JPS62174100A - Ｇｔ―２に特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 この発明は、免疫、がん診断及びモニターの分野に関す
るものである。特に、腫瘍マーカーであるガラクトシル
トランスフェラーゼ・アイソエンザイムＩＩ（ＧＴ−１
１）に特異的なモノクローナル抗体及びＣＴ−１１の免
疫測定に関係している。

Ｌ」炎」 ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）は、ウリジン
ジホスホがラクトース　（ＵＤＰガラクトース）から、
種々の糖たん白質の寡糖類や単糖類の非還元残基への、
〃ラクトース転移を触媒する酵素である。種々の悪性腫
瘍で異常なＧＴ活性が観察されたため、初期の研究者は
悪性腫瘍の血清マーカーとしてＧＴ研究を開始した。全
血清ＧＴは、あまり悪性腫瘍の指標としては役に立たな
いことがわかった。しかし、ＧＴのイソ酵素であるＧＴ
−ＩＩの血清中の量が、がんの存在と密接な関連がある
ことが発見された。ＣＴ−ＩＩの全血清ＣＴ量に占める
割合は小さい。〃ラクトシルトランスフェラーゼＪ　　
（ＧＴ−■）と呼ばれる、電気泳動の異なる種＠（速く
移動する）が、血清中のＧＴの大部分を占めている。

ＧＴに対するネズミモノクローナル抗体に関し、前に報
告がある。Ｄ、に、ボトルスキー　（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ
）とに、Ｊ、イセルバッチ−１−−（Ｉｓｓｅｌｂａｃ
ｈｅｒ）は、７種類のネズミ抗ＣＴモノクローナル抗体
分析を報告し、そのうちの一種類は“比較的にＧＴ−］
１に対して特異性を示していた（ＰＮＡＳ誌（ＵＳＡ）
　（１９８４年）第８１号２５２９−２５３３頁）。デ
ータによるとこの抗体は、ＧＴ−ｉと免疫グロブリンＧ
に対する有意の交叉反応性を有していた。親和性は、中
位から低い値であった。このような交叉反応性及び低い
親和力のため、がん診断の検査試薬としての有用性は限
られてしまう。Ｓ、に、チャタジー　（Ｃｈａｓｔｅｒ
ｊｅｅ）等は、高親和力を持つ５種のネズミ抗ＧＴモノ
クローナル抗体を報告している　（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ
ｓ。

誌　（１９８４年）第４４号、５７２５−５７３２頁）
。しかし、この抗体のアイソエンザイム特異性や、がん
診断薬としての実用的な有用性に関しては触れられてい
ない。

ここで述べる発明は、ＧＴ−Ｉや免疫グロブリンＧと交
叉反応せず、高親和力を示すネズミ抗ＧＴ−■モノクロ
ーナル抗体を提供している。この抗体は、ＧＴが存在す
る血清や他の体液中のＧＴ−ＩＩ量を決める卓越した免
疫測定試薬である。

３Ｂ＃　ｐ、ｆ１即− この発明は、ＧＴ−ＩＩに特異的なモノクローナル抗体
、この抗体を産生するハイブリドーマ、体液中のＧＴ−
ＩＩ量を決定するための免疫測定法及び試薬を提供する
。

従ってこの発明の態様の−っは、〃２クトシルトランス
７エラーゼ■とは交叉反応せずガラクトシルトランスフ
ェラーゼＨに対するモノクローナル抗体である。

この発明の別の態様は、このような抗体を産生するハイ
プリドーマ株である。

この発明の別の態様は、〃ラクトシルトランスフェラー
ゼＨの免疫測定に用いる、特許請求の範囲（クレーム）
の１番目に記した、固体保持体に結合したモノクローナ
ル抗体からなる製品である。

この発明の別の態様は、ヒトがん検査法で、次の項目か
ら成っている。

（、）患者の体液の試料を、前述の製品と培養する； （ｂ）前述の保持体から結合しなかった体液を取り去る （ｃ）保持体に結合した物質によって示されるガラクト
シルトランスフェラーゼ活性を測定する。

明を　　する この文書で使われている“モノクローナル抗体”とは、
十分に均一な抗体を含んでいる免疫グロブリン構成物で
、抗体それぞれが同一の抗原決定基に結合する。別に規
定されていない限り、どんな特定の哺乳動物からの抗体
や、アイソタイプや、どんな既定の様式で調整された抗
体にも限定されない。この用語は、抗原結合部分と全抗
体分子を含むものである　（即ち、Ｆａｂ、　Ｆ（ａｂ
’）２．　Ｆｖ）。

ここで使われている　「ハイブリドーマ株」とは、個々
の細胞、産生された細胞、関連の細胞株の細胞から白米
する細胞を含む培養液のことである。

ハイブリッド細胞株に関してここで使われている　「子
孫」とは、世代や核型の同一性に関わらず、この細胞株
からの全ての派生物、排出物、子孫のことを言う。

ここで使われている［ＧＴ−［に対して特異的な」と　
「ＧＴ−ＩＩ特異性の」とは、ＧＴ−Ｉ［と免疫反応を
する　（結合する）が、ＧＴ−Ｉ［のオリゴマー　（重
合体）と反応する可能性を除いては、ＧＴ　−（あるい
は血清の他の成分とは交叉反応しないモノクローナル抗
体のことである。このような抗体は、ＧＴ−■あるいは
ＧＴ−ＩＩオリゴマーに存在するがＧＴ−（や他の血清
成分には存在しない抗原決定基に結合する。３８７２と
呼ばれたＧＴ−Ｉ［特異モノクローナル抗体と、同じ機
能をする物質　（即ち、３８７２と同じ抗原決定基に結
合するモノクローナル抗体）は、統合して扱われる。

ここで使われる「体液」とは、ＧＴが見い出される体液
のことである。制限を設けることな（、血液、血漿や血
清のような血液成分、腹水、組織培養上澄み液、を髄液
を含む。血清が優先される。

この「体液」はＧＴ−ｎ量を測定するに先立ち前処理さ
れることも可能である。例えば酸、アルカリ、酵素によ
る消化、吸収材、沈澱操作による分解手段等が挙げられ
る。これらは、ＧＴ−１［量を測定するための方法によ
り最も適した前処理で行なわれる。

にＴ−］１特異性モノクローナル抗体を分泌するハイプ
リドーマ細胞株の調整に使用する一般手順は以下の如く
である。ＧＴ−ＩＩを含むヒ）ＧＴ含有調整液を用い、
抗ヒ）ＧＴ抗体を分泌することの出来るリンパ球源を得
るために、被験動物を免疫する。

通常、ラット、マウスあるいはもつと大きな哺乳動物で
ある被験動物にアジュバント　（抗原性補強剤）を通常
加えたにＴｉ１ｌ整液の腹腔内注射、あるいは静脈内注
射を行い、免疫反応をおこさせる。適当なリンパ球を、
循環器系（末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）　）か、動物が
殺せる場合は膵臓から採取する。

膵臓細胞あるいはＰＢＬｓを、その後、ハイブリドーマ
を得るために、無限に増殖する細胞株と融合させる。

典型的な融合では、リンパ球調整液を、通常、ネズミや
ラットの骨髄腫のような適切な、免疫された動物と同じ
種から得られた無限に増殖する細胞株の培養液と混合す
る。しかし、別の無限増殖方法も可能であり、たとえば
エプスタイン・バー・ウィルスのように無限に増殖する
ウィルスによる変形もその一つである。融合の際、抗体
産生リンパ球調整液と無限増殖の細胞は、多くの場合ポ
リエチレン・グリコールなどの、融合誘発剤を入れて混
合され、選択培地で平板培養される。最も一般に使用さ
れる選択培地は、ヒボキサンチン−７ミノプテリンチミ
シン　（）ＩＡＴ）培地であるが、これは核酸合成の副
路を持つ細胞のみ生きのびさせる培地である。多くのリ
ンパ球はこの副路があるが、多くの無限増殖細胞株には
ないのである。

それ故、■へＴ培地では、無限増殖する骨髄腫細胞株は
副路を持たないため滅亡する　；ハイブリッドになって
いないリンパ球細胞も、単に無限に増えないということ
で死んでしまう。ハイブリドーマだけが生き残るのは、
無限増殖と副路を持つという共通の特徴を持つからであ
る。もちろん、選択培地は、無限増殖する融合相手の代
謝的特徴に合うように選択される必要がある。

選択培地で一定時間経た後、生き残った培養液をマイク
ロタイタープレート上に拡げ、抗ＧＴ抗体の産生を検査
した。純粋なＣＴ−Ｉ［を使用することができないため
、全ＧＴ混合物に対する上澄み液検査をし、続いてにＴ
−Ｉに対する検査をすると便利である。混合物に対して
陽性でにＴ−１に対して陰性の試料は、ＧＴ−Ｉｔ特異
性となる。種々の免疫測定法によって検査ができるが、
放射免疫測定法や酵素免疫測定法もその一つである。

他のイムノアッセイによるにＴ−ＩＩ量を測定する方法
としでは、溶液内沈降反応を応用した比濁法や混濁度測
定法を、また各種の受身凝集反応、逆受身凝集反応等を
用いることができる。より高感度に測定したい場合には
、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、蛍光イ
ムノアッセイ等が用いられる。

これらの反応型式としでは、競合法、サンドイツチ法が
あげられる。ＧＴ−Ｉ［量をサンドイツチ法で測定する
場合には、二種類以上（通常は２種類）の抗体を組み合
せて用いられるが、ここで用いられる抗体としては、ポ
リクローナル抗体、本発明及び本発明以外のモノクロー
ナル抗体（例えば、前述したポドルスキイらが作製した
モノクローナル抗体等）をあげることができる。これら
の抗体は一゛方を固相に固定化、他方をラジオアイソト
ープ、酵素、蛍光物質等で標識化することにより用いら
れる。

典型的な方法は、マイクロタイタープレートを抗原調整
液で被覆し、洗浄し、テストされるノ１イブリドーマ上
澄み液をいろいろに希釈した液と混合して培養し、再び
洗浄し、予想される抗体が白米する種に対して調整した
同位元素標識した抗体で処理する。モノクローナル抗体
が抗原調整液によって保持されているウェル（穴）のみ
、二番目の抗体で標識される。もちろんこの方法の変法
も可能であるし、実際よく見かけられる。

ＧＴ−ｎ特異抗体を産生することが示された適当なハイ
ブリドーマのコロニーは、単一の“モノクローナル”細
胞株ができたことが明らかになるまで、逐次移し変えて
二次培養を行った。この培養液は無限に継続できるし、
にＴ−ｎ特異抗体の必要量を得るために適当な条件下で
培養で鰺る。代りに、ハイブリドーマを通常よく使われ
るマウスやラットなど適当な被験動物に注射し、抗体産
生がんを誘導することによって、体内でハイブリドーマ
培養ができる。この結果、腹水（腹腔内滲出液）と血流
中に高濃度の抗体があることになる。もちろん、出来た
モノクローナル抗体調整液は完全には純粋ではない。な
ぜならば、常に宿主固有の抗体が存在するからである。

しかし、固有の抗体の量はわずかであり、多くの目的に
使うに十分な純度が得られる程、殆んどの抗体はモノク
ローナル抗体である。必要なら、硫酸アンモニウム沈殿
法、ゲル電気泳動法、透析、クロマトグラフィー、限外
濾過法など通常の免疫グロブリン精製法によって、ＧＴ
−Ｉ［特異モノクローナル抗体を培養液や体液から分離
できるだろう。免疫グロブリンＧのアイソタイプの抗体
が優先されるが、分離が容易だからである。

この発明のＧＴ−ＩＩ特異モノクローナル抗体は、体液
、特に血清中のＣＴ−ＩＩ量検査のため免疫測定で用い
られる。体液中のＧＴ−ＩＩＩが高い場合、がんの存在
が示唆される。この点に関し、正常な血漿あるいは血清
（即ち、がんではない患者からの血漿あるいは血清）は
一般に約３０−１７５ピコモル／時／ｖａｌのＧＴ−Ｉ
Ｉ酵素活性を示すが、がん患者からの血漿あるいは血清
は、普通、約１７５ピコモル／時／ｖｌより大きなＧＴ
活性を示す　（基質として卵白アルブミンを用いて測定
した）。（純粋なにＴ−１の特異活性は約５００マイク
ロモル／時／ωｇである）。

値の上昇度合は、がんのタイプや検査される液体によっ
て変わるだろう。（、Ｔ−１１の上昇量は、卵巣がんの
ような癌腫、黒色腫、白血病、リンパ腫など、種々の細
胞新生物に伴って変わる。がんの早期発見のためのスク
リーニングにおける診断、手術や放射線療法や化学療法
後の病気の状態を評価するなどの治療、あるいは、再発
や転移の可能性の検査等の病気の予後に、この抗体を用
いる検査が役立つだろう。

たくさんの一般免疫プロトコルが使われるだろうが、優
先されるプロトコルは、固定されたＧＴ−■特異モノク
ローナル抗体と共に体液試料をインキュベートし、結合
しなかった物質を除去し、固体（固定された）相の有す
るＧＴ活性を決定する、という手順を経るものである。

抗体は、吸着あるいは共有結合で、適切な固体保持体や
、マイクロタイタープレートのウェル（穴）やビーズな
どの基質に固定されるだろう。体液試料とのインキュベ
ートは、試料中のどんなＧＴ−ｎも固定された抗体に結
合できるような条件下で実施される。この点に関し、十
分に強い抗原抗体の結合ができるように、少なくとも１
０９、でき得れば１０”Ｌ／Ｍ　（スキャッチャード　
（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）検査で測定）の親和力を抗体が
持っているのが望まれる。生理学的条件（ｐｌｙ　イオ
ン強度、温度）で、通常インキュベートをする。インキ
ュベート後、結合しなかった体液は固体相から除去され
、残りの体液を除去するために固体相を洗浄する。固体
相のＧＴ活性を、技術項目の通常の既知手順で、測定す
る。

例− 次の例は、発明の種々の態様を合わせて述べたものであ
る。この例は、発明をいかなる様式にも限定するもので
はない。

以下は、ＧＴ−ＩＩ特異モノクローナル抗体の調整、同
定、特性付けを述べたものである。ＧＴ、−ｎ特異モノ
クローナル抗体の調整及び分離に使われた戦略は、ヒト
悪性腫瘍滲出液より得られた混合ＧＴでＢＡＬＢ／ｃ系
マウスを免疫し、免疫されたマウスの膵臓細胞とマウス
骨髄腫細胞株との細胞融合を行ってハイブリドーマを作
り、出来たハイブリドーマが、混合ＧＴに対する抗体を
産生じているかを検査するものである。ヒト悪性腫瘍滲
出液由来の混合ＧＴに対する抗体を産生していると認定
された培養液は、そのあと、正常にヒト血清から分離さ
れたＧＴ−（への反応性をチェックされた。腫瘍滲出液
由来のＣＴに陽性で、正常ＧＴ−■には陰性だったハイ
ブリドーマは、ＧＴ−［特異的と判断された。

吐を」へ１１ ヒト腫瘍滲出液は、卵巣がん患者から得られた。

更に、悪性腎臓がん患者からがん滲出液が得られ、日数
を経た正常ヒト血清も得られた。この液体は全て一８０
℃で凍結保存し、使用前に４℃で融解した。

高速三段階精製法が、ＧＴ精製のために考え出され、正
常血清及びがん滲出液のＣＴ精製に用いられた。ＧＴ精
製手順は全て４℃で実施された。

融解されたＣＴを含むヒト液体試料は２０倍の体積の冷
蒸留水で一晩透析し、１０１６　Ｍのカコジル酸ナトリ
ウム液、１−０　＋ｎ　Ｍの二塩化マンガン液、５＋ｎ
ＭのＮ−アセチルグルコ−スアミン の７７化フエニルメチルスルホン酸液（ＰＭＳＦ）に調
整した。１時間静置後、１６，３００ｇで３０分遠心分
離された。上澄み液を取って、ＧＴ活性測定のため部分
標本を作った（以下−二述べるとおり）。固型物は捨て
られた。

上澄み液をα−ラクトアルブミン−セフ７０ース　４Ｂ
　　アフイニティ力ラム　（５Ｘ３０ｃｍ）に入れ、１
０　ｍ　Ｍカコジル酸ナトリウム液、１０ＩｆｉＭ二塩
化マンガン液、５ｍＭのＮ−アセチルグルコースアミン
液、５０μＨの７７化フエニルメチルスルホン酸、０．
００５％’ｒ　リ）　：７１００倍液（ｐｌ（７．２）
　（緩ｍｉＡ）’ｔ”洗浄した。結合していないたん白
質が全部流出した後、Ｎ−アセチルグルコースアミンを
含まない緩衝液でＧＴを特異的に流出させ、最終のＮ−
アセチルグルコースアミン濃度が５＋ｎＭになるのに十
分な量のＩＭＮ−７セチルグルコースアミンの入った試
験管にＣＴを入れた。ＧＴを含んだ分画を保存し、最初
のａ−ラクトアルブミンカラムと同一の条件で、第二番
目のα−ラクトアルブミン　アフイニティ力ラム　（１
，５Ｘ２８ｃ＋ｎ）で再度クロマトグラフィーを実施し
た。結合しなかったたん白質が全部流出した後、Ｎ−７
セチルグルコースアミンを含まないカコジル酸塩緩衝液
でＧＴを流出させ、Ｎ−７セチルグルコ一スアミン濃度
が５＋ｏＭに戻るのに十分な量のＮ−７セチルグルコー
スアミンの入ったシアル酸で被覆した試験管にとった。

６丁を含む分画を合わせて、前もっで緩衝液Ａで平衡に
しておいたヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧアフイニティ力
ラム　（１，５Ｘ　３　ｃｍ）　（シグマ・ケミカル社
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｂｅ＋ｏｉｃａｌ）製）に通した。Ｇ
Ｔを含む分画を集め、透析チューブに入れ、アクアサイ
ド■　（カルバイオオケム　（Ｃａｌｂｉｏｃｂｅｍ）
製）を使って約１０　ｍ　ｊ！に濃縮した。ＧＴを蒸留
水で透析し、イスコミ気泳動コンセントレイターを使っ
て０．２＋Ｊにまで更に濃縮した。

リｎ舅」（ ｔｌＤＰ−［コＨ］−ガラクトース　（４０．３　Ｃｉ
／　ｍｍｏｌ）はニューイングランドヌクレアー　（Ｎ
ｅｕ＋　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）より得られ、
ＵＤＰ−　　［３Ｈ］　、Ｉｙフラクトース、標識して
いないＵＤＰ−ガラクトース　（シグマ・ケミカル社製
）で希釈して２＋＋＋Ｍ溶液を調整した。特異活性は、
適当に希釈された部分標本の２６２ｎｍでの光学密度測
定及び液体シンチレーション計数測定で測定した。最終
特異活性は、約３Ｘ１０’ｃｐＩＩｌ／μ＋ｎｏｌであ
った。いくつか測定では、もっと高い特異活性（６　Ｘ
　１０’ｃｐｍ／μｎ＋ｏｌ，　０．４ａ＋Ｍ）のＵＤ
Ｐ−　　［３）Ｉ］　−、ｆラクトースが用いられた。

ＧＴ活性は、２ＩｎＭのＵＤＰ−　　［３Ｈ］　、ｆラ
クトース液を７μＮ，　Ｏ．ＺＭの二塩化マンガン′ｅ
．３μ１１卵白アルブミン溶液５０μｍ　（０，１Ｍカ
コジル酸ナトリウムと０．１５４Ｍ塩化ナトリウムの溶
液に５０＋ｎｇ／　ｍｆ入っている液、ｐＨ７．４）と
、酵素を含む試料１０μｌを０℃で混合して、測定した
。混合後、試験管を３７℃で１時間インキュベートし、
０℃にした。部分標本（５０μｍ）を取り、１インチ角
のホワットマン　（ｌＩＩｈａｔｍａｎ）３　＋ｎｍ紙
にスポットして、すぐに室温にて１０％三塩化酢酸（Ｔ
Ｃ＾）に浸した。１０％ＴＣ＾で毎回１０分ずつ３、４
回、試験紙を洗浄した後、余分のＴＣ＾は、乾燥前に、
９５％エタノールで１０分、エーテルで１０分の洗浄に
よって除去された。酸で沈殿した［３Ｈ］ガラクトース
量は、液体シンチレーション計数法によって定量した。

他のたん白質基質をＣＴ基質として用いた時もある。こ
の場合、ＴＣＡ溶液の代りに、２Ｎの塩酸を含む５％リ
ンタングステン酸液を用いた。他の手順は、全て前述の
通りである。

ポリアクリルアミドデル電気泳動 分離されたたん白質の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム
　：ポリアクリルアミド　ゲル電気泳動（ＳＤＳ−　ｐ
ＡｃＥ）で測定された。ＣＴアイソエンザイムは、変性
しない条件下で８％ポリアクリルアミドデルを用いて分
離した（ボトルスキー　（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ）とワイズ
ナー　（Ｗｅｉｓｎｅｒ）、Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ，　Ｂｉ
ｏ　ｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃ　ｏ　ＩＩｌ＋Ｉｌｕ　ｎ
　、誌、１９７５年第６５号５４５−　５５１頁）。変
性しないポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
の後ＧＴ活性を測定するために、個々の試料レーン（行
路）を２．５ｎ＋ｍ毎に切り、ボトルスキーとワイズナ
ーの方法（Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　ＣＩ＋ｅｍ０誌１９７
９年第２５４号３９８３−３９９０頁）で、流出緩衝液
に浸した。流出ＧＴを前述の方法で高特異活性を持っＵ
ＤＰ−［３Ｈ］がラクトースを用いて分析した。たん白
質は、ＰＡＧＥの後、銀感知染色法を用いて発色させた
。ＰＡＧＥで分離されたＧＴをニトロセルロース上に“
ウェスタン”ブロッティング（“Ｗｅｓｔｅｒｎ″ｂｌ
ｏｔｔｉｎｇ）　した。正常ヒト血清から調整されたＧ
Ｔは、ＧＴ−１特有の移動をした唯一っのたん白質染色
帯を示した。

ヒト悪性腫瘍滲出液がらの調整液は、同じＧＴ−１の帯
を示したが、更に、ＧＴ−ｆｌに対応する染色帯もまた
観察された。両方の染色帯にガラクトシルトランスフェ
ラーゼ活性があるがどうかは、デルを２．５Ｉ巾に薄く
切り、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を測定しで
確認した。ｃＴ活性は明らかに両方の染色帯で見い出さ
れた。

主要ヒト悪性Ｍ＃Ｉｆ滲出液からのＧＴ調整液のうちい
くつかは、変性しないＰＡＧＥでＧＴ−１［より遅く移
動する少量のたん白質染色物質を含んでいた。この高分
子量たん白質の帯は正常ヒト血清から分離されたＧＴで
は観察されなかった。分子量の対数に対して、帯の相対
移動をグラフにあられすと　（単量体の分子量が５７０
００であり、観察された帯は単量体が重合したものと仮
定する）、直線となる−即ち、観察される追加帯は、Ｃ
Ｔ調整液の中にオリゴマーが形成されたことによる可能
性が大きいといえよう。正常ヒト血清からのＣＴ調整液
には、オリゴマーの帯は観察されなかった。そのため、
多分ＧＴ−［は、自己会合をひき起こす構造的要素を持
っており、この要素はＧＴ−■には無いと言えるだろう
。この構造の相違により、にＴ−１と区別できる特別な
免疫学的エピトープ（抗原決定基）がＧＴ−［にある可
能性がある。

１創ム五しＬ乞 ＢＡＬＢ／ｃ系マウスは、−匹あたり約３０μｇのＧＴ
が投与される割合の７０インド完全アジユバントで免疫
された（両側の側腹部に約７．５μｇずつ、腹腔ｉ：１
５／７ｇ注射）、、３週間後、１鹿島だ’）　３０　／
ｊ　ｇ（１’）　ＧＴを含んだ７０イント不完全アジユ
バントを腹腔内注射した。この投与後２週間目に、目よ
り採血して、抗体を含む血清を調整した。この血清は、
酵素結合免疫吸着剤分析（ＥＬＩＳ八）によって、抗体
の存在を検査した。血清が抗体陽性であれば、このマウ
スにリン酸塩緩衝液食塩水（ＰＢＳ）に溶かしたＧＴ５
０μｇを静脈注射した。静脈注射後３日目に被験動物を
殺し、肺臓を取り、以下の様に細胞融合を実施した。

エライ　　ＥＬＩＳ＾ ９６コのウェルがあるマイクロタイタープレートのウェ
ルな、４℃で一晩、精製したＧＴで被覆した（５０Ｉ１
１．５μｇ／ｍｌ、　０．０５Ｍカルボン酸ナトリウム
液、ｐＨ９，６）。ＧＴ液を取り除いたあと、ウェルを
、リン酸塩（０，ＯＩＭ）　ｖｃ衝液液食塩０．１５Ｍ
　）水（ｐＨ７，４）（ＰＢＳ）に溶かして０．１％の
トウィーン　（Ｔｗｅｅｎ）８０とした液で１回洗浄す
る。ウシ血清アルブミン　（ＢＳＡ）を３％含むＰＢＳ
液でウェルを満たし、４℃で一晩、あるいは３７℃で１
時間培養する。ＢＳＳ液液除去し、十分な除去のため、
トウィーン８０を０．１％含むＰＢＳ溶液で、ウェルを
洗浄する。抗体を含む液（５０μＬ　ＢＳＡを１％含む
ＰＢＳ液で希釈）を加え、３７℃で１時間培養する。ト
ゥイーン８ｏを０．１％含むＰＢＳ液と５０μ！のベル
オキシグーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧと免疫
グロブリンＭ混合液（ターボ・イミュ／グイ７グ７ステ
イツクス（Ｔａｇｏ　Ｉ＋Ｉ＠ｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃｓ）　５！　；正常ヤギ血清を１０％含むＰＢＳ液
で希釈）で、十分にウェルを洗浄する。３７℃で１時間
培養後、抗体溶液を除去し、トウィーン８０を０．１％
含むＰＢＳ液で十分にウェルを洗浄する。ペルオキシダ
ーゼ基質溶液［ウェル１個当たり１００Ｉ１１；　０，
５Ｍのクエン酸、０．２５ｍＮの２゜２′−アクノービ
ス　（３−エチルベンズチアゾリン）　スルホン酸と０
．０１％過酸化水素水］を加え、発色させる。　４１０
ｎｍでの光学密度を、ＨＲ５８０マイクロエリザ・オー
ト・リーダー　（グイナテク　（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）製
）を用いて測定する。

」１１菖ｌの増殖 ５Ｐ２１０−へｇ１４系細胞を、胎生ウシ血清を１０％
含有し、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン
を補ったＲＰ旧１６４０組織培養培地（増殖培地）で、
増殖させた。骨髄腫細胞をＴ７５組織培養フラスコ内で
、７−８Ｘ１０５細胞数／ｌ１１１の密度になるまで増
殖させた。細胞生育可能性は、トリパン青染料排除法及
び血球計で計数して測定する。

細胞融合 免疫されたマウスから取った肺臓を、３１０１の増殖培
地中に徐々に均一化させ、２００ｇで遠心分離して肺臓
細胞を分離する。血清を含まないＲＰ旧１６４０で３回
ｌｌ４Ｉｌｉｌ細胞を洗浄した後、はぼ等しい数の生育
肺臓細胞と骨髄腫細胞を合わせ、混合し、遠心分離で分
離する。合わさった細胞を、ポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）　（アルデハイドを含まない。

ＢＲＬ研究所より得る）を５０％含むＲＰ１１６４０液
にゆっくりと懸濁し、徐々にＲＰＭ１１６４０液で希釈
してポリエチレングリコール濃度を５％にする。細胞を
遠心分離で分離し、徐々に増殖培地に分散させ、マイク
ロタイタープレートのウェルに、１ウエル当たｌ）　１
０６個１０．１ｍｆの細胞数を植え、５％の二酸化炭素
中で３７℃で培養する。細胞融合後１日目に、０、１＋
ｎｌのＨへＴ培地　（０，０１＋ｎＭのハイポキサンチ
ア、１．６μＨのチミジン、０．０４μＨのアミノプテ
リンを補充した増殖培地）を加える。その後２．３日毎
に、約半分のＨＡＴ培地を新しいＨＡＴ培地と交換する
。細胞は顕微鏡で観察する。クローン　（純株）が７−
１０日後に現れ、１０−１４日逃し抗体産生陽性のため
ＧＴエライザ検査法で上澄み液をスクリーンする。

抗体産生陽性のコロニー　（群）は、２４個のウェルが
あるプレートに拡げ、細胞密度が高くなった時にＴ−２
５７ラスコに移し変える。ハイブリドーマを）ＩＴ培地
　（アミノプテリンを含まない１（ＡＴ培地）で保持し
、それぞれの段階で抗ＧＴ抗体産生をチェックする。

１６個の細胞融合で、最初のエライザスクリーニングで
は、混合ＧＴに結合した抗体を産生じする２０個のハイ
ブリドーマが出来た。このハイブリドーマを、次の評価
のために、サブクローニングした。

ハイブリドーマサブクローニング 抗ＧＴ抗体を産生するハイブリドーマは、希釈を制限し
てサブクローニングさせた。バイブリド−マ細胞を０．
１ｍβのＨＴ培地あたり０．５個の生育細胞数の割合で
懸濁し、マイクロ価試験プレート上のウェル１個当たり
に０．１ｍｌ入れた。５−７日毎に培地を交換して細胞
を増殖させた（約２週間）。２週間後、エライザを用い
て抗体産生を調べた。２０個のハイブリドーマのうち２
個からの上澄み液は、正常血清ＧＴ　（ＧＴ−１）と交
叉反応せず、ＧＴ−１特異性があると評価された。この
ハイブリドーマ２個を、３８７２．４５６２と名付けた
。

抗Ｇ丁モノクローナル抗体（ＭｃＡｂ）の」「２個のに
Ｔ−［特異ハイブリドーマは、Ｔ−２５及びＴ−７５組
織培養フラスコ中のＩＩＡＴ培地の細胞培養の中で増殖
した。ハイブリドーマ細胞は５−８×１０５細胞数／ｗ
ｅの密度にまで増殖した。ハイブリドーマ細胞を２００
ｇ　５分間の遠心分離によって集め、上澄み液はＭｃＡ
ｂ精製やサブタイプ分類のため取って置いた。マウス腹
水中でＮ　ｃ　八Ｉ３を産生させるため、ハイブリドー
マ細胞を血清を含まないＲＰＭ１１５４０で１回洗浄し
、１×１０７細胞数／Ｉｎｌの割合でＲＰＭ１１６４０
に再懸濁した。ＢＡＬＢ／ｃ系マウス　（少なくとも７
日以上前に、ブリスタン　（２、６，１０，１４−テト
ラメチルペンタデカン）で処置しである）の腹腔に０．
５＋ｎｊ！　（５Ｘ　１０６個の細胞数）を注射した。

腹腔腫瘍の存在は、１−２週間内に明らかにされねばな
らない。マウスが傾眠状態になり腹部が膨張した時に、
腹水を採取し、遠心分離（５分間２００ｇ）で細胞を分
離し、ＭｃＡｂを含む上澄み液を注意して取り除く。

ＨｃＡｂの精製 腹水を２倍量のＰＢＳで希釈し、飽和硫酸アンモニウム
を加えて５０％飽和とする。ＭｃＡｂを含む沈殿は、１
０，０００ｇで１５分間遠心分離して分離し、洗浄後、
少量のＰＢＳに溶解し、１００倍量の２０＋ｎＮ　）リ
スと４０＋＋＋Ｈの塩化す）　＋７ウムの緩衝液（ｐＨ
７，８）で２度透析する。このＭｃ八すをＦＰＬＣｆｉ
器（ファルマシア　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）を用い
て、モノＱ（第四アンモニウム樹脂、ファルマシア製）
カラムのクロマトグラフィーで、更に精製する。Ｍ　ｃ
　Ａ　ｌ）を塩の直線濃度勾配の液で流出し、エライザ
で検査する。この方法で調整したＭ　ｃ　Ａ　ｌ）は非
常に純度が高く、ＧＴ検査の開発で用いるのに適当であ
る。

Ｍｃ八へ）の型および′−型（サブタイプ）分類ＧＴ−
］Ｉ特異ＭｃＡｂの抗体クラスとサブタイプは、市販さ
れている　（マイルス　（Ｍｉｌｅｓ）研究新製）特異
抗マウス免疫グロブリン抗血清を使い、オクタロニイ　
（Ｏｃｌ＋ｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法によって、細胞
培養の上澄み液に基づ外決定した。３８７２は免疫グロ
ブリンＧ１で、４５６２は免疫グロブリンＭであること
がわかった。３８７２の親和定数はスキッチャード　（
Ｓｃａｔｃｈａｒｃｌ）分析によって４　Ｘｌ０１０Ｌ
／Ｍであるとわかった。ＭｅΔ１１３８７２を産生する
ハイブリドーマ試料は、登録番号ＨＢ８９４５で、１９
８５年１１月１９日に、米国タイプカルチャーコレクシ
ョンに寄託された。この寄託は、ブタペスト条約の条項
に従って行われたもので、保存され、この条約に従って
それ以後利用が許されるのである。

牡ハ３８７２の特異性確認 正常血清と悪性腫瘍滲出液を精製した調整液を、変性し
ないＰＡにＥにかけ、“ウェスタン゛ブロッティング法
を用いて電気泳動によりニトロセルロースに移動させた
。占有されていないたん白質結合場所を前述のようにＢ
ＳＡでふさぎ、分解したＧＴたん白質の４つのレーンを
それぞれ、次のもので培養した。（１）マウス抗ヒトＣ
Ｔ血清（ポリクローナル）の１０００倍希釈液、（２）
　ＭｃＡｂ３８７２の１００倍希釈液、（３）　ＭｃＡ
ｂ３８７２の１０００倍希釈液、（４）正常ヒト血清の
１０００倍希釈液。すべてＰＢＳで希釈したものである
。結合しなかった抗体を洗浄しで除去した後、ベリオキ
シグーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧと免疫グロ
ブリンＭをＰＢＳに溶かした液を加えて、結合した抗体
に対する染色試薬とした。洗浄後、抗ＧＴ％　／クロー
ナル抗体が結合する場所を、ベルオキシグーゼ基質溶液
（ＰＢＳに過酸化水素と４〜クロロ−１−す７トールを
溶かした液）を加えて発色させた。マウス抗ヒ）ＧＴ血
清は、すべての形のＣＴに結合した。二つの希釈液のＭ
ｃＡｂ３８７２は、ＧＴ−［とより大きいオリゴマーに
結合し、ＧＴ−Ｉには結合しなかった。正常ヒト血清は
、とのＧＴたん白質にも結合しなかった。

Ｍ　ｃ　八Ｉ）３８７２を使用した正常　びがん患者か
らの試料盆」ｒ プロトコル Ａ、抜准、３８７２ｆｌ＋ンしΣｐｉｔ！ｉ”カルボジ
イミドで活性化したトリスアクリルデルＧＦ−２０００
（ピアス化学社製　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃ１＋ｅＩＩ１．
Ｃｏ、））を、蒸留水と結合（カップリング）緩衝液（
０，１Ｍホウ酸塩液、　ｐｌ（８，５）で２回洗浄する
。モノクローナル抗体３８７２　（２Ｂ）を結合ｒ＆衝
液２ｍｆと、洗浄した［；Ｆ−２０００ゲルにそれぞれ
入れ４℃で一晩振どう培養する。反応しなかったモノク
ローナル抗体を再使用のため回収し、ゲルの未反応活性
場所はＢＳへの５％結合緩衝液２訂と４℃で一晩振どう
培養してブロックする。結合したデルを０．１Ｍクエン
酸塩液、１．４Ｍ塩化ナトリウム液（ｐＨ４，０）、０
．１Ｍカルボン酸塩液、１．４Ｍ塩化ナトリウム液（ｐ
ｌ（１１，０）、最後にＣＫＴ緩衝液（２０ｍ　Ｍカコ
ジル酸ナトリウム、１５０ｉｉＨ塩化カリウム、ｏ、ｏ
ｉ％トリトンＸ−１００）で洗浄する。結合したゲルを
、５倍量のＣＫＴ緩衝液（中に５％のＢＳＡ、　０．０
５％のアジ化ナイリウムを含む）に入れ４℃で保存した
。回収未結合たん白質に基づきゲル１１当たりの結合Ｍ
ｃ八ｂ　１［Ｉｌｇの評価をする。

Ｂ、ＮｃＡｂ３８７２結合ＧＦ−２０００ゲルを用いた
ＧＴ−［分析− ２５μｐのＭｃＡｂ３８７２が結合したデル懸濁液（ゲ
ル容積は５　ｍｆ）とＣＴ試料を合わせて１２Ｘ７５＋
＋＋ｍのホウケイ酸塩試験管に入れ、４°Ｃで一晩振ど
う培養した。２Ｔｎ１の冷ＣＫＴ緩衝液を加え、１ｇで
５分間放置した後、上澄み液を吸引する。この手順を２
度繰り返す。７０１１１ｆ）（、Ｔ基質液を加え　（７
μｌの０．５ｍＭ［’Ｈ］　ＵＤＰ　　ｇａｌ液、全投
入量１５０，０００ｄｐｍ　（−ニーイングランドヌク
レアー　（Ｎｅｕ＋　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ
）製）、３μｌの０．２Ｍ二酸化マンガン液、６０μＩ
のＣＫＴｌ衝液、２ｍｇの卵白アルブミン　（ＯＶＡ’
）　）、この混合液を３７℃で２時間振どうインキュベ
ートした。

５０μｌの反応混合液を１インチ角のホワットマン３１
紙にスポットし、直ちに多量の１０％ＴＣ＾で１０分間
洗浄した。ＴＣ八に接触させるこの操作を３回くり返し
た。さらに、この試験紙を９５％エタノール、次いでジ
エチルエーテルそれぞれ１０分間洗浄した。空気中で乾
燥した後、この分析試験紙をシンチレーション用小びん
に入れ、シンチレーションカクテルを加え、濾紙上に沈
殿した放射性たん白質量を液体シンチレーション計数法
で測定した。

Ｌ」 健康人からの血漿試料２９個と、がん患者の腹水試料２
４個を、前記の手順で別々に分析した。健康人の試料か
ら得られた活性は１０００　Ｃｌ）ｗ以下であったが、
腹水試料のうち３個は１１０００ｃｐより大きい活性値
を示した。１０００ｃｐ＋ｎという値は、１７５ピコモ
ル／時／＋ｎｌの酵素活性とほぼ同等である。

以下に述べる方法は、にＴ−ＩＩ値を測定する為に考え
られた一方法である。

ＧＴ−ＩＩのサンドイッチイムノアッセイに用いられる
抗体は２種類の抗体が利用され得る。その組み合わせと
して、ＨΔ１１３８７２とＨへＩ）４８８０が一例とし
て挙げられた。

Ｈへｂ　４８８０は、Ｍ　Ａ　１１３８７２と同様の操
作によって作製され、特異性の確認の際ＧＴ−１とにＴ
−ＩＩ　（及びそのオリゴマー成分）相方に対し反応性
を持っていることが確かめられたクローンである。ＭＡ
ｂ３８７２と同様にマウス腹水から精製されたＭ　Ａ　
１１４８８０を１０μｇ／ｗｌＰＢｓに溶解し、１７４
インチポリスチレンビーズに４℃１晩、固定化した。Ｐ
ＢＳで２階洗浄後、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで、表面を
処理し再びＰＢＳで洗浄した。

試験管中へ、１００μｌのＧＴ−Ｉｆを測定しようとす
る試料及び前記ポリスチレンビーズを加え、４°Ｃ１晩
放置する。ＰＢＳで３回洗浄後、ヨード１２５でラベル
化されたＭＡｂ３８７２を含む２％ＢＳ＾、ＰＢＳ溶液
１００μｒ加え３７℃３時間インキュベートした。

（Ｍ＾ｂ３８７２は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社エンザイモビー
ズによって、ラベル化されたものであり、アッセイあた
り約４ｎｇ、１００，０００ｃｐｍに調整されである）
ビーズを３回ＰＢＳで洗浄後、γ−カウンターにより測
定した。

（結果） ＧＴ−ＩＩの値が、既知の標準サンプルを測定した結果
を以下に示す。

ＧＴ−［、ｖ［Ｉ／ｙＬ　　　　　ｃｐｍ（デュプリケ
イト）０２７５・　２８５ ４００　　　　　　　　　９９０・１００５８００　　
　　　　　　　１５５０・１６４５これらの結果から、
サンドイッチイムノアッセイによってもＧＴ−［値の測
定が可能なことが示された。

免疫学、ハイプリドーマ技術、がん診断、生化学、及び
関連分野の技術者にとって明らかな、この発明を実施す
るための上記方式の変法は、本願の特許請求の範囲内の
ものとされる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ガラクトシルトランスフェラーゼ I と交叉反応
   せずガラクトシルトランスフェラーゼIIに対するモノク
   ローナル抗体。
2. （２）モノクローナル抗体３８７２と、機能的同等物。