JPH03259093A - 癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素に特異的なモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ及びそれを用いた検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素に特異
的なモノクローナル抗体及び該抗体を産生ずるハイブリ
ドーマに関する。

［従来の技術］ ガラクトース転移酵素（ガラクトシルトランスフェラー
ゼ（以下、ＧＴと言うことがある））は、ウリジンジホ
スホガラクトース（ＵＤＰ−ガラクトース）から種々の
糖蛋白質のオリゴ糖や単糖類の非還元残基へのガラクト
ース転移を触媒する酵素であり、殆ど全ての組織に存在
している。

このＧＴの異常な活性が種々の悪性腫瘍で認められ、腫
瘍マーカーとしてのＧＴの研究が行なわれた。その結果
、ＧＴアイソザイムであるＧ　Ｔ　−ＩＴの血清中の量
が癌の存在と密接な関係にあることが発見された。この
ＧＴ−Ｈとは、　ＢｉｏｃｈｅＩＩ。

Ｂｉｏｐｂｙｓ、　　Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋ｍＩＩｏｎ、６
５　（２１，５４５−５５１，１０７５に記載されてい
る通り、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥにおいて正常人に主と
して存在するＧＴ−Ｉに比較し移動度の小さいＧＴ酵素
活性を有するバンドを定義したものである。

本発明者らはＧ　Ｔ　−ＩＴについてさらに究明した結
果、癌に特異的なＧＴが存在し、Ｇ　Ｔ　−ＴＩとして
Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥに認められるバンドはその一現
象に過ぎず、ＧＴ−１のバンド、原点にも一部この癌特
異性を有するＧＴが混在していることを発見した（特願
平１−４４７６号）。この癌に特異的なＧＴは、これま
で言及されてきたＧＴ−ＩＴとしての性質を一部包含す
ると共に下記に限定されるようなその本質となる物性を
有するものである。すなわち、該ＧＴは、癌患者腹水よ
りα−ラクトアルブミンアガロースアフィニティクロマ
トグラフィーにより精製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元条
件下電気泳動で約５万の分子量を示し、ネイティブの状
態でＭＡｂ４８８０と反応性があり、一部自己会合して
おり、還元加熱処理によりＭＡｂ４８８０との反応性が
増大すると共に自己会合がへ進してゲル濾過クロマトグ
ラフィーで分子Ｍ２０万以上の分画に検出される癌関連
ヒト由来ガラクトース転移酵素である。

［発明が解決しようとする課題１ 上述のように、癌に特異的なＧＴが分離され、腫瘍マー
カーとしても有用であることが示唆されている。従って
、本発明の目的は、上記した癌関連ヒト由来ガラクトー
ス転移酵素に特異的に反応し、癌診断薬としての用途を
有する新規なモノクローナル抗体を提供することである
。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、鋭意研究の結果、上記癌関連ヒト由来ガ
ラクトース転移酵素を特異的に認識するモノクローナル
抗体を作製することに成功し、また、該モノクローナル
抗体を用いて癌の診断が可能であることを見出し、この
発明を完成した。

すなわち、本発明は、癌患者腹水よりａ−ラクトアルブ
ミンアガロースアフィニティクロマトグラフィーにより
精製され、　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元条件下電気泳動で約
５万の分子量を示し、ネイティブの状態でＭＡｂＪ８８
（ｌと反応性があり、一部自己会合しており、還元加熱
処理によりＭＡｂ４８８０との反応性が増大すると共に
自己会合が亢進してゲル濾過クロマトグラフィーで分子
量２０万以上の分画に検出される癌関連ヒト由来ガラク
トース転移酵素に特異的なモノクローナル抗体を提供す
る。

また、本発明は本発明のモノクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマを提供する。

さらに１本発明は、上記本発明のモノクローナル抗体と
検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素とを特異
的に反応させることを含む検体中の癌関連ヒト由来ガラ
クトース転移酵素の測定方法を提供する。

〔発明の効果］ 本発明により、癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素を
特異的に認識する新規なモノクローナル抗体及びそれを
産生ずるハイブリドーマ並びにそれを用いた癌関連ヒト
由来ガラクトース転移酵素の測定方法が提供された０本
発明により、検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転移
酵素を測定することが可能になり、従って１本発明は卵
巣癌をはじめとする癌の診断に貢献する。

［発明の詳細な説明］ 本発明のモノクローナル抗体の作製方法を詳細に説明す
る。

本発明のモノクローナル抗体の作製に用いる免疫原は、
癌患者の腹水、例えば卵巣癌患者の腹水からＣａｎｃｅ
ｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４８巻、５３２５頁、１９８８
年に記載の方法に従い、α−ラクトアルブミンアフィニ
ティークロマトグラフィーにより正常人のＧＴと同様に
して精製することができる。もっとも、卵巣癌患者に限
らず、子宮癌、大腸癌、肺癌、肺癌、食堂癌、肝臓症等
の癌患者にも存在し、また２腹水に限らず血清その他の
体液中にも存在する。

免疫原は、哨乳動物に免疫するが、免疫は一般的方法に
より行なうことがきる。すなわち、上記した免疫原をフ
ロイントコンプリートアジュバント等のアジュバントと
共に腹腔内又は静脈内に投与することかてきる。

次に、免疫動物から採取した牌細胞はマウス骨髄種細胞
と融合させる。骨髄種細胞としては既に公知の種々の細
胞、例えばＸ６３−Ａｇ　８．５５３等を用いることか
てきる。また、融合促進剤としてポリエチレンクリコー
ル（ＰＥＧ）等を用いることかできる。牌細胞と骨髄種
細胞との混合比はｌ対１〜１０対１程度か好ましい。

細胞融合した後、通常の選択用培地て培養することによ
りバイプリトーマを選択することかてきる。前記した骨
髄種細胞はＨＡＴ＠地中ては成育てきないためＨＡＴ培
地中で成育する細胞を選択すればよい。

ハイフリトーマのコロニーか充分に大きくなったところ
て目的とする抗体を産生ずる株の検索及びクローニング
を行なう０本発明においては、一般に抗体の検索に用い
られる方法、例えばＥＬＩＳＡ法等により行なうことか
てきる。免疫原に反応し、かつ血清タンパクと交差性の
ないものをさらに限外希釈法によりクローニングを行な
うことによりモノクローン化されたハイプリドーマを得
ることができる。

本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培地
中で培養し、培養上清から分離する方法又はバイプリド
ーマをマウス腹腔内に投与し、その腹水より回収する方
法により得ることができる。さらに、一般的な方法、硫
酸沈殿、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等を
用いて精製することもできる。

下記実施例において詳述するように、上記方法により、
　ＭＡｂ７９０７、ＭＡｂ１１５１３及びＭＡｂ８６７
７　　という３つの本発明のモノクローナル抗体が得ら
れた。これらのモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマは黴工研に寄託されており、その受託番号は下記
実施例】に記載されている。

本発明のモノクローナル抗体を用いて検体中の癌関連ヒ
ト由来ガラクトース転移酵素を測定することは、抗体と
抗原との間の特異的な抗原抗体反応を利用した従来のイ
ムノアッセイに基づいて行なうことができる０例えば、
常法であるサンドイッチアッセイにより行なうことがで
きる。サンドイッチアッセイの場合には、本発明のモノ
クローナル抗体を適当な固相担体１例えばマイクロプレ
ートやプラスチックビーズ等に固定し、検体と接触させ
た後、例えば＋２１１１等のラジオアイソトープ、ペル
オキシダーゼ等の酵素で標識した、抗原決定基の異なる
第２抗体を作用させ、洗浄後、標識を測定することによ
って行なうことができる。この場合、第２抗体としては
、モノクローナル抗体ＭＡｂ４８８０並びに後述の実施
例において詳述するモノクローナル抗体ＭＡｂ８５０７
及びＭＡｂ８６２８を好ましく用いることができる。

本発明のモノクローナル抗体を癌診断に応用する場合、
通常検体としては体液が用いられ、特に血清が好ましく
用いられる。

本発明のモノクローナル抗体は、癌関連ガラクトース転
移酵素が自己会合した状態の高分子分画に選択的特異性
が高いことが分かっているが、血清中ではほとんどの癌
関連ガラクトース転移酵素は自己会合していない低分子
状態で存在している。しかしなから１本発明のモノクロ
ーナル抗体な固相に固定化して用いる場合、比較的高い
温度、好ましくは３７℃以上、５６°Ｃ以下で反応させ
ることにより、抗原との反応性を高めることかてきる。

これは熱により癌関連ガラクトース転移酵素の立体構造
的な変化か生し、抗体との反応性か増すものと考えられ
る。

［実施例］ 以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するか、
本発明はこれらの実施例に限定されるものてはない。

実施例１ 免疫原の調製 卵巣癌患者腹水１１をＣａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
　４８巻、５３２５頁、１９８８年に記載の方法に従い
、α−ラクトアルフミンアフィニティクロマトグラフィ
ーにより精製し、ガラクトース転移酵素２．５　ｍｇを
得た。すなわち、腹水は精製水て４°Ｃ−晩透析後、不
溶物を遠心して取り除きトリスバッファー（ｐＨ７，２
）、マンガンクロライド（ＭｎＣＩ２）　、　Ｎ−アセ
チルクルコサミンをそれぞれ２０ｍＭ、１０℃Ｍ、５−
　になるように加えα−ラクトアルブミンアフイニテイ
カラム（２，５ｃｍｘ　ＳＯｃ■）に流した。上記バッ
ファー１１てカラムを洗浄した後、Ｎ−アセチルグルコ
サミンを含まないバッファーて溶出を行なしＸ６１画分
を得た。得られたＧＴ画分はざらにα−ラクトアルブミ
ンアフイニテイカラムて同様に操作を行ないさらに精製
した。

上記のようにして得られた癌関連ガラクトース転移酵素
０．５■ｇを、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）１．０１に溶解
したものを免疫原として用いた。

笈東ｌ工員皇皇ｊ Ｂａｌｂ／ｃマウス（雌、６週令）に上記て調製した免
疫原０．５　　菖旦にフロイントコンプリードアシュハ
ント０．５　　閣文を加え充分に混和したもの０．２■
１を腹腔内に注射した。以後、同様に３週間後フロイン
トインコンプリードアシュハントを用しＸる以外は同様
に０．２１を腹腔内に注射し、さらに２週間後に免疫原
１１００ｕのみを尾に静脈注射した。

最終免疫３日後、マウスの牌細胞を摘出しＲＰＭＩＩ　
６４０培地にて洗浄した。牌臓細胞４ｘ１０♂個の浮遊
液とマウスミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ３．６５３）
８　ｘ　１０’の浮遊液を混合し、遠心分離にて培地を
除去した。３７℃に加温した水浴中て混合した細胞にポ
リエチレングリコール−ＲＰＭＩ１６４０培地１１を徐
々に加えて穏やかに攪拌させ融合を行なった。遠心分離
により培地を除去し、細胞に１５％牛脂児血清含有ＲＰ
ＩＩＩ１１５４０培地４０１を加えた後、９６穴プレー
トに１穴当たり０．１５ｍ１ずつ分配した。翌日、ＨＡ
Ｔ培地（４に１０−’Ｍアミノプテリン、　１．６　ｘ
　１０−’Ｍチミジン、１　ｘ　１０−’Ｍヒボキサン
チン、　ＩＯ！牛脂児血清を含むＲＰＭ１１５４０培地
）０．１５　ｍｌを各ウェルに加えた。各ウェルの培地
は、更に３日又は４日ごとにＨＡＴＭ地に半量ずつ交換
した。培養２週間後、約８０％のウェルにハイプリトー
マの生育か認められた。

バイプリトーマの選択 バイプリトーマ培養上清中の抗体の検索は。

抗原として上記免疫原の調製で得た癌関連ガラクトース
転移酵素を用いてＥＬＩＳＡ法にて行なった。

抗原をＰＢＳ中２ｇｇ／ｍｌの濃度てＥＬＩＳＡ用マイ
クロタイタープレートに吸着させ、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ
溶液にてブロッキングした後、培養上清を反応させた。

更に、バーオキシターゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリ
ン抗体を反応させ、基質としてオルトフェニレンシアミ
ンを用いて４９２　ｎｍにおける吸光度を測定すること
により目的の抗体を検出した。その結果、都合１４回の
細胞融合にて作製したバイプリトーマ中、癌関連ガラク
トース転移酵素と反応し、血清タンパク質と反応しない
ハイブリトーマ８つか得られた。

得られたバイプリトーマはＨＡＴ培地からアミノプテリ
ンを除いたＨＴ培地に移し、更にｌＯ％牛脂児血清（Ｆ
ＣＳ）含有ＲＰＭ１１６４０培地に移し培養した。

次に、得られたハイフリトーマを限定希釈法によりクロ
ーニングした。すなわち、９６穴プレートに１穴当り０
．５〜４個の密度に細胞を希釈してｌ大当り１０６個の
マウス胸腺細胞と共に培養し、２週間後に　ＥＬＩＳＡ
法にて抗体産生細胞を選択した。クローニングを更に繰
り返し、安定なバイプリトーマ（ＭＡｂ７９０７、ＭＡ
ｂ８Ｓ１３、ＭＡｂ８６７７、ＭＡｂ８６２８ＭＡｂ８
５０７、ＭＡｂ８６１１、ＭＡｂ８９１３、ＭＡｂ８９
１．９）か得られた。

モノクローナル抗体ＭＡｂ７９０７、ＭＡｂ８５］：］
はＥＬＩＳＡ法によりクラスはＩｇＭと決定されＭＡｂ
８６２８、−＾ｂ８６７７、ＭＡｂ８５０７、ＭＡｂ８
６１１、ＭＡｂ８９］９はＩｇＧ、と決定され、　ＭＡ
ｂ８９１：ＩはＩｇＧ２ｂと決定された。このうちハイ
ツリトーマＭＡｂ７９０７、ＭＡｂ８Ｓ１３、ＭＡｂ８
６２１１、ＭＡｂ８６７７は工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託され、その受託番号はそれぞれ微工研菌寄
１１２２０号、同１．１２１９号、同１１２２１号、同
１１２２２号である。

実施例１て精製された免疫原をｌＪｉｇ／ｍｌの濃度に
ＰＢＳて調整したものをマイクロタイターフレート（タ
ンク社製）に固定した。ＰＢＳて洗浄後、１％ＢＳＡて
ブロッキングした０次に、過ヨウ素酸法によりホースラ
デイツシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）て標識した誠＾
ｂ４８８０、ＭＡｂ７９０７（以下、ＩＩＡｂ４８８０
−ＨＲＰ、　ＭＡｂ７９０７−ＨＲＰのように記載する
。また、これらを総称してラベル体という）を１％ＢＳ
Ａて２０００倍に希釈したもの１００ｕＬ１をプレート
に加え３７°Ｃ，１時間反応させた。反応後、ＰＢＳて
洗浄し、基質として０−フェニレンシアミンを加えて発
色させ波長４９２ｎ＋ｓにおける吸光度を測定した。ま
た、ＭＡｂ４８８０−ＨＲＰ、　ＭＡｂ７９０７−ＨＲ
Ｐそれぞれに表１に示すモノクローナル抗体を濃度１０
ｐｇ／■ｌになるように加えて、同様の操作を行ない、
その影響を測定した。その結果を表１に示す。

表　　１ 表１より、上記の抗体は以下のように３つに分類するこ
とかてきる。

グループ１．　：　ＭＡｂ４Ｂ８０、ＭＡｂ８５０７、
ＭＡｂ８６２８グループ２　：　ＭＡｂ７９０７、ＭＡ
ｂ８５１３、ＭＡｂ８６７７クループ３　：　ＭＡｂ８
６１１、ＭＡｂ８９１３、ＭＡｂ８９１９また、サンド
イッチアッセイの抗体の組み合わせについて同一グルー
プの組み合わせは避けるへきであることか予想される。

さらに、下記実施例３に記載されているように、本発明
のモノクローナル抗体は上記グループ２のモノクローナ
ル抗体であるか、サンドイッチアッセイを行なう場合に
は、クループ２の本発明のモノクローナル抗体を固相に
固定し、第２抗体としてクループ１のモノクローナル抗
体を用いることか好ましい。

１亙璽３ 実施例１て得られた免疫原をビオチン化後、Ｓｕｌ＞−
１２ＦＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィー（ファルマシ
ア社製）にて分画した（溶媒：　ＰＢＳ、流量：　０．
５　ｍｌ／５ｉｎ）　、分子量約５０万から約２００の
両分をＰ−１、分子量約５万から約３０万の両分をＰ−
２とした。マイクロタイタープレートに表２に示す各種
抗体を濃度１０μｇ／■Ｉて固定化した。１％ＢＳＡて
ブロッキングした後、Ｐ−１又はＰ−２を１％ＢＳＡで
所定の濃度に希釈したもの１００ｇＪＬを加え３７℃１
時間反応させた。反応後、ＰＢＳて洗浄し、ストレプト
アビジン−ＨＲＰを１％ＢＳＡて２０００倍に希釈した
もの１００ｋｌを加え室温て３０分間反応させた。反応
後、ＰＢＳて洗浄し、０−フェニレンシアミンを加えて
発色させ波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。結
果を表２に示す。

表 ２ 表２より、クループ２のモノクローナル抗体は癌関連ガ
ラクトース転移酵素を含む高分子画分であるＰ−１に反
応し、正常人に存在するガラクトース転移酵素を含むＰ
−２に殆ど反応しないことか分かる。一方、クループｌ
の抗体ＭＡｂ４８８０、繭Ａｂ８５０７、ＭＡｂ８６２
８及びクループ３のＭＡｂ８９１３はＰ−１に反応性を
有するか、正常人に存在するガラクトース転移酵素を含
むＰ−２に対しても反応性を有し、クループ３のＭＡｂ
８６１１、ＭＡｂ８９１９はＰ−２に対し反応性を有し
ていることか分かる。すなわち、癌関連ガラクトース転
移酵素に特異的に反応する本発明のモノクローナル抗体
として１１１Ａｂ７９０７、滅Ａｂ８Ｓ１］、鋪Ａｂ８
６７７か得られた。

実施例４ 本発明の抗体ＭＡｂ８５１３を濃度１０μ文／■１て１
／４インチプラスチックビーズに４℃て一晩固定した。

ＰＢＳて洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳて３７℃、−昼夜
ブロッキングした０反応トレイに卵巣癌患者２７人、良
性卵巣腫瘍患者５３人及び正常人３７人の血清検体５０
μ文、Ｉ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１を含む１００層Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６，０）１５０ル文及び上記ビーズを加え４
５℃て２時間反応させた０反応後、ＰＢＳて３回洗浄し
、ＭＡｂ８６２８−ＨＲＰを１％ＢＳＡ、ＩＭＮａＣ１
を含む２０ｍＭリン＃緩衝液（ｐＨ７，３）て２０００
倍に希釈したもの２００μ又を加え３７°Ｃ１時間反応
させた。反応終了後ＰＢＳて４回洗浄し、３ｕＬｇ／ｍ
ｌの０−フェニレンシアミン３００ｇＭを加えた試験管
にビーズを移し発色反応を室温て３０分間行なった。反
応後、ＩＮ硫酸１１を加え波長４９２ｎｍて吸光度を測
定した。予め設定したキャリブレータに対する相対濃度
て表示した。結果を図に示す。

図より１本発明のモノクローナル抗体 ＭＡｂ８５１３により卵巣癌の検出かてきることか確認
された。

【図面の簡単な説明】

図は、本発明のモノクローナル抗体を用いて卵巣癌患者
、良性卵巣腫瘍患者及び正常人の血清中の癌関連ヒト由
来ガラクトース転移酵素を測定した結果を示す。 卵 、ｌε巣 者癌 図 程良 瘍性 思卵 者巣

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）癌患者腹水よりα−ラクトアルブミンアガロース
   アフィニティクロマトグラフィーにより精製され、ＳＤ
   Ｓ−ＰＡＧＥ還元条件下電気泳動で約５万の分子量を示
   し、ネイティブの状態でＭＡｂ４８８０と反応性があり
   、一部自己会合しており、還元加熱処理によりＭＡｂ４
   ８８０との反応性が増大すると共に自己会合が亢進して
   ゲル濾過クロマトグラフィーで分子量２０万以上の分画
   に検出される癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素に特
   異的なモノクローナル抗体。
2. （２）請求項１記載のモノクローナル抗体を産生するハ
   イブリドーマ。
3. （３）請求項１のモノクローナル抗体と検体中の癌関連
   ヒト由来ガラクトース転移酵素とを特異的に反応させる
   ことを含む検体中の癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵
   素の測定方法。