JP2009236925A - フォンビルブランド因子特異的切断酵素を主成分とする診断薬および医薬品 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ADAMTS-13の全長もしくは部分欠失変異体を主成分とする診断薬あるいは医薬品。
【選択図】なし
Description
本願発明の第二の課題は、斯かる抗体の製造方法を提供することにある。
本願発明の第三の課題は、斯かる抗体の用途を提供することにある。
本願発明の第六の課題は、斯かる全長もしくは改変分子の用途を提供することにある。
[1] フォンビルブランド因子特異的切断酵素(以下、ADAMTS-13と称することがある)を構成するアミノ酸配列のうち全長または1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列または前記のいずれかのアミノ酸配列の部分配列もしくは前記アミノ酸配列を含有するポリペプチド鎖よりなる蛋白質またはペプチドに対する抗体、
[2] ADAMTS-13が霊長類または齧歯類を起源とするものである[1]の抗体、
[3] 配列番号1記載のADAMTS-13を構成するアミノ酸配列のうち1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列または前記のいずれかのアミノ酸配列の部分配列もしくは前記アミノ酸配列を含有するポリペプチド鎖よりなる蛋白質に対する抗体、
[5] [1]から[4]のいずれかの抗体であって、ADAMTS-13を構成するアミノ酸配列のうち1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列または前記のいずれかのアミノ酸配列の部分配列もしくは前記アミノ酸配列を含有するポリペプチド鎖よりなる蛋白質のアフィニティー精製に用いられ得る抗体、
[7] ADAMTS-13のSpacer領域よりN末端側、Metalloprotease領域またはDisintegrin-like領域を認識する[6]の抗体、
[9] 配列番号1記載のポリペプチド鎖の全長あるいはその一部の発現物を免疫あるいはそれを発現する発現ベクターを直接動物にトランスフェクトし得られる抗体、
[10] ポリクローナル抗体である、[1]から[9]のいずれかの抗体、
[11] モノクローナル抗体である、[1]から[9]のいずれかの抗体並びにその抗体をコードする遺伝子、
[14] [1]から[13]のいずれかの抗体を含む医薬品組成物または診断薬、
[15] [1]から[13]のいずれかの抗体を構成成分とする標識蛋白質、
[16] [1]から[13]のいずれかの抗体を産生し得る単離された細胞、
[17] ハイブリドーマである[16]の細胞、
[20] ADAMTS-13のアミノ酸配列の一部または全部を含むポリペプチドで温血動物を免疫感作する工程と、該免疫感作された温血動物の体液から[1]から[13]のいずれかの抗体を採取する工程を含む抗体の製造方法、
[21] 温血動物を免疫感作するためのポリペプチドが、ADAMTS-13の一部として、配列表における配列番号1に示すアミノ酸配列の一部または全部を含む[20]の抗体の製造方法、
[23] 抗体を産生し得る単離された細胞がハイブリドーマである[22]の抗体の製造方法、
[25] [1]から[13]のいずれかの抗体を被験試料に接触させ、免疫反応によりADAMTS-13を検出することを特徴とするADAMTS-13の検出方法、
[27] 被験試料が生体から採取した生物学的試料である[25]または[26]にの検出方法、
[28] [1]から[13]のいずれかの抗体をADAMTS-13と夾雑物質とを含む混合物に接触させて抗体に当該蛋白質を吸着させる工程と、吸着した当該蛋白質を抗体から脱着させる工程を含むADAMTS-13の精製方法、
[30] ADAMTS-13の全長もしくは部分欠失変異体を主成分とする診断薬あるいは医薬品、
[31] ADAMTS-13のSpacerからN末端側、あるいはmetalloprotease領域、Disintegrin-like領域、Tsp1-1領域、Cys-rich領域からSpacer領域を主成分とする[30]の診断薬あるいは医薬品、
[33] ADAMTS-13の全長もしくは部分欠失変異体を主成分とした抗体検出またはエピトープ解析用抗原の利用及びその調製法である。
ADAMTS-13に結合できる抗体を、ここに開示する。これらの抗体は、当該分野において標準的な技術を用いて改変することができる。また、ここに最初に例示する抗体と類似する抗体を、ここに教示する方法と公知の方法とを組み合わせて製造することもできる。抗体を生成するこれらの方法は、哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル)を、ADAMTS-13またはそれらのフラグメントで免疫あるいはADAMTS-13を遺伝子組換え的に発現できる発現ベクターを皮下、皮内もしくは筋肉内にトランスフェクトすることを含む。抗体は、当該分野において公知の様々な技術を用いて、免疫した動物から得ることができ、好ましくは、興味のある抗原に対する抗体の結合を用いて、スクリーニングすることができる。抗体及び/または抗体生成細胞の動物からの単離は、動物を屠殺する工程によって行なうことができる。
本発明の抗体は、様々なアッセイ形式で、本発明の検出または診断方法において用いることができる。抗体は、ADAMTS-13に特異的に結合できる結合剤として用いることができ、例えば、in vitro において試料中のADAMTS-13の検出を可能にする。または試験試料と接触させた後に、試験試料中の被検体(分析対象物)であるvWF切断酵素によって占められた結合剤の結合部位の画分を測定するための現像剤として用いることができる。すなわち、本発明の抗体がその結合部位で、分析対象物と結合し、分析対象物に結合した抗体の量を測定することにより、分析対象物の量もわかり、本発明の抗体をあたかも被検体の存在を明らかにする現像剤のように利用することができる。
(b)抗体を固定化し、さらに試料を接触させた固型支持物を、抗体の未占有結合部位、抗体に結合した結合ADAMTS-13または抗体の占有結合部位に結合できる標識化現像剤と接触させること;及び、(c)試料中におけるADAMTS-13の濃度に相応する値を得るために、工程(b)において特異的に結合した現像剤の標識を検出すること。
(ポリクローナル抗体(PoAb)の作製)
マウスまたはウサギに、常法により(Current Protocols in Molecular Biology: Chapter 11 immunology、Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J.McCAFFERTY et al.あるいはANTIBODY ENGINEERING second edition Edited by Carl A. K. BORREBAECKなど)、ヒトプラズマより部分精製した抗原タンパク、あるいはその一部のアミノ酸配列を有する合成ペプチド(例として、配列番号2または配列番号3記載のペプチド)を適切なキャリアー物質(KLH等)に結合させたもの(KLHを付加しやすくするためにCysをN末端あるいはC末端などに付加したもの)、あるいは遺伝子組換えタンパク質またはそれをコードする遺伝子を導入した発現ベクターを皮下・皮内または筋肉内にトランスフェクトし、モノクローナル抗体発現ハイブリドーマの確立及びポリクローナル抗体(PoAb)の作出を行なった。PoAbに関しては全長または後述するQ449stopまたはP285stopを発現するベクターのトランスフェクトによりPoAb1、PoAb2及びPoAb3の三種を作製した。
(モノクローナル抗体(MoAb)の作製)
Balb/cマウスに、初免疫感作として後肢にフロイント完全アジュバント存在下で遺伝子組換え由来ADAMTS-13または配列番号2もしくは配列番号3記載のペプチドを、KLHをキャリアーとして付加したものを調製した。ADAMTS-13はWO 02/088366に記載の方法で調製すればよい。
96ウェルのマイクロテストプレートに前記のごとく作製した合成ペプチド抗原、または精製抗原(蛋白質濃度0.5〜2μg/ml)を50μl/ウェルで加え、4℃で一晩インキュベートすることにより固相化した。さらに、1%BSA(ウシ血清アルブミン)溶液300μlを加え、同様にインキュベートしてマスキングを行なった。このようにして作製した抗原固相化プレートに細胞融合法によって得られたハイブリドーマ及びクローニング後のハイブリドーマの培養上清を加えて、4℃で1時間インキュベート後、TBSで3回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体溶液 (カッペル社製、5,000倍希釈)を100μl/ウェル加えた。4℃で1時間インキュベート後、TBSにて3回洗浄し、その後TMBZ基質溶液を加え、常法により発色させその吸光度を波長450nmにて測定した。こうして精製抗原と反応するハイブリドーマクローンを選択した。また、この方法はさらにヒト血漿中のADAMTS-13に対する自己抗体検出への応用も可能であった。
ELISAで得られた陽性コロニーについてウエスタン・ブロッティング法によるスクリーニングを行なった。精製抗原を8%のSDS−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、PVDF膜上に移行させ、膜を0.4〜0.5cm幅に切断した。各細片をハイブリドーマ培養上清液に浸し、1時間37℃でインキュベートした。その後、細片をTBST(0.05%Tween含)で3回洗浄した後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG(TAGO社製)の1:2000希釈液中で37℃、1時間インキュベートした。TBSTで3回洗浄後、BCIP/NBTを用いる発色試薬(Bio−Rad社製)で発色させ、精製抗原の発色バンドを示すハイブリドーマを選択しクローニングした。クローニング後のハイブリドーマクローンについても同様の手法で選別した。上記の選別方法によって所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマがおよそ30クローン得られた。また、この方法はさらにヒト血漿中のADAMTS-13に対する自己抗体検出への応用も可能であった。
(ADAMTS-13C末欠失変異体の作製)
図1に示すストラテジーにより、全長のvWF切断酵素遺伝子クローニングベクター(pCR2.1vWFCP)を利用して、全長及び配列番号表4から18に示すプライマーを用いてC末端より逐次ドメインを欠失させた変異体(Full1427stop、T1135stop、W1016stop、W897stop、W808stop、W746stop、W688stop、T581stop、Q449stop、W387stop、P285stop、:それぞれの数字は開始コドンATGのコードするMetから終結コドンまでのアミノ酸の残基数を示し、FLAGエピトープ(DNA配列:gactacaaggacgatgacgataagtga(配列番号表19)、アミノ酸配列:Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys(配列番号表20))を付加した部位を示す。)を発現する遺伝子を調製し、pCAG発現ベクター(Niwa, H., et al. Gene vol.108, 193-199)に組み込み、Hela細胞を用いて、以下の手順でトランスフェクトした。
(ADAMTS-13C末欠失変異体のvWF切断活性確認)
vWFの調製
vWFは、セファクリルS-500HR(アマシャムファルマシア)の2.6×90 cmカラムにより、プラズマクリオ画分2gを20 mLのバッファー(0.01% Tween-80 / 50 mM Tris-HCl / 100mM NaCl pH 7.4)に溶解したものをゲル濾過することにより調製した(WO 02/088366を参照)。
vWF切断活性のアッセイは、WO 02/088366に記載の方法で行った。すなわち、終濃度10mMの塩化バリウムを加えたサンプルを37℃で5分間プレインキュベートし、プロテアーゼの活性化を行なった。50mLのファルコンチューブにバッファー(15〜20mLの1.5M Urea / 5mM Tris-HCl pH8.0)を入れた。次にミリポア社製のメンブレンフィルター(0.025μm)を浮遊させ、50μLのvWF基質溶液を加えて混合した活性化サンプルを100μL添加した。37℃のインキュベーターに一晩静置して翌日フィルターから回収した。回収したサンプルを、以下のSDS-PAGEの項に示すvWFの切断パターンにより評価した。
SDS-5%ポリアクリルアミドゲルを自家調製し使用した。vWF切断活性のアッセイ項で述べたサンプル10μLに、SDS泳動バッファー(還元剤2-メルカプトエタノール存在下または不在下)2μLを加え3分間煮沸したものを泳動サンプルとした。30mAで1時間電気泳動したのち、ゲルはCBB染色を利用したGel Code Blue Stain Reagent(PIERCE社)にて染色した。
(ウェスタンブロットを利用した抗体のエピトープの解析)
常法により、ウェスタンブロットを行ない、確立したポリクローナル抗体(PoAb1, PoAb2)及びお互いに認識部位が競合しないと考えられたモノクローナル抗体数種(本発明者らが先に作製したClone No. WH10(FERM BP-8174)に加えて、WH63.1(FERM BP-8175)、WHS40.3(FERM BP-8176)、Pep4-34.1(FERM BP-8177))についての認識領域を特定するため、実施例4記載の部分欠失改変分子の一時発現培養上清を利用し、ウェスタンブロットを行なった(図4〜9)。
(ELISAを利用した抗ADAMTS-13抗体のエピトープ領域の確認)
イムノモジュール96ウェルプレートに抗FLAG抗体10μg/mL 100μLを固相化したのちFLAGをポリペプチド鎖に付加した ADAMTS-13 wild typeもしくは各種上記欠失変異体を固相化、もしくはFLAGの付加に無関係に直接プレートへ本酵素変異体を固相化し、公知の方法によりブロッキング操作を施したプレートに適当に希釈されたMoAbの100μLを反応後、プレートをTweenなどの界面活性剤を含有するバッファーにて洗浄後、抗マウスIgHRPコンジュゲートと37℃一時間反応させ洗浄後、TMBZ等で発色させることにより、実施例5同様なエピトープ領域の絞込みを行なった。その結果、実施例5で示された結果を支持した。また、この方法はヒト血漿中に存在する抗ADAMTS-13抗体の検出並びにエピトープ解析に有効であると考えられた。
(確立された抗体を用いてのウェスタンブロットによるヒト血漿中のADAMTS-13の検出)
続いて、上記種々の方法により調製された抗体を用いて、常法により(Current Protocols in Molecular Biology: Chapter 10 analysis of proteins、Chapter 11 immunologyなど)、本酵素のウエスタンブロット法による検出を行なった。本酵素のC末端領域のペプチド配列(配列番号2)Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-SerをKLHに結合したものを免疫原として得られたペプチド抗体により、還元条件下、健常人血漿、TTP患者血漿中から本酵素の検出を行なったところ、一部のTTP患者血漿では明瞭ではないが、概ね250kDa程度の本酵素由来のシグナルと想定されるバンドが確認された(図11)。
(確立された抗体を用いた酵素免疫測定法によるヒト血漿中のADAMTS-13の検出・測定1)
得られたポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の組み合わせ(MoAb-PoAbの系)により(認識エピトープは図10参照)構築される酵素免疫測定法(ELISA)を用いて(図12)、様々な検体での本酵素の定量を行なった。測定方法の工程を以下に示す。
2. WH10 MoAb固定化プレートにサンプルを100μl/ウェル添加
37℃ 1時間
3. 0.05% Tween-20 -TBSでプレート洗浄3回
4. PoAb 1 またはPoAb 2を1μg/mlとなるよう希釈液(1%BSA-TBS)にて希釈し、100μl/ウェル添加
37℃ 1時間
6. 抗ウサギIgG-HRP標識コンジュゲートを希釈液(1%BSA-TBS)にて10000倍希釈し、100μl/ウェル添加
37℃ 1時間
7. 0.05% Tween-20 -TBSでプレート洗浄3回
8. TMB基質液(直前に室温で2液を混ぜたもの)100μl/ウェル添加(ポジティブウェルは青色へ)室温10分程度(スタンダードとして同封の組み換え品100ng/mlの色が反応停止後、最終的にOD450nm=1 程度となるように)反応停止液(0.5 M 硫酸)を100μl/ウェル添加(ポジティブウェルは黄色へ)
9. プレートリーダにて450nm及び650nm測定
(確立された抗体を用いた酵素免疫測定法によるヒト血漿中のADAMTS-13の検出・測定2)
得られたモノクローナル抗体を組み合わせることで構築される酵素免疫測定法(MoAb-MoAbの系)(図14)により、数検体のヒト血漿中の本酵素の定量を行なった。測定方法の工程を以下に示す。
2. WH10 MoAb固定化プレートにサンプルを100μl/ウェル添加
37℃ 1時間
3. 0.05% Tween-20 -TBSでプレート洗浄3回
4. ビオチン化抗体を1μg/mlとなるよう希釈液(1%BSA-TBS)にて希釈し、100μl/ウェル添加
37℃ 1時間
6. ストレプトアビジン-HRP標識コンジュゲートを希釈液(1%BSA-TBS)にて10000倍希釈し、100μl/ウェル添加
37℃ 1時間
7. 0.05% Tween-20 -TBSでプレート洗浄3回
8. TMB基質液(直前に室温で2液を混ぜたもの)100μl/ウェル添加(ポジティブウェルは青色へ)室温10分程度(スタンダードとして同封の組み換え品100ng/mlの色が反応停止後、最終的にOD450nm=1 程度となるように)
反応停止液(0.5 M 硫酸)を100μl/ウェル添加(ポジティブウェルは黄色へ)
9. プレートリーダにて450nm及び650nm測定
(遺伝子組換えADAMTS-13の発現)
ヒト胎児腎細胞株である293細胞を用いて組換えADAMTS-13の安定発現株を以下の方法で作出した(WO 02/088366)。概略として、以下の手順でトランスフェクトした。まず初めに1−3×105個/35mm dishで細胞を捲き、その翌日に上記発現ベクターを2μg当たり10μlのPolyamine Transfection ReagentであるTransIT(TAKARA社製)をとり、Opti-MEM等の無血清培地200μlに添加して、試薬添付文書に従い、DNAとのコンプレックスを調製後、準備しておいた前記各種細胞へ滴下し、6時間インキュベーションし、その後、培地交換し、さらにその3日後G418添加選択培地に交換した。これからさらに3日毎に培地交換を行ない、選択されたコロニー群から限界希釈法及び先のMoAb(WH10)-PoAb1のELISA系を利用して、発現クローン(Clone No.VWFCP-293-35並びに293-2-4)を確立した。
(抗体を用いての遺伝子組換え体の培養上清からの遺伝子組換えADAMTS-13の精製)
得られた抗体の一例としてWH10を用いた例を示す。この抗体を適当な固定化担体に結合させることでアフィニティーカラムを作製し、当該酵素の精製に供した。アフィニティーカラムの調製には、チッソ社製NHS活性化セルロファインを用いて、添付文書に従い抗体を固定化した。これにより調製した約1mlの膨潤担体を用いて、実施例9に示す当該酵素の293細胞を宿主とした遺伝子組換え体の発現培養上清をアプライしたのち、50mM Tris-HCl 0.1M NaCl pH7.5(以下TBS)でカラムを洗浄後、0.1MグリシンpH3バッファーで溶出した。溶出された画分を1M Tris-HCl pH8.5にて中和し、TBSに対して透析した。得られた精製酵素のSDS-PAGEを図15に示す。また、得られた精製画分にvWFを切断する活性が存在することも確認された。そして、この組換え酵素により断片化されたvWFの切断点は、その断片のN末端アミノ酸配列解析から842Tyr-843Metの位置であることが確認された。
(抗体を用いてのヒトプール血漿由来FIペーストからのADAMTS-13の精製)
FIペーストの可溶化
FIペーストは12gずつに小分けし凍結保存した。使用する前日に4℃に出して融解させ、翌日、可溶化バッファー(0.05% アザイド、50 mM Tris-HCl pH7.4、100 mM NaCl)を10 mg/mLになるよう、120mL加え37℃で2時間攪拌した。10000rpmで10分間遠心した後、上清を回収し、プレフィルター、5.0μmフィルター、0.8μmフィルターの順でろ過したものを可溶化サンプルとした。
可溶化したFIペーストを、セファクリルS-300HR(アマシャムファルマシア)の5×90cmカラムにかけ、1回目のゲルろ過を行なった。可溶化バッファーと同じ0.05% アザイド、50 mM Tris-HCl pH7.4、100 mM NaCl(以後溶出バッファー)を用い、流速は5 mL/min.、分取は推定分子量100k〜300kDaに相当する画分をプールし、これに、終濃度33%飽和となるよう飽和硫安を少量ずつ滴下した。これをさらに一晩4℃に静置した。翌日10000rpm、10分遠心し、目的の活性画分を沈殿として回収した。以上の可溶化・ゲルろ過・硫安沈澱の操作を5バッチ行ない、−20℃で凍結保存した。
(抗体による本酵素活性の中和)
前述の家兎ポリクローナル抗体によるvWF切断酵素の中和活性を評価した。遺伝子組換えADAMTS-13の1〜10μg/ml(ブラッドフォード法にて概算)に対して、正常家兎血清、C末端領域のペプチド配列(配列番号2)Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-SerをKLHに結合したものを免疫原として得られた家兎抗血清、及び全長ADAMTS-13発現ベクターにより発現された蛋白質により免疫誘導された抗血清(PoAb1)のそれぞれを体積比1対1あるいは10倍希釈した抗血清を1対1で予め37℃で1時間反応させた後、前述したvWF切断活性のアッセイに供し、その活性の阻害を評価した。
(ヒト血漿中の抗ADAMTS-13抗体の検出)
実施例6に示す方法を利用し、後天性TTP患者血漿中の抗ADAMTS-13抗体の検出を行った。イムノモジュール96ウェルプレートに抗FLAG抗体2μg/mL 100μLを固相化したのちFLAGをポリペプチド鎖に付加した ADAMTS-13 wild typeを反応させたのち、5、10、50倍希釈された検体100μLを37℃一時間反応後、プレートを0.05%Tween20を含むトリスバッファーにて洗浄後、抗ヒトIgHRPコンジュゲートと37℃一時間反応させ洗浄後、TMBZ等で発色させた。その結果、図18に示されるように後天性のTTP患者血漿(Acquired)のみが正常血漿(Normal)並び先天性TTP血漿(Congenital)に比べ450nmの吸光度において突出した値を示し、抗ADAMTS-13抗体を有することが確認された。
(抗マウスADAMTS-13ポリクローナル抗体(PoAb)の作製)
ヒト同様マウスの本酵素をコードする遺伝子(WO 02/088366)を常法にしたがい導入した発現ベクターをウサギの皮下・皮内または筋肉内にトランスフェクトし、ポリクローナル抗体(PoAb)の作出を行なった。得られた抗体を用いてマウス血漿中より本酵素を免疫沈降させ検出した(図19)。マウスの系統により本酵素の分子サイズが異なることが認められた。また、本ポリクローナル抗体をプレートに固相化し、さらにはビオチン化することでPoAb-PoAbのサンドウィッチELISAを構築した(表4)。これにより本酵素の血中存在量の測定がマウスでも可能になる。
Claims (4)
- ADAMTS-13の全長もしくは部分欠失変異体を主成分とする診断薬あるいは医薬品。
- ADAMTS-13のSpacerからN末端側、あるいはmetalloprotease領域、Disintegrin-like領域、Tsp1-1領域、Cys-rich領域からSpacer領域を主成分とする請求項1記載の診断薬あるいは医薬品。
- ADAMTS-13の全長もしくは部分欠失変異体を主成分とした当該ポリペプチド鎖に対する抗体検出用の試薬・診断薬または医薬品。
- ADAMTS-13の全長もしくは部分欠失変異体を主成分とした抗体検出またはエピトープ解析用抗原の利用及びその調製法。
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