JPH06209788A - ヒト可溶性ｉｃａｍ−１の免疫学的測定法、その測定用抗 体および測定用キット - Google Patents
ヒト可溶性ｉｃａｍ−１の免疫学的測定法、その測定用抗 体および測定用キットInfo
- Publication number
- JPH06209788A JPH06209788A JP5037262A JP3726293A JPH06209788A JP H06209788 A JPH06209788 A JP H06209788A JP 5037262 A JP5037262 A JP 5037262A JP 3726293 A JP3726293 A JP 3726293A JP H06209788 A JPH06209788 A JP H06209788A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- icam
- immunological assay
- human soluble
- sicam
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】全ヒト可溶性ＩＣＡＭ−１及び活性型ヒト可溶
性ＩＣＡＭ−１の分別定量を可能とする高感度免疫学的
測定法を提供する。 【構成】固相抗体および標識抗体として、抗原結合定数
が１０８Ｍ−１以上の抗体を用い、固相抗体として非中
和抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体及び中和抗ＩＣＡ
Ｍ−１モノクローナル抗体を用いることによりそれぞれ
全ヒト可溶性ＩＣＡＭ−１及び活性型ヒト可溶性ＩＣＡ
Ｍ−１を測定可能とならしめる免疫学的測定法、該抗Ｉ
ＣＡＭ−１モノクローナル抗体、該抗体含有試薬及び該
測定法用キットならびに該抗体産生ハイブリドーマ。 【効果】本発明測定法により検出限界５０ｐｇ／ｍｌ以
下のヒト可溶性ＩＣＡＭ−１の高感度免疫学的測定が可
能である。
性ＩＣＡＭ−１の分別定量を可能とする高感度免疫学的
測定法を提供する。 【構成】固相抗体および標識抗体として、抗原結合定数
が１０８Ｍ−１以上の抗体を用い、固相抗体として非中
和抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体及び中和抗ＩＣＡ
Ｍ−１モノクローナル抗体を用いることによりそれぞれ
全ヒト可溶性ＩＣＡＭ−１及び活性型ヒト可溶性ＩＣＡ
Ｍ−１を測定可能とならしめる免疫学的測定法、該抗Ｉ
ＣＡＭ−１モノクローナル抗体、該抗体含有試薬及び該
測定法用キットならびに該抗体産生ハイブリドーマ。 【効果】本発明測定法により検出限界５０ｐｇ／ｍｌ以
下のヒト可溶性ＩＣＡＭ−１の高感度免疫学的測定が可
能である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト可溶性ＩＣＡＭ−
１の免疫学的測定法、その測定に用いるモノクローナル
抗体並びにその測定用キット、さらにはそれらのモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
１の免疫学的測定法、その測定に用いるモノクローナル
抗体並びにその測定用キット、さらにはそれらのモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫学における接着分子研究の進展には
目ざましいものがあり、これまで抗原と抗原レセプター
間の相互作用あるいはサイトカインとそれに対応するレ
セプター間の相互作用として論じられてきた免疫細胞間
相互作用において、細胞間の直接接着（ｃｅｌｌ ａｄ
ｈｅｓｉｏｎ）が重要な関わりを持つことが判明した
〔Ｓ．Ｊ．Ｓｉｎｇｅｒ：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ），２５５，１６７１（１９９２）〕。例えば、抗原
提示細胞とリンパ球との結合、Ｔ細胞／Ｂ細胞間の相互
作用、標的細胞に対するキラー細胞の認識、血管内皮細
胞に対する血流リンパ球のローリング及び接着、また胸
腺細胞とストロ一マ間の相互作用などにおける接着分子
の役割が今や次々と明らかとなっている。このような免
疫反応における接着蛋白の重要性の認識は、これらが免
疫賦活化及び免疫応答の早期マーカーでありうるとの予
測に鑑みて、直ちに各種疾患における接着蛋白の役割研
究へと進展した。その結果、喘息やリウマチなどの炎症
性疾患のマーカーとしてだけではなく、癌の転移におい
ても重要な役割を演じているとの認識から、癌の悪性度
マーカーとしても注目されるようになってきた。特に、
細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１：ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕ
ａｒ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）／リ
ンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ−１：ｌｙｍｐｈｏｃｙｔ
ｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔ
ｉｇｅｎ−１）接着経路〔玉谷卓也、宮坂昌之：実験医
学，９，３１８（１９９１）〕は白血球の血管内皮細胞
への接着、リンパ球の抗原特異的反応など免疫系の様々
な相互作用において重要な役割を果たしていることが、
多くの動物実験モデルにおいて明らかとなった。例え
ば、ラット・アジュバント関節炎モデルにおいて抗ＩＣ
ＡＭ−１抗体が関節炎の発症を抑制〔Ｙ．Ｉｉｇｏ ｅ
ｔ ａｌ．：ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．），１４７，４１６７（１９９１）〕、
マウス・アロ心臓移植において抗ＩＣＡＭ−１／抗ＬＦ
Ａ−１抗体が移植拒絶反応を抑制〔磯部光章：メディカ
ル イムノロジー（Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），２
２，６４５（１９９１））、さらには サル気管支喘息
モデルにおいて抗ＩＣＡＭ−１抗体が好酸球の気管支上
皮への浸潤を抑制〔Ｃ．Ｄ．ｗｅｇｎｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２４７，４５６
（１９９０）〕したことなどが報告されている。
目ざましいものがあり、これまで抗原と抗原レセプター
間の相互作用あるいはサイトカインとそれに対応するレ
セプター間の相互作用として論じられてきた免疫細胞間
相互作用において、細胞間の直接接着（ｃｅｌｌ ａｄ
ｈｅｓｉｏｎ）が重要な関わりを持つことが判明した
〔Ｓ．Ｊ．Ｓｉｎｇｅｒ：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ），２５５，１６７１（１９９２）〕。例えば、抗原
提示細胞とリンパ球との結合、Ｔ細胞／Ｂ細胞間の相互
作用、標的細胞に対するキラー細胞の認識、血管内皮細
胞に対する血流リンパ球のローリング及び接着、また胸
腺細胞とストロ一マ間の相互作用などにおける接着分子
の役割が今や次々と明らかとなっている。このような免
疫反応における接着蛋白の重要性の認識は、これらが免
疫賦活化及び免疫応答の早期マーカーでありうるとの予
測に鑑みて、直ちに各種疾患における接着蛋白の役割研
究へと進展した。その結果、喘息やリウマチなどの炎症
性疾患のマーカーとしてだけではなく、癌の転移におい
ても重要な役割を演じているとの認識から、癌の悪性度
マーカーとしても注目されるようになってきた。特に、
細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１：ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕ
ａｒ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）／リ
ンパ球機能関連抗原（ＬＦＡ−１：ｌｙｍｐｈｏｃｙｔ
ｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔ
ｉｇｅｎ−１）接着経路〔玉谷卓也、宮坂昌之：実験医
学，９，３１８（１９９１）〕は白血球の血管内皮細胞
への接着、リンパ球の抗原特異的反応など免疫系の様々
な相互作用において重要な役割を果たしていることが、
多くの動物実験モデルにおいて明らかとなった。例え
ば、ラット・アジュバント関節炎モデルにおいて抗ＩＣ
ＡＭ−１抗体が関節炎の発症を抑制〔Ｙ．Ｉｉｇｏ ｅ
ｔ ａｌ．：ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．），１４７，４１６７（１９９１）〕、
マウス・アロ心臓移植において抗ＩＣＡＭ−１／抗ＬＦ
Ａ−１抗体が移植拒絶反応を抑制〔磯部光章：メディカ
ル イムノロジー（Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），２
２，６４５（１９９１））、さらには サル気管支喘息
モデルにおいて抗ＩＣＡＭ−１抗体が好酸球の気管支上
皮への浸潤を抑制〔Ｃ．Ｄ．ｗｅｇｎｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．：サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２４７，４５６
（１９９０）〕したことなどが報告されている。
【０００３】また悪性メラノーマ患者では、血中の可溶
性ＩＣＡＭ−１〔ｓＩＣＡＭ−１：Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｉ
ＣＡＭ−１〕濃度が顕著に増加し、生存率と逆相関して
いることが明らかとなった〔Ｔ．Ｋａｇｓｈｉｔａ ｅ
ｔ ａｌ．：キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．），５１，１７２６（１９９１）〕。即ち、ｓＩ
ＣＡＭ−１レベルの高い患者はより延命期間が短く、一
方でメラノーマ患者より採取したメラノーマ細胞上のＩ
ＣＡＭ−１の発現増大は転移のリスクと正の相関を示し
〔Ｒ．Ｈａｒｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．：キャンサー リ
サーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．），５１，５００３
（１９９１）〕、この分子が悪性メラノーマの転移に密
接な関わりを持つことを示唆している。 さらにリウマ
チ性関節炎（ＲＡ）患者や白血球接着不全症〔ＬＡＤ
（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｄｅｆｉｃ
ｉｅｎｃｙ）：常染色体性劣性遺伝の免疫不全症で、白
血球表面で細胞接着に関与する膜蛋白が欠損〕患者で
は、血中のｓＩＣＡＭ−１濃度が増大すると言われてい
る。また正常リンパ球あるいは炎症性疾患患者由来のリ
ンパ球や癌細胞などの培養液中には、ｓＩＣＡＭ−１が
遊離されてくることも分かっており、宿主免疫応答能の
上昇をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞培養で検索
することも可能となるかもしれない。
性ＩＣＡＭ−１〔ｓＩＣＡＭ−１：Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｉ
ＣＡＭ−１〕濃度が顕著に増加し、生存率と逆相関して
いることが明らかとなった〔Ｔ．Ｋａｇｓｈｉｔａ ｅ
ｔ ａｌ．：キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．），５１，１７２６（１９９１）〕。即ち、ｓＩ
ＣＡＭ−１レベルの高い患者はより延命期間が短く、一
方でメラノーマ患者より採取したメラノーマ細胞上のＩ
ＣＡＭ−１の発現増大は転移のリスクと正の相関を示し
〔Ｒ．Ｈａｒｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．：キャンサー リ
サーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．），５１，５００３
（１９９１）〕、この分子が悪性メラノーマの転移に密
接な関わりを持つことを示唆している。 さらにリウマ
チ性関節炎（ＲＡ）患者や白血球接着不全症〔ＬＡＤ
（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｄｅｆｉｃ
ｉｅｎｃｙ）：常染色体性劣性遺伝の免疫不全症で、白
血球表面で細胞接着に関与する膜蛋白が欠損〕患者で
は、血中のｓＩＣＡＭ−１濃度が増大すると言われてい
る。また正常リンパ球あるいは炎症性疾患患者由来のリ
ンパ球や癌細胞などの培養液中には、ｓＩＣＡＭ−１が
遊離されてくることも分かっており、宿主免疫応答能の
上昇をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞培養で検索
することも可能となるかもしれない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本来、ＩＣＡＭ−１は
細胞膜表面に発現される蛋白であるため、発現細胞その
ものを抗ＩＣＡＭ−１抗体を用いて酵素標識、さらには
蛍光標識して定量していたが、前述したように近年、血
中あるいは細胞培養液中に可溶性ＩＣＡＭ−１（ｓＩＣ
Ａ−１） が遊離していることが分かり、これらが各種
炎症性疾患、癌疾患あるいは免疫不全症などの診断マー
カーとして有用であるとの認識が高まってきた。この血
中あるいは細胞培養液中のｓＩＣＡ−１の定量には、酵
素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅ
ｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）が専ら用
いられてきた。しかしながら従来のＥＬＩＳＡでは、感
度が必ずしも十分でないため、微量のｓＩＣＡＭ−１含
有体液や組織内濃度の測定には不適当である。また、膜
上に発現されるｉｎｔａｃｔ ＩＣＡＭ−１と類似の生
物活性を有し、従ってＩＣＡＭ−１発現細胞へのリンパ
球の結合を阻止したり、血管内皮細胞に結合していたリ
ンパ球の脱着を促進する活性型ｓＩＣＡＭ−１のみを測
定しており、不活性型ｓＩＣＡＭ−１の多くが測定され
ていないので、全ｓＩＣＡＭ−１量を測定していないこ
となどの欠点があった。
細胞膜表面に発現される蛋白であるため、発現細胞その
ものを抗ＩＣＡＭ−１抗体を用いて酵素標識、さらには
蛍光標識して定量していたが、前述したように近年、血
中あるいは細胞培養液中に可溶性ＩＣＡＭ−１（ｓＩＣ
Ａ−１） が遊離していることが分かり、これらが各種
炎症性疾患、癌疾患あるいは免疫不全症などの診断マー
カーとして有用であるとの認識が高まってきた。この血
中あるいは細胞培養液中のｓＩＣＡ−１の定量には、酵
素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅ
ｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）が専ら用
いられてきた。しかしながら従来のＥＬＩＳＡでは、感
度が必ずしも十分でないため、微量のｓＩＣＡＭ−１含
有体液や組織内濃度の測定には不適当である。また、膜
上に発現されるｉｎｔａｃｔ ＩＣＡＭ−１と類似の生
物活性を有し、従ってＩＣＡＭ−１発現細胞へのリンパ
球の結合を阻止したり、血管内皮細胞に結合していたリ
ンパ球の脱着を促進する活性型ｓＩＣＡＭ−１のみを測
定しており、不活性型ｓＩＣＡＭ−１の多くが測定され
ていないので、全ｓＩＣＡＭ−１量を測定していないこ
となどの欠点があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記事情を
鑑み鋭意研究した結果、検液中のｓＩＣＡＭ−１を高感
度に、かつ全ｓＩＣＡＭ−１と活性型ｓＩＣＡＭ−１と
を分別定量できる免疫学的測定法を見いだし、本発明を
完成するに至った。即ち本発明は、（１）担体上に保持
された抗体と該抗体とは抗原決定基が異なる標識化され
た抗体を用いるヒト可溶性ＩＣＡＭ−１の免疫学的測定
法において、それぞれ抗原結合定数が１０８Ｍ−１以上
の抗体を用いることを特徴とするヒト可溶性ＩＣＡＭ−
１の免疫学的測定法、（２）検出限界が５０ｐｇ／ｍｌ
以下である上記（１）記載の免疫学的測定法（３）標識
化された抗体がＩＣＡＭ−１の細胞接着作用に対する非
中和抗体である上記（１）記載の免疫学的測定法、
（４）標識化された抗体がマウスモノクローナル抗体Ｓ
Ｍ−１である上記（３）記載の免疫学的測定法、（５）
担体上に保持された抗体がＩＣＡＭ−１の細胞接着作用
に対する非中和抗体であり、全ヒト可溶性ＩＣＡＭ−１
を定量可能な上記（１）記載の免疫学的測定法、（６）
担体上に保持された抗体がマウスモノクローナル抗体Ｗ
ＩＳ２−１１である上記（５）記載の免疫学的測定法、
（７）担体上に保持された抗体がＩＣＡＭ−１の細胞接
着作用を阻害する中和抗体であり、活性型可溶性ＩＣＡ
Ｍ−１を定量可能な上記（１）記載の免疫学的測定法、
（８）担体上に保持された抗体がマウスモノクローナル
抗体ＷＩＳ４−４７、ＷＩＳ５−８５及びＷＩＳ５−２
５４である上記（７）記載の免疫学的測定法、（９）標
識化された抗体が非放射性物質で標識化された抗体であ
る上記（１）記載の免疫学的測定法、（１０）非放射性
物質がビオチンである上記（９）記載の免疫学的測定
法、（１１）非放射性物質が酵素である上記（９）記載
の免疫学的測定法、（１２）酵素が西洋ワサビ・パーオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）である上記（１１）記載の免疫学
的測定法、（１３）抗体がＦａｂ’抗体である上記
（１）記載の免疫学的測定法に関するものであり、また
（１４）抗原結合定数が１０８Ｍ−１以上である抗ヒト
可溶性ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体、（１５）抗原
結合定数が１０８Ｍ−１以上である抗ヒト可溶性ＩＣＡ
Ｍ−１モノクローナル抗体を含有する可溶性ＩＣＡＭ−
１の免疫学的測定用試薬、（１６）少なくとも担体上
に保持された抗体と該抗体とは抗原決定基が異なる標
識化された抗体とを構成成分とし、該およびの抗体
の抗原結合定数が１０８Ｍ−１以上であり、検出限界が
５０ｐｇ／ｍｌ以下であるヒト可溶性ＩＣＡＭ−１の免
疫学的測定用キット、（１７）抗原結合定数が１０８Ｍ
−１以上である抗ヒト可溶性ＩＣＡＭ−１モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ、（１８）ハイブリド
ーマがマウスハイブリドーマＳＭ−１、ＷＩＳ２−１
１、ＷＩＳ４−４７、ＷＩＳ５−８５あるいはＷＩＳ５
−２５４である上記（１７）記載のハイブリドーマに関
するものである。
鑑み鋭意研究した結果、検液中のｓＩＣＡＭ−１を高感
度に、かつ全ｓＩＣＡＭ−１と活性型ｓＩＣＡＭ−１と
を分別定量できる免疫学的測定法を見いだし、本発明を
完成するに至った。即ち本発明は、（１）担体上に保持
された抗体と該抗体とは抗原決定基が異なる標識化され
た抗体を用いるヒト可溶性ＩＣＡＭ−１の免疫学的測定
法において、それぞれ抗原結合定数が１０８Ｍ−１以上
の抗体を用いることを特徴とするヒト可溶性ＩＣＡＭ−
１の免疫学的測定法、（２）検出限界が５０ｐｇ／ｍｌ
以下である上記（１）記載の免疫学的測定法（３）標識
化された抗体がＩＣＡＭ−１の細胞接着作用に対する非
中和抗体である上記（１）記載の免疫学的測定法、
（４）標識化された抗体がマウスモノクローナル抗体Ｓ
Ｍ−１である上記（３）記載の免疫学的測定法、（５）
担体上に保持された抗体がＩＣＡＭ−１の細胞接着作用
に対する非中和抗体であり、全ヒト可溶性ＩＣＡＭ−１
を定量可能な上記（１）記載の免疫学的測定法、（６）
担体上に保持された抗体がマウスモノクローナル抗体Ｗ
ＩＳ２−１１である上記（５）記載の免疫学的測定法、
（７）担体上に保持された抗体がＩＣＡＭ−１の細胞接
着作用を阻害する中和抗体であり、活性型可溶性ＩＣＡ
Ｍ−１を定量可能な上記（１）記載の免疫学的測定法、
（８）担体上に保持された抗体がマウスモノクローナル
抗体ＷＩＳ４−４７、ＷＩＳ５−８５及びＷＩＳ５−２
５４である上記（７）記載の免疫学的測定法、（９）標
識化された抗体が非放射性物質で標識化された抗体であ
る上記（１）記載の免疫学的測定法、（１０）非放射性
物質がビオチンである上記（９）記載の免疫学的測定
法、（１１）非放射性物質が酵素である上記（９）記載
の免疫学的測定法、（１２）酵素が西洋ワサビ・パーオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）である上記（１１）記載の免疫学
的測定法、（１３）抗体がＦａｂ’抗体である上記
（１）記載の免疫学的測定法に関するものであり、また
（１４）抗原結合定数が１０８Ｍ−１以上である抗ヒト
可溶性ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体、（１５）抗原
結合定数が１０８Ｍ−１以上である抗ヒト可溶性ＩＣＡ
Ｍ−１モノクローナル抗体を含有する可溶性ＩＣＡＭ−
１の免疫学的測定用試薬、（１６）少なくとも担体上
に保持された抗体と該抗体とは抗原決定基が異なる標
識化された抗体とを構成成分とし、該およびの抗体
の抗原結合定数が１０８Ｍ−１以上であり、検出限界が
５０ｐｇ／ｍｌ以下であるヒト可溶性ＩＣＡＭ−１の免
疫学的測定用キット、（１７）抗原結合定数が１０８Ｍ
−１以上である抗ヒト可溶性ＩＣＡＭ−１モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ、（１８）ハイブリド
ーマがマウスハイブリドーマＳＭ−１、ＷＩＳ２−１
１、ＷＩＳ４−４７、ＷＩＳ５−８５あるいはＷＩＳ５
−２５４である上記（１７）記載のハイブリドーマに関
するものである。
【０００６】本発明におけるｓＩＣＡＭ−１あるいはＩ
ＣＡＭ−１発現細胞は通常の遺伝子工学的手法〔Ｔ．Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．：“モレキュラー クロ
ーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）”，
コールド スプリング ハーバー ラボラトリ（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）刊（米国）、高木康敬編著：”遺伝子操作実験
法”，講談社刊〕を用いて作製される。また、インター
ロイキン−１β（ＩＬ−１β）や腫瘍壊死因子α（ＴＮ
Ｆα）で活性化されたヒトさい帯血管内皮細胞 （ＨＵ
ＶＥＣ：ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｎｏｕｓ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、あるいは各
種ＩＣＡＭ−１高発現腫瘍細胞株〔Ｂリンパ腫細胞（Ｒ
ａｊｉ，Ｄａｕｄｉ等）、Ｂリンパ芽球（ＩＭ９，ＣＣ
ＲＦ−ＳＢ等）、ＥＢウイルス感染リンパ球（ＴＡＰＣ
−３０１，ＣＥＳＳ等）、Ｔ白血病細胞（ＣＥＭ）〕も
ＩＣＡＭ−１発現細胞として、さらにそれらの細胞
（膜）抽出物をＩＣＡＭ−１粗製液として用いることも
できる。本発明で用いられる抗ＩＣＡＭ−１モノクロー
ナル抗体（ＭｏＡｂ）は公知の遺伝子工学的手法によっ
ても作成できるが、通常、ハイブリドーマ法によって作
成される。該抗体産生ハイブリドーマの作製は常法に従
って実施される。すなわち、上述のようにして得られた
ｓＩＣＡＭ−１あるいはＩＣＡＭ−１発現細胞を動物に
免疫し抗体産生細胞を得る。次に免疫動物より採取した
これらの抗体産生細胞、例えば脾臓細胞やリンパ節細胞
などを骨髄腫細胞（例．マウスの場合、ＮＳ−１，Ｐ３
Ｕ１，Ｓｐ２／０）と融合し、得られるハイブリドーマ
の中からｓＩＣＡＭ−１に特異的に結合し、ＩＣＡＭ−
１発現細胞に結合可能な抗体を産生する細胞をスクリー
ニングする。免疫動物としては、例えばウサギ、ラッ
ト、マウス、モルモットなどが用いられるが、マウスが
特に好ましく用いられる。接種方法としては通常実施さ
れる方法に従えばよく、例えばｓＩＣＡＭ−１投与の場
合、マウスに１回０．１〜３０μｇ、好ましくは０．３
〜５μｇ、ＩＣＡＭ−１発現細胞の場合、マウスに１回
１０５〜１０７細胞数を、等容量の生理食塩水及びフロ
イントの完全アジュバントで乳化して、背部、腹部の皮
下あるいは腹腔内に２〜３週毎に３〜６回接種する方法
が採られる。
ＣＡＭ−１発現細胞は通常の遺伝子工学的手法〔Ｔ．Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．：“モレキュラー クロ
ーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）”，
コールド スプリング ハーバー ラボラトリ（Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）刊（米国）、高木康敬編著：”遺伝子操作実験
法”，講談社刊〕を用いて作製される。また、インター
ロイキン−１β（ＩＬ−１β）や腫瘍壊死因子α（ＴＮ
Ｆα）で活性化されたヒトさい帯血管内皮細胞 （ＨＵ
ＶＥＣ：ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｎｏｕｓ
ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、あるいは各
種ＩＣＡＭ−１高発現腫瘍細胞株〔Ｂリンパ腫細胞（Ｒ
ａｊｉ，Ｄａｕｄｉ等）、Ｂリンパ芽球（ＩＭ９，ＣＣ
ＲＦ−ＳＢ等）、ＥＢウイルス感染リンパ球（ＴＡＰＣ
−３０１，ＣＥＳＳ等）、Ｔ白血病細胞（ＣＥＭ）〕も
ＩＣＡＭ−１発現細胞として、さらにそれらの細胞
（膜）抽出物をＩＣＡＭ−１粗製液として用いることも
できる。本発明で用いられる抗ＩＣＡＭ−１モノクロー
ナル抗体（ＭｏＡｂ）は公知の遺伝子工学的手法によっ
ても作成できるが、通常、ハイブリドーマ法によって作
成される。該抗体産生ハイブリドーマの作製は常法に従
って実施される。すなわち、上述のようにして得られた
ｓＩＣＡＭ−１あるいはＩＣＡＭ−１発現細胞を動物に
免疫し抗体産生細胞を得る。次に免疫動物より採取した
これらの抗体産生細胞、例えば脾臓細胞やリンパ節細胞
などを骨髄腫細胞（例．マウスの場合、ＮＳ−１，Ｐ３
Ｕ１，Ｓｐ２／０）と融合し、得られるハイブリドーマ
の中からｓＩＣＡＭ−１に特異的に結合し、ＩＣＡＭ−
１発現細胞に結合可能な抗体を産生する細胞をスクリー
ニングする。免疫動物としては、例えばウサギ、ラッ
ト、マウス、モルモットなどが用いられるが、マウスが
特に好ましく用いられる。接種方法としては通常実施さ
れる方法に従えばよく、例えばｓＩＣＡＭ−１投与の場
合、マウスに１回０．１〜３０μｇ、好ましくは０．３
〜５μｇ、ＩＣＡＭ−１発現細胞の場合、マウスに１回
１０５〜１０７細胞数を、等容量の生理食塩水及びフロ
イントの完全アジュバントで乳化して、背部、腹部の皮
下あるいは腹腔内に２〜３週毎に３〜６回接種する方法
が採られる。
【０００７】これらの免疫動物、例えばマウスから抗体
価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓及び／
あるいはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生
細胞を骨髄腫細胞と融合させる。融合操作は既知の方法
に従って実施できるが、融合促進剤としてはポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げ
られ、好ましくはＰＥＧが繁用される。骨髄腫細胞とし
てはＮＳ−１，Ｐ３Ｕ１，Ｓｐ２／０など、特にＰ３Ｕ
１が好ましく用いられる。脾臓細胞と骨髄腫細胞との好
ましい比率は１：１〜１０：１で、これに分子量１００
０〜９０００のＰＥＧが１０〜８０％の濃度で添加さ
れ、２０〜３７℃、好ましくは３０〜３７℃で３〜１０
分間インキュベートするのが良い。抗ＩＣＡＭ−１ Ｍ
ｏＡｂ産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の
方法が使用できる。例えば、マイクロプレート上にｓＩ
ＣＡＭ−１あるいはＩＣＡＭ−１発現細胞を固定化し、
抗原感作プレートを作成する。次いでハイブリドーマ培
養上清をこの抗原感作プレートに添加し、プレート上に
結合した抗ＩＣＡＭ−１抗体を検出する、酵素免疫測定
法（ＥＬＩＳＡ）により培養上清中の抗体価を測定す
る。ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン）添加培地で選別、育種された抗体活性陽性のハイブ
リドーマは直ちにクローニングに供されるが、通常この
クローニング操作は限界希釈法などで容易に実施され
る。クローン化されたハイブリドーマの培養上清を上記
のＥＬＩＳＡに供し、ｓＩＣＡＭ−１感作プレートある
いはＩＣＡＭ−１発現細胞固定化プレートで陽性、ＩＣ
ＡＭ−１非発現細胞固定化プレートで陰性となる抗体産
生ハイブリドーマを選別し、目的とするモノクローナル
な抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマを取得
することができる。以上のような製造法に従って作成し
た抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマの例と
して、後述の実施例３に示したハイブリドーマＳＭ−
１，ＷＩＳ２−１１，ＷＩＳ４−４７，ＷＩＳ５−８５
及びＷＩＳ５−２５４が挙げられる。
価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓及び／
あるいはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生
細胞を骨髄腫細胞と融合させる。融合操作は既知の方法
に従って実施できるが、融合促進剤としてはポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げ
られ、好ましくはＰＥＧが繁用される。骨髄腫細胞とし
てはＮＳ−１，Ｐ３Ｕ１，Ｓｐ２／０など、特にＰ３Ｕ
１が好ましく用いられる。脾臓細胞と骨髄腫細胞との好
ましい比率は１：１〜１０：１で、これに分子量１００
０〜９０００のＰＥＧが１０〜８０％の濃度で添加さ
れ、２０〜３７℃、好ましくは３０〜３７℃で３〜１０
分間インキュベートするのが良い。抗ＩＣＡＭ−１ Ｍ
ｏＡｂ産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の
方法が使用できる。例えば、マイクロプレート上にｓＩ
ＣＡＭ−１あるいはＩＣＡＭ−１発現細胞を固定化し、
抗原感作プレートを作成する。次いでハイブリドーマ培
養上清をこの抗原感作プレートに添加し、プレート上に
結合した抗ＩＣＡＭ−１抗体を検出する、酵素免疫測定
法（ＥＬＩＳＡ）により培養上清中の抗体価を測定す
る。ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ン）添加培地で選別、育種された抗体活性陽性のハイブ
リドーマは直ちにクローニングに供されるが、通常この
クローニング操作は限界希釈法などで容易に実施され
る。クローン化されたハイブリドーマの培養上清を上記
のＥＬＩＳＡに供し、ｓＩＣＡＭ−１感作プレートある
いはＩＣＡＭ−１発現細胞固定化プレートで陽性、ＩＣ
ＡＭ−１非発現細胞固定化プレートで陰性となる抗体産
生ハイブリドーマを選別し、目的とするモノクローナル
な抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマを取得
することができる。以上のような製造法に従って作成し
た抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマの例と
して、後述の実施例３に示したハイブリドーマＳＭ−
１，ＷＩＳ２−１１，ＷＩＳ４−４７，ＷＩＳ５−８５
及びＷＩＳ５−２５４が挙げられる。
【０００８】上記した本発明のハイブリドーマの培養は
通常、液体培地中または動物腹腔内（例えば、マウスな
ど哺乳動物を使用）で公知の方法により実施できる。培
養液及び腹水液中の抗体の精製についても公知の生化学
的手法を組み合わせて実施できる。例えば、細胞培養液
あるいは腹水液を遠心分離後、塩析（通常、硫酸ナトリ
ウムもしくは硫酸アンモニウムを使用）し、得られた蛋
白沈澱物を適当な溶液に溶解し透析する。次いでカラム
・クロマトグラフィー（イオン交換カラム、ゲル濾過カ
ラム、プロテインＡカラム、ヒドロキシアパタイト・カ
ラムなど）に供し、目的とする抗体を分離ないし精製で
きる。以上のような分離ないし精製操作により、例えば
９０％以上の純度のＭｏＡｂを、１Ｌの細胞培養上清か
らら約５〜２０ｍｇ、２０ｍｌの腹水液からは約２０〜
１００ｍｇ得られる。以上のようにして得られたＭｏＡ
ｂは蛋白質として均一であり、蛋白分解酵素処理などに
より、ＩＣＡＭ−１に対する結合能を保持したままＦ
（ａｂ’）２やＦａｂ断片などを調製でき、これらは本
発明のＭｏＡｂ全ＩｇＧ分子と同様の目的に用いられる
ものであり、本発明でいう「抗ヒト可溶性ＩＣＡＭ−１
モノクローナル抗体」に含まれる。またこれらのハイブ
リドーマがマウスＩｇＧ ＭｏＡｂを産生する場合に
は、該抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂの抗原認識部位を含む
可変領域あるいは超可変領域をコードするＤＮＡを取得
し、これに遺伝子操作技術〔Ｚ．Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．：プローディングス オブ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８５．４８５２（１
９８８）；Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．：ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，３２３（１９８
８）〕を用いてヒトＩｇＧの定常領域あるいは／及び可
変領域フレームワークをコードする遣伝子を結合させ、
マウス−ヒト・キメラ抗体あるいはヒト型化抗体を作製
することもできる。かかるＭｏＡｂの抗原に対する親和
性は、公知の方法で測定した抗原結合定数で評価するこ
とができる。例えば、固相化された抗原に標識化された
被検抗体を添加し、結合した抗体量を放射活性量として
測定する方法〔Ｍ．Ｅ．Ｆｒａｎｋｅｌ ａｎｄ Ｗ．
Ｇｅｒｈａｒｄ：モレキュラー イムノロジー（Ｍｏ
ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６，１０１（１９７
９）〕、あるいは酵素標識された抗原に遊離の被検抗体
を加え一定時間反応後、第２抗体を加えて沈殿させ、沈
殿物の酵素活性を測定する方法〔八木沢晧記：“蛋白質
・核酸・酵素−酵素免疫測定法”，別冊３１、２１９
（１９８７）〕などが挙げられる。
通常、液体培地中または動物腹腔内（例えば、マウスな
ど哺乳動物を使用）で公知の方法により実施できる。培
養液及び腹水液中の抗体の精製についても公知の生化学
的手法を組み合わせて実施できる。例えば、細胞培養液
あるいは腹水液を遠心分離後、塩析（通常、硫酸ナトリ
ウムもしくは硫酸アンモニウムを使用）し、得られた蛋
白沈澱物を適当な溶液に溶解し透析する。次いでカラム
・クロマトグラフィー（イオン交換カラム、ゲル濾過カ
ラム、プロテインＡカラム、ヒドロキシアパタイト・カ
ラムなど）に供し、目的とする抗体を分離ないし精製で
きる。以上のような分離ないし精製操作により、例えば
９０％以上の純度のＭｏＡｂを、１Ｌの細胞培養上清か
らら約５〜２０ｍｇ、２０ｍｌの腹水液からは約２０〜
１００ｍｇ得られる。以上のようにして得られたＭｏＡ
ｂは蛋白質として均一であり、蛋白分解酵素処理などに
より、ＩＣＡＭ−１に対する結合能を保持したままＦ
（ａｂ’）２やＦａｂ断片などを調製でき、これらは本
発明のＭｏＡｂ全ＩｇＧ分子と同様の目的に用いられる
ものであり、本発明でいう「抗ヒト可溶性ＩＣＡＭ−１
モノクローナル抗体」に含まれる。またこれらのハイブ
リドーマがマウスＩｇＧ ＭｏＡｂを産生する場合に
は、該抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂの抗原認識部位を含む
可変領域あるいは超可変領域をコードするＤＮＡを取得
し、これに遺伝子操作技術〔Ｚ．Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．：プローディングス オブ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８５．４８５２（１
９８８）；Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．：ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３２，３２３（１９８
８）〕を用いてヒトＩｇＧの定常領域あるいは／及び可
変領域フレームワークをコードする遣伝子を結合させ、
マウス−ヒト・キメラ抗体あるいはヒト型化抗体を作製
することもできる。かかるＭｏＡｂの抗原に対する親和
性は、公知の方法で測定した抗原結合定数で評価するこ
とができる。例えば、固相化された抗原に標識化された
被検抗体を添加し、結合した抗体量を放射活性量として
測定する方法〔Ｍ．Ｅ．Ｆｒａｎｋｅｌ ａｎｄ Ｗ．
Ｇｅｒｈａｒｄ：モレキュラー イムノロジー（Ｍｏ
ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１６，１０１（１９７
９）〕、あるいは酵素標識された抗原に遊離の被検抗体
を加え一定時間反応後、第２抗体を加えて沈殿させ、沈
殿物の酵素活性を測定する方法〔八木沢晧記：“蛋白質
・核酸・酵素−酵素免疫測定法”，別冊３１、２１９
（１９８７）〕などが挙げられる。
【０００９】上記の精製ＭｏＡｂは標識化もしくは固相
化されてから本発明の免疫測定法に用いられる。標識物
質としては、放射性物質または非放射性物質のいずれで
あってもよいが、好ましくは非放射性物質が使用され
る。該放射性物質としてはα線、β線、γ線などの放射
線を出す放射性同位元素が挙げられる。また該非放射性
物質としては、例えば酵素、（蛍光）色素、化学発光物
質などがあり、好ましくは酵素、（蛍光）色素が用いら
れる。該酵素としては西洋ワサビ・パーオキシダーゼ
（ＨＲＰ）、アルカリ・ホスファターゼ、グルコース・
オキシダーゼなどが挙げられるが、ＥＬＩＳＡにおいて
通常用いられる酵素であれば特に限定されるものではな
い。また（蛍光）色素としては、ビオチン、フルオレセ
イン、ロダミンなどが挙げられるが、特にビオチンはＨ
ＲＰ標識アビジンとの組合せにより測定感度の高感度化
が可能であるため繁用される。これら標識物質と抗体と
の結合には公知の方法が使用できるが、例えばクロラミ
ンＴ法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９４，４９５
（１９６２）〕、過ヨウ素酸法〔ジャーナル オブ ヒ
ストケミストリーアンド サイトケミストリー（Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．），２２，１０
８４（１９７４）〕、マレイミド化法〔ジャーナル オ
ブ バイオケミストリー （Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，），
７９，２３３（１９７６）〕、活性化ビオチン法〔ジャ
ーナルオブ アメリカン ケミカルソサイエティー
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），１００，３５８５
（１９７８）〕などが用いられる。
化されてから本発明の免疫測定法に用いられる。標識物
質としては、放射性物質または非放射性物質のいずれで
あってもよいが、好ましくは非放射性物質が使用され
る。該放射性物質としてはα線、β線、γ線などの放射
線を出す放射性同位元素が挙げられる。また該非放射性
物質としては、例えば酵素、（蛍光）色素、化学発光物
質などがあり、好ましくは酵素、（蛍光）色素が用いら
れる。該酵素としては西洋ワサビ・パーオキシダーゼ
（ＨＲＰ）、アルカリ・ホスファターゼ、グルコース・
オキシダーゼなどが挙げられるが、ＥＬＩＳＡにおいて
通常用いられる酵素であれば特に限定されるものではな
い。また（蛍光）色素としては、ビオチン、フルオレセ
イン、ロダミンなどが挙げられるが、特にビオチンはＨ
ＲＰ標識アビジンとの組合せにより測定感度の高感度化
が可能であるため繁用される。これら標識物質と抗体と
の結合には公知の方法が使用できるが、例えばクロラミ
ンＴ法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９４，４９５
（１９６２）〕、過ヨウ素酸法〔ジャーナル オブ ヒ
ストケミストリーアンド サイトケミストリー（Ｊ．Ｈ
ｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．），２２，１０
８４（１９７４）〕、マレイミド化法〔ジャーナル オ
ブ バイオケミストリー （Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，），
７９，２３３（１９７６）〕、活性化ビオチン法〔ジャ
ーナルオブ アメリカン ケミカルソサイエティー
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），１００，３５８５
（１９７８）〕などが用いられる。
【００１０】本発明において標識物質として用いられる
放射性物質の定量は自体公知な方法により測定される。
また非放射性物質を用いる場合、その量あるいは濃度の
定量も、使用される標識剤の種類に基づいてそれぞれ自
体公知な方法により測定される。例えば、該非放射性物
質としてＨＲＰが使用される場合には、酵素基質として
オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベ
ンジディンなどを用い、それぞれの基質に由来する反応
生成物に特徴的な最大吸収波長付近の吸光度を測定する
ことにより実施される。また該非放射性物質が蛍光色
素、例えばフルオレセインである場合、その蛍光強度を
測定することにより実施される。さらに化学発光の原理
が使用されてもよい。
放射性物質の定量は自体公知な方法により測定される。
また非放射性物質を用いる場合、その量あるいは濃度の
定量も、使用される標識剤の種類に基づいてそれぞれ自
体公知な方法により測定される。例えば、該非放射性物
質としてＨＲＰが使用される場合には、酵素基質として
オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベ
ンジディンなどを用い、それぞれの基質に由来する反応
生成物に特徴的な最大吸収波長付近の吸光度を測定する
ことにより実施される。また該非放射性物質が蛍光色
素、例えばフルオレセインである場合、その蛍光強度を
測定することにより実施される。さらに化学発光の原理
が使用されてもよい。
【００１１】本発明において用いられる担体上に保持さ
れたＭｏＡｂにおける担体としては、例えば、アガロー
スゲル〔セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂ（ファル
マシア社製）など〕、デキストランゲル〔セファデック
スＧ−７５、セファデックスＧ−２００（ファルマシア
社製）など〕、ポリアクリルアミドゲル〔バイオゲルＰ
−３０、バイオゲルＰ−１００（バイオラッド社製）な
ど〕、セルロース粒子〔アビセル（旭化成社製）、イオ
ン交換セルロースなど〕、物理的吸着剤〔ガラス球、シ
リコン片、ポリスチレン球、イムノアッセイ用マイクロ
プレート（ヌンク社製）など〕などが用いられ、好まし
くはイムノアッセイ用プレートあるいはシリコン片、ポ
リスチレン球などが挙げられる。担体にＭｏＡｂを保持
させるには、常套手段を応用しうるが、例えばブロムシ
アン法、グルタルアルデヒド法などが挙げられる〔代
謝、８，６９６（１９７１）〕。 またより簡便な方法
として、蛋白吸着能の高い担体を用いてその表面にＭｏ
Ａｂを物理的に吸着させる方法が繁用される。
れたＭｏＡｂにおける担体としては、例えば、アガロー
スゲル〔セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂ（ファル
マシア社製）など〕、デキストランゲル〔セファデック
スＧ−７５、セファデックスＧ−２００（ファルマシア
社製）など〕、ポリアクリルアミドゲル〔バイオゲルＰ
−３０、バイオゲルＰ−１００（バイオラッド社製）な
ど〕、セルロース粒子〔アビセル（旭化成社製）、イオ
ン交換セルロースなど〕、物理的吸着剤〔ガラス球、シ
リコン片、ポリスチレン球、イムノアッセイ用マイクロ
プレート（ヌンク社製）など〕などが用いられ、好まし
くはイムノアッセイ用プレートあるいはシリコン片、ポ
リスチレン球などが挙げられる。担体にＭｏＡｂを保持
させるには、常套手段を応用しうるが、例えばブロムシ
アン法、グルタルアルデヒド法などが挙げられる〔代
謝、８，６９６（１９７１）〕。 またより簡便な方法
として、蛋白吸着能の高い担体を用いてその表面にＭｏ
Ａｂを物理的に吸着させる方法が繁用される。
【００１２】以下にヒトｓＩＣＡＭ−１の非放射性物質
を利用した免疫学的測定法の操作について具体例を挙げ
て説明するが、これに限定されるものでないことはいう
までもない。マイクロプレート（９６穴）の各ウェルに
緩衝液で希釈した抗ヒトｓＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂを一
定量加え、一定時間反応させる。反応時間は低温（例え
ば冷蔵庫内）では長く（例えば１０〜４８時間）、室温
（例えば２５℃前後）では短く（１〜５時間）設定され
る。この反応時間は以下の各操作においても適用され
る。該抗体の濃度は０．１〜１００μｇ／ｍｌ、好まし
くは０．５〜３０μｇ／ｍｌである。該緩衝液のｐＨは
６〜１０が好ましく、塩濃度は０．０１〜１．０Ｍが好
ましい。緩衝液の種類としてはリン酸ナトリウム、リン
酸カリウム、重炭酸ナトリウムなどが用いられる。特に
好ましい緩衝液の一例として０．１Ｍ重炭酸ナトリウム
緩衝液 （ｐＨ９．０）が挙げられる。一定時間反応さ
せたＭｏＡｂを吸着させたのち、トゥイン（Ｔｗｅｅ
ｎ）２０（バイオラッド社製）などの界面活性剤を含む
洗浄液でプレートを洗浄する。該Ｔｗｅｅｎ２０の濃度
は０．０１〜０．５％（Ｖ／Ｖ）、好ましくは０．０５
〜０．１５％（Ｖ／Ｖ）が用いられる。洗浄終了後、ブ
ロックエース〔雪印乳業社製：０．５〜１０％（Ｖ／
Ｖ）、好ましくは１〜５％（Ｖ／Ｖ〕含有リン酸緩衝液
（ｐＨ７付近）を添加し一定時間放置し反応させる。こ
の操作は以後の各操作に使用される抗体及び抗原の非特
異的吸着を防止するために重要である。反応終了後は前
記と同様の洗浄操作を実施する。
を利用した免疫学的測定法の操作について具体例を挙げ
て説明するが、これに限定されるものでないことはいう
までもない。マイクロプレート（９６穴）の各ウェルに
緩衝液で希釈した抗ヒトｓＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂを一
定量加え、一定時間反応させる。反応時間は低温（例え
ば冷蔵庫内）では長く（例えば１０〜４８時間）、室温
（例えば２５℃前後）では短く（１〜５時間）設定され
る。この反応時間は以下の各操作においても適用され
る。該抗体の濃度は０．１〜１００μｇ／ｍｌ、好まし
くは０．５〜３０μｇ／ｍｌである。該緩衝液のｐＨは
６〜１０が好ましく、塩濃度は０．０１〜１．０Ｍが好
ましい。緩衝液の種類としてはリン酸ナトリウム、リン
酸カリウム、重炭酸ナトリウムなどが用いられる。特に
好ましい緩衝液の一例として０．１Ｍ重炭酸ナトリウム
緩衝液 （ｐＨ９．０）が挙げられる。一定時間反応さ
せたＭｏＡｂを吸着させたのち、トゥイン（Ｔｗｅｅ
ｎ）２０（バイオラッド社製）などの界面活性剤を含む
洗浄液でプレートを洗浄する。該Ｔｗｅｅｎ２０の濃度
は０．０１〜０．５％（Ｖ／Ｖ）、好ましくは０．０５
〜０．１５％（Ｖ／Ｖ）が用いられる。洗浄終了後、ブ
ロックエース〔雪印乳業社製：０．５〜１０％（Ｖ／
Ｖ）、好ましくは１〜５％（Ｖ／Ｖ〕含有リン酸緩衝液
（ｐＨ７付近）を添加し一定時間放置し反応させる。こ
の操作は以後の各操作に使用される抗体及び抗原の非特
異的吸着を防止するために重要である。反応終了後は前
記と同様の洗浄操作を実施する。
【００１３】上記のＭｏＡｂ感作プレートの各ウェルに
ブロックエース含有緩衝液もしくは抗原非含有血漿など
で希釈された試料〔ヒトｓＩＣＡＭ−１含有体液（血
清、血漿、尿など）あるいは細胞培養液など〕を一定量
添加し反応させる。該緩衝液としてはｐＨ６〜８のリン
酸ナトリウムあるいはリン酸カリウム緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）が好ましく用いられる。該試料の希釈率は、
含有されるｓＩＣＡＭ−１濃度により一義的には決定で
きないが、検量線の直線性が成立する範囲内に収まるよ
うに選択される。本操作においては、精製された物理化
学的に純品と判断されたｓＩＣＡＭ−１について、検体
試料と同じ希釈液による順次希釈系列を作成して検量線
として使用される。この第１次反応終了後、上記感作プ
レート上の抗体（固相抗体）と抗原決定基が異なる標識
化された抗ヒトｓＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂを緩衝液で希
釈したものを一定量加え一定時間反応させる。該緩衝液
には抗原非含有血漿あるいはウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）などの血漿蛋白が０．１〜１０％添加されていても
よい。
ブロックエース含有緩衝液もしくは抗原非含有血漿など
で希釈された試料〔ヒトｓＩＣＡＭ−１含有体液（血
清、血漿、尿など）あるいは細胞培養液など〕を一定量
添加し反応させる。該緩衝液としてはｐＨ６〜８のリン
酸ナトリウムあるいはリン酸カリウム緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ）が好ましく用いられる。該試料の希釈率は、
含有されるｓＩＣＡＭ−１濃度により一義的には決定で
きないが、検量線の直線性が成立する範囲内に収まるよ
うに選択される。本操作においては、精製された物理化
学的に純品と判断されたｓＩＣＡＭ−１について、検体
試料と同じ希釈液による順次希釈系列を作成して検量線
として使用される。この第１次反応終了後、上記感作プ
レート上の抗体（固相抗体）と抗原決定基が異なる標識
化された抗ヒトｓＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂを緩衝液で希
釈したものを一定量加え一定時間反応させる。該緩衝液
には抗原非含有血漿あるいはウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）などの血漿蛋白が０．１〜１０％添加されていても
よい。
【００１４】第２次反応に続いてマイクロプレートに残
存した非放射性物質量あるいは濃度が測定される。ここ
では非放射性物質がＨＲＰ及びビオチンである場合につ
いて以下に説明する。上記標識抗体としてＨＲＰ標識Ｍ
ｏＡｂを用いた場合、酵素の基質としてはＯＰＤと過酸
化水素（Ｈ２Ｏ２）の組み合わせが繁用される。酵素反
応停止剤としては１〜４Ｎ硫酸が、酵素反応生成物の量
あるいは濃度の測定には通常マイクロプレート・リーダ
ーが使用される。標識抗体としてビオチン化ＭｏＡｂを
用いた場合には、第２次反応終了後緩衝液で希釈したア
ビジン標識ＨＲＰ（市販品の場合、１：１０００〜１：
１００００希釈）を添加し更に一定時間反応させる。次
いでプレートに結合した酵素量を上記の反応で測定す
る。上記の測定法において、固相抗体として中和抗体を
選択することにより活性型ｓＩＣＡＭ−１を、非中和抗
体を選択することにより全ｓＩＣＡＭ−１をそれぞれ測
定することができる。本願発明の測定法は、坦体上に保
持された抗体および標識化された抗体としていずれも抗
原結合定数が１０８Ｍ−１以上の強い抗原結合活性を有
する抗体を選択することによりヒトｓＩＣＡＭ−１の検
出限界が５０ｐｇ／ｍｌ以下である高感度測定法であ
り、また坦体上に保持された抗体として中和抗体を選択
することにより活性型ｓＩＣＡＭ−１を、非中和抗体を
選択することにより全ｓＩＣＡＭ−１をそれぞれ測定す
ることができる。さらには、検出限界が３０ｐｇ／ｍｌ
以下の高感度測定も可能である。
存した非放射性物質量あるいは濃度が測定される。ここ
では非放射性物質がＨＲＰ及びビオチンである場合につ
いて以下に説明する。上記標識抗体としてＨＲＰ標識Ｍ
ｏＡｂを用いた場合、酵素の基質としてはＯＰＤと過酸
化水素（Ｈ２Ｏ２）の組み合わせが繁用される。酵素反
応停止剤としては１〜４Ｎ硫酸が、酵素反応生成物の量
あるいは濃度の測定には通常マイクロプレート・リーダ
ーが使用される。標識抗体としてビオチン化ＭｏＡｂを
用いた場合には、第２次反応終了後緩衝液で希釈したア
ビジン標識ＨＲＰ（市販品の場合、１：１０００〜１：
１００００希釈）を添加し更に一定時間反応させる。次
いでプレートに結合した酵素量を上記の反応で測定す
る。上記の測定法において、固相抗体として中和抗体を
選択することにより活性型ｓＩＣＡＭ−１を、非中和抗
体を選択することにより全ｓＩＣＡＭ−１をそれぞれ測
定することができる。本願発明の測定法は、坦体上に保
持された抗体および標識化された抗体としていずれも抗
原結合定数が１０８Ｍ−１以上の強い抗原結合活性を有
する抗体を選択することによりヒトｓＩＣＡＭ−１の検
出限界が５０ｐｇ／ｍｌ以下である高感度測定法であ
り、また坦体上に保持された抗体として中和抗体を選択
することにより活性型ｓＩＣＡＭ−１を、非中和抗体を
選択することにより全ｓＩＣＡＭ−１をそれぞれ測定す
ることができる。さらには、検出限界が３０ｐｇ／ｍｌ
以下の高感度測定も可能である。
【００１５】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、これらが本発明の範囲を制限するものない
ことは言うまでもない。なお、実施例で用いられている
動物細胞は、以下の表に示すように寄託されている。
説明するが、これらが本発明の範囲を制限するものない
ことは言うまでもない。なお、実施例で用いられている
動物細胞は、以下の表に示すように寄託されている。
【００１６】 実施例１ ＩＣＡＭ−１発現細胞株の作成 ＩＣＡＭ−１／ｃＤＮＡを含むベクターＢＢＧ５８〔コ
スモバイオ社販売：Ｄ．Ｌ．Ｓｉｍｍｏｎｓ，ｅｔ ａ
ｌ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３１，６２４
（１９８８）〕とｄｈｆｒ／ｃＤＮＡを含むベクターｐ
ＴＢ３４８〔Ｒ．Ｓａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．：セル
ストラクチャー アンド ファンクション（Ｃｅｌｌ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ），１２，
２０５（１９８７）〕とを１０：１の割合で混合し、通
常のリン酸カルシウム法によりＣＨＯ細胞へ遺伝子導入
した。２日後にプロリン含有選択培地（ダルベッコＭＥ
Ｍ培地：コスモバイオ社販売）に播種し、生育したコロ
ニーを９６穴マイクロプレートへ移した後ｃｅｌｌ−Ｅ
ＬＩＳＡに供しＩＣＡＭ−１高発現細胞株を選択した。
即ち各ウェルに、１次抗体として市販の抗ＩＣＡＭ−１
ＭｏＡｂ ＢＢＡ４（コスモバイオ社販売）を、２次
抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（カッペ
ル社製）を添加し、それぞれ氷冷下１時間反応させた。
細胞洗浄後、酵素基質としてＯＰＤ及びＨ２Ｏ２を含有
する０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を各ウェル
に加え、室温で酵素反応を実施した。１Ｎ硫酸で反応を
停止後、４９０ｎｍの吸光度から細胞に結合したＨＲＰ
活性量を測定した。得られたＩＣＡＭ−１高発現細胞株
ＣＩ−１７をＥＤＴＡ含有ＰＢＳで洗浄後、１次抗体と
して抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂ ＢＢＡ４を、２次抗体
としてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（コスモバ
イオ社販売）を、それぞれ室温で１時間反応させた。蛍
光染色された細胞をＦＡＣＳｔａｒ（ベクトン・ディッ
キンソン社製）に供したところ、〔図１〕及び〔図２〕
に示す結果が得られた。ＤＮＡ移入前のＣＨＯ細胞は全
く蛍光染色されないが、ＣＩ−１７細胞は抗ＩＣＡＭ−
１抗体により強く蛍光染色されＩＣＡＭ−１を細胞表面
に強く発現していることが判明した。なお１次抗体とし
てＩＣＡＭ−１非結合性の（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔな）
抗アンサマイトシンＭｏＡｂ ＡＳ６−４４（Ｋ．Ｏｋ
ａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．：ジャパン ジャーナル オ
ブ キャンサー リサーチ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．），８３，７６１（１９９２）〕を用いた時
にはＣＩ−１７細胞は全く蛍光染色されなかった。
スモバイオ社販売：Ｄ．Ｌ．Ｓｉｍｍｏｎｓ，ｅｔ ａ
ｌ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３３１，６２４
（１９８８）〕とｄｈｆｒ／ｃＤＮＡを含むベクターｐ
ＴＢ３４８〔Ｒ．Ｓａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．：セル
ストラクチャー アンド ファンクション（Ｃｅｌｌ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ＆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ），１２，
２０５（１９８７）〕とを１０：１の割合で混合し、通
常のリン酸カルシウム法によりＣＨＯ細胞へ遺伝子導入
した。２日後にプロリン含有選択培地（ダルベッコＭＥ
Ｍ培地：コスモバイオ社販売）に播種し、生育したコロ
ニーを９６穴マイクロプレートへ移した後ｃｅｌｌ−Ｅ
ＬＩＳＡに供しＩＣＡＭ−１高発現細胞株を選択した。
即ち各ウェルに、１次抗体として市販の抗ＩＣＡＭ−１
ＭｏＡｂ ＢＢＡ４（コスモバイオ社販売）を、２次
抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（カッペ
ル社製）を添加し、それぞれ氷冷下１時間反応させた。
細胞洗浄後、酵素基質としてＯＰＤ及びＨ２Ｏ２を含有
する０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を各ウェル
に加え、室温で酵素反応を実施した。１Ｎ硫酸で反応を
停止後、４９０ｎｍの吸光度から細胞に結合したＨＲＰ
活性量を測定した。得られたＩＣＡＭ−１高発現細胞株
ＣＩ−１７をＥＤＴＡ含有ＰＢＳで洗浄後、１次抗体と
して抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂ ＢＢＡ４を、２次抗体
としてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（コスモバ
イオ社販売）を、それぞれ室温で１時間反応させた。蛍
光染色された細胞をＦＡＣＳｔａｒ（ベクトン・ディッ
キンソン社製）に供したところ、〔図１〕及び〔図２〕
に示す結果が得られた。ＤＮＡ移入前のＣＨＯ細胞は全
く蛍光染色されないが、ＣＩ−１７細胞は抗ＩＣＡＭ−
１抗体により強く蛍光染色されＩＣＡＭ−１を細胞表面
に強く発現していることが判明した。なお１次抗体とし
てＩＣＡＭ−１非結合性の（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔな）
抗アンサマイトシンＭｏＡｂ ＡＳ６−４４（Ｋ．Ｏｋ
ａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．：ジャパン ジャーナル オ
ブ キャンサー リサーチ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．），８３，７６１（１９９２）〕を用いた時
にはＣＩ−１７細胞は全く蛍光染色されなかった。
【００１７】実施例２ ｓＩＣＡＭ−１の調製 ｓＩＣＡＭ−１発現ベクターの構築 ＩＣＡＭ−１細胞外領域の最も細胞膜に近い部位（４７
９Ｔｙｒ→Ｐｈｅ，４８０Ｇｌｕ→Ｓｔｏｐ ｃｏｄｏ
ｎ）に突然変異を導入する方法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃ
ｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によりｓＩＣＡＭ−
１発現ベクターを構築した（〔図３〕，〔図４〕）。ま
ずプライマー１及び２を用いるＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりＢＢＧ
５８を鋳型として、停止コドンを有する約０．１２ｋｂ
のＤＮＡ断片を作製した。この断片をＢｇｌＩＩ／Ｘｂ
ａＩを用いて分解し、ＢＢＧ５８のＢｇｌＩＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ分解により切り出した１．４ｋｂ断片と共にＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
販売）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位に挿入した（ｐ
ｓＩＣＡＭ／ＢＳ）。 プライマー １ ＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＡＴＣＴＡＧＡＡＣＣＧＧＧＧ
ＧＧＡＧＡ（配列番号：１） プライマー ２ ＧＴＣＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＧＧＧＣＡ（配列
番号：２） 次にｐｓＩＣＡＭ／ＢＳの１．５ｋｂ ＸｂａＩ断片を
切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化し
たのち、ｐＴＢ１４１７〔ヨーロッパ公開第４９１３５
１号公報 参照〕のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入しＳＲα’
プロモーターとｐｏｌｙＡ付加シグナルを有するｐｓＩ
ＣＡＭ／１４を作製した。得られたｐｓＩＣＡＭ／１４
から２．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ断片を切り
出し、薬剤耐性遺伝子ｄｈｆｒを有するｐＴＢ３４８の
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ部位に挿入してｓＩＣＡＭ−
１発現ベクターｐｓＩＣＡＭｄを構築した。 ｓＩＣＡＭ−１分泌細胞株の作製 ｐｓＩＣＡＭｄベクターを通常のリン酸カルシウム法に
よりＣＨＯ細胞に導入した。０．１μＭ ＭＴＸにより
形質転換細胞株を選択し、生育したクローンの培養上清
を市販のｓＩＣＡＭ−１／ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｎｄ
ｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社製）に供した。陽性クロ
ーン約１２０種を更に高濃度のＭＴＸで選択し、限界希
釈法によるクローニングにより１０μＭ ＭＴＸ耐性の
高発現細胞株ＳＩＣ３ａを採取した。 ｓＩＣＡＭ−１の同定 培養上清中のｓＩＣＡＭ−１を非還元条件下でＳＤＳ−
ＰＡＧＥに供し、ウェスタン・ブロット法により検出し
た。約８０ｋｄの位置に単一のバンドが見られ、文献値
〔Ｄ．Ｅ．Ｓｔａｕｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，セル（Ｃ
ｅｌｌ），６１，２４３，（１９８９）〕と一致した。
また、ｓＩＣＡＭ−１発現量は播種細胞数１．０×１０
５個当り３日間培養で約５μｇであった。 ｓＩＣＡＭ−１の精製 上記で得られたＳＩＣ３ａ細胞株の培養上に、最終濃
度０．７Ｍとなるように（ＮＨ４）２ＳＯ４を添加し塩
析した。次いで０．７Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４／２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化されたブチル
トヨパール・カラムを用いた０．７Ｍ→ＯＭ（ＮＨ４）
２ＳＯ４の塩濃度勾配によりｓＩＣＡＭ−１を溶出し精
製した。
９Ｔｙｒ→Ｐｈｅ，４８０Ｇｌｕ→Ｓｔｏｐ ｃｏｄｏ
ｎ）に突然変異を導入する方法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃ
ｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によりｓＩＣＡＭ−
１発現ベクターを構築した（〔図３〕，〔図４〕）。ま
ずプライマー１及び２を用いるＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）法によりＢＢＧ
５８を鋳型として、停止コドンを有する約０．１２ｋｂ
のＤＮＡ断片を作製した。この断片をＢｇｌＩＩ／Ｘｂ
ａＩを用いて分解し、ＢＢＧ５８のＢｇｌＩＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ分解により切り出した１．４ｋｂ断片と共にＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
販売）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位に挿入した（ｐ
ｓＩＣＡＭ／ＢＳ）。 プライマー １ ＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＡＡＴＣＴＡＧＡＡＣＣＧＧＧＧ
ＧＧＡＧＡ（配列番号：１） プライマー ２ ＧＴＣＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＴＧＡＧＧＧＣＡ（配列
番号：２） 次にｐｓＩＣＡＭ／ＢＳの１．５ｋｂ ＸｂａＩ断片を
切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化し
たのち、ｐＴＢ１４１７〔ヨーロッパ公開第４９１３５
１号公報 参照〕のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入しＳＲα’
プロモーターとｐｏｌｙＡ付加シグナルを有するｐｓＩ
ＣＡＭ／１４を作製した。得られたｐｓＩＣＡＭ／１４
から２．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ断片を切り
出し、薬剤耐性遺伝子ｄｈｆｒを有するｐＴＢ３４８の
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ部位に挿入してｓＩＣＡＭ−
１発現ベクターｐｓＩＣＡＭｄを構築した。 ｓＩＣＡＭ−１分泌細胞株の作製 ｐｓＩＣＡＭｄベクターを通常のリン酸カルシウム法に
よりＣＨＯ細胞に導入した。０．１μＭ ＭＴＸにより
形質転換細胞株を選択し、生育したクローンの培養上清
を市販のｓＩＣＡＭ−１／ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｎｄ
ｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ社製）に供した。陽性クロ
ーン約１２０種を更に高濃度のＭＴＸで選択し、限界希
釈法によるクローニングにより１０μＭ ＭＴＸ耐性の
高発現細胞株ＳＩＣ３ａを採取した。 ｓＩＣＡＭ−１の同定 培養上清中のｓＩＣＡＭ−１を非還元条件下でＳＤＳ−
ＰＡＧＥに供し、ウェスタン・ブロット法により検出し
た。約８０ｋｄの位置に単一のバンドが見られ、文献値
〔Ｄ．Ｅ．Ｓｔａｕｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，セル（Ｃ
ｅｌｌ），６１，２４３，（１９８９）〕と一致した。
また、ｓＩＣＡＭ−１発現量は播種細胞数１．０×１０
５個当り３日間培養で約５μｇであった。 ｓＩＣＡＭ−１の精製 上記で得られたＳＩＣ３ａ細胞株の培養上に、最終濃
度０．７Ｍとなるように（ＮＨ４）２ＳＯ４を添加し塩
析した。次いで０．７Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４／２０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化されたブチル
トヨパール・カラムを用いた０．７Ｍ→ＯＭ（ＮＨ４）
２ＳＯ４の塩濃度勾配によりｓＩＣＡＭ−１を溶出し精
製した。
【００１８】実施例３ マウス抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡ
ｂ産生ハイブリドーマの作成 免疫 実施例２−で調製したｓＩＣＡＭ−１５μｇ／ｍｌ生
理食塩水溶液に等量のフロイント不完全アジュバントを
添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、０．４μ
ｇ／０．６１／マウス）に背部皮下投与し、３週間隔で
追加免疫した。４回目の追加免疫１０日後に、実施例１
記載のＩＣＡＭ−１高発現細胞株ＣＩ−１７を用いるｃ
ｅｌｌ−ＥＬＩＳＡに供し、最大の血清抗体価を示した
個体について、さらにｓＩＣＡＭ−１溶液（５μｇ／
０．１ｍｌ生理食塩水／マウス）を静脈内投与した。 細胞融合 最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常法
により調製した（約１０８個）。次いでマウス骨髄腫細
胞Ｐ３Ｕ１２×１０７個を添加し、ＰＥＧ６０００を用
いて融合した〔ケーラーとミルスタイン：ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ），２５６，４９５（１９７５）〕。融
合終了後、細胞混液をヒポキサンチン、アミノプテリン
及びチミジンを含む、いわゆるＨＡＴ培地中に懸濁し１
０日間培養した。以後は親細胞株の選択除去が終了次
第、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地に
代え培養を続けた。 ハイブリドーマの選択及びクローニング 融合１０〜２０日後にハイブリドーマの出現を認めたの
で、ＣＩ−１７細胞結合マイクロプレート及びＴＮＦα
活性化ＨＵＶＥＣを用いるｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡにより
ハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定した。特に強い
抗体活性を示したハイブリドーマについては、限界希釈
法によるクローニングに供した。得られた結果は表１に
示した通りであった。ＣＩ−１７細胞及び活性化ＨＵＶ
ＥＣに対して強い結合能を示した５種の抗ＩＣＡＭ−１
ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマＳＭ−１、ＷＩＳ２−１
１、ＷＩＳ４−４７、ＷＩＳ５−８５及びＷＩＳ５−２
５４を得た。これらの免疫グロブリン・クラス及びサブ
クラスはオクタロニー法による測定で、それぞれＩｇＧ
２ａ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１及びＩｇＧ１で、
軽鎖は全てκ鎖であった。 モノクローナル抗体の精製 予め０．５ｍｌ鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウ
スに、上記で取得した５種の抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡ
ｂ産生ハイブリドーマの５×１０６個を腹腔内投与し
た。約１０〜１５日後に腹水の貯溜が見られたので、こ
れを採取しプロテインＡカラムを用いるアフィニティク
ロマトグラフィーにより常法通り精製した。 モノクローナル抗体の結合定数 公知の方法（Ｔ．Ｋｕｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．：ス
ロンボーシス アンヘモスターシス（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈ
ａｅｍｏｓｔａｓ．），６６、６８４（（１９９１）〕
に従いモノクローナル抗体の結合定数を測定した。すな
わち、上記で得られた精製抗体を常法に従いＮａＩ
１２５を用いてヨード標識化した。次いで実施例２−
で取得した精製ｓＩＣＡＭ−１（２μｇ／ｍｌ）を添加
し、固相化した９６穴マイクロプレートに、種々の濃度
の１２５Ｉ−Ｍｏａｂ溶液を（０．１ｎＭ〜０．１Ｍ：
０．１％ＢＳＡ及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ ８０ 含有
ＰＢＳに溶解）を添加し、３７℃で９０分間インキュベ
ートした。１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ ８０
含有ＰＢＳで３回洗浄後、プレートの各ウェルに吸着し
た放射活性をγ−カウンターを用いて測定し結合型の抗
体量を算定した。結果は〔表１〕に示した通り、いずれ
の抗体も１０８Ｍ−１以上の結合定数を示した。
ｂ産生ハイブリドーマの作成 免疫 実施例２−で調製したｓＩＣＡＭ−１５μｇ／ｍｌ生
理食塩水溶液に等量のフロイント不完全アジュバントを
添加し十分乳濁後、ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、０．４μ
ｇ／０．６１／マウス）に背部皮下投与し、３週間隔で
追加免疫した。４回目の追加免疫１０日後に、実施例１
記載のＩＣＡＭ−１高発現細胞株ＣＩ−１７を用いるｃ
ｅｌｌ−ＥＬＩＳＡに供し、最大の血清抗体価を示した
個体について、さらにｓＩＣＡＭ−１溶液（５μｇ／
０．１ｍｌ生理食塩水／マウス）を静脈内投与した。 細胞融合 最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾臓細胞懸濁液を常法
により調製した（約１０８個）。次いでマウス骨髄腫細
胞Ｐ３Ｕ１２×１０７個を添加し、ＰＥＧ６０００を用
いて融合した〔ケーラーとミルスタイン：ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ），２５６，４９５（１９７５）〕。融
合終了後、細胞混液をヒポキサンチン、アミノプテリン
及びチミジンを含む、いわゆるＨＡＴ培地中に懸濁し１
０日間培養した。以後は親細胞株の選択除去が終了次
第、ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたＨＴ培地に
代え培養を続けた。 ハイブリドーマの選択及びクローニング 融合１０〜２０日後にハイブリドーマの出現を認めたの
で、ＣＩ−１７細胞結合マイクロプレート及びＴＮＦα
活性化ＨＵＶＥＣを用いるｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡにより
ハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定した。特に強い
抗体活性を示したハイブリドーマについては、限界希釈
法によるクローニングに供した。得られた結果は表１に
示した通りであった。ＣＩ−１７細胞及び活性化ＨＵＶ
ＥＣに対して強い結合能を示した５種の抗ＩＣＡＭ−１
ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマＳＭ−１、ＷＩＳ２−１
１、ＷＩＳ４−４７、ＷＩＳ５−８５及びＷＩＳ５−２
５４を得た。これらの免疫グロブリン・クラス及びサブ
クラスはオクタロニー法による測定で、それぞれＩｇＧ
２ａ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１、ＩｇＧ１及びＩｇＧ１で、
軽鎖は全てκ鎖であった。 モノクローナル抗体の精製 予め０．５ｍｌ鉱油を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウ
スに、上記で取得した５種の抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡ
ｂ産生ハイブリドーマの５×１０６個を腹腔内投与し
た。約１０〜１５日後に腹水の貯溜が見られたので、こ
れを採取しプロテインＡカラムを用いるアフィニティク
ロマトグラフィーにより常法通り精製した。 モノクローナル抗体の結合定数 公知の方法（Ｔ．Ｋｕｒｏｋａｗａ ｅｔ ａｌ．：ス
ロンボーシス アンヘモスターシス（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈ
ａｅｍｏｓｔａｓ．），６６、６８４（（１９９１）〕
に従いモノクローナル抗体の結合定数を測定した。すな
わち、上記で得られた精製抗体を常法に従いＮａＩ
１２５を用いてヨード標識化した。次いで実施例２−
で取得した精製ｓＩＣＡＭ−１（２μｇ／ｍｌ）を添加
し、固相化した９６穴マイクロプレートに、種々の濃度
の１２５Ｉ−Ｍｏａｂ溶液を（０．１ｎＭ〜０．１Ｍ：
０．１％ＢＳＡ及び０．０２％Ｔｗｅｅｎ ８０ 含有
ＰＢＳに溶解）を添加し、３７℃で９０分間インキュベ
ートした。１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ ８０
含有ＰＢＳで３回洗浄後、プレートの各ウェルに吸着し
た放射活性をγ−カウンターを用いて測定し結合型の抗
体量を算定した。結果は〔表１〕に示した通り、いずれ
の抗体も１０８Ｍ−１以上の結合定数を示した。
【００１９】実施例４ 細胞凝集阻止能試験 ヒトＢ細胞由来Ｒａｊｉ細胞１×１０５／ウェル抗ＩＣ
ＡＭ−１ ＭｏＡｂ含有培養上清を添加し１５分間反応
させた。次いで５０ｎｇ／ｍｌホルボール・エステル
（ＰＭＡ：ｐｈｏｒｂｏ １ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａ
ｃｅｔａｔｅ）を加え３０分後に細胞凝集像を観察し
た。結果は〔表１〕に示した通りで、ＳＭ−１およびＷ
ＩＳ２−１１は凝集阻止能を示さなかったが、ＷＩＳ４
−４７、ＷＩＳ５−８５およびＷＩＳ５−２５４はいず
れも強い凝集阻止能を示した。
ＡＭ−１ ＭｏＡｂ含有培養上清を添加し１５分間反応
させた。次いで５０ｎｇ／ｍｌホルボール・エステル
（ＰＭＡ：ｐｈｏｒｂｏ １ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａ
ｃｅｔａｔｅ）を加え３０分後に細胞凝集像を観察し
た。結果は〔表１〕に示した通りで、ＳＭ−１およびＷ
ＩＳ２−１１は凝集阻止能を示さなかったが、ＷＩＳ４
−４７、ＷＩＳ５−８５およびＷＩＳ５−２５４はいず
れも強い凝集阻止能を示した。
【００２０】実施例５ 細胞接着阻害活性試験 ９６穴マイクロプレートに実施例２−で取得した精製
ｓＩＣＡＭ−１（０．６μｇ／ｍｌ）を添加し固相化し
た。２％ブロックエース含有ハンクス平衡生理食塩水
（ＨＢＳＳ）でブロッキングしたのち、抗ＩＣＡＭ−１
モノクローナル抗体含有培養上清を添加し１５分間反応
させた。一方、Ｒａｊｉ細胞を１０μＭＢＣＥＣＦ−Ａ
Ｍ〔２’，７’−ｂｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）
ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｔｅｔｒａａ
ｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ：同仁化学製〕
で１時間蛍光標識し、ＰＭＡ５０ｎｇ／ｍｌで１５分間
活性化後、上記のｓＩＣＡＭ−１固相化プレート添加し
た。３７℃で３０分間インキュベート後、ＨＢＳＳで洗
浄し、次いで０．１％トリトンＸ−１００を添加してプ
レートに接着したＲａｊｉ細胞を溶解し、溶出した蛍光
色素量を励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍで測
定した。結果は〔表１〕に示した通りで、ＳＭ−１及び
ＷＩＳ２−１１は細胞接着阻害活性を全く示さなかった
が、ＷＩＳ４−４７、ＷＩＳ５−８５及びＷＩＳ５−２
５４はほぼ完全にＲａｊｉ細胞の接着を阻害した。
ｓＩＣＡＭ−１（０．６μｇ／ｍｌ）を添加し固相化し
た。２％ブロックエース含有ハンクス平衡生理食塩水
（ＨＢＳＳ）でブロッキングしたのち、抗ＩＣＡＭ−１
モノクローナル抗体含有培養上清を添加し１５分間反応
させた。一方、Ｒａｊｉ細胞を１０μＭＢＣＥＣＦ−Ａ
Ｍ〔２’，７’−ｂｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）
ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｔｅｔｒａａ
ｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ：同仁化学製〕
で１時間蛍光標識し、ＰＭＡ５０ｎｇ／ｍｌで１５分間
活性化後、上記のｓＩＣＡＭ−１固相化プレート添加し
た。３７℃で３０分間インキュベート後、ＨＢＳＳで洗
浄し、次いで０．１％トリトンＸ−１００を添加してプ
レートに接着したＲａｊｉ細胞を溶解し、溶出した蛍光
色素量を励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍで測
定した。結果は〔表１〕に示した通りで、ＳＭ−１及び
ＷＩＳ２−１１は細胞接着阻害活性を全く示さなかった
が、ＷＩＳ４−４７、ＷＩＳ５−８５及びＷＩＳ５−２
５４はほぼ完全にＲａｊｉ細胞の接着を阻害した。
【００２１】
【表１】
【００２２】 実施例６ 全免疫反応性ｓＩＣＡＭ−１の定量 実施例３−で精製した中和活性を有さない抗ＩＣＡＭ
−１ ＭｏＡｂ ＷＩＳ２−１１を、２μｇ／０．１ｍ
ｌ／ウェルの濃度でマイクロプレートに固相化し、次い
で被検ヒト血漿あるいはｓＩＣＡＭ−１分泌細胞の培養
上清を添加し２時間反応させた。０．０５％ＴＷｅｅｎ
２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗ）でプレートを洗浄後、
常法によりＮ−ヒドロキシスクシミドビオチンで標識し
た抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂ ＳＭ−１の２０ｎｇ／
０．１ｍｌ／ウェルを加えて室温で２時間反応させ、さ
らにＰＢＳ−Ｔｗで洗浄しＨＲＰ標識ストレプトアビジ
ン（コスモバイオ社販売）３０００倍希釈液を添加し
た。室温で１時間反応後ＰＢＳ−ＴＷでプレートを十分
に洗浄し、次いで実施例１に記載の方法でプレートに結
合したＨＲＰ活性を測定した。得られたｓＩＣＡＭ−１
の標準曲線は〔図５〕に示した通りで、最小検出感度は
１〜２ｐｇ／ウェル（１０〜２０ｐｇ／ｍｌ）であっ
た。また各種ヒト血漿及び細胞培養液について得られた
ｓＩＣＡＭ−１濃度を全免疫反応性ヒトｓＩＣＡＭ−１
濃度として〔表２〕に記載した。
−１ ＭｏＡｂ ＷＩＳ２−１１を、２μｇ／０．１ｍ
ｌ／ウェルの濃度でマイクロプレートに固相化し、次い
で被検ヒト血漿あるいはｓＩＣＡＭ−１分泌細胞の培養
上清を添加し２時間反応させた。０．０５％ＴＷｅｅｎ
２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗ）でプレートを洗浄後、
常法によりＮ−ヒドロキシスクシミドビオチンで標識し
た抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂ ＳＭ−１の２０ｎｇ／
０．１ｍｌ／ウェルを加えて室温で２時間反応させ、さ
らにＰＢＳ−Ｔｗで洗浄しＨＲＰ標識ストレプトアビジ
ン（コスモバイオ社販売）３０００倍希釈液を添加し
た。室温で１時間反応後ＰＢＳ−ＴＷでプレートを十分
に洗浄し、次いで実施例１に記載の方法でプレートに結
合したＨＲＰ活性を測定した。得られたｓＩＣＡＭ−１
の標準曲線は〔図５〕に示した通りで、最小検出感度は
１〜２ｐｇ／ウェル（１０〜２０ｐｇ／ｍｌ）であっ
た。また各種ヒト血漿及び細胞培養液について得られた
ｓＩＣＡＭ−１濃度を全免疫反応性ヒトｓＩＣＡＭ−１
濃度として〔表２〕に記載した。
【００２３】 実施例７ 活性型免疫反応性ｓＩＣＡＭ−１の定量 実施例６で使用した抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂ ＷＩＳ
２−１１の代わりに中和抗体ＷＩＳ５−８５をマイクロ
プレートに固相化しＥＬＩＳＡに供した。以下、実施例
６と同じ要領でＥＬＩＳＡを実施した。得られたｓＩＣ
ＡＭ−１の標準曲線は〔図６〕に示した通りで、最小検
出感度は２〜４ｐｇ／ウェルであった。また各種ヒト血
漿及び細胞培養液について得られたｓＩＣＡＭ−１濃度
を活性型免疫反応性ヒトｓＩＣＡＭ−１濃度として〔表
２〕に記載した。ヒト血漿では活性型免疫反応性ｓＩＣ
ＡＭ−１濃度は全免疫反応性ｓＩＣＡＭ−１濃度の６．
１〜１０．１％であった。
２−１１の代わりに中和抗体ＷＩＳ５−８５をマイクロ
プレートに固相化しＥＬＩＳＡに供した。以下、実施例
６と同じ要領でＥＬＩＳＡを実施した。得られたｓＩＣ
ＡＭ−１の標準曲線は〔図６〕に示した通りで、最小検
出感度は２〜４ｐｇ／ウェルであった。また各種ヒト血
漿及び細胞培養液について得られたｓＩＣＡＭ−１濃度
を活性型免疫反応性ヒトｓＩＣＡＭ−１濃度として〔表
２〕に記載した。ヒト血漿では活性型免疫反応性ｓＩＣ
ＡＭ−１濃度は全免疫反応性ｓＩＣＡＭ−１濃度の６．
１〜１０．１％であった。
【００２４】
【表２】
【００２５】実施例８ 全ｓＩＣＡＭ−１及び活性型ｓ
ＩＣＡＭ−１の分別定量 ＨＲＰ標識Ｆａｂ’の作製 実施例３−で精製した非中和抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡ
ｂ ＳＭ−１を常法に従いペプシン分解しＦ（ａｂ’）
２画分を取得したのち〔Ｙ．Ｈａｍａｇｕｃｈｉｅｔ
ａｌ．：ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．），８５，１２８９（１９７９）〕、
１０ｍＭ２−メルカプトエチルアミン溶液（ｐＨ６．
０）中３７℃で９０分間還元しＦａｂ’画分を作製した
〔Ｓ．Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．：ジャーナル
オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１
０，８１（１９７９）〕。次ぎにＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミドに溶解したＮ−スクシニミジル４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト（ピアース社販売）の１００倍モル溶液をＨＲＰ２ｍ
ｇ／０．３ｍｌ溶液（ｐＨ７．０）に添加し３０℃で６
０分間反応させた〔Ｅ．Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａ
ｌ．：アナルス オブ ザ ニューヨーク アカデミー
オブ サイエンス（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．），４２０，７４（１９８３））。０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いるセファデック
スＧ−２５カラム・クロマトグラフィーで過剰の結合試
薬を除去しマレイミド化ＨＲＰを作成した。Ｆａｂ’画
分溶液２ｍｇ／０．４ｍｌ（ｐＨ６．０）に上記のマレ
イミド化ＨＲＰ溶液１．８ｍｇ／０．４５ｍｌを添加し
４℃で２０時間反応させたのち、ウルトロゲルＡｃＡ４
４カラム（ＬＫＢ社製）を用いてＨＲＰ標識抗ＩＣＡＭ
−１ＭｏＡｂ ＳＭ−１を精製した。 ＥＬＩＳＡ操作法 実施例６及び７でそれぞれ作成した抗ＩＣＡＭ−１ Ｍ
ｏＡｂ ＷＩＳ２−１１感作マイクロプレート及びＷＩ
Ｓ５−８５感作マイクロプレートに被検ヒト血漿を添加
し室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗでプレートを
洗浄後、上記で調製したＨＲＰ標識抗ＩＣＡＭ−１
ＭｏＡｂ ＳＭ−１ ３０ｎｇ／０．１ｍｌ／ウェルを
加えて２時間反応させ、更にＰＢＳ−Ｔｗで洗浄した。
次いで実施例１に記載の方法でプレートに結合したＨＲ
Ｐ活性を測定した。得られたｓＩＣＡＭ−１の標準曲線
は〔図６〕に示した通りで、最小検出感度は５ｐｇ／ウ
ェル（５０ｐｇ／ｍｌ）以下であった。各種ヒト血漿に
ついて得られた全免疫反応性ｓＩＣＡＭ−１濃度及び活
性型免疫反応性ｓＩＣＡＭ−１濃度はそれぞれ〔表３〕
に記載したとおりであった。
ＩＣＡＭ−１の分別定量 ＨＲＰ標識Ｆａｂ’の作製 実施例３−で精製した非中和抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡ
ｂ ＳＭ−１を常法に従いペプシン分解しＦ（ａｂ’）
２画分を取得したのち〔Ｙ．Ｈａｍａｇｕｃｈｉｅｔ
ａｌ．：ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．），８５，１２８９（１９７９）〕、
１０ｍＭ２−メルカプトエチルアミン溶液（ｐＨ６．
０）中３７℃で９０分間還元しＦａｂ’画分を作製した
〔Ｓ．Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．：ジャーナル
オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），１
０，８１（１９７９）〕。次ぎにＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミドに溶解したＮ−スクシニミジル４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト（ピアース社販売）の１００倍モル溶液をＨＲＰ２ｍ
ｇ／０．３ｍｌ溶液（ｐＨ７．０）に添加し３０℃で６
０分間反応させた〔Ｅ．Ｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａ
ｌ．：アナルス オブ ザ ニューヨーク アカデミー
オブ サイエンス（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．），４２０，７４（１９８３））。０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いるセファデック
スＧ−２５カラム・クロマトグラフィーで過剰の結合試
薬を除去しマレイミド化ＨＲＰを作成した。Ｆａｂ’画
分溶液２ｍｇ／０．４ｍｌ（ｐＨ６．０）に上記のマレ
イミド化ＨＲＰ溶液１．８ｍｇ／０．４５ｍｌを添加し
４℃で２０時間反応させたのち、ウルトロゲルＡｃＡ４
４カラム（ＬＫＢ社製）を用いてＨＲＰ標識抗ＩＣＡＭ
−１ＭｏＡｂ ＳＭ−１を精製した。 ＥＬＩＳＡ操作法 実施例６及び７でそれぞれ作成した抗ＩＣＡＭ−１ Ｍ
ｏＡｂ ＷＩＳ２−１１感作マイクロプレート及びＷＩ
Ｓ５−８５感作マイクロプレートに被検ヒト血漿を添加
し室温で２時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗでプレートを
洗浄後、上記で調製したＨＲＰ標識抗ＩＣＡＭ−１
ＭｏＡｂ ＳＭ−１ ３０ｎｇ／０．１ｍｌ／ウェルを
加えて２時間反応させ、更にＰＢＳ−Ｔｗで洗浄した。
次いで実施例１に記載の方法でプレートに結合したＨＲ
Ｐ活性を測定した。得られたｓＩＣＡＭ−１の標準曲線
は〔図６〕に示した通りで、最小検出感度は５ｐｇ／ウ
ェル（５０ｐｇ／ｍｌ）以下であった。各種ヒト血漿に
ついて得られた全免疫反応性ｓＩＣＡＭ−１濃度及び活
性型免疫反応性ｓＩＣＡＭ−１濃度はそれぞれ〔表３〕
に記載したとおりであった。
【００２６】
【表３】
【００２７】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１ 配列の長さ（ＳＥＱＮＣＥ ＬＥＮＧＴＨ）：３０ 配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ） 鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：１本鎖（Ｓｉｎ
ｇｌｅ） トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａ
ｒ） 配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ ＴＹＰＥ）：他の核酸
（ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）配列： ＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣ ＡＡＴＣＴＡＧＡＡＣ ＣＧＧＧＧＧＧＡＧＡ ３０
ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ） 鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：１本鎖（Ｓｉｎ
ｇｌｅ） トポロジー（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａ
ｒ） 配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ ＴＹＰＥ）：他の核酸
（ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）配列： ＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣ ＡＡＴＣＴＡＧＡＡＣ ＣＧＧＧＧＧＧＡＧＡ ３０
【００２８】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２ 配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＥＮＧＴＨ）：２２ 配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＴＹＰＥ）：核酸（ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ） 鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：１本鎖（ｓｉｎ
ｇｌｅ） トポロジ−（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａ
ｒ） 配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ ＴＹＰＥ）：他の核酸
（ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ） 配列： ＧＴＣＡＣＴＣＧＡＧ ＡＴＣＴＴＧＡＧＧＧ ＣＡ
ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ） 鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：１本鎖（ｓｉｎ
ｇｌｅ） トポロジ−（ＴＯＰＯＬＯＧＹ）：直鎖状（ｌｉｎｅａ
ｒ） 配列の種類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ ＴＹＰＥ）：他の核酸
（ｏｔｈｅｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ） 配列： ＧＴＣＡＣＴＣＧＡＧ ＡＴＣＴＴＧＡＧＧＧ ＣＡ
【図１】実施例１で作成したＩＣＡＭ−１遺伝子導入Ｃ
ＨＯ細胞ＣＩ−１７の蛍光抗体染色の結果を示す。実線
は抗ＩＣＡＭ−１抗体、破線は抗アンサマイトシン抗体
（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ ＭｏＡｂ）による染色を示
す。
ＨＯ細胞ＣＩ−１７の蛍光抗体染色の結果を示す。実線
は抗ＩＣＡＭ−１抗体、破線は抗アンサマイトシン抗体
（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ ＭｏＡｂ）による染色を示
す。
【図２】実施例１で作成したＩＣＡＭ−１遺伝子非導入
ＣＨＯ細胞の蛍光抗体染色の結果を示す。実線は抗ＩＣ
ＡＭ−１抗体、破線は抗アンサマイトシン抗体（ｉｒｒ
ｅｌｅｖａｎｔ ＭｏＡｂ）による染色を示す。
ＣＨＯ細胞の蛍光抗体染色の結果を示す。実線は抗ＩＣ
ＡＭ−１抗体、破線は抗アンサマイトシン抗体（ｉｒｒ
ｅｌｅｖａｎｔ ＭｏＡｂ）による染色を示す。
【図３】実施例２−で構築したヒト可溶性ＩＣＡＭ−
１（ｓＩＣＡＭ−１）発現用ベクター（ｐｓＩＣＡＭ
ｄ）の構造を示す。更に、斜線部分はｓＩＣＡＭ−１遺
伝子エクソン部を示す。
１（ｓＩＣＡＭ−１）発現用ベクター（ｐｓＩＣＡＭ
ｄ）の構造を示す。更に、斜線部分はｓＩＣＡＭ−１遺
伝子エクソン部を示す。
【図４】実施例２−で構築したヒト可溶性ＩＣＡＭ−
１（ｓＩＣＡＭ−１）発現用ベクター（ｐｓＩＣＡＭ
ｄ）の構造を示す。更に、斜線部分はｓＩＣＡＭ−１遺
伝子エクソン部を示す。
１（ｓＩＣＡＭ−１）発現用ベクター（ｐｓＩＣＡＭ
ｄ）の構造を示す。更に、斜線部分はｓＩＣＡＭ−１遺
伝子エクソン部を示す。
【図５】実施例２−で精製されたｓＩＣＡＭ−１を用
いて、実施例６（○）及び実施例７（●）記載のＥＬＩ
ＳＡで得られた標準曲線を示す。
いて、実施例６（○）及び実施例７（●）記載のＥＬＩ
ＳＡで得られた標準曲線を示す。
【図６】固相抗体として抗ＩＣＡＭ−１ ＭｏＡｂ Ｗ
ＩＳ２−１１（○）あるいはＷＩＳ５−８５（●）を用
いる実施例８−記載のＥＬＩＳＡで得られた、実施例
２−で精製されたｓＩＣＡＭ−１に対する標準曲線を
示す。
ＩＳ２−１１（○）あるいはＷＩＳ５−８５（●）を用
いる実施例８−記載のＥＬＩＳＡで得られた、実施例
２−で精製されたｓＩＣＡＭ−１に対する標準曲線を
示す。
図中の符号は以下の酵素切断部位を示す。 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ Ｘｂ：ＸｂａＩ Ｘｈ：ＸｈｏＩ Ｂｇ：Ｂｇ１ＩＩ Ｐ：ＰｓｔＩ Ｎ：ＮｏｔＩ Ｓ：ＳａｌＩ Ｈｃ：ＨｉｎｃＨ Ｃ：ＣｌａＩ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (18)
- 【請求項１】担体上に保持された抗体と該抗体とは抗原
決定基が異なる標識化された抗体を用いるヒト可溶性Ｉ
ＣＡＭ−１の免疫学的測定法において、それぞれ抗原結
合定数が１０８Ｍ−１以上の抗体を用いることを特徴と
するヒト可溶性ＩＣＡＭ−１の免疫学的測定法。 - 【請求項２】検出限界が５０ｐｇ／ｍｌ以下である請求
項１記載の免疫学的測定法。 - 【請求項３】標識化された抗体がＩＣＡＭ−１の細胞接
着作用に対する非中和抗体である請求項１記載の免疫学
的測定法。 - 【請求項４】標識化された抗体がマウスモノクローナル
抗体ＳＭ−１である請求項３記載の免疫学的測定法。 - 【請求項５】担体上に保持された抗体がＩＣＡＭ−１の
細胞接着作用に対する非中和抗体であり、全ヒト可溶性
ＩＣＡＭ−１を定量可能な請求項１記載の免疫学的測定
法。 - 【請求項６】担体上に保持された抗体がマウスモノクロ
ーナル抗体ＷＩＳ２−１１である請求項５記載の免疫学
的測定法。 - 【請求項７】担体上に保持された抗体がＩＣＡＭ−１の
細胞接着作用を阻害する中和抗体であり、活性型可溶性
ＩＣＡＭ−１を定量可能な請求項１記載の免疫学的測定
法。 - 【請求項８】担体上に保持された抗体がマウスモノクロ
ーナル抗体ＷＩＳ４−４７、ＷＩＳ５−８５及びＷＩＳ
５−２５４である請求項７記載の免疫学的測定法。 - 【請求項９】標識化された抗体が非放射性物質で標識化
された抗体である請求項１記載の免疫学的測定法。 - 【請求項１０】非放射性物質がビオチンである請求項９
記載の免疫学的測定法。 - 【請求項１１】非放射性物質が酵素である請求項９記載
の免疫学的測定法。 - 【請求項１２】酵素が西洋ワサビ・パーオキシダーゼ
（ＨＲＰ）である請求項１１記載の免疫学的測定法。 - 【請求項１３】抗体がＦａｂ’抗体である請求項１記載
の免疫学的測定法。 - 【請求項１４】抗原結合定数が１０８Ｍ−１以上である
抗ヒト可溶性ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体。 - 【請求項１５】抗原結合定数が１０８Ｍ−１以上である
抗ヒト可溶性ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体を含有す
る可溶性ＩＣＡＭ−１の免疫学的測定用試薬。 - 【請求項１６】少なくとも担体上に保持された抗体と
該抗体とは抗原決定基が異なる標識化された抗体とを
構成成分とし、該およびの抗体の抗原結合定数が１
０８Ｍ−１以上であり、検出限界５０ｐｇ／ｍｌ以下で
あるヒト可溶性ＩＣＡＭ−１の免疫学的測定用キット。 - 【請求項１７】抗原結合定数が１０８Ｍ−１以上である
抗ヒト可溶性ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ。 - 【請求項１８】ハイブリドーマがマウスハイブリドーマ
ＳＭ−１、ＷＩＳ２−１１、ＷＩＳ４−４７、ＷＩＳ５
−８５あるいはＷＩＳ５−２５４である請求項１７記載
のハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5037262A JPH06209788A (ja) | 1993-01-14 | 1993-01-14 | ヒト可溶性ｉｃａｍ−１の免疫学的測定法、その測定用抗 体および測定用キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5037262A JPH06209788A (ja) | 1993-01-14 | 1993-01-14 | ヒト可溶性ｉｃａｍ−１の免疫学的測定法、その測定用抗 体および測定用キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06209788A true JPH06209788A (ja) | 1994-08-02 |
Family
ID=12492752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5037262A Withdrawn JPH06209788A (ja) | 1993-01-14 | 1993-01-14 | ヒト可溶性ｉｃａｍ−１の免疫学的測定法、その測定用抗 体および測定用キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06209788A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103698537A (zh) * | 2014-01-06 | 2014-04-02 | 天津医科大学总医院 | 定量检测人血清可溶性细胞间粘附分子-1的化学发光免疫分析试剂盒及检测方法 |
| RU2574984C2 (ru) * | 2009-01-20 | 2016-02-10 | Трансжене Са | Растворимый icam-1 в качестве биомаркера для прогнозирования терапевтического ответа |
-
1993
- 1993-01-14 JP JP5037262A patent/JPH06209788A/ja not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2574984C2 (ru) * | 2009-01-20 | 2016-02-10 | Трансжене Са | Растворимый icam-1 в качестве биомаркера для прогнозирования терапевтического ответа |
| CN103698537A (zh) * | 2014-01-06 | 2014-04-02 | 天津医科大学总医院 | 定量检测人血清可溶性细胞间粘附分子-1的化学发光免疫分析试剂盒及检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0068763B2 (en) | Recombinant monoclonal antibodies | |
| EP0265500B1 (en) | Antibody to human progesterone receptor and diagnostic materials and methods | |
| Lewis et al. | Conformation-specific monoclonal antibodies directed against the calcium-stabilized structure of human prothrombin | |
| WO2004029242A1 (ja) | フォンビルブランド因子特異的切断酵素に対する抗体及びそれを用いたアッセイ系 | |
| EP2884277B1 (en) | Method and immunoassay reagent for measuring PIVKA-II | |
| CA2660947A1 (en) | Monoclonal antibody to soluble lox-1 | |
| JPS62174100A (ja) | Ｇｔ―２に特異的なモノクローナル抗体 | |
| JP2012082210A (ja) | Ａｄａｍｔｓ１３活性検定用抗体及び活性検定方法 | |
| EP1190259B1 (en) | Diagnostic assay for human matrix gla-protein and its use as a biomarker | |
| CA2281262C (en) | Anti-human medullasin monoclonal antibody, process for producing the same and immunoassay using the same | |
| JPH06209788A (ja) | ヒト可溶性ｉｃａｍ−１の免疫学的測定法、その測定用抗 体および測定用キット | |
| JPWO2014147873A1 (ja) | Ｈｍｇｂ１の分解産物と特異的に結合する抗体、並びにｈｍｇｂ１の分解産物の測定方法及び測定試薬 | |
| JP4164804B2 (ja) | 酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂに特異的なモノクローナル抗体およびその用途 | |
| US4952507A (en) | Production and diagnostic use of antibodies against pancreatic alpha-amaylase | |
| EP1142995B1 (en) | Antiuracil monoclonal antibody | |
| JP7313659B2 (ja) | 試料中のｈｍｇｂ１の測定方法及び測定試薬 | |
| JP4829961B2 (ja) | プロスタシン部分ペプチド及び抗プロスタシン抗体 | |
| JP3504676B2 (ja) | αカテニンに対するモノクローナル抗体 | |
| JP4856381B2 (ja) | ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の測定法 | |
| JP4803943B2 (ja) | 肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−１に対する抗体とその用途 | |
| US7087391B2 (en) | Antibody to hepatocyte growth factor activator inhibitor-1 and use thereof | |
| JPH08319298A (ja) | 抗ヒト老化マーカータンパク質モノクローナル抗体及びそれを用いる測定方法 | |
| JP2002308900A (ja) | 抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ抗体 | |
| JPH0458960B2 (ja) | ||
| JPH06107695A (ja) | 新規ヒト血液細胞関連抗原及びそれを認識する単クローン抗体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20000404 |