JPH04248991A - ヒトガラクト−ス転移酵素に特異的なモノクローナル抗体及び該抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトガラクトース転移
酵素に特異的なモノクローナル抗体及び該抗体を産生す
るハイブリドーマに関する。

【０００２】

【従来の技術】ガラクトース転移酵素（ガラクトシルト
ランスフェラーゼ（以下、ＧＴと言うことがある））は
、ウリジンジホスホガラクトース（ＵＤＰ−ガラクトー
ス）から種々の糖蛋白質のオリゴ糖や単糖類の非還元残
基へのガラクトース転移を触媒する酵素であり、殆ど全
ての組織に存在している。最近、癌患者の体内のＧＴ量
が健常人のＧＴ量よりも有意に高いことが見出された。 従って、ＧＴの総量を測定することにより、癌診断の一
助とすることができる。しかしながら、ＧＴは酵素活性
が失活しやすく、酵素活性に基づいてＧＴ量を測定する
ことは困難である。また、従来ＧＴに対する抗体はポリ
クローナル抗体しか得られておらず、これを用いたＧＴ
の定量は定量性が悪いという問題点を有する。もし、抗
ヒトＧＴモノクローナルが存在すれば、これを用いて定
量性良くヒトＧＴ量を測定することができると考えられ
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、上記したヒトガラクトース転移酵素に特異的に反応
する新規なモノクローナル抗体を提供することである。

【０００４】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研
究の結果、上記ヒトガラクトース転移酵素を特異的に認
識する新規なモノクローナル抗体を作製することに成功
し、この発明を完成した。すなわち、本発明は、ヒトガ
ラクトース転移酵素に特異的なモノクローナル抗体を提
供する。また、本発明は本発明のモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマを提供する。

【０００７】

【発明の効果】本発明により、ヒトガラクトース転移酵
素を特異的に認識する新規なモノクローナル抗体及びそ
れを産生するハイブリドーマが提供された。本発明によ
り検体中のヒトガラクトース転移酵素を測定することが
可能になり、本発明のモノクローナル抗体は癌の診断に
貢献するものである。

【０００８】

【発明の具体的説明】本発明のモノクローナル抗体の作
製方法を詳細に説明する。本発明のモノクローナル抗体
の作製に用いる免疫原は、例えばヒトの腹水、血清、そ
の他の体液からＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　４８
巻、　５３２５頁、　１９８８年に記載の方法に従い、
α−ラクトアルブミンアフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製することができる。

【０００９】免疫原は、哺乳動物に免疫するが、免疫は
一般的方法により行なうことができる。すなわち、上記
した免疫原をフロイントコンプリートアジュバント等の
アジュバントと共に腹腔内又は静脈内に投与することが
できる。次に、免疫動物から採取した脾細胞はマウス骨
髄種細胞と融合させる。骨髄種細胞としては既に公知の
種々の細胞、例えばＸ６３−Ａｇ　８．６５３等を用い
ることができる。また、融合促進剤としてポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）等を用いることができる。脾細胞
と骨髄種細胞との混合比は１対１〜１０対１程度が好ま
しい。細胞融合した後、通常の選択用培地で培養するこ
とによりハイブリドーマを選択することができる。前記
した骨髄種細胞はＨＡＴ培地中では成育できないためＨ
ＡＴ培地中で成育する細胞を選択すればよい。ハイブリ
ドーマのコロニーが充分に大きくなったところで目的と
する抗体を産生する株の検索及びクローニングを行なう
。本発明においては、一般に抗体の検索に用いられる方
法、例えばＥＬＩＳＡ法等により行なうことができる。 免疫原に反応し、かつ血清タンパクと交差性のないもの
をさらに限界希釈法によりクローニングを行なうことに
よりモノクローン化されたハイブリドーマを得ることが
できる。

【００１０】本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリ
ドーマを培地中で培養し、培養上清から分離する方法又
はハイブリドーマをマウス腹腔内に投与し、その腹水よ
り回収する方法により得ることができる。さらに、一般
的な方法、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過、イオン交
換クロマトグラフィー等を用いて精製することもできる
。下記実施例において詳述するように、上記方法により
、ＭＡｂ１１６８　及びＭＡｂ９１９８　という２つの
本発明のモノクローナル抗体が得られた。

【００１１】本発明のモノクローナル抗体を用いて検体
中のヒトガラクトース転移酵素を測定することは、抗原
と抗体との間の特異的な抗原抗体反応を利用した従来の
イムノアッセイに基づいて行なうことができる。例えば
、常法であるサンドイッチアッセイにより行なうことが
できる。また、本発明のモノクローナル抗体を癌診断に
応用する場合、検体としては血清、腹水、乳汁等の体液
が用いられる。

【００１２】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。 実施例１ 免疫原の調製 卵巣癌患者腹水１リットルをＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ　４８巻、５３２５頁、　１９８８年に記載の方
法に従い、α−ラクトアルブミンアフィニティクロマト
グラフィーにより精製し、ガラクトース転移酵素２．５
　ｍｌを得た。すなわち、腹水は精製水で４℃一晩透析
後、不溶物を遠心して取り除きトリスバッファー（ｐＨ
　７．２）、マンガンクロライド（ＭｎＣｌ２）　、Ｎ
−アセチルグルコサミンをそれぞれ２０ｍＭ、　１０ｍ
Ｍ、　５ｍＭ　になるように加えα−ラクトアルブミン
アフィニティカラム（２．５ｃｍ×５０ｃｍ）　に流し
た。上記バッファー１リットルでカラムを洗浄した後、
Ｎ−アセチルグルコサミンを含まないバッファーで溶出
を行ないＧＴ画分を得た。得られたＧＴ画分はさらにα
−ラクトアルブミンアフィニティカラムで同様に操作を
行ないさらに精製した。上記のようにして得られた癌関
連ガラクトース転移酵素０．５ｍｌ　を、リン酸緩衝液
（ＰＢＳ）１．０ｍｌ　に溶解したものを免疫原として
用いた。

【００１３】免疫及び細胞融合 ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６週令）に上記で調製した免
疫原０．５　μｌにフロイントコンプリートアジュバン
ト０．５　ｍｌを加え充分に混和したもの０．２　ｍｌ
を腹腔内に注射した。以後、同様に３週間後フロイント
インコンプリートアジュバントを用いる以外は同様に０
．２　ｍｌを腹腔内に注射し、さらに２週間後に免疫原
１００μｇ　のみを尾に静脈注射した。最終免疫３日後
、マウスの脾細胞を摘出し、ＲＰＭＩ　１６４０　培地
にて洗浄した。脾臓細胞４×１０８　個の浮遊液とマウ
スミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）８×１０
７　の浮遊液を混合し、遠心分離にて培地を除去した。 ３７℃に加温した水浴中で混合した細胞にポリエチレン
グリコール−ＲＰＭＩ　１６４０　培地１ｍｌを徐々に
加えて穏やかに攪拌させ融合を行なった。遠心分離によ
り培地を除去し、細胞に１５％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ
　１６４０　培地４０ｍｌを加えた後、９６穴プレート
に１穴当たり０．１５ｍｌずつ分配した。 翌日、ＨＡＴ培地（　４　ｘ　１０−７Ｍアミノプテリ
ン、１．６　ｘ　１０−５Ｍチミジン、　１　ｘ　１０
−４Ｍヒポキサンチン、　１０％牛胎児血清を含む　Ｒ
ＰＭＩ　１６４０培地）０．１５ｍｌ　を各ウエルに加
えた。各ウエルの培地は、更に３日又は４日ごとにＨＡ
Ｔ培地に半量ずつ交換した。培養２週間後、約８０％の
ウエルにハイブリドーマの生育が認められた。

【００１４】ハイブリドーマの選択 ハイブリドーマ培養上清中の抗体の検索は、抗原として
上記免疫原の調製で得たガラクトース転移酵素を用いて
ＥＬＩＳＡ　法にて行なった。抗原をＰＢＳ中２μｇ　
／ｍｌの濃度で　ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレー
トに吸着させ、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ　溶液にてブロッキ
ングした後、培養上清を反応させた。更に、パーオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体を反応させ
、基質としてオルトフェニレンジアミンを用いて　４９
２　ｎｍ　における吸光度を測定することにより目的の
抗体を検出した。その結果、都合１４回の細胞融合にて
作製したハイブリドーマ中、ガラクトース転移酵素と反
応し、血清タンパク質と反応しないハイブリドーマ２つ
が得られた。得られたハイブリドーマはＨＡＴ培地から
アミノプテリンを除いたＨＴ培地に移し、更に１０％牛
胎児血清（ＦＣＳ）含有　ＲＰＭＩ　１６４０培地に移
し培養した。次に、得られたハイブリドーマを限界定希
釈法によりクローニングした。すなわち、９６穴プレー
トに１穴当り０．５　〜４個の密度に細胞を希釈して１
穴当り１０６　個のマウス胸腺細胞と共に培養し、２週
間後にＥＬＩＳＡ法にて抗体産生細胞を選択した。クロ
ーニングを更に繰り返し、抗ヒトモノクローナル抗体を
産生する安定なハイブリドーマ１１６８及び９１９８が
得られた。ハイブリドーマ１１６８及び９１９８が産生
するモノクローナル抗体をそれぞれＭＡｂ１１６８　、
ＭＡｂ９１９８　と命名した。モノクローナル抗体ＭＡ
ｂ１１６８、　ＭＡｂ９１９８は、ＥＬＩＳＡ　法によ
りクラスはＩｇＧ１　と決定された。なお、ハイブリド
ーマ１１６８及び９１９８は微工研に寄託されており、
その受託番号はそれぞれ１１８６６及び１１８６７であ
る。

【００１５】実施例２ ヒトの乳汁１００ｍｌを３０００ｒｐｍ　で２０分間遠
心分離して得た脱脂乳に０．２　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝
液を等量加えてｐＨ４．６　として３０分間静置した後
、２０、０００　ｒｐｍで３０分間超遠心を行ない上清
のみを分離して乳清を得た。得られた乳清は蒸留水によ
り４℃で一晩透析した後、不溶物を遠心分離により除去
し、トリスバッファー（ｐＨ７．２）　、塩化マンガン
（ＭｎＣｌ２）　、Ｎ−アセチルグルコサミンをそれぞ
れ２０ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭになるように加え、α−
ラクトアルブミンアフィニティカラム（　１ｃｍ×５ｃ
ｍ）　に流した。上記バッファー１００ｍｌでカラムを
洗浄した後、Ｎ−アセチルグルコサミンを含まないバッ
ファーで溶出を行ないＧＴ画分を得た。得られたＧＴ画
分は再度α−ラクトアルブミンアフィニティカラムで同
様に操作を行ない精製した。上記のようにして得られた
人乳由来ガラクトース転移酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元
条件下で電気泳動を行なった。また、同様にＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ後、ポリビニリデン・ジフルオライド膜（ＰＶＤ
Ｆ膜）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製）に転写
させＭＡｂ１１６８　、抗マウスＩｇ−ＨＲＰ標識抗体
を順次反応させることにより免疫染色した。その結果、
分子量約５万の単一バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に得る
と同時にＰＶＤＦ膜上で対応するバンドが染色されたこ
とから本発明のモノクローナル抗体ＭＡｂ１１６８　が
人乳汁中のガラクトース転移酵素と反応していることを
確認した。

【００１６】実施例３ ２５μｌのＭＡｂ９１９８　が結合したＧＴ−２０００
（ピアス化学社製（Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｍＣｏ．））
ゲル懸濁液（ゲル容積は５ｍｌ）と実施例２で得た人乳
汁中のＧＴ試料を合わせて１２×７５ｍｍのホウケイ酸
塩試験管に入れ４℃で一晩振盪培養した。２ｍｌの冷Ｃ
ＫＴ緩衝液（２０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１５０ｍ
Ｍ塩化カリウム、０．０１％　トリトンＸ−１００）を
加え、５分間放置した後、上澄み液を吸引した。この操
作を２度繰り返した後、７０μｌのＧＴ基質液（７μｌ
の０．５ｍＭ　［３Ｈ］ＵＤＰ−ｇａｌ　液、全投入量
１５０，０００ｄｐｍ（ニューイングランドヌクレアー
（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）製）、
３μｌの０．２　Ｍ二酸化マンガン液、６０μｌのＣＫ
Ｔ緩衝液、２ｍｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）の混合液
を加え３７℃で２時間振盪培養した。５０μｌの反応混
合液を１インチのホワットマン３ＭＭ紙にスポットし、
直ちに多量の１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で１０分
間洗浄した。ＴＣＡに接触させる操作を３回繰り返し、
さらにこの試験紙を９５％エタノール、次いでジエチル
エーテルでそれぞれ１０分間洗浄した。自然乾燥した後
、この分析試験紙をシンチレーション用小瓶に入れシン
チレーションカクテルを加え、濾紙上に沈殿した放射性
蛋白質を液体シンチレーション計数法で測定した。対照
用として、実施例１で精製された癌患者腹水由来のＧＴ
、正常人の血清より同様の方法で得たＧＴ及び人乳汁よ
り単離したＧＴを１００℃で５分間加熱処理したものを
用いた。その結果を表１に示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ヒトガラクトース転移酵素に特異的な
   モノクローナル抗体。
2. 【請求項２】　　モノクローナル抗体ＭＡｂ１１６８　
   又はＭＡｂ９１９８である請求項１記載のモノクローナ
   ル抗体。
3. 【請求項３】　　請求項１記載のモノクローナル抗体を
   産生するハイブリドーマ。
4. 【請求項４】　　ハイブリドーマ１１６８又は９１９８
   である請求項３記載のハイブリドーマ。