WO2004029242A1

WO2004029242A1 - フォンビルブランド因子特異的切断酵素に対する抗体及びそれを用いたアッセイ系

Info

Publication number: WO2004029242A1
Application number: PCT/JP2003/012280
Authority: WO
Inventors: Kenji Soejima; Noriko Mimura; Hiroaki Maeda; Chikateru Nozaki; Takayoshi Hamamoto; Tomohiro Nakagaki
Original assignee: Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
Priority date: 2002-09-25
Filing date: 2003-09-25
Publication date: 2004-04-08
Also published as: JP2009236925A; CN1701117B; AU2003266632A1; EP1544293A4; JPWO2004029242A1; CA2499926A1; JP2013078319A; KR101154550B1; US20060251655A1; AU2008202992A1; US7575872B2; ATE460479T1; AU2008202992B2; KR20050048647A; DE60331666D1; CA2499926C; CN1701117A; EP2157178A1; EP1544293B1; EP1544293A1

Abstract

ADAMTS-13に対して選択的に免疫反応性を示す抗体の提供並びに当該抗体のエピトープ解析またはADAMTS-13自己抗体陽性患者の診断への利用を目的とした。あるいは医薬品としての利用を目的とした部分欠失ADAMTS-13改変分子の製造方法及び用途を提供する。ADAMTS-13のアミノ酸配列の一部または全部を含むポリペプチドで免疫感作した温血動物から得ることができるADAMTS-13に特異的な抗体。ADAMTS-13のアミノ酸配列の一部または全部を含むポリペプチドで温血動物を免疫感作する工程を含む抗体の製造方法。ADAMTS-13の検出方法及び精製方法を含む当該抗体の用途並びに部分欠失ADAMTS-13改変分子を提供することよりなる。

Description

明細 ^ 因子特異的切断酵素に対する抗体及びそれを用いたアツセィ

技術分野

本願発明は、医療用医薬品の分野に係る蛋白質に関する。詳細には、血液凝固に関与するフォンビルブランド因子（von Wi l lebrand Factor：以下、 v WFと称することがある）の特異的切断酵素（以下、 ADAMTS- 13と称することがある）の全長もしくは部分断片及びそれらに対する抗体に関する。本願発明で提供される ADAMTS- 13に対する抗体により、血栓性血小板減少性紫斑病（thrombot ic thrombocytopenic purpura ：以下、 T T Pと称することがある）等を含む当該酵素の欠損 ·低下（一つの可能性として以下の報告がある；例えば、非特許文献 1 参照）の診断または本酵素蛋白質に対する自己抗体陽性患者の診断及びそれにともなう疾病患者への当該酵素の補充療法のための効率的で高純度な当該酵素の調製の可能性が拓かれる。あるいは Disseminated intravascular coagulat ion (以下 DICと略すことがある。）、などによる血小板減少と先天性 ·後天性 TTPによる血小板減少の区別が可能となり、血小板輸注の際の指標を得ることが可能となる。さらには、新規な抗 ADAMTS - 13薬としての利用も考えられる。背景技術

v W Fは、血管内皮細胞や骨髄巨核球で産生され、 2 0 5 0アミノ酸残基（モノマー約 2 5 0 k D a )からなる単一サブュニッ卜が S— S結合にて結ばれたマルチマー構造（分子量 5 0 0〜2 0 , 0 0 0 k D a )を持って存在している止血因子である。血中濃度は約 1 0 g /m 1で、.一般に高分子量のものほど比活性が高い。

V WFには 2つの大きな止血因子としての機能があり、 1つは血液凝固第 VII I 因子と結合し、これを安定化させるキャリアー蛋白質としての働き、もう 1つは傷害血管壁の血管内皮細胞下組織に血小板を粘着 ·凝集させ、血小板血栓を形成する機能である。

血栓性血小板減少性紫斑病（TTP) は、全身の体組織細動脈と毛細血管に血小板血栓を生じる疾患であり、今日の医療技術の進歩にもかかわらず、当該疾患での関連死亡率は 1971〜1991年にかけて約 3倍に増加している。病理学的に、 T T Pは血管内皮細胞障害や血管内血小板凝集によつて惹き起こされると考えられており、免疫組織学的には生じた血小板血栓中に多量の vWFの存在が認められ、 vWFがこの成因に大きな役割を果たしていると考えられている。 TT P患者の vWFのマルチマ一構造は正常もしくは高分子量が優位となっており、特に通常では見られない超高分子量の V W F (unusually large vWF multimer： UL vWFM)や高分子量 vWF重合体（large vWF mul timer： L vWFM)が、高ずり応力下での血小板凝集の促進と微小血栓形成に大きな役割を果たしていることが推察される。一方で、 vWFは健常人の循環血液中で高ずり応力下、 vWF切断酵素（vWF- cleaving protease)の作用により 842 Ty r一 843Me tの位置で分解を受けることが知られていた。したがって、 TT Pは血漿中の当該酵素活性が何らかの原因で低下して、 UL vWFM〜L vWF Mが増加して血小板凝集が亢進し、血管内に血小板血栓が形成されるためというシナリオが描かれている。

200 1年、この酵素活性を有する活性本体である vWF切断酵素、別名 ADAMTS- 13をコ一ドする遺伝子が本願出願人によりクローニングされた（W0 02/088366) 。以下に、 ADAMTS- 13の分子構造に関する知見を整理する。

ADAMTS- 13のドメイン構成は Signal pep deに続いて Propeptideが存在し、次いで、 Furinの切断モチーフの RQRR配列が存在し、 HEXXHXXGXXHDのコンセンサス配列からなる Reprolysinタイプの亜鉛キレ一ト領域を含む Metalloprotease domainが続く（P285stopまで）。そして、蛇毒メタ口プロテア一ゼで見出されるような Disintegrin- like domainを経て（W387stopまで）、一般的に分子認識に重要と考えられているおよそ 50〜60残基からなる最初の Tspl motif (Tspl-1) (Q449stopまで）へとつながり、さらに、細胞接着モチーフの 1つ RGDS配列が含まれる Cys- rich region (T581s topまで）へと続く。次いで、システィン残基を全く含まない約 1 3 0アミノ酸残基からなる Spacer domain (W688s topまで）を経て、再び Tsp l mot i iの繰り返し（Tsp卜 2〜8) の後、補体成分 Clrあるいは Clsの中に最初に見つかったとされる CUB domain- 1, 2が続く。

ところで、本酵素の効率的、高純度な精製法あるいは本酵素の存在量に関して定性的、定量的な診断の方法は確立されていない。さらに本酵素に対する自己抗体陽性患者の診断法も確立されておらず、また、本酵素の活性発現の必須ドメィンの特定もされていない。発明の開示

斯かる状況に鑑み、本願発明の第一の課題は、高い選択性で ADAMTS- 13に対して免疫反応性を示す抗体を提供することにある。

本願発明の第二の課題は、斯かる抗体の製造方法を提供することにある。本願発明の第三の課題は、斯かる抗体の用途を提供することにある。

本願発明の第四の課題は、上述の抗体あるいは自己抗体陽性患者由来の抗体の存在あるいは認識領域を特定することを可能にする全長もしくは部分欠失させた

ADAMTS- 13分子を提供することにある。

本願発明の第五の課題は、斯かる全長もしくは改変分子の製造方法を提供することにある。

本願発明の第六の課題は、斯かる全長もしくは改変分子の用途を提供することにある。

v W F特異的切断酵素の先天的欠損患者及び後天性の当該酵素に対する抗体陽性患者の治療法として、現在までプラズマ交換療法が施されており、当該酵素の精製品または遺伝子組換え体等純品による補充療法の確立が望まれる。家族性 T T P患者は、先天的に v W F特異的切断酵素が欠損しており、非家族性では後天的に当該酵素に対する自己抗体の産生が原因と報告されている。したがって、家族性 T T P患者には、本酵素の補充療法が望ましく（現実には血漿投与が行われている）、非家族性では、血漿交換による自己抗体の除去と本酵素の補充が必要である。

したがって、本酵素の効率的な調製法あるいは診断等が必要となるが、しかし. vWF切断酵素は、本願出願人による先の出願に記載の方法（W0 02/088366) 、あるいはその他の方法（例えば、 Kokame, Κ· ら、 "Proc. N. A. S. USA", 20 0 2 年、第 99巻、 p. 1 1902 - 1 1 907 ; Fujikawa, K. ら、 "Blood"、 200 1年、第 98巻、 p. 1662— 1 666参照）により、血漿あるいは組換え体発現上清中より精製される方法では、十分な純度及び収量が期待できない。また、本酵素の存在量、特に抗原量としての酵素量を測定する術は今まで存在しなかつた。またとくに血小板減少症において DICなどが原因の場合と異なり TTPが基礎疾患として存在する場合の血小板輸注による症状の増悪などのリスクがあった。従って、本発明はこれらの問題点を解決するための vWF切断酵素に対する抗体の提供を目的とする。該抗体により vWFの定量や精製が可能になる。

上述の状況の下、本願発明者等は vWF切断酵素の単離同定を達成するべく、鋭意研究を重ねた結果、従来報告のなかった所望の vWF切断酵素の精製単離に成功し、その成熟型蛋白質のアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードする遺伝子を同定するに至った (W 02/088366) 。

そして、活性発現に必須と考えられる領域を特定するために、 C末端側 CUBドメインより逐次欠失した改変分子を作製し、その vWF切断活性を測定した。これにより Spacer領域と呼ばれる配列番号 1に掲げるアミノ酸番号で 688位近傍より N末端側から構成される分子においてもその定性的な酵素活性は維持されることが確認された。一方で 58 1位近傍までから構成される分子では正常な分泌が阻害され、 449位近傍までから構成される分子では培養上清中への分泌は認められるもののその酵素活性は微弱あるいは活性が認められないことが確認され、これらの知見により本酵素分子の活性発現に必須な領域が示された。これらから本酵素活性を中和しうる抗体の作製に必要なェピトープ領域あるいは活性を有する本酵素分子の検出が可能な抗体の作製が可能となった。

そして、得られる ADMITS - 13のアミノ酸配列を基に調製されるペプチド等を抗原にして、通常の免疫方法（Current Protocols in Molecular Biology, Edited by F. M. Ausbel et al. (1987) 、 Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al. (1996) 、 Antibodies: A Laboratory Man顧 1， Edited by Harlow David Lane ( 1988) あるいは ANTIBODY ENGINEERING second edition Edited by Carl A. K. BOR EBAECK (1995) ) によってモノクローナル及びポリクロ一ナル抗体等の作製が可能である。あるいは、ファージデイスプレィ技術を利用した抗体作製技術（Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Edited by Brian K. Kay et al. (1996) 、 Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al. (1996)、あるいは ANTIBODY ENGINEERING second edition edited by Carl A. K. BORREBAECK (1995) ) により当該蛋白質と結合する抗体の作出が可能である。あるいは、これらの技術に基づき、本酵素に対する自己抗体陽性である TTP患者検体からの本酵素活性の中和抗体もしくは単なる結合抗体の単離も可能である。そして、これらの抗体を用いることで、本酵素量の変動を伴う疾病、例えば TT Pなどの疾患の診断及び治療への応用が可能となる。あるいは調製された抗体を用いて例えばマゥスの ADAMTS- 13に対する抗体を作製し、マウスへ移入もしくは、この抗体の遺伝子を組み込んだ発現ベクターをマウスへ移入することにより、自己抗体陽性のモデルマウスが作出される。

すなわち、本発明は以下のとおりである。

[1] フォンビルブランド因子特異的切断酵素（以下、 ADAMTS- 13と称することがある）を構成するアミノ酸配列のうち全長または 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列または前記のいずれかのアミノ酸配列の部分配列もしくは前記アミノ酸配列を含有するポリべプチド鎖よりなる蛋白質またはぺプチドに対する抗体、

[2] ADAMTS- 13が霊長類または齧歯類を起源とするものである [1]の抗体、

[3] 配列番号 1記載の ADAMTS- 13を構成するアミノ酸配列のうち 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列または前記のいずれかのアミノ酸配列の部分配列もしくは前記ァミノ酸配列を含有するポリべプチド鎖よりなる蛋白質に対する抗体、 [4] 配列番号 1記載の ADAMTS- 13を構成するアミノ酸配列よりなるポ

ドに対し、当該ポリべプチドの Space r領域より N末端側または Me tal loprotease 領域、 Disintegrin- like領域、 Tsp卜 1領域、 Cys- rich領域から Spacer領域の間を認識する抗体、

[5] [1]から [4]のいずれかの抗体であって、 ADAMTS- 13を構成するアミノ酸配列のうち 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列または前記のいずれかのアミノ酸配列の部分配列もしくは前記アミノ酸配列を含有するポリべプチド鎖よりなる蛋白質のァフィ二ティ一精製に用いられ得る仉体、

[6] [1]から [4]のいずれかの抗体であって、 ADAMTS- 13を構成するアミノ酸配列のうち 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列または前記のいずれかのアミノ酸配列の部分配列もしくは前記アミノ酸配列を含有するポリペプチド鎖よりなる蛋白質が有する酵素活性を阻害もしくは中和' し得る抗体、

[ 7 ] ADAMTS- 13の Spacer領域より N末端側、 Metal loprotease領域または Disintegrin- like領域を認識する [6]の抗体、

[8] 配列番号 2及び 3の ADAMTS- 13部分ペプチドを含有してなる免疫原により調製された抗体、

[9] 配列番号 1記載のポリペプチド鎖の全長あるいはその一部の発現物を免疫あるいはそれを発現する発現べクタ一を直接動物に卜ランスフエク卜し得られる抗体、 —

[1 0] ポリクロ一ナル抗体である、 [1]から [9]のいずれかの抗体、

[1 1] モノクローナル抗体である、 [1]から [9]のいずれかの抗体並びにその抗体をコードする遺伝子、

[1 2] ハイプリドーマ WH10、 WH63. WHS40.3、 Pep4-34. WH2-22-1A, WH2- 1 - 1、 WH2-11-K Pep6 - 6Aおよび Pep4-5B - 1からなる群から選択されるハイブリド一マが産生する抗体である [9]のモノクローナル抗体並びにその抗体をコードする遺伝子、ここで WH10、 WH63. WHS40.3および Pep4 - 34.1は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6) に、それぞれ受託番号 FERM BP- 8 1 74, FERM B P- 8175, FERM B P— 8 1 76及び F E RM BP— 8 1 77として、 2002年 9月 4日に、寄託されている。 H2-22-1A, WH2- 1-1、 WH2-11-K Pep6-6A および Pep4- 5B- 1は、それぞれ受託番号 F E RM B P— 848 3、 FERM BP— 8484、 FERM BP— 8485、 FERM BP— 8474及び F ERM BP— 8475として、 2003年 4月 22日および 2003年 9月 1 0日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6) に寄託されている、

[1 3] [1]から [1 2]のいずれかの抗体によって認識される ADAMTS- 13のェピトープに結合または競合的に結合することができる抗体、

[14] [1]から [13]のいずれかの抗体を含む医薬品組成物または診断薬、

[1 5] [1]から [13]のいずれかの抗体を構成成分とする標識蛋白質、

[16] [1]から [13]のいずれかの抗体を産生し得る単離された細胞、

[17] ハイプリドーマである [1 6]の細胞、

[1 8] ハイプリドーマ株 WH 10 (受託番号 FERM BP— 8174) 、ノ、イブリドーマ株 WH63. 1 (受託番号 FERM B P— 8 175 ) 、ハイブリドーマ株 WHS 40. 3 (受託番号 FERM B P _ 8 176 ) 、ハイプリド —マ株 P e p 4— 34. 1 (受託番号 FERM B P— 8 1 77 ) 、ハイプリド —マ株 WH 2 - 22 - 1 A (受託番号 FERM B P— 8483) 、ハイブリド —マ株 WH2— 1— 1 (受託番号 FERM B P _ 8484 ) 、ハイプリドーマ株 WH 2— 1 1— 1 (受託番号 FERM B P— 8485 ) 、ハイブリド一マ株 P e p 6— 6 A (受託番号 FERM B P - 8474) およびハイブリドーマ株 P e p 4— 5 B— 1 (受託番号 FERM B P— 8475 ) からなる群から選択される [17]の細胞、

[1 9] [1]から [13]のいずれかの抗体を含んでなる免疫測定キット、

[20] ADAMTS- 13のアミノ酸配列の一部または全部を含むポリペプチドで温血動物を免疫感作する工程と、該免疫感作された温血動物の体液から [1]から [1 3]のいずれかの抗体を採取する工程を含む抗体の製造方法、

[21] 温血動物を免疫感作するためのポリペプチドが、 ADAMTS- 13の一部として、配列表における配列番号 1に示すアミノ酸配列の一部または全部を含む [2 0]の抗体の製造方法、

[22] [1]から [1 3]のいずれかの抗体を産生し得る単離された細胞を生体内または生体外で培養する工程と、その体液または培養物から該抗体を採取するェ程を含む抗体の製造方法、

[23] 抗体を産生し得る単離された細胞がハイプリドーマである [22]の抗体の製造方法、

[24] 塩析、透析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトダラフィ一、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動から選ばれる 1 種または 2種以上を含む精製方法により抗体を採取する [20]から [23]のいずれかの抗体の製造方法、

[25] [1]から [13]のいずれかの抗体を被験試料に接触させ、免疫反応により AMMTS- 13を検出することを特徴とする ADAMTS- 13の検出方法、

[26] [1]から [1 3]のいずれかの抗体を利用するラジオィムノアツセィ、ェンザィムィムノアッセィまたは蛍光ィムノアッセィである [25]の検出方法、 [27] 被験試料が生体から採取した生物学的試料である [25]または [26]にの検出方法、

[28] [1]から [1 3]のいずれかの抗体を ADAMTS- 13と夾雑物質とを含む混合物に接触させて抗体に当該蛋白質を吸着させる工程と、吸着した当該蛋白質を抗体から脱着させる工程を含む AD崖 TS-13の精製方法、

[29] 抗体が水不溶性担体に結合している [28]の精製方法、

[30] ADAMTS-13の全長もしくは部分欠失変異体を主成分とする診断薬あるいは医薬品、

[3 1] ADAMTS- 13の Spacerから N末端側、あるいは metal loprotease領域、 Disintegrin- like領域、 Tspl- 1領域、 Cys- rich領域から Spacer領域を主成分とする [ 3 0 ]の診断薬あるいは医薬品、

[ 3 2 ] ADAMTS- 13の全長もしくは部分欠失変異体を主成分とした当該ポリぺプチド鎖に対する抗体検出用の試薬 ·診断薬または医薬品、ならびに

[ 3 3 ] ADAMTS- 13の全長もしくは部分欠失変異体を主成分とした抗体検出またはェピトープ解析用抗原の利用及びその調製法である。

ADAMTS- 13に結合できる抗体を、ここに開示する。これらの抗体は、当該分野において標準的な技術を用いて改変することができる。また、ここに最初に例示する抗体と類似する抗体を、ここに教示する方法と公知の方法とを組み合わせて製造することもできる。抗体を生成するこれらの方法は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ゥマ、ャギ、ヒッジまたはサル）を、 ADAMTS- 13またはそれらのフラグメントで免疫あるいは ADAMTS- 13を遺伝子組換え的に発現できる発現ベクターを皮下、皮内もしくは筋肉内にトランスフエクトすることを含む。抗体は、当該分野において公知の様々な技術を用いて、免疫した動物から得ることができ、好ましくは、興味のある抗原に対する抗体の結合を用いて、スクリーニングすることができる。抗体及び Zまたは抗体生成細胞の動物からの単離は、動物を屠殺する工程によって行なうことができる。

ADAMTS- 13で哺乳動物を免疫する代替または補足として、 ADAMTS-13に対する特異抗体を、例えば、ラムダパクテリオファージもしくは表面に機能的なィムノグロブリン結合ドメィンを示すバクテリオファージフィラメントを用いて、発現させたィムノグロブリンの可変ドメインの組換え生成ライブラリーから得ることができる。ライブラリ一は、いかなる AD崖 TS- 13 (もしくはフラグメント）によつても免疫されていない生物から得られた配列から構築された天然のもの、または興味のある抗原に曝された生物から得られた配列を用いて構築されたものとすることができる。

ここに用いられるモノクローナル抗体は、 Kohler と Mi l s te in, Nature, 256 :495, 1975によって最初に記載された方法、または組換え方法 ( Mage と Lamoyi 、 Monoc lonal Ant ibody Product ion Techni ues and Appl icat ions, 79-97頁、 Marce l Dekker社、 New York, 1987を参照) によって作製することができる。

ハイプリド一マ法において、免疫のために用いられる ADAMTS- 13と特異的に結合する抗体を生成する、もしくは生成することができるリンパ球を引き出すために、皮下、腹腔内、または筋内経路で、マウス、ラット、ゥサギ、ゥマ、ャギ、ヒッジまたはサル等の適した宿主温血動物を抗原で免疫する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫することができる。次いで、リンパ球を、適した融合剤、例えばポリエチレングリコールなどを用いてミエローマ細胞と融合させ、ハイプリドーマ細胞を形成させる [God ing, Monoclonal ant ibodies Principles and Pract ice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986) 参照]。

免疫に用いる抗原としては、ヒトまたは非ヒト哺乳類の血液から単離した天然の vWF切断酵素、遺伝子工学の手法を用いて作製したリコンビナントの vWF 切断酵素が挙げられ、由来はヒトでも他の哺乳類でもよい。全長 vWF切断酵素を用いることもでき、酵素的に切断したフラグメントあるいは v W F切断酵素をコードする D NAのフラグメントを用いて遺伝子工学的に作製した、リコンビナントの v WF切断酵素の部分ペプチドを用いることができる。 vWFの断片としては、例えば Spacer領域より N末端側または Metal loprotease領域、 Dis integrin- l ike領域、 Tspl- 1領域、 Cys- rich領域から Spacer領域の間を含む断片が挙げられる。

このように調製したハイブリド一マ細胞は、好ましくは、未融合の親ミエローマ細胞の増殖もしくは生存を阻害する一以上の物質を含む、適した培地中に播種し、培養することができる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングァニンホスホリポシルトランスフェラーゼ（H G P R Tもしくは H P R T) を欠く場合、ハイプリドーマ用培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノブテリン、及びチミジンを含み（HA T培地）、これらの物質が H G P R T欠損細胞の増殖を阻害する。

好ましいミエ口一マ細胞は、有効に融合し、選択された抗体生成細胞によって安定した高レベルでの抗体発現が支持され、 H A T培地などの培地に感受性を有するものである。ハイプリドーマ細胞を培養する培地は、 ADAMTS- 13に対するモノクローナル抗体の生成でアツセィする。好ましくは、特異結合は、固相酵素免疫検定アツセィ (ELISA) によって測定される。本発明のモノクローナル抗体は、 ADAMTS- 13あるいはその部分断片に特異的に結合するものである。

抗体が結合するェピトープは、後述する C末欠失改変 ADAMTS- 13分子を発現させることでマッピングすることができる。従って、本発明は、例示された抗体が結合する ADAMTS- 13ェピトープと結合することができる抗体を含む。

本発明の好ましい実施態様において、モノクローナル抗体は、マイクロモルを超える親和性、または、例えばスキャッチヤード分析により測定された時 (Munsonと Pol lard、 Anal. B iochem. 107 : 220， 1980参照) に、より大きな親和性 (すなわち 1 0— ⁶モルよりも大きな親和性）を有するであろう。

所望する特異性と親和性の抗体を生成する八イブリドーマ細胞を同定した後に、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で培養する。この目的のために適した培地は、 D u 1 b e c c o ' s改変イーグル培地または R P M I— 1 6 4 0培地を含む。さらに、ハイプリドーマ細胞を、動物における腹水腫瘍として、インビポで増殖させることができる。

該ハイプリドーマ細胞を in vi t ro で培養することにより、所望の抗体を含む培養上清が得ることができる。また、該ハイブリドーマをマウス等の哺乳類の腹腔に移植することにより、所望の抗体を含む腹水を得ることができる。

ハイプリド一マにより分泌されたモノクローナル抗体は、従来のィムノグロプリン精製法、例えばプロテイン Aセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはァフィ二ティークロマトグラフィーなどによって、好適に、培地、腹水液、または血清から分離される。

本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸は、当該分野において公知の方法、例えば齧歯類抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いて、容易に単離、配列決定される。本発明のハイプリドーマ細胞は、抗体またはそれらのフラグメントをコードする核酸の好ましい供給源である。単離後、核酸は、発現ベクターまたはクローニングベクタ一に結紮し、次いでこれを宿主細胞に形質転換し、組換え宿主培養細胞においてモノクローナル抗体が生成されるように、これを培養することができる。

所望する結合特性を有する抗体を生成することができるハイプリドーマは、抗体（抗体フラグメントを含む）をコードする核酸を含み、それらを発現することができる宿主細胞として、本発明の範囲内である。また、本発明は、抗体が生成し、好ましくは分泌される条件下で、抗体を生成するこができる細胞を培養することを含む、抗体の生成方法を提供する。

本発明の抗体は、様々な方法で改変することができる。さらに言えば、「抗体」という用語は、必要とされる特異性を示す結合ドメインを有する全ての結合物質を網羅するものとして解釈されるべきである。従って、本発明は、抗原またはェピト一プ、ここでは ADAMTS- 13に結合することができる抗体に類似した形状を有する、合成分子と分子を含む、抗体フラグメント、誘導体、抗体の機能的均等物及び相同体を網羅するものである。

抗原または他の結合対を結合することができる抗体フラグメントの実施例は、 VL、 VH、 C 1及び CHI ドメインからなる F a bフラグメント； VHと CH 1 ドメインからなる Fdフラグメント；抗体の単一アームの VLと VHドメインからなる Fvフラグメント； VHドメインからなる dAbフラグメント；単離された CDR領域と F (a b ' ) 2フラグメント、ヒンジ領域でジスルフイドプリッジによって連結された二つの F a bフラグメントを含む二価フラグメントである。また、単一鎖 Fvフラグメントも含まれる。

本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、遺伝変異またはその他の変異を受けることができる。さらに、当業者によって、モノクローナル抗体は、元の抗体の特異性を保持するその他の抗体、ヒト化抗体またはキメラ分子を作製するための組換え DNAテクノロジ一の技術を受けることができると解されるであろう。そのような技術は、抗体の、ィムノグロブリンの可変領域または相補性決定領域（CDR) をコードする DNAを、異なるィムノグロブリンの、定常領域または枠組み領域をつなげた定常領域に導入することを含むことができる。本発明で提供されるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマとして、

WH10、 WH63. 1 , WHS40. 3、 Pep4 - 34. 1、 WH2-22-1A, WH2-1-K WH2-11-L Pep6-6A および Pep4-5B - 1が挙げられる。

本発明の抗体は、様々なアツセィ形式で、本発明の検出または診断方法において用いることができる。抗体は、 ADAMTS-13に特異的に結合できる結合剤として用いることができ、例えば、 in vi tro において試料中の ADAMTS- 13の検出を可能にする。または試験試料と接触させた後に、試験試料中の被検体（分析対象物）である V W F切断酵素によって占められた結合剤の結合部位の画分を測定するための現像剤として用いることができる。すなわち、本発明の抗体がその結合部位で、分析対象物と結合し、分析対象物に結合した抗体の量を測定することにより，分析対象物の量もわかり、本発明の抗体をあたかも被検体の存在を明らかにする現像剤のように利用することができる。

抗体の使用、特にアツセィにおける現像剤としての抗体の使用は、検出できて、好ましくは測定できるシグナルを、直接的または間接的に産出することができる、標識物質またはレポーター分子で、それらを標識することを含む。また、本発明の抗体には標識した抗体も含まれる。標識は標識物質またはレポーター分子と抗体を連結させることにより行い、この連結は、直接的または間接的に、例えばべプチド結合を介した共有結合または非共有結合とすることができる。ペプチド結合を介した連結は、抗体とレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組換え発現により得ることができる。 Hunterら、 Nature, 144 : 945， 1962 ； Davidら、 Biochemis try 13 : 1014, 1974 ； Painら、 J. Immunol. Met h. 40 : 219, 1981 ；及び Nygren、 J. His tochem. and Cytochem. 30 : 407， 1982に記載された方法を含む、抗体を検出可能部分に別々に結合させるための当該分野において公知のあらゆる方法を、用いることができる。

標識物質またはレポ一ター分子としては、スぺクトル的に単離された吸光もしくは発光特性を有する、各蛍光色素、蛍光体もしくはレーザー染料等が挙げられ、これらと抗体を共有結合により連結すればよい。適した蛍光色素は、フルォロレセイン、口一ダミン、ルシフェリン、フィコエリスリン及びテキサスレッドを含む。適した発色性染料は、ジァミノべンジジンを含む。他の検出できる標識は、放射性同位元素標識、例えば、 ³ H、 ^{1 4} C、 ^{3 2} P、 ^{3 5} S、 ^{1 2 5} Iまたは^{9 9 Π} Τ cと、検出できる反応生成物をもたらす反応を触媒し、シグナルを増幅することができる酵素標識、例えばアルカリホスファタ一ゼ、 j8—ガラクトシダーゼまたは西洋ヮサビペルォキシダーゼを含む。またこれら酵素の標識にはピオチン Zアビジンまたはピオチン Zストレプトアビジン結合を用いるなど、当該分野に公知の技術を用いて行なうことができる。

他のレポ一夕一分子は、視覚的に観察される、電気的に検出される、またはその他の手段により記録される、検出可能なシグナルを、直接的または間接的にもたらすことができる、着色された、高分子コロイド粒子または例えばラテックスビーズなどの微粒子物質を含む。また、磁性または常磁性の微粒子も用いることができる。さらに、レポーター分子は、例えば、着色反応、変色反応、または電気的特性を変化させる反応を、触媒する酵素であってもよい。これらは、ェネルギー状態間の電気的遷移により、特徴的なスぺクトル吸収もしくは発光を生じるような、分子反応性を有していてもよい。さらに、これらは、バイオセンサーと結合して用いられた化学的な存在を含むことができる。

さらに、抗体は、試料中に存在する他の物質に優先して、 ADAMTS- 13と特異的に結合できることから、抗体を結合剤として用いることができる。好適には、結合剤は、アツセィ中にそれらを容易に操作できるように、固体支持体上に、例えば特定の部位で、固定化する。固定化は、物理吸着または化学吸着などの当該分野に公知の技術を用いて行なうことができ、例えば、固型支持物（固体支持体）に抗体を化学的に結合させるためのピオチン Zアビジンまたはピオチン/ストレブトアビジンを用いることができる。通常、試料中に存在する ADAMTS- 13が結合剤に結合できるように、適切な条件下で、結合試薬と試料を接触させる。次いで、結合剤の結合部位の画分占有率を、現像剤を用いて測定することができる。すなわち、試料中の分析対象物と結合した抗体の量を測定することにより、分析対象物の量を測定することができる。

本発明の抗体を上記の現像剤として用いる場合、現像剤は、当該分野における公知の技術を用いて検出することができるように、（例えば、放射能標識、蛍光標識または酵素標識で）標識する。従って、放射能標識は、シンチレーシヨン力ゥン夕一または他の放射線計数装置を用いて検出することができ、蛍光標識は、レーザーもしくは共焦点顕微鏡を用いて検出することができ、酵素標識は、基質における酵素標識の作用、典型的には、色の変化を生じる作用によって検出することができる。結合剤の占有結合部位に対して、現像剤が被検体と競合する競合的方法において、または結合剤と結合した、もしくは占有結合部位に結合した被検体と標識化現像剤が結合する非競合的方法において、現像剤を用いることができる。両方の方法により、被検体によって占有された結合部位の画分が示され、これにより試料中の被検体濃度が、例えば被検体の既知濃度を含む試料を用いて得られた標準と比較して、示される。

診断的アツセィは、患者からの生物学的試料を用いて行なわれる。これらの試料は、前処置なしに直接的に用いられることもできるし、アツセィを行なう前に例えば遠心分離やろ過により干渉する可能性のある試料中の物質を除去する等の処置を行ってもよい。適した生物学的試料の例は、血液、尿、汗、組織もしくはその抽出液または血清である。

一実施態様において、本発明は、 T T P、 Τ Τ Ρ様の疾患または v W F依存性の血栓症（v W Fによりもたらされる血栓症）の恐れのある患者がこれらの疾患に罹患しているか否かを診断する方法、あるいは罹患するリスクがあるかを評価する方法に関し、該方法は、以下の工程を含む：（a ) 患者から得られた生物学的試料を、 ADAMTS-13と特異的に結合できる抗体を固定化した固型支持物と接触させること；

( b ) 抗体を固定化し、さらに試料を接触させた固型支持物を、抗体の未占有結合部位、抗体に結合した結合 ADAMTS- 13または抗体の占有結合部位に結合できる標識化現像剤と接触させること；及び、（c ) 試料中における ADAMTS- 13の濃度に相応する値を得るために、工程（b ) において特異的に結合した現像剤の標識を検出すること。

さらなる実施態様において、本発明は、患者における v W F依存性の血栓にまつわる診断をするための方法を提供し、該方法は以下を含む：（a ) 患者の生物学的試料を、請求項記載のいずれか一つの抗 AMMTS- 13抗体と接触させること；及び、（b ) 試料中における AMMTS-13の抗 ADAMTS- 13抗体に対する結合を測定すること。

そしてさらに、試料中の ADAMTS- 13濃度に相応する値を、既知標準から得られた値に相関させる工程、例えば濃度が既知の標準物質を測定し、標準曲線を作成し、濃度未知の物質測定に得られた測定値を標準曲線と比較し濃度を算出するェ程を、さらに含む。

本発明の抗体は、あらゆる公知の免疫学的測定方法、例えば競合的結合アツセィ、直接的及び間接的サンドウイツチアツセィ、及び免疫沈降アツセィ [Zol a, Monoclonal Ant ibodies： A Manual of Techni ues, ppl47-158 ( CRC Press社、 1987) 参照]、において用いられることができる。

サンドウイツチアツセィは、各々、検出される ADAMTS- 13の異なる免疫性部位またはェピトープに、結合できる二種の抗体を使用する。サンドウイツチアツセィにおいて、試験試料の被検体を、固型支持物上に固定化されている一次抗体と結合させた後、該被検体に二次抗体を結合させて、不溶性の三部複合体（抗原、一次抗体および二次抗体）を形成させる。二次抗体は、検出できる部分（標識物質またはレポーター分子）で標識することができ、または検出できる部分で標識した抗ィムノグロブリン抗体を用いて測定することができる（間接的サンドウイツチアツセィ）。例えば、サンドウイツチアツセィの一つの型は、検出できる部分が酵素である ELISAアツセィである。

本発明の抗体を含む免疫測定キットも本発明に包含される。該キッ卜が酵素免疫測定法に基づく場合は、抗体を固相化した担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該キットがラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は、抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該キットは適宜、標準試料、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。

また、本発明の抗体は、インビポでのイメージングに有用であり、ここで、抗体は、放射性同位元素などの検出できる部分で標識され、宿主に、好ましくは血流中に投与され、宿主における標識化抗体の存在と局在が測定される。抗体は、 v W F切断酵素が存在または局在する組織、器官等に結合し得る。抗体は、核磁気共鳴、 X線透視、または当該分野において公知のその他の検出手段によって、検出できるあらゆる部分で、標識することができ、検出できる部分に応じて特定の検出手段を用いることにより、標識抗体の存在または局在を測定することができ、すなわち v W Fの存在または局在を検出することができる。

また、本発明の抗体は、ァフィ二ティ一クロマトグラフィーにおけるァフィ二ティ一精製用試薬としても有用である。この方法において、抗体は、セルロファイン樹脂等の合成樹脂、濾紙等の支持物上に、当該分野に公知の方法を用いて固定化する。次いで、精製すべき ADAMTS- 13を含む試料と固定化した抗体を接触させた後、固定化抗体に結合する ADAMTS- 13以外の試料中の全物質を完全に除去し得る溶剤で、支持物を洗浄する。最後に、支持物を、抗体から ADAMTS-13を遊離させ得る溶剤、例えばグリシン緩衝液、 p H 3〜5で洗浄することにより、 v W F切断酵素を単離 ·精製することができる。

本発明の抗体または ADAMTS- 13分子もしくはその変異体は、薬学的組成物中に配合することができる。すなわち、本発明は本発明の抗体または ADAMTS - 13 分子またはその変異体を含む薬学的組成物を包含する。ここで、変異体とは、分子全体のうち薬学的効果を奏する部分を含むフラグメントまたは ADAMTS- 13分子のアミノ酸配列において 1個から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したァミノ酸配列を有する分子である（必ずしも活性を保持した改変に絞らない）。本発明の抗体は、 ADAMTS- 13が有する酵素活性を阻害し、または中和し得る抗体を含む。該抗体は、好ましくは ADAMTS- 13のドメイン構造中の Spacer領域より N末側に存在するェピトープを認識し結合する。また、該抗体は、 me t al loprotease領域、 D i s int egrin- l ike領域、 Tsp l- 1領域または Cys- Spacer領域に存在するェピ卜ープを認識し結合する。薬学的組成物は、上記の抗体または AMMTS- 1 3分子もしくはその変異体に加えて、薬学的に受容できる賦形剤、担体、緩衝液、安定剤または当該分野において公知であるその他の物質を含むことができる。そのような物質は、無毒であり、活性成分の効能に干渉しないものである。担体またはその他の物質の厳密な性質は、投与経路、例えば口、静脈、皮膚もしくは皮下、鼻、筋内、腹腔内経路に依存し、投与経路に応じて適切なものを選択することができる。

経口投与のための薬学的組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体形状であることができる。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固型担体を含むことができる。液体の薬学的組成物は、通常、液体の担体、例えば水、石油、動物性油、植物性油、鉱物性油、または合成油であることができる。生理食塩水、ブドウ糖もしくは他のサッカリド溶液またはグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールが含まれる。

静脈、皮膚もしくは皮下注射または苦痛部位への注射の場合は、活性成分が、発熱性因子を含まず、好適な pH、等張性及び安定性を有する、腸管外で受容できる水溶液の形状とするであろう。当業者は、適切な溶液を、例えば等張性の媒体、例えば塩化ナトリウム液、リンゲル液、乳酸加リンゲル液などを用いて、調製することができる。防腐剤、安定剤、緩衝液、抗酸化剤、及び/またはその他の添加剤を必要に応じて含むことができる。

本発明の ADAMTS- 13に対する抗体または ADAMTS- 1 3分子もしくはその変異体を生理食塩水、緩衝液等で希釈して製剤化し、医薬組成物を得ることもできる。製剤の pHは体液の pHに近い弱酸性〜中性域の pHが望ましく、その下限は 5 . 0〜 6 . 4が望ましく、その上限は pH 6 . 4〜 8 . 0が望ましい。また、凍結乾燥形態等の長期間保存可能な形態で提供することもでき、この場合使用時に水、生理食塩水、緩衝液等で所望の濃度になるように溶解して使用することができる。本発明の製剤は、通常医薬品に用いられる薬理的に許容される添加剤（例えば担体、賦形剤、希釈剤等）、安定化剤または製薬上必要な成分を含有していてもよい。安定化剤としては、ダルコース等の単糖類、サッカロ一ス、マルトース等の二糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、塩化ナトリウム等の中性塩、グリシン等のアミノ酸、ポリエチレンダリコール、ポリオキシエチレン—ポリオキシプロピレン共重合体 (プル口ニック）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トウィーン）等の非イオン系界面活性剤、ヒトアルブミン等が例示され、 l〜 1 0 w V %程度が添加されていることが好ましい。

本発明の医薬組成物は、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射等により有効量で投与することができ、 1回または数回に分けて投与される。その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、 1回あたり、 0 . 0 0 l m g〜 1 0 O m gが好ましい。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2002- 279924号および 2002- 377569号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、抗体のェピトープを決定するための C末欠失変異体作製法を示す図でめる。

図 2は、調製された C末欠失変異体の一時発現を抗 F L A G抗体を用いて非還元下ウエスタンブロットにて確認した図である。

図 3は、調製された C末欠失変異体の一時発現の v W F切断活性を還元下の SDS-PAGEにて確認した図である。

図 4は、 PoAblのェピトープを確認した結果を示す非還元下ウエスタンブロッ卜の図である。

図 5は、 PoAb2のェピトープを確認した結果を示す非還元下ウェスタンブロッ卜の図である。

図 6は、 MoAb Pep4- 34- 1のェピト一プを確認した結果を示す非還元下ウェス夕ンブロッ卜の図である。

図 7は、 MoAb TO10のェピトープを確認した結果を示す非還元下ウエスタンブロットの図である。

図 8は、 MoAb WH63-1のェピト一プを確認した結果を示す非還元下ウエスタンブロットの図である。

図 9は、 MoAb WHS40- 3のェピト一プを確認した結果を示す非還元下ウエスタンブロットの図である。

図 1 0は、各種抗体の認識領域と活性発現に重要な領域をまとめた図である。図 1 1は、 v W F切断酵素の部分合成ペプチドを免疫して得られたゥサギ抗血清を用いた健常人血漿及び TTP患者血漿中の ADAMTS- 13の確認を還元下ウエスタンブロット法で行なった結果を示す図である。

図 1 2は、ポリクロ一ナル抗体とモノクローナル抗体を組み合わせて構築した ELISA系の模式図とアツセィの流れ図である。

図 1 3は、ドメイン毎に調製された抗体により構築された ELISA法の概念図である。

図 1 4は、モノクローナル抗体とモノクローナル抗体を組み合わせて構築した ELISA系の模式図とアツセィの流れ図である。

図 1 5は、ヒト胎児腎細胞株 293を宿主とした培養上清から抗体カラムによりァフィ二ティ一精製された遺伝子組換え ADAMTS- 13の SDS-PAGEの泳動図である。図 1 6は、ヒトプール血漿の FIペース卜から抗体カラムによりァフィ二ティー精製された ADAMTS- 13の SDS-P AGEの泳動図である。

図 1 7は、抗体を用いた中和活性能の評価（非還元下の v W F切断活性の SDS- PAGE) を示す図である。

図 1 8は、後天性 TTP患者血漿中の抗 ADAMTS- 13抗体の検出（ELISA法）を示す図である。

図 1 9は、マウス血漿中の ADAMTS- 13の検出（ウェスタンプロット法）を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下に、実施例に従って本願発明を詳説するが、本願発明はこれら実施例に何等限定されるものではない。

実施例 1 (ポリクローナル抗体（P oAb) の作製）

マウスまたはゥサギに、常法により（Current Protocols in Molecular Biology ： Chapter 11 i匪 nology、 Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al. あるいは ANTIBODY ENGINEERING second edition Edited by Carl A. K. BORREBAECKなど）、ヒトプラズマより部分精製した抗原タンパク、あるいはその一部のアミノ酸配列を有する合成べプチド（例として、配列番号 2または配列番号 3記載のペプチド）を適切なキャリア一物質（KLH等）に結合させたもの（KLHを付加しやすくするために Cysを N末端あるいは C末端などに付加したもの）、あるいは遺伝子組換えタンパク質またはそれをコードする遺伝子を導入した発現ベクターを皮下 ·皮内または筋肉内にトランスフエクトし、モノクローナル抗体発現ハイプリドーマの確立及びポリクローナル抗体（PoAb) の作出を行なった。 PoAbに関しては全長または後述する Q449stopまたは P285stopを発現するベクターのトランスフエクトにより PoAbl、 PoAb2及び PoAb3の三種を作製した。

実施例 2

(モノクローナル抗体（MoAb) の作製）

B a 1 b/cマウスに、初免疫感作として後肢にフロイント完全アジュバント存在下で遺伝子組換え由来 ADAMTS- 13または配列番号 2もしくは配列番号 3記載のペプチドを、 KLHをキャリア一として付加したものを調製した。 ADAMTS - 13 は W0 02/088366に記載の方法で調製すればよい。

調製した抗原の 1 gから 10 g相当量を 1回接種した後、 1週間後に常法に従いマウス後肢大腿部のリンパ節または脾臓より細胞を採取した。それぞれマウス 2匹から、得られた細胞をミエローマ細胞 P 3X 63Ag 8U. 1 (P 3 U 1 ) (ATC C寄託番号 CRL— 1 597 ： Cu r r. T o . M i c r o b i o 1. I mmu n o 1. , v o 1. 8 1， p . 1 ( 1 978 ) )と細胞数 1対 1〜 2の割合で混合し、遠心処理（1, 500 r pm、 5分）して上清を除き、沈殿した細胞塊を充分ほぐした後、予め 37°Cに加温しておいた lm 1のポリエチレンダリコール溶液（45 % ポリエチレングリコール 4000、 55% RPM I培地）を攪拌しながら加えた。 37°Cで 5分間インキュベートした後、液の全量が 50m 1 となるようにゆつくりと RPM I培地を加えた。遠心分離（1, 300 r pm、 7分）後、上清を除去して緩やかに細胞をほぐした。これにエスクロン CM— B 培地（三光純薬社製） 50m lを加え、メスピぺットを用いて緩やかに細胞を懸濁した。この細胞懸濁液を 4〜 5枚の 96ゥエル細胞培養プレートの各ゥエルに 1 00 M 1ずつ分注し、 5 %炭酸ガスを含む 37 の〇0₂ィンキュベー夕一内で培養した。翌日に、 HAT培地（エスクロン CM— B培地にヒポキサンチン 1 X 1 0 ⁴ M、チミジン 1. 5 X 1 0- 3 M、アミノプテリン 4 X 1 0— ⁷ Mになるよう添加したもの）を各ゥエルに 100 ^ 1ずつ分注し、 5 %炭酸ガスを含む 3 7°Cの C0₂インキュベーター内で培養した。ハイプリドーマのコロニーが十分生育したものから H T培地（上記 H A T培地からァミノプテリンを除いたもの）に交換し、培養上清の一部を分取し、以下に述べるスクリーニング法にて目的のハイブリドーマを選別した。

目的のハイプリドーマの選別は下記の ELISA法、ウェスタン ·ブロッテイング法を組み合わせて実施した。

(l)ELISA法

96ゥエルのマイクロテス卜プレートに前記のごとく作製した合成ペプチド抗原、または精製抗原（蛋白質濃度 0.5〜2 z g/m l )を 50 JLL 1 /ゥエルで加え、 4 °Cでー晚インキュベートすることにより固相化した。さらに、 1 %B SA (ゥシ血清アルブミン）溶液 300 i lを加え、同様にインキュベートしてマスキングを行なった。このようにして作製した抗原固相化プレートに細胞融合法によつて得られたハイプリドーマ及びクローニング後のハイプリドーマの培養上清を加えて、 4 °Cで 1時間インキュベート後、 TBSで 3回洗浄し、ペルォキシダ一ゼ標識抗マウス免疫グロプリン抗体溶液（カッペル社製、 5, 000倍希釈）を 10 0 1/ゥエル加えた。 4°Cで 1時間インキュベート後、 TB Sにて 3回洗浄し、その後 TMB Z基質溶液を加え、常法により発色させその吸光度を波長 450 η mにて測定した。こうして精製抗原と反応するハイプリドーマク口一ンを選択した。また、この方法はさらにヒト血漿中の ADAMTS-13に対する自己抗体検出への応用も可能であった。

(2)ウエスタン ·ブロッティング法

ELISAで得られた陽性コロニーについてウエスタン ·プロッティング法によるスクリーニングを行なった。精製抗原を 8 %の SDS—ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、 PVDF膜上に移行させ、膜を 0.4〜0. 5 cm幅に切断した。各細片をハイプリドーマ培養上清液に浸し、 1時間 37 ^DCでインキュベートした。その後、細片を TB ST (0. 0 5 %Twe e n含）で 3回洗浄した後、アルカリフォスファタ一ゼ標識抗マウス I gG (TAGO社製）の 1 ： 2000希釈液中で 37° (：、 1時間インキュベートした。 TB STで 3回洗浄後、 BC I P /NBTを用いる発色試薬（B i o— R a d社製）で発色させ、精製抗原の発色バンドを示すハイプリド一マを選択しクロ一ニングした。クロ一ニング後のハイプリド一マクローンについても同様の手法で選別した。上記の選別方法によって所望のモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマがおよそ 30クローン得られた。また、この方法はさらにヒト血漿中の ADAMTS- 13に対する自己抗体検出への応用も可能であった。

実施例 3

(ADAMTS-13C末欠失変異体の作製）

図 1に示すストラテジーにより、全長の vWF切断酵素遺伝子クローニングべクタ一（pCR2. lvWFCP) を利用して、全長及び配列番号表 4から 1 8に示すプライマーを用いて C末端より逐次ドメインを欠失させた変異体（Full 1427s top、 T1135stop、 W1016stop、画 stop、 W808stop、 W746stop、 W688stop、 T581stop、 Q449stop、 W387stop、 P285stop, ：それぞれの数字は開始コドン AT Gのコードする Metから終結コドンまでのアミノ酸の残基数を示し、 FLAGェピトープ（DNA配列： gactacaaggacgatgacgataagtga (配列番号表 1 9) 、アミノ酸配列： Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (配列番号表 20) ) を付加した部位を示す。）を発現する遺伝子を調製し、 pCAG発現ベクター（Niwa, H.， et al. Gene vol.108, 193-199) に組み込み、 Hela細胞を用いて、以下の手順でトランスフエクトした。全長の vWF切断酵素遺伝子クロ一ニングベクタ一（pCR2. lvWFCP) は、 W 02/088366に記載の方法により入手可能である。

まず初めに、 1一 3X10⁵個 Z35mm dishで細胞を捲き、その翌日に上記発現べク夕一を 2 i g当たり 10 1の Polyamine Transfection Reagentである TransIT (TAKARA社製）をとり、 0pti_MEM等の無血清培地 200 lに添加して、試薬添付文書に従い、 DNAとのコンプレックスを調製後、準備しておいた前記各種細胞へ滴下し、 6時間インキュベーションし、その後、培地を ASF104無血清培地（味の素社製）に変更後、 72時間 37°Cインキュベーション後、その上清を回収した。検出は抗 FLAG-M2抗体（コダック社製）を用いたウェスタンプロット法により、抗マウス Ig -アル力リフォスファターゼ酵素標識抗体系で染色して行なつた（図 2に発現の様子を確認した結果を示す。）。また本改変分子群は FLAGタグを付加しており、常法である抗 FLAGタグ抗体固定化ァガロース等を用いて容易に精製可能であった。

実施例 4

(ADAMTS-13C末欠失変異体の v W F切断活性確認）

vWFの調製

vWFは、セフアクリル S-500HR (アマシャムフアルマシア）の 2.6X90 cmカラムにより、プラズマクリオ画分 2gを 20 mLのバッファー（0.01% Tween-80 I 50 mM Tris-HCl I lOOmM NaCl H 7.4)に溶解したものをゲル濾過することにより調製した（W002/088366を参照）。

vWF切断反応

vWF切断活性のアツセィは、 W002/088366に記載の方法で行った。すなわち、終濃度 lOmMの塩化バリウムを加えたサンプルを 37 で 5分間プレインキュベートし、プロテアーゼの活性化を行なった。 50mLのファルコンチューブにバッファ一（15〜20mLの 1· 5M Urea / 5mM Tris- HC1 pH8.0)を入れた。次にミリポア社製のメンブレンフィルター（0.025 m)を浮遊させ、 50/ Lの vWF基質溶液を加えて混合した活性化サンプルを 100 pi L添加した。 37°Cのインキュベーターに一晩静置して翌日フィルターから回収した。回収したサンプルを、以下の SDS- PAGEの項に示す vWFの切断パターンにより評価した。 SDS-PAGE

SDS- 5%ポリアクリルアミドゲルを自家調製し使用した。 v W F切断活性のアツセィ項で述べたサンプル 10 Z Lに、 SDS泳動バッファー（還元剤 2-メルカプトエタノール存在下または不在下）を加え 3分間煮沸したものを泳動サンプルとした _c 30mAで 1時間電気泳動したのち、ゲルは CBB染色を利用した Gel Code Blue Stain Reagent (PIERCE社)にて染色した。

その結果、図 3に示す如く、 Ful l- lengthの分子から W688stopまでの分子で明らかな v W F切断活性が認められた。また先の抗 FLAG抗体による上清中への発現パターンを考慮した場合、 T581stopでの発現が上清中に認められないことからこの近傍（Cys-ricli領域から Spacer領域）での切断は分泌障害を起こす場合があることが確認され、本酵素活性を維持するためには、この領域を含むことが重要であることがわかった。

実施例 5

(ウエスタンプロットを利用した抗体のェピト一プの解析）

常法により、ウェスタンブロットを行ない、確立したポリクローナル抗体

(PoAbl, PoAb2) 及びお互いに認識部位が競合しないと考えられたモノクロ一ナル抗体数種（本発明者らが先に作製した Clone No. WH10 (FERM BP - 8174)に加えて、 WH63. 1 (FERM BP- 8175)、 WHS40. 3 (FERM BP - 8176)、 Pep4-34. 1 (FERM BP - 8177) ) についての認識領域を特定するため、実施例 4記載の部分欠失改変分子の一時発現培養上清を利用し、ウェスタンプロットを行なった（図 4〜9 ) 。

これに加えて新たに確立されたクローン WH2- 22- 1A (FERM BP - 8483)、 WH2-1- 1 (FERM BP- 8484)、 WH2-11-1 (FERM BP-8485) , Pep6-6A (FERM BP-8474) , Pep4-5B- 1 (FERM BP- 8475)についても同様の解析を行った。決定された抗体の認識領域及び活性発現に重要と考えられた領域を図 1 0にまとめる。 PoAblの認識領域は図 4から Q449s top以降 W688stopまでの間あるいは全長部分にわたっていることが推察され、 PoAb2は図 5より P285s top以降 W387stop、またはこれ以降 Tspl-を認識しており、本ポリクローナル抗体 PoAMが中和活性を有すること（後述）並びに PoAb2さらには PoAb3も ADAMTS- 13の酵素活性を中和したため、これらの事実を併せて鑑みると Spacer領域より N末端側、 metalloprotease領域、 Disintegrin-like 領域、 Tspl_l領域、 Cys_Spacer領域等が in vitroのアツセィにおいて機能的に重要であり中和領域となりえることが確認された。

実施例 6

(ELISAを利用した抗 ADAMTS- 13抗体のェピトープ領域の確認）

ィムノモジュール 9 6ゥエルプレ一トに抗 FLAG抗体 1 0 β g/ml 1 0 0 L を固相化したのち FLAGをポリペプチド鎖に付加した ADAMTS- 13 wild typeもしくは各種上記欠失変異体を固相化、もしくは FLAGの付加に無関係に直接プレ一卜へ本酵素変異体を固相化し、公知の方法によりブロッキング操作を施したプレートに適当に希釈された MoAbの 1 0 0 を反応後、プレートを Tweenなどの界面活性剤を含有するバッファーにて洗浄後、抗マウス IgHRPコンジュゲートと 3 7 °C— 時間反応させ洗浄後、 TMBZ等で発色させることにより、実施例 5同様なェピトープ領域の絞込みを行なった。その結果、実施例 5で示された結果を支持した。また、この方法はヒト血漿中に存在する抗 ADAMTS- 13抗体の検出並びにェピトープ解析に有効であると考えられた。

実施例 7

(確立された抗体を用いてのウエスタンブロットによるヒト血漿中の ADAMTS - 13 の検出）

続いて、上記種々の方法により調製された抗体を用いて、常法により ( Current Protocols in Molecular Biology ： Cha ter 10 analysis of proteins. Chapter 11 immunologyなど）、本酵素のウェスタンブロット法による検出を行なった。本酵素の C末端領域のペプチド配列（配列番号 2) Phe-Ser- Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln- Ser- Serを K L Hに結合したものを免疫原として得られたぺプチド抗体により、還元条件下、健常人血漿、 TTP患者血漿中から本酵素の検出を行なったところ、一部の T TP患者血漿では明瞭ではないが、概ね 2 5 OkDa程度の本酵素由来のシグナルと想定されるバンドが確認された（図 1 1 ) 。

実施例 8 (確立された抗体を用いた酵素免疫測定法によるヒト血漿中の ADAMTS- 13の検出 ·測定 1 )

得られたポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の組み合わせ（MoAb - PoAb の系）により（認識ェピトープは図 1 0参照）構築される酵素免疫測定法 (ELISA)を用いて（図 1 2 ) 、様々な検体での本酵素の定量を行なった。測定方法の工程を以下に示す。

1. 各試薬類を室温に戻す。

2. WH10 MoAb固定化プレートにサンプルを 100 μ ΐ /ゥエル添加

37°C 1時間

3. 0.05% Tween-20 -TBSでプレート洗浄 3回

4. PoAb 1 または PoAb 2を 1 μ g/mlとなるよう希釈液（1%BSA - TBS)にて希釈し、 100 μ 1 ウエル添加

37°C 1時間

5. 0.05% Tween-20 -TBSでプレート洗浄 3回

6. 抗ゥサギ IgG- HRP標識コンジュゲートを希釈液（1%BSA- TBS)にて 10000倍希釈し、 100 μ 1Ζゥエル添加

37°C 1時間

7. 0.05% Tween-20 -TBSでプレート洗浄 3回

8. TMB基質液（直前に室温で 2液を混ぜたもの） 100 IX 1Zゥエル添加 (ポジティブウエノレは青色へ）室温 10分程度（スタンダードとして同封の組み換え品 lOOng/mlの色が反応停止後、最終的に OD450nm= l 程度となるように）反応停止液（0.5 M 硫酸）を 100 / lZ ゥエル添加（ポジティブゥ-ルは黄色へ）

9. プレートリーダにて 450nm及ぴ 650nm測定定量のためのスタンダードは遺伝子組換え ADAMTS- 13を後述する抗体によるァフィニティー精製により得られたものを用いた。その結果、健常人血漿中の

ADAMTS-13濃度は用いた抗体により変化することが明らかとなり、これは.血漿中で本酵素が様々な分子形態で存在することを示唆するものであった（表 1 ) 。このことから理想的な ELISA系として、積極的に分解パターンを解析できるようなドメイン毎に認識する抗体群を利用した系もしくは表 2に示すこれらの影響が少ないと考えられる PoAb— PoAb (ProteinG等で精製した PoAbを直接 ELISAプレートへ固相化し、ピオチン化 PoAb—ストレプトアビジン HRP) による系の構築が望ましいと考えられた（図 1 3) 。図 1 3に示す系において、ポリクロ一ナル抗体 (PoAb) もしくは N末より（メタ口プロテアーゼドメインなど）の認識ェピトープを有するモノクローナル抗体（MoAb) を固相化に用いて、検出側の二次抗体にドメイン毎に異なるェピトープの MoAbを用いることで全てのパリエーションの ADAMTS- 13をトラップする。あるいは、この逆に様々なェピトープの MoAbを固相化に用いるあるいは PoAbと PoAbでのサンドィツチ ELISAなどが想定される。図に示すようにサンプル中の ADAMTS - 13は様々なバリエーションが存在する。これらの系で病態と血漿中の存在分子形態との相関を見ることが可能になる。

表 2

PoAbl-PoAbl

Plasma 4 1.0 n g/ml

Plasma 5 1.0 n g/ml

Plasma 6 0.9/ g/ml

Plasma 7 1.1 ti g/ml

Plasma 8 0.9 g/ml

実施例 9

(確立された抗体を用いた酵素免疫測定法によるヒト血漿中の ADAMTS- 13の検出 ·測定 2 )

得られたモノクローナル抗体を組み合わせることで構築される酵素免疫測定法 (MoAb- MoAbの系）（図 1 4 ) により、数検体のヒト血漿中の本酵素の定量を行なった。測定方法の工程を以下に示す。

1. 各試薬類を室温に戻す。

2. WH10 MoAb固定化プレートにサンプルを 100 μ ΐ/ゥヱル添加

37°C 1時間

3. 0.05% Tween-20 -TBSでプレート洗浄 3回

4. ビォチン化抗体を 1 μ g/mlとなるよう希釈液（1%BSA- TBS)にて希釈し、 100 μ lZゥェノレ添カロ

37°C 1時間

5. 0.05% Tween-20 -TBSでプレート洗浄 3回

6. ストレプトアビジン- HRP標識コンジュゲートを希釈液（1%BSA- TBS)にて 10000倍希釈し、 100 lZゥヱル添加

37°C 1時間

7. 0.05% Tween-20 -TBSでプレート洗浄 3回

8. TMB基質液（直前に室温で 2液を混ぜたもの） 100 μ 1/ゥエル添加（ポジティブゥエルは青色へ）室温 10分程度（スタンダードとして同封の組み換え品 100ng/mlの色が反応停止後、最終的に〇D450nm= l 程度となるように）

反応停止液（0.5 M 硫酸）を 100 μ 1/ゥェル添加（ポジティブゥエルは黄色へ）

9. プレートリーダにて 450nm及び 650nm測定その結果を前述の実施例 5に示す結果と比較すると、この組み合わせの系は最も低い定量値を示した（表 3 ) 。また、この組み合わせでは後述するヒトプール血漿の FIペーストから精製された本酵素を検出することは出来なかった。このことは、抗体の組み合わせにより定量値が変動するという事実を考慮すると抗体の組み合わせを変えた様々な系の構築（図 1 3 ) の重要性を示している。表 3

実施例 1 0

(遺伝子組換え ADAMTS-13の発現）

ヒト胎児腎細胞株である 2 9 3細胞を用いて組換え ADAMTS- 13の安定発現株を以下の方法で作出した（W0 02/088366) ₀ 概略として、以下の手順でトランスフエクトした。まず初めに 1— 3 X 10⁵個/ ^35讓 dishで細胞を捲き、その翌日に上記発現べクタ一を 2 g当たり 1 0 a 1の Polyamine Trans fect ion Reagentである TransIT (TAKARA社製）をとり、 Opt i- MEM等の無血清培地 1に添加して、試薬添付文書に従い、 DNAとのコンプレックスを調製後、準備しておいた前記各種細胞へ滴下し、 6時間インキュベーションし、その後、培地交換し、さらにその 3日後 G418添加選択培地に交換した。これからさらに 3日毎に培地交換を行ない、選択されたコロニー群から限界希釈法及び先の MoAb (WHlO) -PoAblの ELISA系を利用して、発現クローン（Clone No. VW F CP- 293- 35並びに 293- 2- 4) を確立した。実施例 1 1

(抗体を用いての遺伝子組換え体の培養上清からの遺伝子組換え AD細 TS- 13の精得られた抗体の一例として WH10を用いた例を示す。この抗体を適当な固定化担体に結合させることでァフィ二ティーカラムを作製し、当該酵素の精製に供したァフィ二ティ一カラムの調製には、チッソ社製 NHS活性化セル口ファインを用いて、添付文書に従い抗体を固定化した。これにより調製した約 l m 1の膨潤担体を用いて、実施例 9に示す当該酵素の 2 9 3細胞を宿主とした遺伝子組換え体の発現培養上清をアプライしたのち、 50mM Tris-HCl 0. IM NaCl pH7. 5 (以下 TBS) でカラムを洗浄後、 0. 1Mグリシン pH3バッファーで溶出した。溶出された画分を IM Tris-HCl pH8. 5にて中和し、 TBSに対して透析した。得られた精製酵素の SDS- PAGEを図 1 5に示す。また、得られた精製画分に v W Fを切断する活性が存在することも確認された。そして、この組換え酵素により断片化された v W Fの切断点は、その断片の N末端アミノ酸配列解析から 842Tyr - 843Metの位置であることが確認された。

続いて精製された組換え体由来の ADAMTS-13の部分アミノ酸配列を決定した。常法により、 SDS-PAGE後、 PVDF膜へトランスファーし、風乾したのち、 PEァプラィドバイオシステムズ社のオートプロティンシークェンサ一 492にて解析を行なつた。その結果、部分 N末端配列として Ma_Ma- Gly- Gly- l ie -を有することが明らかとなつた。この配列は、遺伝子構造から推定された当該酵素の成熟体の N末端配列に一致した。

実施例 1 2

(抗体を用いてのヒトプール血漿由来 FIペーストからの ADAMTS- 13の精製）

FIペース卜の可溶化

FIペーストは 12gずつに小分けし凍結保存した。使用する前日に 4 °Cに出して融解させ、翌日、可溶化バッファ一（0. 05° ァザイド、 50 mM Tri s-HCl pH7. 4、 100 mM NaCl) を 10 mg/mLになるよう、 120mL加え 37 で 2時間攪拌した。 lOOOOrpmで 10分間遠心した後、上清を回収し、プレフィルター、 5. O mフィルタ ―、 0. 8 mフィルターの順でろ過したものを可溶化サンプルとした。

v W F切断酵素のゲルろ過クロマ

可溶化した FIペーストを、セフアクリル S- 300HR

の 5 X 90cmカラムにかけ、 1回目のゲルろ過を行なった。可溶化バッファーと同じ 0. 05% ァザイド、 50 mM Tri s - HC 1 pH7. 4、 100 mM NaCl (以後溶出バッファー）を用い、流速は 5 mL/min.、分取は推定分子量 100k〜300kDaに相当する画分をブールし、これに、終濃度 33 %飽和となるよう飽和硫安を少量ずつ滴下した。これをさらに一晩 4°Cに静置した。翌日 10000rpm、 10分遠心し、目的の活性画分を沈殿として回収した。以上の可溶化 ·ゲルろ過 ·硫安沈澱の操作を 5バッチ行ない、一 20°Cで凍結保存した。

1回目のゲルろ過によって得られた硫安沈殿物 2〜3バッチ分を、溶出バッファ一 50mLに溶解し 1回目と同様セフアクリル S-300HRカラム（5 X 90cm)に通液し、 2 回目のゲルろ過を行なった。溶出バッファ一、条件、操作等については 1回目と同様である。この操作を 2回実施した。

2回目のゲルろ過によって得られた硫安沈殿物 2回分を、溶出バッファー 50mL に溶解し、 1、 2回目と同様、セフアクリル S - 300HRカラム（5 X 90cm)にかけ、 3 回目のゲルろ過を実施した。溶出バッファ一、条件、操作等については 1、 2回目と同様である。そして推定分子量 100k〜 3 OOkDaに相当する画分をプールした。このプールサンプルを前述のリコンビナント ADAMTS-13精製と同様の手順にて C lone No. WH10モノクローナル抗体固定化カラムを用いて精製を行なった。その結果、図 1 6に示されるように SDS- PAGEにて 105kDa〜160kDaのサイズを有するほぼ単一の ADAMTS- 13が精製された。この N末端アミノ酸配列を解析したところリコンビナントと同様の結果が得られた。

実施例 1 3

(抗体による本酵素活性の中和）

前述の家兎ポリクローナル抗体による v W F切断酵素の中和活性を評価した。遺伝子組換え ADAMTS-13の 1〜10 g Zm 1 (ブラッドフォード法にて概算）に対して、正常家兎血清、 C末端領域のペプチド配列（配列番号 2 ) Phe-Ser-Pro- Al a-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser- Serを KLHに結合したものを免疫原として得られた家兎抗血清、及び全長 AD崖 TS - 13発現ベクターにより発現された蛋白質により免疫誘導された抗血清（PoAbl) のそれぞれを体積比 1対 1あるいは 10倍希釈した抗血清を 1対 1で予め 3 7 で1時間反応させた後、前述した v W F切断活性のアツセィに供し、その活性の阻害を評価した。その結果、図 1 7に示すごとく本酵素の阻害活性を有するものが調製された (メタ口プロテアーゼのインヒビターである E D T Aを阻害の陽性コントロールとした。）。また、中和活性を有するポリクローナル抗体（ΡοΑΜ)のェピトープ解析の結果（図 4 ) から、 ADAMTS- 13のドメイン構造中の Spacer領域より Ν末側に中和ェピトープが存在することが推察された。またさらに、 PoAb2並びに PoAb3 においても中和能を有することが確認された。これらのことから、中和可能領域として、 metal loprotease領域、 Di s integr in- l ike領域なども想定された。このように中和抗体が作成可能であるということは、 V W F切断酵素に対する自己抗体陽性の後天的 T T P患者様のモデルを構築できる可能性も示唆している。

実施例 1 4

(ヒト血漿中の抗 ADAMTS- 13抗体の検出）

実施例 6に示す方法を利用し、後天性 TTP患者血漿中の抗 ADAMTS- 13抗体の検出を行った。ィムノモジュール 9 6ゥエルプレートに抗 FLAG抗体 2 n g /mL 1 0 0 を固相化したのち FLAGをポリペプチド鎖に付加した ADAMTS-13 wi ld typeを反応させたのち、 5、 1 0、 5 0倍希釈された検体 1 0 0 / Lを 3 7 °C— 時間反応後、プレートを 0. 05 % Tween20を含むトリスバッファ一にて洗浄後、抗ヒト IgHRPコンジュゲ一トと 3 7 ^—時間反応させ洗浄後、 TMBZ等で発色させた。その結果、図 1 8に示されるように後天性の TTP患者血漿（AcQui red) のみが正常血漿 (Normal) 並び先天性 TTP血漿 (Congeni tal) に比べ 450mnの吸光度において突出した値を示し、抗 ADAMTS- 13抗体を有することが確認された。

実施例 1 5

(抗マウス ADAMTS - 13ポリクローナル抗体（P o A b ) の作製）

ヒト同様マウスの本酵素をコードする遺伝子（W0 02/088366) を常法にしたがい導入した発現ベクターをゥサギの皮下 ·皮内または筋肉内にトランスフエクトし、ポリクロ一ナル抗体（PoAb) の作出を行なった。得られた抗体を用いてマウス血漿中より本酵素を免疫沈降させ検出した（図 1 9 ) 。マウスの系統により本酵素の分子サイズが異なることが認められた。また、本ポリクローナル抗体をプレートに固相化し、さらにはピオチン化することで PoAb-PoAbのサンドウイツチ ELISAを構築した（表 4 ) れにより本酵素の血中存在量の測定がマウスでも可能になる。表 4

本明細書に引用されたすベての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。産業上の利用可能性

本願発明の抗体は、 ADAMTS-13に対して特異的に免疫反応性を示す。したがつて ADAMTS- 13酵素量の迅速な検出、本酵素変動に伴う疾病の診断及び ADAMTS- 13の効率的な精製あるいは ADAMTS- 13の酵素活性の中和が可能となる。このように、本願発明の抗体は、 ADAMTS- 13の検出及び精製をはじめとする多種多様の用途を有するものでもある。斯くも有用なこの発明の抗体はこの発明による抗体の製造方法により所望量を容易に得ることができる。

本願発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であると云える。また、本願発明の ADAMTS- 13部分欠失体も機能上重要な領域の決定等に利用することができる。さらにこれら酵素分子を利用した試料中の本酵素に対する抗体の存在の有無の判定が可能となり、血小板減少症のより詳細な原因究明の手段を提供し、これによりあやまった血小板輸注のリスクを回避可能にするものである。

Claims

請求の範囲

1 . フォンビルブランド因子特異的切断酵素（以下、 ADAMTS- 13と称することがある）を構成するアミノ酸配列のうち全長または 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列または前記のいずれかのアミノ酸配列の部分配列もしくは前記アミノ酸配列を含有するポリペプチド鎖よりなる蛋白質またはぺプチドに対する抗体。

2 . ADAMTS-13が霊長類または齧歯類を起源とするものである請求項 1記載の仉体。

3 . 配列番号 1記載の ADAMTS- 13を構成するアミノ酸配列のうち 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ酸配列または前記のいずれかのアミノ酸配列の部分配列もしくは前記アミノ酸配列を含有するポリぺプチド鎖よりなる蛋白質に対する抗体。

4 . 配列番号 1記載の ADAMTS- 13を構成するァミノ酸配列よりなるポリべプチドに対し、当該ポリペプチドの Spacer領域より N末端側または Metal loprotease 領域、 Di s integrin-l ike領域、 Tspl- 1領域、 Cys_rich領域から Spacer領域の間を認識する抗体。

5 . 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載の抗体であって、 ADAMTS- 13を構成するアミノ酸配列のうち 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ酸配列または前記のいずれかのァミノ酸配列の部分配列もしくは前記アミノ酸配列を含有するポリペプチド鎖よりなる蛋白質のァフィ二ティー精製に用いられ得る抗体。

6 . 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載の抗体であって、 ADAMTS- 13を構成するアミノ酸配列のうち 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列または前記のいずれかのアミノ酸配列の部分配列もしくは前記アミノ酸配列を含有するポリペプチド鎖よりなる蛋白質が有する酵素活性を阻害もしくは中和し得る抗体。

7 . ADAMTS- 13の Spacer領域より N末端側、 Metal loprotease領域または Dis integr in- l ike領域を認識する請求項 6記載の抗体。

8. 配列番号 2及び 3の ADAMTS-13部分ペプチドを含有してなる免疫原により調製された抗体。

9. 配列番号 1記載のポリぺプチド鎖の全長あるいはその一部の発現物を免疫あるいはそれを発現する発現ベクターを直接動物にトランスフエク卜し得られる抗体。

1 0. ポリクローナル抗体である、請求項 1から 9のいずれか 1項に記載の抗体。

1 1. モノクローナル抗体である、請求項 1から 9のいずれか 1項に記載の抗体並びにその抗体をコードする遺伝子。

12. ハイブリド一マ株 WH 1 0 (受託番号 FERM BP— 8 174) 、ノ、イブリドーマ株 WH63. 1 (受託番号 FERM B P— 8 1 75 ) 、ハイプリドーマ株 WHS 40. 3 (受託番号 FERM B P _ 8176 ) 、ハイブリド一マ株 P e p 4— 34. 1 (受託番号 FERM BP— 8177) 、ハイブリド一マ株 WH2— 22 - 1 A (受託番号 FERM BP— 8483) 、ハイブリド一マ株 WH 2— 1— 1 (受託番号 FERM B P _ 8484 ) 、ハイプリドーマ株 WH2 - 1 1— 1 (受託番号 FERM B P - 8485 ) 、ハイプリドーマ株 P e p 6 - 6 A (受託番号 FERM B P- 8474) およびハイブリドーマ株 P e p 4- 5 B- 1 (受託番号 FERM B P— 8475 ) からなる群から選択されるハイプリドーマが産生する抗体である請求項 9記載のモノクロ一ナル抗体並びにこの抗体をコードする遺伝子。

1 3. 請求項 1から 1 2のいずれか 1項に記載の抗体によって認識される AMMTS- 13のェピトープに結合または競合的に結合することができる抗体。

14. 請求項 1から 1 3のいずれか 1項に記載の抗体を含む医薬品組成物または診断薬。

1 5. 請求項 1から 1 3のいずれか 1項に記載の抗体を構成成分とする標識蛋白質。

16. 請求項 1から 1 3のいずれか 1項に記載の抗体を産生し得る単離された細胞。

1 7. ハイプリドーマである請求項 16に記載の細胞。

1 8. ハイプリドーマ株 WH 10 (受託番号 FERM BP— 81 74) 、ハイブリドーマ株 WH63. 1 (受託番号 FERM B P— 81 75 ) 、ハイプリドーマ株 WHS 40. 3 (受託番号 FERM B P— 8176 ) 、ハイプリド —マ株 P e p 4— 34. 1 (受託番号 FERM B P— 8 1 77 ) 、ハイプリド —マ株 WH 2 - 22 - 1 A (受託番号 FERM BP— 8483) 、ハイブリド —マ株 WH2— 1— 1 (受託番号 FERM B P _ 8484 ) 、ハイプリドーマ株 WH2 - 1 1— 1 (受託番号 FERM B P— 8485 ) 、ハイプリドーマ株 P e p 6 - 6 A (受託番号 FERM B P - 8474) およびハイプリドーマ株 P e p 4- 5 B- 1 (受託番号 FERM B P— 8475 ) からなる群から選択される請求項 17記載の細胞。

1 9. 請求項 1から 13のいずれか 1項に記載の抗体を含んでなる免疫測定キッ卜。

20. ADAMTS- 13のアミノ酸配列の一部または全部を含むポリペプチドで温血動物を免疫感作する工程と、該免疫感作された温血動物の体液から請求項 1から 1 3のいずれか 1項に記載の抗体を採取する工程を含む抗体の製造方法。

2 1. 温血動物を免疫感作するためのポリペプチドが、 ADAMTS- 13の一部として、配列表における配列番号 1に示すアミノ酸配列の一部または全部を含む請求項 20に記載の抗体の製造方法。

22. 請求項 1から 13のいずれか 1項に記載の抗体を産生し得る単離された細胞を生体内または生体外で培養する工程と、その体液または培養物から該抗体を採取する工程を含む抗体の製造方法。

23. 抗体を産生し得る単離された細胞がハイプリドーマである請求項 22に記載の抗体の製造方法。

24. 塩析、透析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトダラフィ一、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動から選ばれる 1 種または 2種以上を含む精製方法により抗体を採取する請求項 20から 23のいずれか 1項に記載の抗体の製造方法。

2 5 . 請求項 1から 1 3のいずれか 1項に記載の抗体を被験試料に接触させ、免疫反応により ADAMTS- 13を検出することを特徴とする ADAMTS-13の検出方法。

2 6 . 請求項 1から 1 3のいずれか 1項に記載の抗体を利用するラジオィムノアツセィ、ェンザィムィムノアッセィまたは蛍光ィムノアッセィである請求項 2 5に記載の検出方法。

2 7 . 被験試料が生体から採取した生物学的試料である請求項 2 5または 2 6 に記載の検出方法。

2 8 . 請求項 1から 1 3のいずれか 1項に記載の抗体を ADAMTS- 13と夾雑物質とを含む混合物に接触させて抗体に当該蛋白質を吸着させる工程と、吸着した当該蛋白質を抗体から脱着させる工程を含む ADAMTS- 13の精製方法。

2 9 . 抗体が水不溶性担体に結合している請求項 2 8に記載の精製方法。

3 0 . ADAMTS- 13の全長もしくは部分欠失変異体を主成分とする診断薬あるいは医薬品。

3 1 . . ADAMTS- 13の Spacerから N末端側、あるいは metal loprotease領域、 Di s integrin- l ike領域、 Tsp l- 1領域、 Cys_rich領域から Spacer領域を主成分とする請求項 3 0記載の診断薬あるいは医薬品。

3 2 . ADAMTS-13の全長もしくは部分欠失変異体を主成分とした当該ポリぺプチド鎖に対する抗体検出用の試薬 ·診断薬または医薬品。

3 3 . ADAMTS-13の全長もしくは部分欠失変異体を主成分とした抗体検出またはェピトープ解析用抗原の利用及びその調製法。