KR100202773B1 - 프로트롬빈 활성화 펩타이드 및 그것의 분해생성물에 대한 모노클론 항체 및 면역 분석법 - Google Patents

프로트롬빈 활성화 펩타이드 및 그것의 분해생성물에 대한 모노클론 항체 및 면역 분석법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 프로트롬빈 활성화 정도를 측정함으로써 혈전증을 예측하기 위한 면역분석법에 사용할수 있는, 프로트롬빈 활성화 펩타이드와 프로트롬빈 활성화 펩타이드 분해 생성물의 카르복시 말단에 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클론 항체 및 그것의 단편에 관한 것이다. 이 모노 클론 항체는 또한 상기 면역분석을 시행하기 위한 킷트에 포함되기도 한다.

Description

[발명의 명칭]
프로트롬빈 활성화 펩타이드 및 그것의 분해 생성물에 대한 모노클론 항체 및 면역 분석법
[발명의 배경]
본 발명은 응고(coagulation) 분야에 관한 것이며, 특히 프로트롬빈 활성화 펩타이드 F1.2 및 F1.2.3와 그것의 분해 생성물 des-R F1.2, F2 및 des-R F2(항원)의 에피토프에 대한 모노클론 항체와, 항원을 검출하기 위한 면역 분석법에서 그리고 진단용 키트의 성분으로서 상기 모노클론 항체 및 그 단편을 이용하는것에 관한 것이다.
혈전증은 응혈괴(혈전)가 혈관 또는 심장의 정성적인 혈류를 방해하는 심각한 질환이며 때로는 치명적이다. 피브린은 피브리노겐에 대한 혈액 응고 단백질 트롬빈의 작용으로 생성되는 단백질이다. 혈전은 혈관이나 심장 강(腔)의 표면 또는 내면위의 적혈구 세포 또는 응집 혈소판과 혈액 성분, 주로 피브린의 축적물이다. 혈전은 불용성 피브린 중합체를 포함하는데, 이것은 이후 피브린 용해에 의해 분해된다. 혈전은 정상적인 혈류를 방해하여, 심각하고 때로는 치명적인 결과를 야기할 수 있다.
6천 4백만 이상의 미국인이 혈전증의 증가된 위험과 연관된 질병인 심장 혈관병(CVD)을 겪고 있다. 심장 마비, 졸중(stroke), 고혈압, 동맥경화증, 류마티스성 심장병 및 선천성 심장 기형을 포함하는 CVD는 미국 내의 전체 사망률 중 50% 이상에 해당된다. 480만 이상의 미국인이 심장마비, 협심증 또는 그 둘다를 앓은 적이 있다. 1989년에, 150만 명의 새로운 심장마비 환자가 발생할 것으로 추정되며, 65세 이하에서 45% 가 발생하고, 75% 이상이 입원을 필요로 하며 1/3 이상이 사망할 것이다. 거의 2백만 명의 졸중 희생자가 오늘날 생존해 있고 매년 약 500,000명이 졸중으로 고통당하고 있다. 총 CVD 사망자중 1/5이 65세 이하이다. CVD에 대한 연간 의료보험 비용은 1988년중 $ 830억이 넘는 것으로 예상된다.
또한 다른 질병도 혈전증 경향을 증가시키는 것으로 나타났다. 여기에는 암, 임신, 노령, 외상, 경구 피임제 사용, 당뇨병, 간 및 신장질환과 비만증이 포함되지만, 이것에 제한되지는 않는다.
항응고제(anticoagulant) 치료시 환자의 혈전증 위험성을 최소화하는 것은 환자 치료의 또 다른 분야이다. 항응고제를 투여할 때, 효과적인 치료를 유지하기 위해서는 원하는 약물의 레벨을 측정할 필요가 있다. 현재 항응고제 경구 치료에 적당한 투여용량은 환자의 프로트롬빈 시간(prothrombin time) (PT)를 모니터 함으로써 설정되는데, 이것은 정상 혈장에서 수득되는 양의 약 1½ 내지 2½ 배로 유지된다. 헤파린 치료에 적당한 투여용량은 종종 환자의 활성화된 부분적 트롬보플라 스틴 시간(activated partial thromboplastin time) (APTT)을 모니터함으로써 설정되기도 하는데, 이것은 콘트롤의 1.5배 이상으로 유지된다.
혈액응고는 매우 복잡한 과정이며, 오늘날까지 완전히 이해되지 않고 있다. 응고 경로중 최종 단계는 혈전 형성에 필요한 성분인 피브린의 형성이다. 프로트롬빈 활성화 및 그와 연관된 트롬빈의 생성은 피브린 형성에 필수적이다. 응고 캐스캐이드에 있어서, 프로트롬빈 활성화는 제1a도에 도시되어 있으며, 프로트롬빈 활성화 생성물 및 그것의 분해 생성물은 제1b도에 도시되어 있다. 인자 Xa는 응고인자 Va, 칼슘 및 자극된 혈소판의 존재하에 프로트롬빈 활성화를 촉매하고, 프로트롬빈을 두 부위(즉, Arg 271-Thr 272 및 Arg 320-Ile 321)에서 절단하여 프로트롬빈 활성화 펩타이드 단편 F1.2와 트롬빈을 생성한다.
상기 절단은 프로트롬빈 상에는 존재하지 않는 F1.2 상의 카르복시 말단을 노출시키는데, 이 카르복시 말단은 F1.2에 특유한 에피토프를 포함한다. 트롬빈은 단일 절단(Arg 155-Ser 156)에 의해 F1.2를 분해하여 프토프롬빈 단편 F1과 프로트롬빈 단편 F2를 생성할 수 있다. 라비에트(MJ. 261J. Biol. Chem. 13210-13215(1986))는 F1.2 보다 13개 아미노산 길이가 더 긴 펩타이드인 프로트롬빈 활성화 펩타이드 단편 1.2.3 이 Arg 284-Thr 285 절단에 의해 응고 혈장에서 형성된다는 사실을 제시하였다. F1.2.3은 매우 불안정하고 프로테아제 억제 인자가 존재할 때만 검출될 수 있다.
순환시, 혈장 카르복시펩티다제는 카르복시 말단에서 최종 아미노산(아르기닌, R)을 제거함으로써 F1.2 또는 F2를 더욱 분해하여, 분해생성물 des-R F1.2 또는 des-R F2를 생성할 수 있다. 이것은 케노베스와 테거-닐슨의 연구를 근거로 가정된 것으로서(Chenoweth, D.E., 75, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3943-3947(1968); Teger-Nilsson, A. C., 22 Acta Chem. Scand. 3171(1968)) 이들은 보체 성분 C5a와 피브리노펩타이드 B의 des-R형을 입증했으며, 이것은 공지된 순환성 카르복시 펩티다제에 대한 기질이다. 카르복시펩티다제는 바람직하게는 글리신 또는 알라닌이 말단 아르기닌 바로 앞에 있는 경우 이 말단 아르기닌을 절단 한다(Mckay, T.J., 197 Archives Biochem. Biophysics 487 -492(1979)). 글리신은 F1.2와 F2의 카르복시 말단 서열인 말단 아르기닌의 바로 앞에 위치하고 있으며, 상기 F1.2와 F2는 둘다 카르복시펩티다제에 대한 효과적인 기질이고, 따라서 절단될 것으로 예상된다.
F1.2는 271 아미노산으로 구성되며 약 90분의 반감기로 순환한다( Bauer, K.A., 76J. Clin. Invest. 826-836(1985)). 이것은 F1과 F2 두 영역을 포함하는 것으로 정의될 수 있다. F1 영역은 F1,F1.2 및 프로트롬빈에 필수적인 특정한 칼슘-결합 아미노산, 감마 카르복시글루탐산을 포함하며, 따라서 정상의 인지질 결합 활성에 요구되는 정상적인 칼슘 의존성 구조임을 추정할 수 있다.
항원의 생성은 트롬빈의 형성과 응고인자 Xa의 활성을 나타낸다. 현재, 혈전증 위험성의 증가와 관련된 임상 상태에서 F1.2 레벨은 증가하며, 항응고제 치료시 감소한다는 사실이 알려져 있다(Bauer, K.A., 70 Blood 343-350(1987)). 이러한 레벨의 측정은 환자 치료에 중요하다.
트롬빈이 다수의 천연 기질 및 억제인자를 갖기 때문에 트롬빈과 항원의 형성이 피브린 형성과 동시에 일어날 필요는 없다. 그러나, 더 많은 프로트롬빈 활성화가 일어날수록, 트롬빈의 양도 증가하고, 피브린 형성 및 가능하게는 혈전 형성의 가능성이 증가하게 될 것이다. 역으로, 프로트롬빈 활성화가 적을수록, 피블리노겐을 절단할 수 있는 트롬빈의 양과 혈전 형성의 가능성도 또한 감소한다.
현재, 활성 혈전증을 진단하는 것 뿐만 아니라 응고에 있어서 출혈 문제를 예견하고 진단하기 위한 많은 시험들이 있다. 예를 들면, PT는 1 단계의 응고 분석법이고, 이것은 인자, X 및 V, 프로트롬빈 및 피브리노겐을 포함하는 응고 시스템의 일부분의 전체 온전한 상태를 시험하며, 경구용 항응고제를 환자에게 투여할 때 유용하다. 전술한 바와 같이, APTT는 헤파린 항응고제 치료를 모니터 하는데 유용하다. 방사능 면역 분석법도 천연 및 비정상 프로트롬빈 레벨을 측정하는데 이용할 수 있다.
피브리노펩타이드 A와 가용성 피브린을 비롯하여, 트롬빈 활성의 결과를 측정하는 면역학적 시험법도 몇 종류가 있다. 피브리노펩타이드 A의 레벨은 명백한 혈전증과 더불어 증가하지만, 피브리노펩타이드 A의 농도와 혈전증의 위험성 사이에는 약한 상관 관계가 있다. 트롬빈-안티트롬빈복합체에 대한 폴리클론 항체-기초 면역분석법은 그것의 주요 생리학적 억제인자인 안티트롬빈에 의해 결합되는 불활성 트롬빈의 순환 농도를 측정하는데 이용할 수 있다.
응고 과정에서 이후에, 형성된 혈전의 플라즈민에 의한 섬유소 용해가 발생하고, 이것은 D-이량체, 총 분해 생성물 및 피브린 분해 생성물 등과 같은 몇가지 면역학적 시험에 의해 측정할 수 있다.
전술한 분석법중 어느 것도 혈전증을 예측할 수 있는 것은 없는 것으로 밝혀졌다.
고 민감성 모노클론 항체에 기초한 시험은 현재 프로트롬빈의 활성화 정도를 측정하는데 이용할 수 없다. 상기 시험은 환자의 증가된 혈전증 위험성을 확인 하는데 유용하며, 항응고제 치료시 환자의 상태를 개선시키며, 2차 합병증의 진단기술을 개선하며, 혈전증으로 인한 사망률을 경감시키고, 혈전증에 의해 사회에 부과되는 경제적 부담을 감소시키는데 유용하다.
F1.2의 측정을 통해 프로트롬빈 활성화를 측정하기 위한 일부 분석법이 문헌에 기재되어 있다. 에이치. 라우(H. Lau, 254 J. Biol. Chem. 8751-8761(1979))는 F2에 대한 폴리클론 항체를 사용하여 프로트롬빈 단편 F2/F1.2을 정량하기 위한 방사능 면역 분석법을 기재하고 있다. 이러한 폴리클론 항체는 여러 가지 면역정제 단계를 거치지 않으면 절단에 의해 방출된 단편과 프로트롬빈을 완전히 구분하지 못한다.
EPA 0 303 983 호( '983)에서는 F2/F1.2의 카르복시 말단에 해당하는 합성펩타이드를 사용하여 동물을 면역화 시킴으로써 F2/F1.2에 대한 폴리클론 항 혈청을 수득할 수 있는 유사한 분석법을 기재하고 있다. 이 항체들도 또한 F1.2 검출을 위한 면역분석에서 기능하기 위해서는 면역 정제가 요구된다.
'983에서 개시하고 있는 면역 분석법은 F1.2의 카르복시 말단의 에피도프에 결합하는 정제된 폴리클론 항체로 고체상을 코팅하며, 그 다음 검출 항체로서 표지화된 폴리클론 항-프로토롬빈을 도입한다. 이 분석법은 F1.2를 검출할 수 있는 능력을 갖지만, 낮은 특이성 및 시약 셋트의 표준화의 어려움을 비롯하여 폴리클론을 사용함에 있어서 갖는 문제점이 존재한다(참고 Pelzer, H., 18 Supp. 2 Haemostasis Abst. No. 102(1988)).
초록 단편 F1.2에 대한 2-부위 효소 면역 분석법을 사용한 프로트롬빈 활성화의 검출법(Shi, Q., 62 Thromb. Hemost. 165, Abst. No. 493(1989))에서는 '983과 유사한 면역원 및 시험 분석법이 기재되어 있다. F1.2 카르복시 말단을 모의한 합성 펩타이드에 대한 폴리클론 항체는 고체상 포획 항체로서 사용되며 표지화된 모노클론 항-F1.2는 검출용으로, 가장 가능하게는 F1 영역을 검출하는데 사용된다. 사이(Shi)등은 폴리클론 포획 항체의 면역친화성 정제가 필요치 않음을 제시하고 있다. 다른 정제법이 사용되는지의 여부는 상기 초록에 나타나 있지 않다. 상기 시약은 폴리클론 항체이기 때문에, 그것의 특이적인 이용성은 공여체(donor) 동물의 수명에 의해 제한되며 재생성이 없다.
프로트롬빈 활성화를 측정하고, 혈전증 상태 형성을 진단하며, 항응고제 치료의 효과를 모니터 하기 위한 항원 검출 문제의 해결책이 F1.2를 검출하는 방사능 및 효소 면역분석법을 사용함으로써 제시되었지만, 현재 유용한 시험법은 사용이 번거롭거나 임상 의사가 사용할 정도로 민감하지 않거나 특이적이지 않다. 모든 공지된 분석법이 갖고 있는 단점중 하나는, 포획 항체로서 폴리클론 항체를 사용하는 것이다. 프로트롬빈, F1 및 가능하게는 F1.2 이외의 다른 단편이 상기 폴리클론에 의해 포획될수 있으며, 따라서 이 시험의 특이성을 감소시킨다.
상기 항원에 대한 모노클론 항체 및 이러한 고 특이성 및 고 민감성 모노클론 항체 또는 그것의 단편을 사용하는 신규한 면역 분석법이 요구된다.
[발명의 요약]
본 발명은 샘플 중에서, 프로트롬빈 활성화 펩타이드 F1.2 및 F1.2.3과 그것의 분해 형태 des-R F1.2, F2 및 des-R F2를 분석하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 특히, 각 항원의 카르복시 말단의 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 모노클론 항체 및 그것의 단편을 청구하고 있다. 또한 상기 모노클론 항체를 함유하는 항원에 대하여 샘플을 분석하기 위한 진단용 키트를 청구하고 있다.
[본 발명의 상세한 설명]
본 발명의 항체는 상기 항원의 카르복시 말단에 특이적인 모노클론 항체이다. 특히 적당한 항원의 아미노산 서열에 근거한 합성 펩타이드를 합텐(hapten)으로 사용하여 상기 모노클론 항체를 수득하였다.
합성 펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연결되는 공지된 서열의 아미노산 쇄이고, 가령 화학적 수단이나 재조합 수단에 의해 제조할 수 있다. 이 서열은 특정한 천연 단백질의 서열과 동일할 수 있다. 작은 합성 펩타이드를 적당한 담체 단백질과 결합시켜서 면역원성을 갖게 할 수 있다.
상기 결합된 펩타이드를 동물에서 면역원으로 사용하여 항원의 카르복시 말단 에피토프에 결합하는 모노클론 항체를 생성하며, 이를 합성 펩타이드로 표시한다.
본 발명의 합성 펩타이드에 사용되는 서열은 프로트롬빈의 cDNA 서열 및 프로트롬빈의 공지된 절단 부위로부터 유도되었다. 특히, 절단시 새롭게 노출되는 카르복시 말단기의 서열을 사용했다. 이 서열을 사용하여, 프로트롬빈과의 교차반응성이 (있다면) 낮은 모노클론 항체를 산출하여 선별했다.
F1.2의 카르복시 말단 및 F2에 대한 모노클론 항체를 생산하는 면역원성 결합체(conjugate)에 있어서 합성 펩타이드의 한 아미노산 서열은 적어도 Ile-Glu-Gly-Arg-OH를 포함한다. 가장 바람직한 합성 펩타이드는 서열 Ser-Asp-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OH를 포함한다. 카르복실 산으로서 카르복시 말단의 아르기닌은 상기 특정 면역원의 필수 성분이다.
F1.2.3의 카르복시 말단에 대한 모노클론 항체를 산출하기 위해 면역원으로서 사용되는 합성 펩타이드의 아미노산 서열은, 최소한 서열 Phe-Asn-Pro-Arg-OH를 갖는다. 가장 바람직한 서열은 Tyr-Gln-Thr-Phe-Phe-Asn-Pro- Arg-OH 이다. 분해 단편 des-R F1.2 및 des-R F2에 대한 모노클론 항체를 생성하기 위하여, 바람직한 서열은 Ser-Asp-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OH이다.
상기 펩타이드는 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 펩타이드 합성을 위한 유기 화학적 방법으로는, 균질상 이나 고체상을 사용하여 축합반응으로 아미노산을 커플링시키는 방법이 포함된다. 흔히 알려진 축합 반응의 방법은 카르보디이미드법, 아자이드법, 혼합 무수물 법 활성화된 에스테르를 사용한 방법(참고, The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology Vo1. 1-3(E. Gross ed. 1979, 1980, 1981))이 포함된다. 고체상 방법은 메리필드(Merrifield, 85 J. Amer. Chem. Soc. 2149(1963))에 의해 기재되어 있다. 적당한 펩타이드는 캠브리지 리서어치 바이오케미칼스(영국, 캠브리지 소재) 또는 멀티플 펩타이드 시스템즈(미국, 캘리포니아, 산디에고 소재)와 같은 공급처에서 시판되고 있다.
본 발명자는 선택한 합성 펩타이드를 담체 분자에 결합시켜서 면역원을 생성했다. 임의의 유효한 담체 분자를 사용할 수 있다. 적당한 담체 분자로는, 예컨대, 오브알부민, 다당류, 바다의 키홀 림펫(marine keyhole limpet) 헤모시아닌 및 트랜스페린이 포함된다. 본 발명에 사용하기에 가장 바람직한 담체는 오브알부민이다.
결합 방법은 당업자에게는 공지된 방법이며, 화학적 가교제 또는 산화반응의 사용을 포함할 수 있다(예, Peter, K., 46 Ann, Rev. Biochem. 523- 51(1977)). 본 발명자는 가교제 N-숙신이디닐 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP)와 칼슨제이의 기본 방법(Carlsson, J., 173 Biochem J. 723-737(1978))을 사용하여 담체 단백질과 합성 펩타이드의 결합체를 제조했다.
엠. 시안프리그리아(M. Cianfriglia, 외., 2(4) Hybridoma 451-457(1983))에 의해 기재된 마우스의 면역화 변형 방법은 적절한 항-항원 모노클론 항체를 생산했다. 상기 변형 방법은, 다른 면역화 프로트콜을 사용한 종래 5가지의 융합법이 면역원에 특이적인 적당한 IgG 모노클론 항체를 생산하지 못하기 때문에 필수적이다. 그러나, 상기 적절한 모노클론 항체를 생산하지 않는 면역화된 마우스의 혈청은 상기 항원에 대해높은 반응성 및 특이성을 갖는 폴리클론 항체를 포함하고 있다.
완전 프로인트 보조제(complete Freund`s adjuvant)내의 결합된 합성 펩타이드를 복강내( I.P.)로 주사함으로써 마우스를 면역화 했다. 초회항원 자극(priming)이후, 21일간 상기 마우스에게 휴식을 준 후, 불완전 프로인트 보조제 내의 동일한 면역원으로 추가자극(boost) 했다. 최종 자극은 정맥내(I.V.) 및 복강내(I.P.) 두 경로로 PBS 중의 동일한 면역원을 사용하여 25, 26 및 27일경에 실시했다. 마우스가 바람직한 매개체이지만, 래트와 기니아 피그와 같은 다른 동물도 사용할 수 있다.
상기 면역화된 마우스를 28일째에 죽이고 비장 세포를 수거했다. 콜러 및 밀스타인(Kohler and Milstein, 256 Nature 495(1975))의 변형 방법(B. Butman, 외., 54 Appl. Env. Micro. 1564-1569(1983))에 의하여 상기 세포를 비-분비자(non-secretor) 혈청 세포주( P3x63Ag8.653, ATCC 번호 CRL 1580, 메릴랜드주, 록크빌 소재)와 융합하여 하이브리도마를 생성하고, 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove`s Modified Dulbecco`s medium) + 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT)와 20% 말 혈정 이나 5% 소 태아 혈청, 1% 뉴트리도마(베링거 만하임), 및 복막 단핵 공급자(feeder) 세포를 포함하는 마이크로타이터 트레이에 배분하였다. 간접 효소-결합 면역 분석법(ELISA)에 의해 상청액을 항-항원 항체에 대하여 스크리닝하고, 선별된 포지티브 하이브리도마 배양물을 클로닝하였다.
상기 적당한 항체를 생성하기 위한 하이브리도마의 스크리닝은 본 발명의 중요한 단계이다. 예를 들면, F1.2에 대한 모노클론 항체의 스크리닝에 있어서, 모노클론 항체는 비 반응성 이거나, 또는 적어도 프로트롬빈 또는 F1과 단지 최소로 교차 반응성이 있어야 한다. 또한 그것은 천연 F1.2와 F2 상의 에피토프를 인식하여야 하지만, 면역화에 사용되는 합성 펩타이드는 인식하지 않아야 한다.
스크리닝 분석은 선별된 포지티브 하이브리도마로부터 유도된 44개의 모노클론 항체가 전술한 원하는 특이성을 나타낸다는 사실을 밝혔다.
8개의 하이브리도마를 클로닝하고, 6개의 선별된 클론을 표준 방법을 사용하여 마우스내의 복수 종양으로서 증식시켰다. 모노클론 항체를 증식시키기 위한 다른 방법은 중공 섬유 카트리지나 발효조와 같은 생물학적 반응기내에서 증식시키는 것을 비롯하여 당업자에게 알려져 있다. 상기 방법을 사용하여 증식시킨 모든 항체들은 또한 특성 규명을 할 필요가 있다. 복수내의 모노클론 항체를 ELISA로 특성 규명을 하여, 6개의 클로닝된 하이브리도마에 의해 배양물에서 입증된 특이성을 확인했다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 상기 복수액으로부터 항체를 정제했다. 또한, 당업자에게 공지된 다른 면역 정제법도 사용할 수 있다.
상기 정제된 항-항원 모노클론 항체들을 이소타입(isotype)과 등전점에 대하여 특성 규명 했다. ELISA 법을 사용하여 모노클론 항체 특이성을 결정하기 위해 면역화학적 분석을 실시했다. 모두 6개 항체들은 항원 F1.2, F2 및 PF2-OVA에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. PF2-OVA는 F1.2 카르복시 말단을 모의한 합성 펩타이드와 오브알부민의 결합물을 의미한다. 하기 항원에 대한 어떤 항체에 대해서도 특이적 결합이 관찰되지 않았다 : 프로트롬빈, 트롬빈, F1, des-R PF2-OVA, 오브알부민. Des-R-PF2-OVA는 des-R F1.2의 카르복시 말단을 모의한 합성 펩타이드와 오브알부민의 결합물을 의미한다.
상기 항-항원 모노클론 항체 및 그것의 단편은 항원을 검출하기 위한 각종 면역 분석법에서 사용할 수 있다. 항원을 분석하기 위한 바람직한 방법은, 하기 a) 내지 g)의 단계를 포함하는 샌드위치 면역분석법에서, 적어도 하나의 항- 항원 모노클론 항체와 적어도 하나의 표지화된 분석물(anayte)을 포함하는데, 상기 분석물은 표지화된 항체 또는 표지화된 펩타이드, 바람직하게는 항-항원 항체, 및 가장 바람직하게는 폴리클론 항체일 수 있다 :
a) 항-항원 모노클로날 항체로 고체상을 코팅하는 단계,
b) 상기 코팅된 고체상에 샘플을 첨가하여 배양하는 단계,
c) 상기 고체상을 세척하는 단계,
d) 표지화된 항-항원 항체를 첨가하여 배양하는 단계,
e) 상기 고체상을 세척하는 단계,
f) 표지 활성을 검출하는 단계, 및
g) 반응을 판독하는 단계.
상기 표지화된 항체는 또는 고체상의 항체에 대해 결합 특시성을 가질 수 있다. 상기 샘플은 혈장이 바람직하지만, 혈청, 전혈, 뇨, 뇌척수액 및 활액과 같은 기타 체액도 사용할 수 있다. 상기 세척액은 일반적으로 완충 용액이지만, 물일수도 있으며 또한 다른 성분을 포함할 수도 있다. 상기 표지(label)는 효소 시스템의 경우, 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제가 바람직하지만, 알칼리성 포스파타제, 글루코즈-6-포스페이트 디히드로게나제, 루시페라제 및 베타-갈락토시다제와 같은 다른 효소도 사용할 수 있고, 이것들은 당업자에게 알려져 있다. 비- 효소 시스템에 유용한 표지의 예는 플루오로이소티오시아네이트, 로다민 또는 플루오레세인과 같은 형광성 표지, 방사능 면역 분석법용의 방사성 동위원소 및 입자를 포함한다.
시험관내 항원 검출을 위한 기타 방법으로는, 경쟁적 억제 분석법, 단일 단계 분석법 및 응집 반응 분석법이 포함되지만, 이것들은 실례로서 주어지는 것이며 이것들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 샘플중의 항원을 분석하는데 사용되는 진단용 시험 키트를 포함하는데, 이것은 프로트롬빈에 거의 비반응성인 적어도 하나의 항-항원 모노클론 항체를 포함한다. 또한 진단용 키트는 완충 용액, 표지화된 폴리클론 또는 모노클론 항-항원 항체, 항원 또는 펩타이드 및 키트 용도에 필요한 임의의 부속물을 포함할 수 있다.
하기 실시예는 항-F1.2 모노클론 항체의 생성 및 사용에 대해 기재하고 있다. 이 실시예들은 단지 본 발명을 설명하기 위해서 제공되는 것이며, 어떤 식으로든 나머지 명세서의 내용을 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예합성 펩타이드의 제조
면역 결합체의 제조 및 항-F1.2 항체의 스크리닝 및 특성 규명에 사용되는 합성 펩타이드의 아미노산 서열은 하기 표1에 도시되어 있다.
* 모든 합성 펩타이드는, 아미드화 카르복실 말단(-CONH2)을 갖는 PF.2 NH2를 제외하고 C- 말단에 유리된 카르복실기를 갖는다. 4개의 펩타이드는 단지 결합 목적으로 그것의 N-말단에 아미노산 C와 G를 갖는다.
PF2, des RPF 2, XPF2 및 PF2.14로 표시된 펩타이드는 캠브리지 리서어치 바이오케미칼즈(영국, 캠브리지 소재)에서 시판되고 있으며 ; 나머지 펩타이드는 멀티플 펩타이드 시스템즈(미국 캘리포니아 산디애고 소재)에서 시판되고 있다. 펩타이드 PF2의 서열, Cys-Gly-Ser-Asp-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OH는 F1.2 카르복시 말단의 마지막 8개 아미노산(-Ser-Asp-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OH)과 결합목적에 유용한 추가의 2개 아미노산, 시스테인 및 글리신을 기초로 한다. 펩타이드 desRPF 2, XPF2 및 PF2.14 도 결합 목적을 위해 그것의 N- 말단에 CG를 포함한다.
실시예면역결합체의 제조
상기 실시예에 기재된 PF2와 오브알부민을 이종의 이관능성 가교제 N- 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP)를 사용하여 커플링시켰다.
커플링 방법을 실시하기 위하여, SPDP의 에탄올 용액을 제조하고, 활성 에스테르 농도를 칼슨의 방법(전술함)을 사용하여 결정했다. 오브 알부민(V 등급 ; 시그마 케미칼스 코오포레이숀)을 100mM NaCl, 100mM NaHPO4, 0.02% NaN3(pH 7.5)의 커플링 완충액 중에 용해시킨 후, 커플링 완충액으로 평형화한 세파덱스 G-25TM(파마시아 LKB 바이오테크놀로지, 인코오포레이티드)에서 겔 여과했다. 오브 알부민을 실온에서 30분동안 17배 몰 과량의 SPDP로 배양한 후 위와 같이 겔여과시켰다. 오브알부민 티올화 정도는, 디티오트레이톨로 티올화 물질을 환원시키고, 피리딜티온의 방출을 343nm에서 모니터함으로써, 오브알부민 1몰 12.5 몰 피리딜디설파이드 기인 것으로 측정되었다. PF2의 N-말단의 시스테인 설프히드릴기(sulfhydryl group)는 실온에서 10분동안 50mM 디티오트레이톨과 함께 커플링 완충액중에서 1mM PF2를 배양함으로써 환원시켰다. PF2를 커플링 완충액에서 평형화시킨 세파덱스 G-10TM(파마시아 LKB 바이오테크놀로지, 인코오포레이티드)에서 급속으로 겔 여과한 후, 오브알부민의 피리딜디설파이드 부위에 비해 PF2의 1.25 몰 초과량을 티올화 오브알부민과 함께 실온에서 배양했다. 상기 커플링 반응은 343nm에서 최대 흡광도 및 공지된 흡광 계수(8.08ml/mol)를 갖는 피리딜티온의 방출에 의해 분광분석적으로 모니터하였다. 10분내에 커플링이 완결되었으며, 평균로딩은 8.9mol PF2/mol(오브알부민)이었다. PF2-OVA 로서 확인된 결합물을 면역원으로서 사용하기 전에 -20에서 보관하였다.
실시예다른 펩타이드-함유 결합체의 제조
des RPF 2 또는 XPF2와 오브알부민의 결합체, 및 PF2.14와 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP ; 시그마 케미칼스 코오포레이숀)의 결합체를 상기 실시예에서 기술한 바대로 SPDP를 가교제로 사용하여 제조했다. 피리딜디설파이드화 반응의 경우,SPDP를 75분동안 실온에서 0.83:1의 몰비를 HRP와, 또는 30:1의 몰비의 오브알부민과 함께 배양했다. 평균 최종 로딩은 10.2 몰 des-RPF2/ 몰(오브알부민), 7.4몰 XPF2/ 몰(오브알부민), 및 1.6몰 PF2.14/HRP 였다. 결합체를 항체 스크리닝 및 특성 규명에 사용할 때까지 -20에서 보관하였다.
실시예. 항펩타이드 모노클론 항체를 스크리닝하고 특성 규명하기 위한 단백질의 제조
F1.2, F2 및 프로트롬빈은 배양액 중의 항 펩타이드 항체를 스크리닝함에 있어서 오차를 제거하기 위해서는 주의깊게 균질상태로 정제되어야 한다. 종종 프로트롬빈은 항- 펩타이드 항체를 스크리닝 및 평가하는 것을 방해할 수 있는 F1 과 F2 같은 오염물질을 포함하기도 한다. 원하는 항체는 프로트롬빈을 인식하지 않아야만 하기 때문에, 프로트롬빈에서 F1.2와 F2를 제거하는 것이 중요하다.
헤파린 세파로스TM-컬럼(Pharmacia LBK Bioctechnology, Inc)을 사용하여, 시판되고 있는 프로트롬빈(Enzyme Research Inc.)으로부터 낮은 수준의 오염 물질을 제거하였다. 이것은 12mg의 프로트롬빈을 4에서 하룻밤동안 20mM 트리스, 50mM NaCl,(pH 7.5) 완충용액으로 투석한 후 동일한 완충액으로 평형화한(참고: Lau ; 전술함) 2.6 x 29cm 헤파린 세파로즈TM컬럼을 저속으로 통과시킴으로써 수행되었다. 정제된 프로트롬빈은 실버-염색된 환원 및 비환원 SDS-PAGE 상에서 단일 밴드를 나타냈다.
촉매량의 정제된 인자 Xa(Boehringer Mannheim)을 5M 트롬스톱TM(Thromstop) (American Diagnostica Inc.) (NAPAP, N-알파-(2-나프틸설포닐 글리실)-D,1- 아미노-페닐알라닌 피페리다이드) 및 100mM CaCl2의 존재하에 정제된 프로트롬빈 25mg과 반응시켜서, 미정제 F1.2을 생성하였다. 반응의 진행을 SDS-PAGE로 모니터하고, GGACKTM(Calbiochem Corp.)(단실-L-글루타밀-글리실-L-아르기닌 클로로메틸 케톤), 및 PPACKTM(Calbiochem Corp.) (D-페닐 알라닐-L-프롤릴-L-아르기닌 클로로메틸 케톤)의 각각 50M를 사용하여 인자 Xa과 트롬빈을 비가역적으로 억제시킴으로써 반응을 종결시켰다. 프로트롬빈을 불활성화 시키거나 F1.2를 파괴함으로써 F1.2의 산출시 트롬빈 생성을 중지시키는데 트롬스톱TM과 높은 수준의 CaCl2둘다 필요하다. 원하는 트롬빈 뿐만 아니라 인자 Xa를 억제시키기 때문에 트롬스톱TM을 대체하는데 PPACKTM을 사용할수 없다.
상기한 바와 같이 산출된 F1.2를, 4에서 하룻밤 동안 20mM Tris, 50mM NaCl, pH 7.4 완충용액에 대하여 먼저 투석한 후, 프로트롬빈 정제를 위해 전술된 조건을 사용하여 2.6 x 29cm 헤파린 세파로즈TM컬럼에 가함으로써 정제했다. F1.2를 포함하는 피크를 SDS-PAGE로 확인한 후, 완충용액으로 평형화한 Mono-QTM(Pharmacia LBK Biotechnology, Inc., HR 5/5 급속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 컬럼)에 가했다. 정제된 F1.2는 50 분 NaCl 그래디언트(20mM Tris 내의 50mM NaCl500mM NaCl, pH 7.4)에서 마지막 피크로 용출되었다. 상기 F1.2는 쿠마시 블루(coomassie blue) 염색된 SDS-PAGE에 근거하여 95% 이상의 순도를 나타냈으며, 추정 분자량은 43,000 달톤이었다. 소량의 오염 물질은 F1과 때로는 프로트롬빈을 포함했다.
미정제 F1과 F2는 옥시우라노우즈(Oxyuraneous) 독액(약 0.1mg ; 시그마 케미칼 코오포레이숀)의 프로테아제로 프로트롬빈(85mg)을 F1, F2 및 트롬빈으로 절단함으로써 생성되었다. 상기 반응의 진행은 트롬빈-민감성 크로요스트레이트(chromostrate)로 트롬빈 활성 증가를 주시함으로써 모니터했다. 60분후 각각 최종 농도 50M로 PPACKTM과 GGACKTM을 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. 이후에 F1과 F2 둘다 F1.2 정제에 대하여 전술한 바와 같이 Mono-QTM컬럼상에서 정제했다.
실시예 V - 면역화 프로토콜
BALB/c 마우스는 시안프리그리아 방법을 변형시켜서 실시예에서 전술한 바대로 PF2-OVA 면역 결합체로 면역화시켰다. 완전 프로인트 보조제 내의 50g면역원을 1일째에 복강내 주사함으로써 마우스를 자극시키고 21일 동안 휴식을 취하게 했다. 22일째에, 불완전 프로인트 보조제 내의 50g 면역 결합체로 마우스를 추가 자극시킨 후, 최종 추가 자극(boost)은 인산염 생략 식염수(PBS)중의 면역결합체 5g을 사용하여 25,26 및 27일 째에 복강내 및 정맥내로 투여했다. 28일 째에 비장을 수거하고 비장 세포(splenocyte)를 하이브리도마 융합을 위해 분리했다.
실시예-하이브리도마의 제조
면역 비장세포를 콜러 및 밀스타인(Kohler and Milstein)에 의해 기재된 기법의 부트만 변형법으로 P3X63Ag 8.653 마우스 골수 세포에 융합시켰다. 융합물 97 세포를 20% 말 혈청 및 HAT를 포함하는 이스코브 변형 둘베코 배지에 플레이팅하고 융합물 98 세포는 마우스 복막 압출 세포의 공급층(feeder layer)상에 1% 뉴트리도마TM(Nutridoma) (Boehringer Mannheim), 5% 소 태아 혈청 및 HAT를 포함하는 이스코브 변형 둘베코 배지에 플레이팅하였다. 각 배양 웰의 50% 배지를 신선한 배지로 대체해 줌으로써 2 내지 3일마다 배양물을 공급하였다.
실시예- 항체 스크리닝(screening)
HAT 배지내에서 하이브리도마 증식을 나타내는 배양물을 F1.2와 반응성이 있는 모노클론 항체의 생성에 대하여 ELISA 법으로 스크리닝했다. 이러한 목적으로, 1001/웰 (정제된 F1.2 ; 5g/ml)을 Immulon TM미세적정판(microtitration plate) (Dynatech, Va.)상에 PBS(pH 7.0)내에서 하룻밤동안 피복시킨 후 3% 어류젤라틴(3001/웰)을 포함하는 PBS 용액으로 블로킹시켰다. 그 다음 하이브리도마상청액(1001/웰)을 첨가하고 37에서 60 분동안 배양한 후, 0.5% 글리세롤 및 0.05% Tween 20TM(Rohm and Haas)를 포함하는 탈이온수로 5회 세척하여 비결합된 항체를 제거했다. 60분동안 마우스 면역 글로불린(IgG + IgM)에 대한 HRP-결합된 염소 항체 100g/웰을 사용하여 특이 항체 결합을 검출하고 세척한 후 30분 동안 100/웰의 테트라메틸벤지딘 크로모겐 기질로 발색시켰다. 100/웰의 2Ｎ H2SO4를 사용하여 상기 반응을 중지시키고 450nm에서 미세적정판 자동 판독기를 사용하여 판독했다. 포지티브 웰을 확장시키고 F1.2, PF2-OVA, OVA 및 프로트롬빈에 대해서 ELISA 법으로 특이성에 대하여 재시험했다. 융합물 97은 Fl.2 특이성 하이브리도마 213개 중 13개를 산출했으며 융합물 98은 Fl.2 특이성 하이브리도마 635개 중 31개를 산출했다. 이소타입 결정은 시판되고 있는 이중 면역확산 키트(double immunodiffusion kit)를 사용하여 상청액 상에서 실시했다. 융합물 97과 융합물 98로부터 총 8개의 하이브리도마를 특이성 데이터 및 IgG 이소타입에 기초한 클로닝을 위해 선택했다.
실시예 VIII - 하이브리도마의 클로닝 및 스케일-업(scale-up)
50% L929 조건 배지를 함유하는 아미노프테린이 없는 각각의 하이브리도마 배양배지로 2번의 제한 희석 클로닝에 의해 하이브리도마가 클로닝되었다. L929 조건배지는 3 내지 4일동안 10% 소 태아 혈청을 포함하는 이스코브 변형 둘베코 배지내에서 ATCC에서 수득한 L929 쥐 섬유아세포의 융합된 단일층(confluent monolayer)을 증식시킨 후, 원심분리 및 상기 조건 배지의 여과 멸균에 의해 제조했다. 상기 2개의 융합물 각각의 안정한 하이브리도마 클론 3개를 PristaneR(Aldrich chemical Co)-프라임된(primed) CD2 F1 마우스(BALB/ C x DBA F1 하이브리드)내의 복수 종양으로서 증식시키고 통상적인 프로토콜을 따랐다.
6개의 IgG 모노클론 항체를 단백질 A 세파로즈를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 복수로부터 정제했다.
실시예 IV - 복수액내의 모노클론 항체의 특성 규명
복수액 내의 모노클론 항체들은 Immulon II미세적정웰 상에 피복된 하기 항원을 사용하여, 실시예 VII에서 전술한 바대로 ELISA법으로 특이성을 확인했다 : Fl.2, F1, F2, PF2-OVA, OVA, des-R-PF2 OVA 및 프로트롬빈. 그 결과는 표 2 및 제2도에 요약했다. 6개의 모든 모노클론 항체들은 시험된 8개 항원에 대하여 유사한 ELISA 반응양상을 나타냈다. 포지티브 반응성은 F1.2, R2 및 PF2-OVA에 대하여 나타났고, 네가티브 반응성은 F1, des-R-PF2-OVA, OVA, 프로트롬빈 및 트롬빈에서 나타났다.
실시예 X - 정제된 모노클론 항체의 특성 규명
6개의 정제된 모노클론 항-F1.2 항체를 물리적 특성 및 특이성면에서 확인했다.
a) 물리적 특성
i) 표 3은 이소타입, 등전점(pI) 및 미세적정 웰을 포화시키는데 필요한 양을 비롯하여 모노클론 항체의 물리적 특성을 나타낸다. 항체 이소타입은 상기 실시예 VII에 기재된 바와 같이 결정했다. 등전점은 Phast-Gel System(Pharmacia LKB Biotechnology, Inc)를 사용하는 등전 집속(isoelectric focusing)법으로 정해졌다. 밴드 양상은 모노클론(폴리클론이 아님) 항체의 존재와 일치했다.
ii) 미세 적정 웰을 포화시키는데 필요한 항체의 양을 결정하기 위하여, 150mM NaCl, 20mM Tris, 5mM CaCl2, pH 7.4 완충액내의 5pg/ml 내지 90g/ml의 항체 100l를 실온에서 18시간동안 Griener미세적정 웰(Organon Teknika, Inc)에서 배양했다. 이 웰을 150mM NaCl, 0.05% Tween-20용액의 3001/ 웰로 3회 세척한 후, 37에서 1시간 동안 150mM NaCl, 20mM Tris, 5mM CaCl2, 5% 탈지 분유, pH 8.2로 블로킹시키고, 상기한 바대로 세척했다. HRP-표지화된 염소 항- 마우스 면역글로불린(Boehriner Mannheim)을 37에서 1시간동안 각 웰에서 배양했다. 이 웰을 상기한 바대로 세척하고, HRP 활성은 지시제로서 테트라메틸벤지딘/과산화수소, 정지 용액으로서 황산을 사용하여 10분간의 발색 시간으로 450nm에서 측정했다. HRP 활성이 더 이상 증가하지 않는 모노클론 항체 농도를 웰 포화에 필요한 농도로 간주했다. 6개 모노클론 항체의 경우, 모노클론 항체에 대하여 일반적으로 보고된 것과 일치하는 항체 양에서 웰 포화가 일어났다.
) 특이성
표 3에서는 Fl.2, F1, F2, 프로트롬빈, 트롬빈, 오브알부민-PF2 면역결합체, 오브알민과 desRPF2, XPF2 및 비관련된 펩타이드(PCPr)의 결합체와, 피리딜 디설파이드부화 오브알부민에 대한 정제된 항-F1.2 항체의 특이성을 요약하였다.
이 연구에 사용하기 위하여, Griener미세적정판을 150mM NaCl, 20mM Tris. 5mM CaCl2,(pH 8.2)중의 항원(1g 트롬빈 ; Fl.2, F1, F2, 프로트롬빈, 오브알부민-PCPr 및 피리딜디설파이드화 오브알부민 각각 100ng; PF2, desRPF2 및 XPF2와 오브알부민 결합체 각각 10ng)으로 실온에서 18시간 동안 피복시켰다. 플레이트를 전술한 바대로 세척 및 블로킹시킨다. 모노클론 항체(150mM NaCl, 20mM Tris, 5mM CaCl2, 0.02% Tween-20, pH 7.4 완충액중의 50pg/ml 내지 70g/ml 항체 100l)를 37에서 1시간동안 상기 피복된 플레이트에서 배양했다. 각 플레이트를 전술한 바대로 세척하고, HRP- 표지화된 염소 항-마우스 IgG(H+L)을 사용하여 결합된 항체를 검출했다. 각 항체에 대한 역가는 플레이트-결합된 오브알부민-PF2 결합체와의 결합 등은 곡선의 중간점이었다(참고. 제3도). 반응성은 5g/ml 항체를 사용했을 때 백그라운드의 3배 보다 더 큰 450nm에서의 흡광도로서 정의하였다.
6개 모노클론 항체 각각은 Fl.2 및 F2를 인지하였으며, 5-10H를 제외하고, F1, 프로트롬빈(), 트롬빈(a), 피리딜디설파이드화 오브알부민(Pyr-OVA) 또는 des-R-PF2, XPF2 및 PCPr과 오브알부민의 결합체는 인지하지 못하였다. 모노클론 항체 5-10H 는, 아마도 비특이적 상호 작용으로 인하여, 다른 5개 모노클론 항체 보다 더 높은 백그라운드를 나타냈다. 더 정확한 반응성 정의를 적용하는 경우, (50g/ml 항체를 사용하는 백그라운드 보다 더 큰 A450), 항체 6-9A, 8-11H, 9-1A, 2-7C, 및 5-3B는 여전히 Fl, 프로트롬빈, 트롬빈 또는 임의의 시험된 오브알부민 결합체를 인지하지 못했다.
) 상기 항체를 또한 샌드위치 ELISA 법에 있어서 용액으로부터 Fl.2를 포획하는 능력에 대해서 평가했다. 항체가 피복된 Griener플레이트를 제조하고 플레이트 포화 연구에 대하여 전술한 바대로 블록킹 시켰으며 ; 상기 플레이트를 포화시키는 것으로 알려진 항체의 농도를 사용했다. 150mM NaCl, 20mM Tris, 50mM CaCl2, pH 7.5 용액중의 Fl.2(0.023-23nM)의 여러 농도를 1시간동안 37에서 상기 플레이트 웰에서 배양한 후, 비결합된 Fl.2를 전술한 바대로 세척에 의해 제거했다. 프로트롬빈 칼슘-의존성 형성체(conformer)에 대한 HRP-표지화된 폴리클론 항체(참고. 실시예 XI)를 37에서 1시간동안 상기 플레이트에서 배양한 후, 이 플레이트를 세척했다. HRP 활성을 전술한 바대로 결정했다.
모노클론 항체의 Fl.2 결합 동온곡선은 제4도에서 보여진다. 각 항체들은 용액상 Fl.2에 결합할 수 있으며, Fl.2 샌드위치 ELISA의 전개에 사용할 수 있다. 항체 5-10H와 5-3B는 Fl.2의 최저 농도의 검출에 있어서 탁월하였다. 5-10H에 의해 나타난 비특이적 결합 성질로 인하여, 5-3B는 Fl.2 ELISA를 전개하기 위한 선택 항체로서 선택되었고, 이것은 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(American Type Culture Collection) (미국, 매릴랜드주 20852, 록크빌, 팍크로운 드라이브 12301)에서 수탁번호 ATCC HB1029(기탁일 1989. 11. 2)로 기탁되었다.
) 모노클론 항체 5-3B의 에피토프 요건을 더욱 정의하기 위하여 추가의 특이성 연구를 실시했다. 경쟁적 ELISA 법은 5-3B의 포화 농도로 전술한 바와 같이 피복된 미세적정 플레이트를 사용하여 실시했다. HRP-표지화된 PF2.14(10nM 결합체의 50L)을 150mM NaCl, 20mM Tris, 50mM CaCl2, 0.05% Tween- 20, pH 7.2의 완충용액 존재하에 동일한 부피의 정제된 Fl.2 또는 합성 펩타이드의 여러 농도와 함께 37에서 75분간 배양했다. 웰을 150mM NaCl, 20mM Tris, 0.05% Tween-20, pH 7.2 완충용액의 300L로 4회 세척했다. HRP 활성은 전술한 바대로 결정했으며 HRP-PF2.14 결합(B)의 정도를 반영하였다. 경쟁적 항체의 부재하에, 최대 결합도(Bo)를 관찰했다. B/Bo의 비는 HRP-PF2.14에 대한 퍼센트 결합을 반영하였다.
Fl.2와 PF 2.14 둘다 HRP-PF 2.14와 효과적으로 경쟁하였는데(제5도), 이것은 천연 단백질과 합성 펩타이드 둘다를 인지하는 5-3B의 능력을 확인시켜 주고, 표지화된 펩타이드를 사용한 경쟁적 분석법의 가능성을 나타내준다. 그와 비교하여, des-RPF2 또는 PF2.NH2둘다 HRP-PF2.14와 경쟁하지 않았으며, PF2.K는 고농도에서만 경쟁하였다(제6도). 이러한 결과는 에피토프가 5-3B에 의해 인지되기 위해서는 유리 카르복실기를 갖는 C-말단의 아미노산이나 유리 카르복실기가 없는 C-말단의 아르기닌의 존재는 충분하지 않으며, 유리 카르복실기를 갖는 C-말단의 양전하 아미노산(즉, 리신)의 존재는 중요하지만 충분치 않다는 점을 제시하고 있다. 유리 카르보실기를 갖는 C-말단의 아르기닌이 존재할 때 최적의 인지가 일어난다.
HRP-PF 2.14와 경쟁하는 각종 길이의 펩타이드의 상대적인 능력은 5-3B에 의해 인지되기 위한 중요한 에피토프 크기가 6 내지 8 아미노산 이라는 점을 나타냈다(제7도).
실시예 XI -프로트롬빈 칼슘-의존성 형성체(conformer)에 대한 항체의 제조
면역원이 인체의 프로트롬빈 및 인체 프로트롬빈 단편 Fl 이며 소의 프로트롬빈이 아니라는 점을 제외하고는 타이 N.M(tai. N.M. 255 J. Biol. Chem. 2790(1980))에 제시된 대로 항체를 제조 및 정제했다. 이 항체들은 그것의 천연 칼슘 의존 형태에서 Fl, 프로트롬빈 및 Fl.2를 인지한다.
실시예 XII - 프로트롬빈 칼슘-의존성 형성체(conformer)에 대한 HRP- 표지화된 항체의 제조
프로트롬빈 칼슘-의존성 형성체에 대한 항체는 가교제로서 SPDP를 사용하고 칼슨 방법(전술함)에 의해 HRP에 커플링시켰다. 이 실시예와 실시예 I 사이의 차이점은 항체와 HRP 둘다 SPDP와의 반응으로 먼저 티올화 되었다는 것이다. HRP 1몰당 약 1개의 피리딜디설피데이트 부위가 도입되었다. 티올화 HRP를 커플링 완충액(pH 4.5)내의 디티오트레이톨을 사용하여 환원시키고 세파덱스 G-25(커플링 완충액(pH 7.5)으로 평형화시킴)으로 겔 여과한 후, 실온에서 45-60 분간 pH 7.5에서 티올화 항체와 반응시켰다. 배양 몰비는 2 내지 5mol HRP/몰(항체)의 평균 로딩 양을 갖는 결합체를 산출하기 위하여 선택되었다. 7.5% 균질의 겔을 사용한 SDS-PAGE로 150,000 달톤 보다 더 큰 분자량을 갖는 결합체의 존재를 확인했다.
실시예 XIII Fl.2 샌드위치 ELISA
Fl.2 ELISA 법은 Fl.2 카르복시 말단에 특이적인 5-3B 모노클론 항체를 포획 항체로 사용하는 인체 Fl.2에 대한 2 단계 샌드위치 면역분석법이다.
이 분석법에 사용된 미세 적정 플레이트는 실온에서 18시간동안 각 웰마다 0.4g 5-3B(150mM NaCl, 20mM Tris, pH 7.2의 완충용액 중의 5-3B)를 배양함으로써 제조하였다.
상기 항체의 양은 이러한 고정화 조건하에 웰을 포화시켰다. 각 웰마다, 내용물을 흡인 제거한 후, 150L의 블록킹 용액(1% 오브알부민, 2.5% 슈크로즈, 150mM NaCl, 20mM Tris, 0.05% Tween-20, pH 7.2)을 첨가했다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 웰 내용물을 다시 흡인제거했다. 이 플레이트를 실온에서 하룻밤 동안 건조시킨 후, 4에서 건조 패킷을 포함하는 마일러 호일 주머니에서 보관했다.
상기 분석법에 사용되는 검정군(calibrators) 및 대조군은 Fl.2 가 제거된 인체 혈장에 정제된 Fl.2를 첨가함으로써 제조했다. 제거 이전에 시트레이트화된 정상혈장을 완충된 혈장-안정화 용액과 9:1(v:v) 비율로 혼합했다. 상기 혈장을 BaSO4(0.22g BaSO4/ml 혈장)로 2회 흡착시킴으로써 제거 단계를 실시했다. 이 방법은 프로트롬빈과 Fl.2를 비롯한 감마-카르복시 글루탐산 잔기를 포함하는 단백질을 제거했다. 정제된 Fl.2를 상기 흡착된 혈장에 첨가하여, 0, 0.25, 1.0, 3.0, 6.0 및 10nM Fl.2를 포함하는 검정군 및 0.5nM 및 7.0nM Fl.2를 포함하는 대조군을 생성하였다. 상기 검정군과 대조군을 1.0ml 분액으로 동결건조시키고 사용하기 전에 완충액으로 재구성하였다. 이 분석에 사용되는 HRP-표지화된 항-칼슘 의존성 프로트롬빈 형성체 항체의 제조는 실시예 XII에 기재된 바와 같다. 이 항체를 토끼 혈청-기초 매트릭스 중에서 동결건조시키고 항체 검출을 위한 분석용도로 사용하기 전에 단백질-기초 완충 용액으로 재구성하였다.
이 분석에 적당한 샘플은 적어도 30% 정상 레벨의 안티트롬빈를 포함하는 헤파린 처리된 혈장이었다. 분석 이전에, 혈장을 분석 민감도를 증가시키는데 사용되는 완충된 샘플 처리 시약과 9:1(v:v) 비율로 혼합했다. Fl.2를 10nM 보다 더 많이 갖는 혈장 샘플은, 표 4에서 보여지는 것처럼 분석 실시 범위 0 내지 10nM Fl.2 내에서 측정할수 있도록 0 nM Fl.2 검정군을 사용하여 필요에 따라 희석하여 측정할수 있다.
* 적당한 희석배율(dilution factor)로 나누어진 희석 샘플내의 F1.2를 농도로부터 계산됨.
** 샘ㅍ르 1과 2는 두 정상 공여체의 헤파린 처리된 혈장에 F1.2를 천가함으로써 제조됨.
혈장 샘플, 검정군(0 내지 10 nM Fl.2) 또는 대조군(레벨, I,II)은 피복된 미세적정 웰을 사용하여 실온에서 60분동안 배양했다. 프로트롬빈을 비롯하여 비결합된 단백질을 세척에 의해 제거했다. 웰 내용물을 흡인 제거함으로써 세척하고, 300L의 완충된 세척액으로 상기 웰을 채운 후, 다시 내용물을 흡인제거하고; 충진 및 흡인 제거를 4회 반복했다. 2단계에서, 결합된 Fl.2는 실온에서 60분간 배양하는 과정에서 프로트롬빈 칼슘-의존성 형성체에 대한 HRP-표지화된 항체에 의해 결합되었다. 두 번째 세척은 비결합된 HRP-표지화된 항체를 제거하였다. 결합된 HRP- 활성은 테트라메틸벤지딘(TMB)/ 과산화수소(1:1 혼합물) 지시제 시스템(발색시간 10분)과 정지 시약으로서 2N 황산을 사용하여 측정했다. 450nm에서 측정된 흡광도는 Fl.2 농도에 비례했다(제8도). 샘플, 검정군, 대조군, 검출 항체, TMB/과산화수소 혼합물 및 황산의 체적은 각각 100l/웰이었다.
실시예 XIV F1.2 ELISA의 분석 성능
분석 민감도(즉, O nM Fl.2 검정군과 구분될 수 있는 Fl.2 최소 레벨)는 0.05nM Fl.2 이다. 이 값을 결정하기 위하여, 0nM Fl.2 검정군의 다중 복제물을 분석하였고, 450nm에서의 평균 흡광도에 관련된 Fl.2 농도 + 2 표준 편차가 검정 곡선으로부터 외삽되었다.
상기 분석은 1.5M 프롬트롬빈의 존재하에 최소한 0.23nM Fl.2에 대해 특이적이다. 1.5M의 정제된 프로트롬빈을 포함하는 완충액-기초 시스템과 약 1.5M의 프로트롬빈을 포함하는 헤파린 처리된 혈장으로부터의 Fl.2 회수율은 각각 평균 92%와 98% 였다(표5 참고).
프로트롬빈 또는 다른 혈장-기초 단백질과의 교차반응성은 100보다 더 큰 회수율을 나타낼 것이다. 또한, 분석에서 트리글리세라이드, 헤모글로빈 또는 빌리루빈에 의한 주요한 장애는 검출되지 않았다(표 6).
측정된 부정확도는 다른 샌드위치 ELISA 법(Hoek, J.A., 34 Clin, Chem, 2058 - 2062(1988))과 필적할만하다. 두 부위에서 측정된 분산 계수는 두 대조군 레벨및에서 분석내 부정확도는 9% 이하이고 분석간 정확도는 11% 이하였다(표7 참고).
실시예 XV Fl.2 ELISA의 임상 효능.
건강한 사람, 혈전증 또는 혈전증 위험성과 관련된 상태의 환자, 항응고제 치료를 받는 환자에 있어서, 상기 실시예 XIII의 ELISA 분석법을 사용하여 Fl.2 레벨을 측정하였다. 45세 이하의 건강한 사람의 경우 평균 Fl.2 농도는 1.50.6nM(SD; n=30)이었으며, 방사능면역 분석법(Bauer, K., 70 Blood 343-350(1987)으로 측정된 값과 일치했다. 표 8에서 제시된 바와 같이 Fl.2 증가(2.7nM )발생율은 확립된 혈전증 상태 100%(16/16 환자)에 비해 혈전증 소인이 있는 상태에서는 38%(15/39 환자)였다. Fl.2 레벨은 겸상 적혈구 빈혈의 2 케이스와 정맥성 혈전증의 한 케이스에서 20nM 보다 더 컸다.
* F1.2에 대한 기준범위(95CI):0.3-2.7nM(30 명의 건갈한 곡여자(donor), 나니 18-45세 ; 정상분포 ; 평균2SD=1.51.2nM)
Fl.2 레벨은 장기간 쿠마딘 치료를 받은 5명의 환자에 있어서 억제 되었다(0.3nM 이하)(표9).
Fl.2 정상 레벨을 갖는 한 환자는 5일간만 상기 치료를 받았다. 급작스런 심장마비/심근 경색증(4명의 환자) 또는 불안정한 앙기나(3명의 환자)를 치료하기 위해 지속적인 헤파린 침출액을 투여한 환자에 있어서(표 10), Fl.2 레벨은 급작스런 심장마비를 앓은 환자를 제외하고는 모든 환자의 경우 감소했으며, 상기 심장마비 환자의 임상 과정은 산재성 혈관내 응혈증이 합병증으로 나타났다.
상기 데이터는 전술한 Fl.2 ELISA 법으로 측정된 Fl.2 레벨을 나타내며 이것은 환자의 혈전증 위험성을 평가하고 항응고제 치료의 효능을 모니터하는데 유효하다.

Claims (10)

  1. 프로트롬빈 활성화 펩타이드 Fl.2의 카르복시 말단 위의 에피토프에 특이적으로 결합하고, 프로트롬빈에는 결합하지 않는 항체로서, 아미노산 서열-Ser-Asp-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OH을 갖는 옥타펩타이드에 특이적으로 결합하는 모노클론 항체 및 그것의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 ATCC 수탁번호 HB 10291 로서 나타내는 하이브리도마에서 유도되는 모노클론 항체.
  3. 샘플에서 프로트롬빈 활성화 펩타이드 Fl.2을 분석하는 방법으로서, a) 제1항 또는 제2항의 모노클론 항체로 고체상을 피복하고 ; b) 샘플을 상기 고체상에 첨가하고 배양하며 ; c) 상기 고체상을 세척하고 ; d) 표지화된(labeled) 항체를 첨가하고 배양하며 ; e) 상기 고체상을 세척하고 ; f) 상기 표지(label)를 검출하며; 및 g) 이 반응을 판독하는 것을 포함하며, 여기에서, 상기 표지화된 항체는 상기 고체상의 항체나 상기 항원에 대하여 결합 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 표지화된 항체가 폴리 클론 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 샘플이 혈청, 혈장, 전혈, 뇨, 뇌척수액 또는 활액으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 표지는 호스 래디쉬 (horse radish) 퍼옥시다제, 글루코즈-6-포스페이트 디히드로게나제, 알킬리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 플루오로이소티오 시아네이트, 로다민, 플루오레세인, 루시퍼라제, 방사성 동위원소로 구성된 군에서 선택된 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 샘플 중의 프로트롬빈 활성화 펩타이드 Fl.2을 분석하는 방법으로서, 제1항 또는 제2항의 모노클론 항체가 포획 항체로서 사용되는 면역분석법을 포함하며, 이 면역 분석법은 경쟁적 억제 면역 분석법, 단일 단계 면역 분석법 및 응집 면역 분석법으로 구성되는 군에서 선택되는 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 면역 분석법은 표지화된 분석물(analyte)을 포함하며, 상기 표지화된 분석물은 표지화된 항체이거나 표지화된 펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. ATCC 수탁번호 HB 10291 로서 나타내는 하이브리도마.
  10. 제1항 또는 제2항의 모노클론 항체를 하나 이상 포함하는 샘플 중의 프로트롬빈 활성화 펩타이드 Fl.2을 분석하기 위한 진단용 키트.
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