づく国際寄託に
よりなされており、以下の受託番号を得ている。
寄託 受託番号 HAE−１ ATCC HB 9466 HAE−３ ATCC HB 9467 HAE−４ ATCC HB 9468 出願人の譲受人、マサチューセッツ・ゼネラル・ホス
ピタル・コーポレイションは、ATCCが寄託物の永続性
と、特許が許可された場合に公衆が容易に入手すること
を可能にする保管所であることを主張する。上記のよう
に寄託された物質の公衆からの入手の容易性に関する全
ての制限は、特許の許可により、最終的に取り除かれる
であろう。特許出願係属中は、該物質は、37CFR1.14お
よび35USC122に基づき、長官が権利を与えると決定され
た者に対して入手可能であろう。少なくとも最後にあっ
た要求後５年間に寄託された微生物試料の供給のため、
また、いかなる場合にも寄託時より少なくとも30年間、
あるいは特許の有効期限の間のどちらかより長い期間
は、寄託物が生存し続け、混入のないようにするため細
心の注意を払って維持されるであろう。出願人の譲受人
は、保管所が寄託物の状態により要求されたときに試料
を供給できなくなった場合には、寄託物を交換する義務
があることを認める。
ピタル・コーポレイションは、ATCCが寄託物の永続性
と、特許が許可された場合に公衆が容易に入手すること
を可能にする保管所であることを主張する。上記のよう
に寄託された物質の公衆からの入手の容易性に関する全
ての制限は、特許の許可により、最終的に取り除かれる
であろう。特許出願係属中は、該物質は、37CFR1.14お
よび35USC122に基づき、長官が権利を与えると決定され
た者に対して入手可能であろう。少なくとも最後にあっ
た要求後５年間に寄託された微生物試料の供給のため、
また、いかなる場合にも寄託時より少なくとも30年間、
あるいは特許の有効期限の間のどちらかより長い期間
は、寄託物が生存し続け、混入のないようにするため細
心の注意を払って維持されるであろう。出願人の譲受人
は、保管所が寄託物の状態により要求されたときに試料
を供給できなくなった場合には、寄託物を交換する義務
があることを認める。
（他の態様） 他の態様は前記の特許請求の範囲に示されている。例
えば、本発明の標識したモノクローナル抗体は生体内悪
性細胞の検出および位置決定、特に、局所的腫瘍の場合
に使用することができる。該モノクローナル抗体の高結
合アフィニティーおよび特異性は表面にエピグリカニン
様糖ペプチドを有する悪性細胞に対して高い感度を与え
ることができる。
えば、本発明の標識したモノクローナル抗体は生体内悪
性細胞の検出および位置決定、特に、局所的腫瘍の場合
に使用することができる。該モノクローナル抗体の高結
合アフィニティーおよび特異性は表面にエピグリカニン
様糖ペプチドを有する悪性細胞に対して高い感度を与え
ることができる。
該モノクローナル抗体はいかなる慣習的な標識、例え
ば放射性標識やフルオロフォアなどで、標識する事がで
きる。生体内悪性細胞の検出および位置決定の像化を行
なうためには、ヒト患者などの動物は、例えば生理的食
塩水中の適切に放射性標識した抗体を静脈内注射で与え
られることが可能である。コンピュータと接続したガン
マカメラを用いれば、全身スキャンシンチグラムを撮る
ことができる。
ば放射性標識やフルオロフォアなどで、標識する事がで
きる。生体内悪性細胞の検出および位置決定の像化を行
なうためには、ヒト患者などの動物は、例えば生理的食
塩水中の適切に放射性標識した抗体を静脈内注射で与え
られることが可能である。コンピュータと接続したガン
マカメラを用いれば、全身スキャンシンチグラムを撮る
ことができる。
本発明のモノクローナル抗体はまた、常磁性イオンで
標識して標的に決まっているNMRコントラスト試薬を形
成させることができる。常磁性イオンは慣習的な方法に
よって、キレート試薬でモノクローナル抗体と複合体を
作ることができる。コントラスト試薬は、ヒト患者など
の動物に投与され、NMRによって表面にエピグリカニン
様糖ペプチドを有する悪性細胞と他の組織の間でコント
ラストをつけることができる。
標識して標的に決まっているNMRコントラスト試薬を形
成させることができる。常磁性イオンは慣習的な方法に
よって、キレート試薬でモノクローナル抗体と複合体を
作ることができる。コントラスト試薬は、ヒト患者など
の動物に投与され、NMRによって表面にエピグリカニン
様糖ペプチドを有する悪性細胞と他の組織の間でコント
ラストをつけることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ・Ｊ・ ２（1985）ｐ．303−314 Ｊ．ＮＡＴＬ．ＣＡＮＣＥＲ ＩＮＳ Ｔ．63［１］（1979）ｐ．153−161 Ｊ．ＮＡＴＬ．ＣＡＮＣＥＲ ＮＳ Ｔ．173［５］（1984）ｐ．1029−1038
Claims (9)
- 【請求項１】ハイブリドーマ細胞系により産生されるモ
ノクローナル抗体がエピグリカニン上のエピトープを認
識することを特徴とする、ATCCに寄託され、受託番号AT
CC HB9466を有する当該細胞系。 - 【請求項２】ハイブリドーマ細胞系により産生されるモ
ノクローナル抗体がエピグリカニン上のエピトープを認
識することを特徴とする、ATCCに寄託され、受託番号AT
CC HB9467を有する当該細胞系。 - 【請求項３】ハイブリドーマ細胞系により産生されるモ
ノクローナル抗体がエピグリカニン上のエピトープを認
識することを特徴とする、ATCCに寄託され、受託番号AT
CC HB9468を有する当該細胞系。 - 【請求項４】特許請求の範囲第１項記載の細胞系により
産生されるモノクロナール抗体であって、前記ハイブリ
ドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体がア
シアログリコフォリンＡに結合することを特徴とする、
前記モノクロナール抗体。 - 【請求項５】特許請求の範囲第２項記載の細胞系により
産生されるモノクロナール抗体であって、前記ハイブリ
ドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体がア
シアログリコフォリンＡに結合することを特徴とする、
前記モノクロナール抗体。 - 【請求項６】特許請求の範囲第３項記載の細胞系により
産生されるモノクロナール抗体であって、前記ハイブリ
ドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体がア
シアログリコフォリンＡに結合することを特徴とする、
前記モノクロナール抗体。 - 【請求項７】前記抗体が標識されている、特許請求の範
囲第４項、第５項または第６項記載の抗体。 - 【請求項８】前記抗体が放射性標識されている特許請求
の範囲第７項記載の抗体。 - 【請求項９】前記抗体が常磁性イオンと結合してNMRコ
ントラスト剤を形成する特許請求の範囲第７項記載の抗
体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/069,311 US4837171A (en) | 1987-07-02 | 1987-07-02 | Anti-epiglycanin monoclonal antibodies |
| US69311 | 1987-07-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6471482A JPS6471482A (en) | 1989-03-16 |
| JP2712320B2 true JP2712320B2 (ja) | 1998-02-10 |
Family
ID=22088120
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63165789A Expired - Fee Related JP2712320B2 (ja) | 1987-07-02 | 1988-07-02 | 細胞系及びそれによって産生される抗エピグリカニンモノクローナル抗体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4837171A (ja) |
| EP (1) | EP0297930A3 (ja) |
| JP (1) | JP2712320B2 (ja) |
| CA (1) | CA1286238C (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5043158A (en) * | 1987-08-21 | 1991-08-27 | Chembiomed, Ltd. | Immunogenic compositions containing ordered carriers |
| US5075218A (en) * | 1987-12-29 | 1991-12-24 | Biomira, Inc. | Screening for antibodies which bind carbohydrate epitopes of tumor-associated antigens, and uses thereof |
| EP0722735A1 (en) * | 1989-03-22 | 1996-07-24 | PANG, Peter K. T. | Parathyroid hypertensive factor |
| US5886012A (en) * | 1989-03-22 | 1999-03-23 | Peter K. T. Pang | Method of treatment for disease associated with excessive PHF using combination therapy involving exogenous calcium and calcium channel blockers |
| US5350771A (en) * | 1989-03-22 | 1994-09-27 | Peter K. T. Pang | Method and treatment for hypertension using combination therapy involving exogenous calcium and calcium channel blockers |
| ATE244888T1 (de) * | 1993-02-05 | 2003-07-15 | Epigen Inc | Humanes carcinoma-antigen (hca), hca antikörper, hca immunoassays, aufzeichnungsmethoden und therapy |
| WO1998008090A1 (en) * | 1995-06-06 | 1998-02-26 | Epigen, Inc. | Anti-idiotypic antibodies to an epiglycanin |
| US10975164B2 (en) | 2018-02-26 | 2021-04-13 | Emory University | Antibodies useful for detection of human carcinoma antigen |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4647447A (en) * | 1981-07-24 | 1987-03-03 | Schering Aktiengesellschaft | Diagnostic media |
-
1987
- 1987-07-02 US US07/069,311 patent/US4837171A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-06-30 CA CA000570924A patent/CA1286238C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-02 JP JP63165789A patent/JP2712320B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1988-07-04 EP EP88306097A patent/EP0297930A3/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ・Ｊ・２（１９８５）ｐ．３０３−３１４ |
| Ｊ．ＮＡＴＬ．ＣＡＮＣＥＲ ＩＮＳＴ．６３［１］（１９７９）ｐ．１５３−１６１ |
| Ｊ．ＮＡＴＬ．ＣＡＮＣＥＲ ＮＳＴ．１７３［５］（１９８４）ｐ．１０２９−１０３８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0297930A3 (en) | 1990-02-14 |
| US4837171A (en) | 1989-06-06 |
| CA1286238C (en) | 1991-07-16 |
| JPS6471482A (en) | 1989-03-16 |
| EP0297930A2 (en) | 1989-01-04 |
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